Mikrobiologia Wybrane metody barwienia

Dr n. biol. Henryk Różański

Laboratorium Biologii Przemysłowej i Eksperymentalnej

Państwowa Wyższa Szkoła Zawodowa w Krośnie

Barwienie złożone

• Barwienie złożone pozwala na wyraźniejsze zróżnicowanie właściwości biologicznych bakterii.

• Polega na zastosowaniu kilku barwników.

• Metoda Grama

• Metoda Ziehla-Neelsena

• Metoda Neissera

• Metoda Giemsy

Metoda Grama

• Pozwala podzielić bakterie na dwie zasadnicze grupy: Gram-dodatnie i Gram-ujemne.

• Odmienne barwienie się bakterii metodą Grama związane jest ściśle z różnicami w budowie chemicznej.

Hans Christian Joachim Gram 1852-1938

• Duński botanik, lekarz.

• Metoda barwienia 1884 r.

Hans Christian Joachim Gram, 1852-1938.

Metoda Grama – technika barwienia

• Utrwalony preparat traktować odczynnikami wg kolejności:

- fiolet krystaliczny 2-3 minuty,

- płyn Lugola 1-2 minuty,

- alkohol aż do odbarwienia ok. 30 sekund,

- woda – spłukanie,

- Fuksyna w roztworze fenolowym (rozc. 1:10) 20 sekund,

- Woda – spłukanie.

Metoda Grama

• Pod wpływem fioletu krystalicznego i płynu Lugola w niektórych drobnoustrojach powstają związki chemiczne (kompleksowe) nierozpuszczalne w alkoholu.

Bakterie takie mimo działania alkoholu pozostają zabarwione na kolor fioletowy bakterie Gram-dodatnie (Gram+).

Inne bakterie odbarwiają się pod wpływem alkoholu, dobarwione fuksyną barwią się na kolor czerwony bakterie Gram-ujemne (Gram-).

Gram Positive Bacteria (Cocci) http://www.sciencephoto.com/media/80940/enlarge

http://www.medschool.lsuhsc.edu/microbiology/DMIP/dmex17.htm

http://faculty.cbu.ca/cglogowski/2008%20BIOL101LAB2.htm

Gram positive (purple) & Gram negative (pink) bacteria

Metoda Ziehla-Neelsena • Rozróżnia bakterie kwasooporne i niekwasooporne.

• Kwasooporność jest cechą gatunkową niektórych bakterii (prątek gruźlicy, niektóre promieniowce).

• Zależy to od składu chemicznego cytoplazmy bakterii.

• Odgrywa ważną rolę w diagnostyce gruźlicy.

• Prątki gruźlicy ze względu na dużą zawartość związków lipidowych nie barwią się metodami zwykłymi.

• Metoda Ziehla-Neelsena służy również do barwienia zarodników.

Franz H. Ziehl 1857-1926, niemiecki bakteriolog

• Friedrich Carl Adolf Neelsen 1854-1898, niemiecki patolog

http://www.spcollege.edu/hec/vt/vtde/ate2639lgs/gramstain.htm http://pathtalk.org/archives/22

http://www.khdf.de/cms/index.php?id=194&site=www&lang=de

Metoda Ziehla-Neelsena – technika barwienia

• Postępowanie wg kolejności: - potraktować preparat fuksyną fenolową, następnie

ogrzewać preparat płomieniem palnika do 1 pary, barwić przez 2-3 minuty;

- Po ostudzeniu, zlać barwnik i spłukać preparat wodą; - Odbarwić alkoholem kwaśnym; - Spłukać wodą - Dobarwić rozcieńczonym błękitem metylenowym przez 1-

2 minuty; - Spłukać wodą; - Wysuszyć; - Obserwować obiektywem metoda immersji. • Bakterie kwasooporne, np. prątek gruźlicy są zabarwione

na czerwono, tło jest niebieskie.

Metoda Neissera

• Uwyraźnia charakterystyczne dla maczugowców błonicy ziarenka wolutyny

• Maczugowce błonicy zostają zabarwione na kolor żółty, a ziarenka wolutyny na fioletowo

http://de.wikibooks.7val.com/wiki/Medizinische_Mikrobiologie:_Grampositive_St%C3%A4bchen

• dwoinka rzeżączki (Neisseria gonorrhoeae) zwana gonokokiem (1879 r.)

Albert Neisser 1885-1916

Metoda Neissera – technika barwienia

• Przed barwieniem zmieszać 2 części odczynnka I (błękit metylenowy 1 g, alkohol absolutny 20 ml, kwas octowy lodowaty 50 ml, woda destylowana – do 1000 ml) z 1 częścią odczynnika II (fiolet krystaliczny 1 g, alkohol absolutny 10 ml, woda destylowana do 300 ml).

• Utrwalony preparat barwi się mieszaniną 5 minut. • Po zlaniu barwnika preparat potraktować

odczynnikiem III (chryzoidyna 10 g, woda destylowana 300 ml) w ciągu 15 sekund, potem spłukać wodą.