NASZA PUSZKA PANDORY

czyli o tym, jakie nasza Matka Ziemia

niesie zagrożenia mikrobiologiczne.

Autor: Kamila Gałęziowska

I SUM Biologia medyczna z elementami diagnostyki,

specjalność: mikrobiologia;

Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

CZYM SIĘ

ZAJMUJĘ?

http://www.med.kagawa-u.ac.jp/~xraylab/research/image9.jpg

Podstawowym celem moich badań jest zbadanie oporności na powszechnie stosowane antybiotyki występującej wśród bakterii środowiskowych wyizolowanych z różnych gleb woj. świętokrzyskiego.

Jakie to antybiotyki i dlaczego?

W badaniach stosuję 7 antybiotyków ß-laktamowych. Są to antybiotyki, które nie pozwalają na tworzenie się ściany komórek bakterii- co uniemożliwia jednocześnie tworzenie się miliardów nowych komórek. Preparaty te są bardzo często stosowane w leczeniu zakażeń powodowanych przez bakterie.

Szczepy z jakich gleb badam?

Do badań wykorzystałam 12 prób różnych gleb (kwaśnych, zasadowych, zanieczyszczonych związkami toksycznymi np. metalami ciężkimi). Z tego materiału wyhodowałam i wyizolowałam różne bakterie.

⓬

⓬

Numery odpowiadają poszczególnym próbkom

glebowym: 1 – 5 – gleby kwaśne z okolic

kopalni siarki (okolice Tarnobrzega); 6 – gleba

uprawna z terenów czystych ekologicznie

(okolice Klonowa); 7 i 8 – gleba skażona

metalami ciężkimi (Kielce); 9 i 11 – gleba

zasadowa (okolice Nowin pod Kielcami);

10 – gleba z terenów zurbanizowanych (Kielce,

centrum); 12 – gleba skażona uranem (Rudki).

Usytuowanie miejsc z których zostały pobrane próbki gleb, z których

następnie wyizolowano szczepy użyte w badaniach.

DLACZEGO AKURAT GLEBA I DLACZEGO

SZUKAM W NIEJ BAKTERII OPORNYCH ?

Gleba jest najbardziej sprzyjającym środowiskiem

do życia bakterii. Jest w niej dużo składników

odżywczych i wilgoci dzięki czemu

mikroorganizmy dobrze się w niej rozwijają. Gleba

chroni również bytujące w niej bakterie przed

szkodliwym promieniowaniem

UV. Dlatego ilość bakterii, jaka

w niej żyje jest olbrzymia. Część

z nich (ok. 1 do 4%) potrafimy

wyhodować w laboratorium.http://www.freedrinkingwater.com/Images-Test/E-Coli01.jpg

W glebie występują różne drobnoustroje produkujące antybiotyki, np. grzyby, z których pozyskano penicylinę – pierwszy antybiotyk ß-laktamowy. Często trafiają tam również inne związki przeciwbakteryjne. Jednym z ich podstawowych źródeł są nawozy naturalne pochodzące z gospodarstw lub pozostałości z oczyszczalni ścieków. Powszechnie stosowaną praktyką w hodowli zwierząt

jest dodawanie do pasz

antybiotyków

chroniących zwierzęta

przed epidemiami. Zaś

w ściekach trafiających

do oczyszczalni

znajdują się związki i

antybiotyki, które nie

zostały wykorzystane

przez organizm. http://www.pseudomonas.com/images/paeruginosa.jpg

Obecnie w Polsce nie

funkcjonuje polityka terapii

antybiotykami, która

określa jakie antybiotyki

można używać i umożliwia

monitorowanie narastania

oporności na antybiotyki

wśród bakterii.

Z tych powodów gleba

może być rezerwuarem

bakterii opornych na

różne antybiotyki.

http://klebsiella-

pneumoniae.org/klebsiella_pneumoniae_treatment_2.jpg

http://www.sciencephoto.com/image/12078/large/B2201522-

Klebsiella_pneumoniae_bacteria-SPL.jpg

• ESBL – jest to oporność na

większość (ok. 84%)

antybiotyków ß-laktamowych.

Bakterie wykazujące taką

oporność można zabić tylko

ok.16% tych antybiotyków.

• MBL – zazwyczaj niemal

wszystkie (prawie 98%)

antybiotyki ß-laktamowe nie

są skuteczne wobec bakterii

wykazujących ten typ

oporności.

• KPC – bakterie wykazujące

ten typ oporności są zwykle

niewrażliwe na ok. 62%

antybiotyków ß-laktamowych.

W moich badaniach poszukiwałam bakterii wykazujących kilka

określonych typów oporności:

http://www.news-

medical.net/image.axd?picture=2010%2F1%2Fstaph.jpg

A dlaczego akurat taka oporność jest ważna?

Zarówno oporność typu ESBL, MBL jak i KPC występuje na elementach

genetycznych, które nie są ściśle związane z określoną bakterią. Mogą się one

stosunkowo łatwo rozprzestrzeniać a bakterie mogą przekazywać je sobie

nawzajem. W rezultacie gwałtownie wzrasta ilość bakterii opornych.

Narastanie ilości wykrywanych opornych bakterii Pseudomonas aeruginosa w latach 2000 (A)

i 2006 (B).

A B

CO JUŻ UZYSKAŁAM W PROWADZONYCH

PRZEZE MNIE BADANIACH?

http://cdn.physorg.com/newman/gfx/news/2008/streptococcu.jpg

I ETAP BADAŃ

Określenie występowania oporności na ampicylinę – jeden

z najczęściej i najdłużej stosowanych antybiotyków

ß-laktamowych.

Zobrazowanie Etapu 1 –bakterie wyizolowane z różnych próbek gleb

hodowane na podłożu z ampicyliną .

Ten etap badań polegał na

hodowli wyizolowanych

szczepów bakterii na podłożu

mikrobiologicznym z

dodatkiem ampicyliny. Na

takiej pożywce wyrastały

jedynie szczepy oporne.

Jednocześnie był to wstępny

skrining, ponieważ bakterie

wykazujące interesujące mnie

typy oporności (czyli

ESBL, MBL i KPC) są również

oporne na ampicylinę.

bakteria wrażliwa

bakteria oporna

W I etapie badań sprawdziłam ile bakterii wyizolowanych z różnych próbek gleb jest

opornych na ampicylinę. Łącznie zbadałam niemal 300 szczepów bakterii, a spośród

nich aż 175 za nic sobie miało obecność antybiotyku i śmiało rosło na tym podłożu.

Te szczepy badałam w kolejnym etapie.

14

4

16

9

30

10

2422

15

29

2

6

1

17

1

15

22

12

86

22

1

0

5

10

15

20

25

30

35

G1 G2 G3 G4 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12

AmpC + (oporne) AmpC - (wrażliwe)

Lic

zba s

zczepów

Zestawienie ilościowe wyizolowanych z poszczególnych gleb, szczepów bakterii

opornych lub wrażliwych na ampicylinę

II ETAP BADAŃ

Określenie występowania oporności typu ESBL.

Do tego realizacji tego etapu badań stosowałam test z wykorzystaniem krążków

nasączonych odpowiednimi antybiotykami. Krążki te układałam w ściśle określony

sposób na płytce z pożywką, na której uprzednio rozprowadziłam zawiesinę bakterii.

Bakteria była klasyfikowana jako ESBL jeśli widziałam charakterystyczne

niesymetryczne strefy wokół określonych krążków z antybiotykami.

Bakteria wykazująca reakcję pozytywną na test ESβL.

Strzałki wskazują charakterystyczne wydłużenie strefy

zahamowania wzrostu bakterii

Bakteria wykazująca reakcję negatywną na

test ESβL. Brak wydłużenia strefy

zahamowania wzrostu bakterii

III ETAP BADAŃ

Określenie występowania oporności typu MBL.Wykonywałam test z wykorzystaniem krążka nasączonego odpowiednim

antybiotykiem oraz krążka z antybiotykiem i substancją hamującą oporność MBL.

Układałam je w określony sposób na płytce z uprzednio rozprowadzoną zawiesinę

bakterii.

Bakteria była klasyfikowana jako MBL jeśli różnica pomiędzy strefami zahamowania

wzrostu bakterii była równa lub większa niż 5 mm.

Bakteria wykazująca reakcję pozytywną na test

MBL. Strzałki wskazują średnicę strefy

zahamowania wzrostu bakterii

Bakteria wykazująca reakcję negatywną na

test MBL. Brak wydłużenia strefy

zahamowania wzrostu bakterii

27mm

21mm

23

,5m

m

24

mm

IV ETAP BADAŃ

Określenie występowania oporności typu KPC.

Tutaj robiłam test z krążkami nasączonymi antybiotykami oraz krążka z substancją

hamującą oporność KPC.

Bakteria była klasyfikowana jako KPC jeśli widziałam charakterystyczne

niesymetryczne strefy wokół określonych krążków

Bakteria wykazująca reakcję pozytywną na test

KPC. Strzałki wskazują charakterystyczne

wydłużenie strefy zahamowania wzrostu bakterii

Bakteria wykazująca reakcję negatywną na

test KPC. Brak wydłużenia strefy

zahamowania wzrostu bakterii

3

2

1

6

2

3

1

0

1

2

3

4

5

6

7

G1 G4 G6 G7 G8 G10 G12

Lic

zba s

zczepów

Zestawienie ilościowe szczepów, które wykazały reakcje pozytywną na testy

ESβL, Mβl lub KPC.

CO

CHCIAŁABYM

JESZCZE

ZROBIĆ ALE

BRAK MI NA TO

FUNDUSZY?

http://www.sciencephoto.com/image/13208/large/B2440035-Uranium_waste_bacteria,_SEM-

SPL.jpg

Identyfikacja bakterii, czyli określenie ich gatunku, które

wykazują oporność typu ESBL, MBL lub KPC.

Jest to o tyle ważne, bo taka oporność jest badana tylko dla kilku ściśle

określonych gatunków bakterii, zwykle związanych z człowiekiem. Jest

bardzo prawdopodobne, że oporność którą wykryłam występuje u innych

gatunków niż już opisywane. Niestety bakterii środowiskowych nie można

zidentyfikować powszechnie dostępnymi testami komercyjnymi. Trzeba

wykorzystywać metody genetyczne, które są znacznie bardziej

skomplikowane i kosztowne.

Określenie, czy oporność którą wykrywałam jest

warunkowana przez znane i opisane już geny.

W naukowych publikacjach jest opisanych kilka genetycznych metod

weryfikacji typów oporności bakterii. Jeśli żadna z nich nie będzie

skuteczna wobec moich bakterii, to oznaczać to będzie, że znalazłam

nowe, nieznane wcześniej geny warunkujące antybiotykoodporność.

Określenie nowych genów warunkujących oporność, w szczególności MBL lub KPC.

Jeśli okaże się, że któryś z moich szczepów bakterii wykazuje oporność wcześniej nie opisywaną to będę mogła określić jak wygląda gen, który ją warunkuje. Niestety wymaga to stosowania metod inżynierii genetycznej, które też do najtańszych nie należą.

Instytucja, w której prowadzę moje

badania posiada aparaturę, która

umożliwi mi realizację tych

planów. Mam do nich wszystkich

dostęp, jak również wsparcie

innych pracowników. Niestety

jednostka ta nie jest w stanie

sfinansować kosztownych

odczynników, które są mi

niezbędne do osiągnięcia

przedstawionych powyżej celów. I na to właśnie chciałabym przeznaczyć

pieniądze z tego stypendium, gdyby

udało mi się je zdobyć.

http://www.isciencemag.co.uk/wp-

content/uploads/2011/04/bacillus-subtilis.jpg

KIM W OGÓLE JESTEM?

http://epinews.com/Newswire/wp-

content/uploads/2010/07/Acinetobacter_baumanni_grn1.jpg

Jestem studentką pierwszego roku studiów magisterskich kierunku Biologia o specjalności mikrobiologicznej na Uniwersytecie Jana Kochanowskiego w Kielcach.

Poza uczelnią natomiast,

zajmuję się sportem jeździeckim

z wszelkimi jego aspektami,

również amatorsko fotografuję

oraz interesuję się sportami walki

i lotnictwem.

Dodatkowe studia podyplomowe

na kierunku Kryminalistyka w

Wyższej Szkole Ekonomii i Prawa

stanowią poszerzenie

zainteresowań z dziedziny

badań nad pismem.

DZIĘKUJĘ

ZA

UWAGĘ.

http://www.topillustrations.com/_upload/portfolio/129908390413920051.png