diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics

2012 • Volume 48 • Number 1 • 25-31

Praca oryginalna • Original Article

25

Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej

Usefulness of laboratory diagnostics in hereditary spherocytosis

Wioleta Żarlak1, Anna Adamowicz-Salach2, Olga Ciepiela1, Iwona Kotuła1, Anna Szmydki-Baran2, Urszula Demkow1

1Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego, Warszawski Uniwersytet Medyczny, 2Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii, Warszawski Uniwersytet Medyczny

StreszczenieWprowadzenie: Sferocytoza wrodzona (ang. HS) jest najczęstszą wrodzoną niedokrwistością hemolityczną w populacji pół-nocnoeuropejskiej i Ameryce Północnej. Przyczyną HS są zaburzenia ilościowe i/lub jakościowe białek cytoszkieletu krwinek czerwonych: α i β spektryny, ankyryny, białka prążka 4.2 i przezbłonowego białka prążka 3.Cel badań: Celem pracy było porównanie przydatności diagnostycznej testu EMA z użyciem cytometru przepływowego oraz testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu AGLT50w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej.Materiał i metody: Badania zostały wykonane we krwi pełnej u 77 pacjentów z podejrzeniem HS. U pacjentów oceniano eks-presję białek błonowych erytrocytów przy pomocy cytometrycznego testu EMA oraz oporność osmotyczną krwinek czerwo-nych testem AGLT50.Wyniki: W przeprowadzonych badaniach wykazano, że test EMA charakteryzuje się 92,86% czułością i 100% swoistością w porównaniu ze 100% czułością i 66,6% swoistością testu AGLT50.Wnioski: Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że test EMA lepiej spełnia warunki badania przesiewowe-go w kierunku sferocytozy wrodzonej niż test AGLT50.

SummaryIntroduction: Hereditary spherocytosis (HS) is the most common inherited hemolytic anaemia in Northern Europe and Northern America. The molecular basis of spherocytosis is a quantitative or qualitative deficiency or dysfunction of one of the erythrocy-te’s membrane proteins: α and β spectrin, ankyrin, protein 4.2 or transmembrane band 3 protein.Aim: The aim of the study was to compare diagnostic usefulness of the flow cytometric (FC) analysis of EMA (eosin-5-m-aleimide) and acidified glycerol lysis test (AGLT50) in diagnostics of hereditary spherocytosis.Materials and methods: The study was performed in peripheral blood (PB) from 77 patients suspected of HS. Expression of erythrocytes membrane proteins was analyzed by FC EMA dye method and osmotic fragility was measured with acidified glycerol lysis test.Results: The results of the studies indicate, that sensitivity of the EMA dye method is 92,86%, whereas specificity was 100%. Although, the sensitivity of AGLT50 was 100%, the specificity was only 66,6%.Conclusions: On the basis of obtained results it can be concluded, that the eosin-5-maleimide (EMA) binding dye test is more accurate screening test for hereditary spherocytosis than acidified glycerol lysis test (AGLT50).

Słowa kluczowe: sferocytoza wrodzona, test EMA, test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50)

Key words: hereditary spherocytosis, the EMA test, acidified glycerol lysis test (AGLT50)

WstępSferocytoza wrodzona (ang. hereditary spherocytosis, HS), zwana chorobą Minkowskiego-Chauffarda, jest najczęściej rozpoznawaną wrodzoną niedokrwistością hemolityczną w populacji północnoeuropejskiej i Ameryce Północne. Wy-stępuje z częstością około 1 przypadek na 2000-5000 uro-dzeń [1, 2, 3, 4]. Choroba może ujawnić się w każdym wie-

ku, najczęściej jest rozpoznawana w okresie niemowlęcym i wczesnodziecięcym [1, 5, 6].Sferocytoza wrodzona jest uwarunkowana genetycznie i w około 80% przypadków występuje rodzinnie. W około 75% przypadków dziedziczy się autosomalnie dominująco. Pozo-stałe 25% dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny i/lub jest wynikiem mutacji powstałych de novo [3, 4, 6, 7, 8].

Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej

26

HS jest spowodowana zaburzeniami w budowie błony ko-mórkowej krwinek czerwonych, które są wynikiem anomalii ilościowych i/lub jakościowych białek błony i cytoszkieletu powstałych na skutek mutacji w genach kodujących te białka. Obserwuje się niedobór jednego lub kilku białek, najczęściej α i β spektryny, ankyryny, białka prążka 4.2 i białka prążka 3 [1, 2, 6, 7, 8]. W większości przypadków sferocytozy wro-dzonej nie jest znany niedobór białka. Jest to spowodowane tym, że elektroforezę białek błon erytrocytów (SDS-PAGE) i badania genetyczne wykonuje się bardzo rzadko [3].Niedobór białek błonowych i cytoszkieletu jest przyczyną nieprawidłowej budowy krwinek czerwonych. Cechują się one osłabieniem budowy cytoszkieletu, zmniejszeniem po-wierzchni erytrocyta, utratą dwuwklęsłego kształtu i przyję-ciem postaci kulistego sferocyta. Takie krwinki mają mniejszą elastyczność i zdolność do odkształcania podczas prze-chodzenia przez drobne naczynia włosowate. Uszkodzone krwinki czerwone są zatrzymywane w układzie siateczkowo-śródbłonkowym śledziony i następnie niszczone [3, 6, 8, 9].Przy rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej dziedziczonej autosomalnie dominująco ważną rolę pełni wywiad i obraz kliniczny, który potwierdza rodzinne występowanie choroby i skłonność do zażółcenia powłok skórnych i powiększenia śledziony. U pacjenta w badaniach laboratoryjnych stwier-dza się niedokrwistość, która może być skompensowana, wzrost średniego stężenia hemoglobiny w krwinkach czer-wonych (MCHC) oraz rozpiętość rozkładu objętości erytro-cytów (RDW). W rozmazie krwi obwodowej stwierdza się anizocytozę i poikilocytozę, mogą być obecne mikrosferocy-ty. Liczba retykulocytów bywa niekiedy znacznie zwiększo-na. W ciężkiej i umiarkowanej postaci sferocytozy wrodzonej oporność osmotyczna krwinek czerwonych jest zmniejszo-na, w łagodnej prawidłowa [3, 6]. W badaniu fizykalnym dziecka stwierdza się mniej lub bardziej nasilone zażółcenie białkówek ocznych i skóry, czasem powiększenie śledziony, zwłaszcza w przebiegu kryzy hemolitycznej, rzadziej obec-ność kamieni w pęcherzyku żółciowym [1, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 11]. W przypadku nietypowego przebiegu choroby konieczne jest wykluczenie niedokrwistości autoimmunohemolitycznej, hemoglobinopatii czy defektów enzymatycznych w krwince czerwonej (np. niedobór aktywności dehydrogenazy gluko-zo-6-fosforanowej, kinazy pirogronianowej) [2, 3, 6, 12].Znacznie trudniejsze w zdiagnozowaniu są łagodne i umiar-kowane postacie choroby, oraz dziedziczone autosomalnie recesywnie. Pacjenci zwykle mają prawidłowe stężenie he-moglobiny i bilirubiny. Liczba retikulocytów może być tylko nieznacznie zwiększona, a w rozmazie krwi obwodowej można nie znaleźć mikrosferocytów. Diagnostyka sferocyto-zy wrodzonej u noworodków i niemowląt również jest bar-dzo trudna, a to ze względu na fizjologicznie skrócony czas przeżycia erytrocytów zawierających hemoglobinę płodową, zwiększoną oporność osmotyczną krwinek, fizjologicznie zwiększoną liczbę retykulocytów i osłabioną erytropoezę [2, 8, 9, 13].U około 10% chorych na sferocytozę wrodzoną w rozma-

zie krwi obwodowej nie wykrywa się mikrosferocytów lub są one pojedyncze [3]. Choroby Minkowskiego-Chauffarda nie można również rozpoznać tylko na podstawie obecności sferocytów w rozmazie krwi obwodowej, bo mogą się one pojawiać także w innych chorobach [2, 4, 14].Badanie oporności osmotycznej metodą Daciego lub za po-mocą testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) nie jest badaniem swoistym dla sferocy-tozy wrodzonej, choć wykonywanym od wielu lat podczas przesiewowej diagnostyki tej choroby. Badanie nie pozwala na rozpoznanie HS bez konieczności wykonywania innych testów, ponieważ nie różnicuje innych niedokrwistości he-molitycznych jak niedokrwistości autoimmunohemolitycznej czy niedokrwistości spowodowanych konfliktem serologicz-nym w układzie AB0, w przebiegu których są obecne sfero-cyty we krwi obwodowej [2, 3, 8, 9, 10, 12, 15]. Testem służącym do przesiewowej diagnostyki sferocytozy wrodzonej, który pozwala dość szybko ocenić czy istnieje niedobór jednego z białek błonowych czy cytoszkieletu krwi-nek czerwonych, jest test EMA z użyciem cytometru prze-pływowego. Charakteryzuje się on wysoką czułością i swo-istością w rozpoznawaniu HS. Wprowadzenie tego testu, w 2000 roku przez M.JKing i wsp. poprawiło znacznie moż-liwości diagnostyczne u osób z łagodną postacią choroby [16]. W przypadku dużej grupy chorych HS nie była wykry-wana przy pomocy badań stosowanych wcześniej, w tym u noworodków i niemowląt [1, 10, 12, 15]. Zaletą testu EMA jest niewielka ilość materiału potrzebna do wykonania badania oraz możliwość jego przeprowadzenia po upływie 3-7 dni od momentu pobrania krwi, ponieważ upływ czasu nie ma znaczącego wpływu na wynik badania i jego interpretację [8, 17]. Jest to bardzo ważne u nowo-rodków i niemowląt, które często mają nasiloną hemolizę i wymagają natychmiastowej transfuzji krwi, a przyczyna nie-dokrwistości nie jest znana. Wówczas wykorzystuje się do wykonania testu EMA próbkę krwi pozostałą po wykonaniu badania morfologii krwi [8, 13, 16, 18].Bardzo rzadko wykonuje się analizę składu białkowego błony erytrocytów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamido-wym (SDS-PAGE), która pozwala na jakościową i ilościową ocenę niedoborów białek w błonie, oraz badania genetyczne identyfikujące mutacje w genach kodujących białka cytosz-kieletu. Diagnostykę tę wdraża się tylko w przypadku po-dejrzenia sferocytozy wrodzonej o nietypowym obrazie lub ciężkim przebiegu klinicznym [1, 2, 4, 6, 15].

Cel pracyCelem pracy było porównanie przydatności diagnostycznej testu EMA i testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwa-szonym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej.

Materiały i metodyMateriał do wykonanych badań stanowiła krew pełna pobie-rana z żyły łokciowej do probówek zawierających 34% roz-

27

twór EDTA-K2. Test EMA każdorazowo wykonywano we krwi pełnej pacjenta i w 5 próbkach krwi dawców z prawidłowymi wynikami parametrów morfologicznych (próbki referencyjne).Krew pochodziła od dzieci hospitalizowanych w Klinice Pe-diatrii, Hematologii i Onkologii Dziecięcej, u których podej-rzewano sferocytozę wrodzoną. Grupę badaną stanowiło 77 dzieci: 29 dziewczynek i 48 chłopców w wieku od 1 miesiąca do 18 lat. Mediana wieku wyniosła 10.

Test EMA.W celu wykonania testu EMA dla każdego pacjenta i 5 próbek referencyjnych przygotowywano po dwie probówki wirówkowe typu eppendorf, jedną dla właściwej próbki ba-danej, a drugą dla odpowiedniej kontroli. Do każdej z nich dodawano 5 µl krwi i uzupełniano do 1 ml roztworem PBS (zbuforowany roztwór soli fizjologicznej). Zawartość probów-ki dokładnie mieszano i wirowano przez 30 sekund z pręd-kością 8500g na wirówce Mini spin (Eppendorf). Następnie odrzucano supernatant. Do peletki przepłukanych krwinek czerwonych (próbka badana) dodawano po 25 µl barwnika EMA o stężeniu 0,5 mg/ml i inkubowano przez 1 godzinę w ciemni w temperaturze pokojowej cały czas mieszając probówki na mieszadle. Do próbek kontrolnych, zamiast barwnika fluorescencyjnego, dodawano po 25 µl roztworu PBS i traktowano dalej tak jak próbki badane. Po upływie czasu inkubacji wszystkie próbki wirowano przy maksymal-nej prędkości (8500g przez 30 sekund) i odciągano super-natant. Pozostałą w probówce peletkę krwinek czerwonych trzykrotnie przepłukiwano 1ml 0,5% roztworu FBS (surowica płodowa cielęca) w PBS i zawieszano w 500 µl 0,5% roz-tworu FBS w PBS. Do analizy cytometrycznej pobierano 100 µl zawiesiny wyznakowanych erytrocytów – próbka badana oraz 100 µl zawiesiny nietraktowanych barwnikiem krwinek czerwonych – odpowiednia próbka kontrolna, i dodawano je do 1,4 ml 0,5% roztworu FBS w PBS.Analizę wyznakowanych krwinek czerwonych przeprowa-dzano natychmiast. Pomiaru intensywności fluorescencji barwnika dokonywano przy fali wzbudzenia 495 nm i fali emisji 520 nm (fluorescencja zielona) w cytometrze przepły-wowym Cytomics FC 500 (Beckman Coulter). Analizowano 100 000 komórek w każdej próbce.Oceniano redukcję intensywności fluorescencji u osób cho-rych w stosunku do średniego wyniku z 5 próbek referencyj-nych. Wyniki przedstawiano jako procent obniżenia średniej fluorescencji barwnika.Zmniejszenie emisji świecenia barwnika w stosunku do średniego wyniku uzyskanego w próbkach referencyjnych wskazuje na obniżenie zawartości białka prążka 3 w bło-nie komórkowej lub wtórnie innych białek [18]. Obniżenie wartości średniej fluorescencji w teście EMA poniżej 80% w stosunku do próbek referencyjnych pozwala na rozpozna-nie sferocytozy wrodzonej, przy wartościach powyżej 80% należy wykluczyć niedokrwistość dyserytropoetyczną typu II (CDAII) [8]. Dokładna procedura przeprowadzanego testu została opisana przez autorów wcześniej [19].

Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicero-lu (AGLT50).Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicero-lu wykonywano wg modyfikacji Zanelli i wsp. Zasada metody polega na określeniu czasu wyrażonego w sekundach, jaki jest potrzebny do powstania 50% hemolizy krwinek czerwo-nych zawieszonych w zbuforowanym kwaśnym hipotonicz-nym roztworze NaCl z glicerolem.W celu wykonania badania sporządzano hemolizat - dodając 20 µl krwi pełnej do 5 ml wody destylowanej, oraz zawiesinę krwinek czerwonych w PBS - przez dodanie 20 µl krwi pełnej do 5 ml roztworu PBS (zbuforowany 0,9% roztwór NaCl o pH 6,85±0,01) i dokładnie mieszano. Następnie w celu przygo-towania próby „ślepej” pobierano 1 ml hemolizatu, a w przy-padku próby badanej 1 ml zawiesiny krwinek czerwonych w PBS i przenoszono do kuwet spektrofotometrycznych o pojemności 4 ml. Do kuwety z próbą „ślepą” dodawano 2 ml odczynnika glicerolowego (23 ml glicerolu i 300 ml roz-tworu PBS uzupełnione wodą destylowaną do 1 litra), do-kładnie mieszano i wstawiano do spektrofotometru Semco S91E (Emco), celem ustawienia absorbancji światła dla tej próby. Do kuwety z próbą badaną dodawano 2 ml odczynni-ka glicerolowego, szybko mieszano i wstawiano do aparatu. Natychmiast włączano stoper i mierzono absorbancję wyj-ściową przy długości fali 625 nm. Następnie określano czas w sekundach, po upływie którego absorbancja wyjściowa zmniejszyła się o połowę (AGLT50).Prawidłowy wynik testu AGLT50 wynosi powyżej 1800 se-kund. U osób ze sferocytozą wrodzoną, oraz cierpiących na inne niedokrwistości hemolityczne, jest znacznie skrócony i wynosi 25 – 150 sekund.

Ocena wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej.Na podstawie wyników rutynowych badań morfologii krwi obwodowej wykonanych w badanej grupie dzieci dokona-no analizy wybranych parametrów takich jak: liczba krwinek czerwonych (RBC), stężenie hemoglobiny (HGB), wartość hematokrytu (HCT), średnia objętość krwinki czerwonej (MCV), średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej (MCH), średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej (MCHC) i rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW). Morfologię krwi obwodowej wykonywano we krwi pełnej po-bieranej z żyły łokciowej do probówek zawierających 34% roztwór EDTA-K2 przy pomocy 5-parametrowego („5-diff”) analizatora hematologicznego HMX (Beckman Coulter).

Analiza statystyczna.Wyznaczono czułość i swoistość diagnostyczną testu EMA i AGLT50 wg następujących wzorów:Czułość = PD / (PD + FU) x 100%, Swoistość = PU / (PU + FD) x 100%, gdzie: PD – wyniki prawdziwie dodatnie, FU – wyniki fałszy-wie ujemne, PU – wyniki prawdziwie ujemne, FD – wyniki fałszywie dodatnie. Analizę statystyczną wyników testu EMA i testu hemolizy

Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej

28

krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) oraz wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej wykonano testem Manna Whitney’a U. Poziom istotności ustalono dla p<0,05. Korelację między wynikami testu EMA a wynikami testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszo-nym glicerolu liczono za pomocą nieparametrycznego testu Chi-kwadrat. W celu wyliczenia punktu odcięcia dla wyników pozytywnych w teście EMA wykreślono krzywą ROC.

WynikiTest EMA.Test EMA wykonano u 77 pacjentów z podejrzeniem cho-roby Minkowskiego-Chauffarda. W 13 przypadkach (16,9%) potwierdzono kliniczne rozpoznanie sferocytozy wrodzonej, ponieważ średnia wartość fluorescencji krwinek czerwonych w stosunku do referencyjnych kontroli wyniosła poniżej 80%. U pozostałych 64 pacjentów (83,1%) uzyskany wynik nie po-zwalał na rozpoznanie HS, gdyż średnia fluorescencja ery-trocytów mieściła się w granicach wartości referencyjnych. U jednego z pacjentów, u którego wcześniej rozpoznano sfe-rocytozą wrodzoną, nie stwierdzono obniżenia średniej flu-orescencji względem wartości referencyjnych, co może być związane z postawionym wcześniej błędnym rozpoznaniem i wymaga dalszej analizy.Wartość średniej fluorescencji po wykonaniu testu EMA dla chorych na sferocytozę wrodzoną wynosiła 72,43 ± 6,40 MCF (jednostki średniej fluorescencji, ang. mean channel of fluorescence), a w przypadku pacjentów bez HS 98,67 ± 9,18 MCF, p< 0,001. (Ryc. 1). Czułość wykonanego testu EMA określono na 92,86%, a swoistość na 100%.

czona powyżej. Powierzchnia pod krzywą (AUC – ang. area under curie) wynosi 0,9875 przy p<0,0001.

Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicero-lu (AGLT50).Badanie oporności osmotycznej erytrocytów za pomocą te-stu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) wykonano u 28 pacjentów z podejrzeniem sfero-cytozy wrodzonej. U 12 pacjentów (42,9%) wartość opor-ności osmotycznej erytrocytów mieściła się w zakresie 25 – 150 sekund, jak w sferocytozie wrodzonej. Jednak tylko u 4 pacjentów rozpoznanie HS potwierdził test EMA. U po-zostałych 8 pacjentów pomimo obniżonej wartości oporności osmotycznej, nie potwierdzono HS. U 16 pacjentów (57,1%) test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu pozwalał na wykluczenie choroby, ponieważ wartość opor-ności osmotycznej była prawidłowa.Średnia wartość oporności osmotycznej krwinek czerwo-nych u pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną wyno-siła 54,00 ± 6,63 sekundy, a u pacjentów bez sferocytozy 1034,5 ± 856,8 sekundy, p= 0,0453 ( Ryc. 3.). Czułość testu AGLT50 określono na poziomie 100%, jednak jego swoistość była bardzo niska, gdyż wynosiła tylko 66,6%.

Rycina 3Średnia wartość oporności osmotycznej krwinek czerwonych z uwzględnieniem odchylenia standardowego (SD) dla określonych grup pacjentów: chorych na sferocytozę wrodzoną i zdrowych. Gwiazdka (*) oznacza, że porównywane grupy wyników różnią się istotnie statystycznie.

Rycina 2 Krzywa ROC dla testu EMA. AUC – pole pod krzywą.

AUC = 0,9875

*

Rycina 1 Wartość średniej fluorescencji erytrocytów wyznakowanych barw-nikiem EMA z uwzględnieniem odchylenia standardowego (SD)u pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną i osób zdrowych. Gwiazdka (*) oznacza,że porównywane grupy wyników różnią się istotnie statystycznie.

*

Wyznaczono również punkt odcięcia dla wyników pozytyw-nych w teście EMA, co obrazuje krzywa ROC przedstawiona na Ryc. 2. Czułość i swoistość testu EMA dla wyznaczonej wartości punktu odcięcia - 80,98% jest taka sama jak wyli-

29

Nie zaobserwowano korelacji pomiędzy wynikami testu EMA i testu AGLT50 w grupie pacjentów chorych na sferocytozę wrodzoną i zdrowych, p>0,05.

Ocena wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej u pacjentów z podejrzeniem sferocytozy wrodzonej. Ocenę liczby krwinek czerwonych i wybranych parametrów morfologii krwi obwodowej wykonano u 34 dzieci z podej-rzeniem HS (9 dziewczynek i 25 chłopców). U 6 pacjentów wyniki sugerowały sferocytozę wrodzoną a u pozostałych 28 pozwoliły na wykluczenie tej choroby.Średnia liczba krwinek czerwonych u osób chorych na sfe-rocytozę wrodzoną wynosiła 3,3±0,7 x 10^6/1µl i była niższa niż u pacjentów bez HS 3,7±0,8 x 10^6/1µl.Stężenie hemoglobiny u większości przebadanych osób chorych na sferocytozę wrodzoną i bez HS (25 pacjentów) było obniżone poniżej 11 g/dl. Stężenie HGB w grupie osób chorych wynosiło 9,4±2,0 g/dl i było niższe niż u pacjentów bez HS – 10,5±1,7 g/dl. Wartość hematokrytu u wszystkich osób z HS była obniżona i wynosiła 27,0±5,4 %. Średnia wartość hematokrytu u pacjen-tów bez HS również była obniżona i wynosiła 31,2±5,4 %.Średnia objętość krwinki czerwonej (MCV) w grupie osób chorych na HS mieściła się w zakresie wartości referencyj-nych i wynosiła 82,7±10,1 fl, podobnie jak dla osób bez HS – 85,8±8,7 fl.Średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej (MCH) u osób chorych na HS wyniosła 28,6±3,1 pg, a u pacjentów bez HS 28,9±3,0 pg.Średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej (MCHC) u osób chorych na sferocytozę wrodzoną (HS) wynosi-ło 34,6±1,2 g/dl i było wyższe niż u pacjentów bez HS – 33,7±1,3 g/dl.Rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów (RDW) dla grupy pacjentów z HS wynosiła 21,6±8,5 %, a dla pacjentów bez HS 15,7±3,8 % .

Wyniki powyżej analizowanych parametrów morfologii krwi obwodowej nie różnią się istotnie statystycznie.Opisane dane dotyczące liczby krwinek czerwonych i pozo-stałych parametrów ocenianych podczas analizy morfologii krwi obwodowej u dzieci chorych na sferocytozę wrodzoną i bez HS zostały zebrane w Tabeli I.

Dyskusja.Sferocytoza wrodzona należy do najczęściej występujących wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych. Objawy kli-niczne w przebiegu HS mogą być mało charakterystyczne, zwłaszcza w łagodnej i umiarkowanej postaci choroby, co dodatkowo sprawia trudności w rozpoznaniu. Stosowane do niedawna badania diagnostyczne, opierające się na wyniku morfologii krwi obwodowej i ocenie rozmazu oraz badaniu oporności osmotycznej, nie zawsze dają zadawalające wy-niki i mogą być nieraz źródłem pomyłek w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej [1, 2, 3, 9]. Natomiast wprowadzenie testu EMA, jako badania o większej swoistości w stosunku do sferocytozy wrodzonej, pozwoliło na poprawę wykrywal-ności tej choroby [8, 12, 20].Celem niniejszej pracy było porównanie przydatności dia-gnostycznej testu EMA i testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu choro-by Minkowskiego-Chauffarda, oraz ocena wybranych para-metrów morfologii krwi obwodowej.Test EMA jest badaniem pozwalającym ocenić czy istnieje niedobór jednego lub kilku białek błony i cytoszkieletu krwi-nek czerwonych. Zasada testu jest oparta na łączeniu się barwnika fluorescencyjnego – 5-maleimidu eozyny (EMA) z lizyną (Lys-430) zawartą w pętli zewnątrzkomórkowej biał-ka prążka 3. Zmniejszenie intensywności świecenia barwni-ka w stosunku do kontroli w 75-95% przypadków wskazuje na niedobór jednego lub kilku białek błonowych. W pozo-stałych przypadkach może być spowodowany niedoborem innych białek, np. z układu Kell lub Rh, które wpływają na wiązanie barwnika z białkiem prążka 3 [8, 12, 18].Zaletą testu EMA jest niewielka ilość materiału jaka jest po-trzebna do wykonania badania (10μl - próbka pozostała po wykonaniu morfologii krwi) oraz możliwość przechowania próbki przez kilka dni, bez istotnego wpływu na ostatecz-ny wynik (od 3 do 7 dni od momentu pobrania). Pozwala to na zabezpieczenie materiału do badania w przypadku ko-nieczności wykonania w trybie pilnym transfuzji krwi i wyko-nanie testu EMA w późniejszym terminie. Taka możliwość wykonania badania w istotny sposób pomaga w postawie-niu prawidłowej diagnozy [17]. Wadą testu EMA może być konieczność posiadania cytometru przepływowego do jego wykonania, oraz trudności w interpretacji wyniku testu, je-śli przeprowadza się go we krwi pobranej od wcześniaków, w której występują duże krwinki płodowe lub od osób z infek-cją, ponieważ wówczas następuje wzrost wiązania barwnika EMA [8].Przeprowadzone badania wykazały, że test EMA charakte-ryzuje się bardzo wysoką czułością (92,86%) i swoistością

Tabela I. Średnia wartość RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC i RDW u dzie-ci chorych na sferocytozę wrodzoną i bez HS.

Badany parametr Dzieci chore na sfe-rocytozę wrodzoną

Dzieci bez sferocy-tozy wrodzonej

RBC ± SD x 10^6/1µl 3,3 ± 0,7 3,7 ± 0,8

HGB ± SD [g/dl] 9,4 ± 2,0 10,5 ± 1,7

HCT ± SD [%] 27,0 ± 5,4 31,2 ± 5,4

MCV ± SD [fl] 82,7 ± 10,1 85,8 ± 8,7

MCH ± SD [pg] 28,6 ± 3,1 28,9 ± 3,0

MCHC ± SD [g/dl] 34,6 ± 1,2 33,7 ± 1,3

RDW ± SD [%] 21,6 ± 8,5 15,7 ± 3,8

HCT – hematokryt, HGB –stężenie hemoglobiny, HS – sferocytoza wrodzona, MCH – średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej, MCHC – średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, MCV – średnia objętość krwinki czerwonej, RBC – liczba krwinek czerwo-nych, RDW – rozpiętość rozkładu objętości erytrocytów.

Ocena przydatności badań laboratoryjnych w diagnostyce sferocytozy wrodzonej

30

(100%) i dlatego jest wiarygodną metodą diagnostyczną w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej. Potwierdza to także King M J i wsp. oraz inni badacze [1, 8, 12, 16, 20]. W swoich pracach podkreślają, że wprowadzenie testu EMA jako badania przesiewowego w kierunku sferocytozy wro-dzonej znacznie poprawi możliwości diagnostyczne, zwłasz-cza u pacjentów z łagodną postacią choroby oraz noworod-ków i niemowląt.W przedstawionym materiale u jednego z pacjentów ze zdiagnozowaną wcześniej chorobą Minkowskiego-Chauffar-da nie uzyskano obniżenia średniej fluorescencji względem wartości referencyjnych (wynik fałszywie ujemny). Wynik taki może być spowodowany przez zły dobór grupy kontrolnej, niezachowanie odpowiedniego odstępu od ostatniej trans-fuzji, wysoką retykulocytozą i obecność zwiększonej liczby dużych krwinek czerwonych czy infekcją wymagającą sto-sowania antybiotyków. Również znaczny niedobór ankiryny może mieć wpływ na wynik testu EMA [8, 15, 18, 20].Bolton-Maggs P H B i wsp. wskazują, że obniżenie śred-niej wartości fluorescencji (dodatni wynik testu EMA) można uzyskać w rzadko występujących zaburzeniach erytrocytów takich jak wrodzona niedokrwistość dyserytropoetyczna typu II (CDA II), owalocytoza czy kriohydrocytoza [1, 12], ale obniżenie wartości MFI jest zwykle mniejsze niż u pacjentów ze sferocytozą [12]. Potwierdzają to również inne prace [10, 16]. Swoistość testu EMA na poziomie 100% uzyskano, gdyż brak było w grupie badanej wyników fałszywie dodatnich.Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że po-wszechnie wykonywany test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50) nie jest tak swoistym badaniem przesiewowym w kierunku sferocytozy wrodzo-nej jak test EMA, ponieważ nie wykrywa łagodnych posta-ci choroby, a na jego wartość mają również wpływ czynniki niezwiązane z defektem białek cytoszkieletu erytrocytów [12]. Czułość wykonanego testu AGLT50 określono na 100%, jego swoistość była bardzo niska i wynosiła zaledwie 66,6%. Uzyskaną 100% czułość testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu dla HS potwierdzają wyniki otrzy-mane przez Zanellę i wsp., chociaż Rutherford i wsp. po-dają, że czułość tego testu jest nieco niższa (92,3%) [5]. W wykonanych badaniach obniżoną wartość oporności osmotycznej odnotowano nie tylko u wszystkich chorych na sferocytozę wrodzoną, ale i u dzieci bez HS, u których nie można było wykluczyć innych chorób przebiegających z obecnością sferocytów we krwi obwodowej. Ponieważ obniżoną wartość wyników tego testu obserwuje się także u osób chorych na niedokrwistość autoimmunohemolitycz-ną, ostre białaczki, przewlekłą białaczkę szpikową, mielofi-brozę oraz u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek i u kobiet w ciąży, opierając się jedynie na jego wyniku nie można postawić ostatecznego rozpoznania [5]. W tym za-kresie otrzymane wyniki potwierdzają doniesienia innych badaczy [11, 14].Prawidłowa wartość testu hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu nie wyklucza choroby Minkow-

skiego-Chauffarda, ponieważ około 10–20% osób, z umiar-kowaną lub łagodną HS, ma prawidłową wartość oporności osmotycznej erytrocytów [1, 8, 10, 12]. W analizowanym materiale negatywny wynik testu AGLT50 uzyskano u jedne-go pacjenta ze sferocytozą wrodzoną. Prawidłową wartość oporności osmotycznej krwinek czerwonych u osób z HS (wynik fałszywie ujemny) można także uzyskać w przypadku niedoboru żelaza, w hiperbilirubinemii pozawątrobowej oraz w fazie zdrowienia po kryzie aplastycznej, gdy we krwi ob-wodowej wykrywa się duży odsetek retikulocytów [1, 12]. Stoya G. i wsp. wskazują na silną korelację pomiędzy testem EMA i testem hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszo-nym glicerolu (AGLT50) w rozpoznawaniu sferocytozy wro-dzonej. Postulują, aby oba testy były używane do wykrywa-nia HS, pomimo różnych ich czułości, którą dla testu EMA i testu AGLT50 określono odpowiednio na 98% i 73% [20]. Przeprowadzone przez nas badania nie potwierdziły tego, gdyż nie obserwowano korelacji pomiędzy testem EMA i te-stem AGLT50.Test AGLT50 nie pozwala na pewne zdiagnozowanie sfero-cytozy wrodzonej bez wykonywania dodatkowych badań diagnostycznych, ponieważ na jego podstawie nie można odróżnić HS od innych niedokrwistości hemolitycznych, w przebiegu których obecne są sferocyty we krwi obwodowej [1]. Dotychczas uważano, że dzięki jego wysokiej czułości oraz temu, że jest szybkim, prostym i tanim badaniem, jest użytecznym testem przesiewowym służącym do diagnostyki sferocytozy wrodzonej [5].Z przeprowadzonej analizy morfologii krwi obwodowej wy-nika, że liczba krwinek czerwonych oraz parametry czerwo-nokrwinkowe u chorych na sferocytozę wrodzoną mogą być prawidłowe. Sytuacja taka ma miejsce w przypadku skom-pensowanej niedokrwistości. Uzyskane wyniki świadczą za-tem o tym, że ocena morfologii krwi obwodowej podobnie jak analiza rozmazu ręcznego pełnią tylko rolę pomocniczą w rozpoznawaniu choroby Minkowskiego-Chauffarda. W sferocytozie wrodzonej o łagodnym przebiegu klinicznym nie zaobserwowano w morfologii krwi obwodowej istotnych odstępstw parametrów od zakresów wartości referencyjnych, co potwierdza badanie wykonane przez Bolton-Maggsa P H B i wsp. [1]. Badaną grupę stanowiły dzieci z medianą wie-ku = 10, dla której nie udało się wykazać charakterystycz-nych dla sferocytozy wrodzonej znaczących zmian wartości wskaźników czerwonokrwinkowych (wzrost wartości MCHC i RDW). Wyniki takie są zwykle stwierdzane w grupie doro-słych chorych z HS [1, 9].Przeprowadzone badania upoważniają do wyciągnięcia wniosku, że najlepszym badaniem przesiewowym w kie-runku sferocytozy wrodzonej jest test EMA. Zdecydowa-nym ograniczeniem w stosowaniu tej metody w rutynowej diagnostyce są niestety wysokie wymagania sprzętowe (cy-tometr przepływowy z laserem argonowym, umożliwiający odczyt fali o długości 520 nm). Uzyskane wyniki pozwalają również stwierdzić, że prawidłowe postawienie diagnozy po-winno opierać się nie tylko na dodatnim wyniku testu EMA,

31

ale przede wszystkim na dobrze zebranym wywiadzie kli-nicznym, badaniu fizykalnym pacjenta oraz wynikach dodat-kowych badań diagnostycznych obejmujących morfologię krwi obwodowej z rozmazem, oceną liczby retykulocytów i stężenia bilirubiny.

Wnioski1. Test EMA jest lepszym testem przesiewowym w rozpo-znawaniu sferocytozy wrodzonej niż test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT50).2. Wprowadzenie testu EMA do rutynowej diagnostyki sfe-rocytozy wrodzonej znacznie poprawiło jej rozpoznawa-nie, szczególnie u pacjentów z łagodną postacią choroby oraz u noworodków i niemowląt. 3. Test hemolizy krwinek czerwonych w zakwaszonym gli-cerolu (AGLT50) nie jest swoisty dla sferocytozy wrodzonej i nie pozwala na zróżnicowanie jej od innych niedokrwistości przebiegających z obecnością sferocytów.4. W morfologii krwi obwodowej u pacjentów ze sferocytozą wrodzonej można nie znaleźć nieprawidłowości poszczegól-nych parametrów czerwonokrwinkowych.

PiśmiennictwoBolton-Maggs PHB, Stevens RF, Dodd NJ, et al. Guidelines for 1. the diagnosis and management of hereditary spherocytosis. Br J Haematol 2004; 126: 455-474.Christensen RD, Henry E. Hereditary Spherocytosis in Neo-2. nates with Hyperbilirubinemia. Pediatrics 2010; 125: 120-125.Mariani M, Barcellini W, Varcellati C, et al. Clinical and hema-Clinical and hema-3. tologic features of 300 patients affected by hereditary sphero-cytosis grouped according to the type of the membrane protein defekt. Haematologica 2008; 93: 1310-1317.Webb D. Disorders of the red cell membrane. Current Paedia-Current Paedia-4. trics 2005; 15: 40-43.Apel D, Mariańska B, Maj S. Wartość diagnostyczna testu lizy 5. krwinek czerwonych w zakwaszonym glicerolu (AGLT) we wro-dzonej niedokrwistości sferocytowej i wybranych zespołach he-matologicznych. Acta Haematol Pol 1993; 44: 267-271.Iolascon A, Avvisati RA. Genotype/phenotype correlation in he-6. reditary spherocytosis. Haematologica 2008; 93: 1283-1288.Adamowicz-Salach A, Matysiak M, Albrecht-Stanisławska K. 7. Niedokrwistości hemolityczne związane z wrodzonym niedobo-rem białek błony komórkowej krwinek czerwonych – diagnosty-ka i leczenie. Klin Pediatr 2005; 13: 327-332.Adamowicz-Salach A, Szmydki-Baran A, Gołębiowska-Starosz-8. czyk S i wsp. Przydatność cytometrycznej analizy białek cytosz-kieletu i błon erytrocytów (test EMA) w diagnozowaniu wrodzo-nych niedokrwistości hemolitycznych u dzieci. Pediatr Pol 2009; 84: 419-422.Adamowicz-Salach A. Sferocytoza wrodzona. Onkologia i he-9. matologia dziecięca. Chybicka A, Sawicz-Birkowska K (red.). Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 2008: 884-889.Adamowicz-Salach A, Zdebska E, Spychalska J i wsp. Postępy 10. w rozpoznawaniu sferocytozy wrodzonej u niemowląt i dzieci w Polsce. Pediatr Pol 2006; 81: 347-250.Adamowicz-Salach A. Standardy rozpoznawania wrodzonych 11. niedokrwistości hemolitycznych. Onkohematologia dziecięca – co nowego? Kowalczyk JR (red.), Cornetis Wrocław 2009: 57-66.Kar R, Mishra P, Pati P. Evaluation of eosin-5-maleimide flow 12. cytometric test in diagnosis of hereditary spherocytosis. Int Jnl Lab Hem 2010; 32: 8-16.

Adamowicz-Salach A, Zdebska E, Matysiak M, Gołębiowska-13. Staroszczyk S. Postępy w diagnostyce wrodzonych niedokrwi-stości hemolitycznych u niemowląt i dzieci w Polsce. Fam Med Prim Care Rev 2007; 9: 589-591.Kłopocka J, Jabłońska-Skwiecińska E. Wstępna ocena znacze-14. nia diagnostycznego próby hemolizy w zakwaszonym glicerolu. Diagn Lab 1993; 29: 315-318.Bogusławska DM, Heger E, Sikorski AF. Molekularny mecha-15. nizm dziedzicznej sferocytozy. Merkuriusz Leki 2006. XX: 112-116.King MJ, Behrens J, Rogers C, et al. Rapid flow cytometric test 16. for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated hemo-lytic anemia. Br J Hematol 2000; 111: 924-933.Szmydki-Baran A, Adamowicz-Salach A, Gołębiowska-Starosz-17. czyk S i wsp. Ocena wpływu długości przechowywania prób-ki krwi na wynik testu EMA. Doniesienie wstępne. Pediatr Pol 2009; 84: 423-425.King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimide binding 18. to band 3 and Rh relatedproteins forms the basis of a screen-ing test for hereditary spherocytosis. Br J Hematol 2004; 124: 106-113.Potapińska O, Kotuła I, Zalewska W i wsp. Test EMA w diagno-19. styce sferocytozy wrodzonej. Diagn Lab 2008; 44: 389-399.Stoya G, Gruhn B, Vogelsang H, et al. Flow cytometry as a di-Flow cytometry as a di-20. agnostic tool for hereditary spherocytosis. Acta Haematol 2006; 116: 186-191.

Zaakceptowano do publikacji 17.01.2012

Adres do korespondencji:mgr Wioleta ŻarlakZakład Diagnostyki Laboratoryjnej i Immunologii Klinicznej Wieku Rozwojowego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego00-576 Warszawa, ul. Marszałkowska 24tel/fax. (22) 6296517wiola. zalewska@wp.pl