Metody analizy genomu

1. Mapowanie restrykcyjne.

2. Sondy do rozpoznawania DNA

3. FISH

4. Odczytanie sekwencji DNA

5. Interpretacja sekwencji DNA genomu

6. Transkryptom

7. Proteom

Były to pierwsze mapy

„molekularne”. genomu

Przykładem mapowania

restrykcyjnego jest strawienie

odcinka DNA dwoma enzymami

osobno i razem.

Poznajemy położenie i sekwencję

miejsc restrykcyjnych, sekwencji

pomiędzy nimi nie.

1. Mapy restrykcyjne

Mapowanie restrykcyjne daje

najlepsze wyniki dla stosunkowo

krótkich odcinków DNA, poniżej 50

kB, bo większe odcinki się zlewają

Gdy pozwolimy na pulsowanie pola

elektrycznego, nawet tak długie

odcinki jak 2Mb (małe

chromosomy, fragmenty dużych,

duże plazmidy, etc.) mogą być

rozdzielone.

1. Mapy restrykcyjne

2. Sondy do rozpoznawania DNA - identyfikowanie genu

na odcinku DNA

Możemy mieć informację o interesującym nas genie, a nie znamy jego

miejsca na chromosomie. Posiadana informacja może posłużyć do

skonstruwanaia sondy (ang. probe), która odszuka ten gen.

Sondy takie mogą być:

- otrzymane na bazie badanego mRNA, czyli są wyznakowanym cDNA

- wyznakowanymi fragmenty homologicznych genów znanych z innych

organizmów

- sztucznie zsyntetyzowane na podstawie sekwencji aminokwasów -

białka: -aa – aa – aa – aa – Tyr – Met – His – aa – aa – aa –

kodony TAC ATG CAC

lub inne TAT CAT

znacznik DNA

i próbki elektroforeza

bibuła

blot – przeniesienie

na filtr

sondy –

odszukują

sekwencje

komplementarne

błona

fotograficzna

Technika bibułowa - blotting

2. Sondy do

rozpoznawania

DNA

Zaczęło się od

omawianej wcześniej

hybrydyzacji metodą

Southerna.

3. FISH (fluorescent in situ

hibridization) - sonda wprost

na chromosom

Komórki z chromosomami w

stadium metafazy denaturujemy

chemicznie i prostujemy na

płytce.

Dodajemy sondę wyznakowaną

fluorescencyjnie.

Mapować można pod

mikroskopem !!

3. FISH (fluorescent in situ

hibridization) - sonda wprost na

chromosom

Na tym przykładzie widzimy

chromosom metafazowy (para

chromosomów homologicznych,

każdy ma dwie chromatydy).

Dodano tu na raz 18 różnych sond.

5. Odczytanie sekwencji DNA – metoda Sangera (tradycyjna)

Reakcja sekwencjonowania DNA polega na przerywanej syntezie DNA.

Wśród normalnych nukleotydów znajduje się domieszka nukleotydów

zmienionych tak, że uniemożliwiają one dalsze wydłużanie łańcucha. Te

zmienione nukleotydy maja 4 markery fluorescencyjne: A, G, T, C.

Tu przykład reakcji

kończącej się na A, inne

kończą się na G, T, C. .

Mieszanina reakcji

kończących się na

A, G, T, C

(z jednej matrycy DNA,

długiej do 700 bp)

jest rozdzielana w jednej

kapilarze sekwenatora

wyposażonego w odczyt

fluorescencji

5. Odczytanie sekwencji DNA

Dawniej rozdzielano i

odczytywano na ogromnych

żelach poliakrylamidowych

Jeden nukleotyd daje

widoczną róznice w tempie

migracji

5. Odczytanie sekwencji CAŁEGO GENOMU

Pewnym sposobem jest poznane wcześniej fizyczne porządkowanie kolekcji

klonów i sekwencjonowanie jej elementów. Stworzenie takiej biblioteki jest

jednak pracochłonne.

Trzeba robić sondy z poszczególnych fragmentów i nimi szukać następnych,

tak by się zazębiały.

Przykladem jest STS (sequence tagged site) mapping

Potrzebnymi unikatowymi znacznikami (tutaj A-I) mogą być sondy zrobione

z cDNA genów mających jedna kopię w genomie.

Możemy uporządkować naszą bibliotekę, czyli, zbudować kontig klonów.

5. Odczytanie sekwencji CAŁEGO GENOMU

Metodą szybszą jest losowe wielokrotne losowe sekwencjonowanie

fragmentów i numeryczne układanie ich w komputerze

- tzw, metoda „shutgun”

- nie wymaga fizycznego klonowania

- obecnie zdecydowanie dominująca

Widoczne pokrycie jest słabe, jak uzyskać setki fragmentów na

danym odcinku?

5. Nowe metody odczytywania sekwencji DNA – analizator Solexa

Na takich płytach

rozprowadza się

fragmenty DNA.

Losowy fragment

(kilkadziesiąt

nukleotydów) ma

wokół wolny promień

około kilku mikronów.

Pozwala to umieścić

miliony różnych

fragmentów na cm

kwadratowym

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Pofragmentowane

DNA (nawet cały

genom na raz –

oczywiście w wielu

kopiach) jest

ligowane ze

standardowymi

starterami

polimeryzacji

Złączone fragmenty

DNA i wolne startery

są umieszczane na

płycie.

Losowy fragment

(kilkadziesiąt

nukleotydów) ma

wokół wolny promień

około kilku mikronów.

Pozwala to umieścić

miliony różnych

fragmentów na cm

kwadratowym.

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Mostkowanie – fragment

z dwoma starterami

odnajduje starter

komplementarny

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Replikacja do

fragmentu

dwuniciowego

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Rozdzielenie do

dwóch pojedynczych

nici

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Powtarzanie

mostkowania i

replikacji prowadzi do

powstania plamek

klonalnego DNA, do

1000 kopii w jednej

plamce

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Dodawanie

pierwszego

nukleotydu

warunkowo

terminującego i

podświetlenie w celu

identyfikacji

przyłączonego

nukleotydu

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Identyfikacja

pierwszego

nulkeotydu

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Odblokowanie i

„odbarwienie” pierwszego

nukleotydu i dołączenie

drugiego świecącego i

blokującego nukleotydu

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Identyfikacja drugiego

nukleotydu

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Wielokrotne

powtarzanie

identyfikacji

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

Złożenie sekwencji w

kontig

5. Nowe metody odczytywania

sekwencji DNA

– analizator Solexa

ORF (open reading frame) to każda

sekwencja mająca na początku kodon

START (ATG), dalej inne kodony

aminokwasów, a kończąca się kodonem

STOP (TAG, TGA, lub TAA).

W sekwencji 4522

zasad są dwa

prawdziwe geny

kodujące białka

(ciemne linie) i

wiele fałszywych

(jasne).

Prawdziwe geny

są odpowiednio

długie i nie

zachodzą na

siebie (z pewnymi

wyjątkami).

6. Interpretacja sekwencji DNA –

czyli gdzie są geny?

6. Interpretacja sekwencji DNA

Poszukiwanie ORF jest utrudnione przez obecność intronów, szczególnie u

wyższych eukariontów.

W rozpoznaniu genów pomaga porównanie sekwencji DNA bliskich sobie

gatunków.

5. Finałem jest podanie sekwencji i ADNOTACJI genów

Celem mapowania fizycznego jest uzyskanie informacji, najlepiej z

dokładnością co do jednej zasady, gdzie w genomie umiejscowiony

jest interesujący nas element (gen, promotor, mutacja punktowa,

profag, etc.) - poniżej przykład mapy chromosomu drożdży.

6) Transkryptom

Transkryptom to ogół mRNA

obecnych w danym momencie w

komórce. Nowoczesna technologia

pozwala na badanie ekspresji

wszystkich genów równocześnie!

Sondy dla pojedynczych genów

układa się w mikropanelach. Trzeba

znać sekwencję badanych genów.

Taki mikropanel jest następnie

eksponowany na ekstrakt mRNA

uzyskany z genów ulegających

ekspresji, a powstawanie hybryd

wykrywa się laserem.

6) Transkryptom

Celem badań ekspresji wszystkich genów jest charakterystyka zmian jakim

ulega metabolizm komórki w różnych tkankach, warunkach

środowiskowych, stanach chorobowych, etc.

6) Transkryptom

Jeżeli badany jest jakieś zjawisko

trwające w czasie, to można pobierać

w zabiegu eksperymentalnym próbki

mRNA co pewien okres i uzyskać w

ten sposób obraz podniesienia

(zielono) lub obniżenia (czerwono)

ekspresji poszczególnych genów w

badanym czasie.

7. Proteom

Proteom to ogół białek obecnych w komórce. Białka zawarte w komórce

można rozdzielić w dwukierunkowej elektroforezie.

Obrót

Po wycięciu i oczyszczeniu

z żelu białko poddawane

jest spektrometrii masowej

dla zidentyfikowania

fragmentów (po strawieniu

na odcinki 5-70 aminokw.) a

potem ułożeniu ich w kontig

sekwencji białka.

7. Proteom

Chcielibyśmy znać nie tylko listę białek, ale też ich oddziaływania ze

sobą. W systemie dwuhybrydowym, dwa dowolne białka (np. ludzkie)

które podejrzewany o oddziaływanie łączymy z dwoma białkami drożdży.

7. Proteom

Wykorzystujemy białka drożdży, które muszą się zbliżyć do siebie i

dołączyć do odpowiednich miejsc przed genem reporterowym (np.

barwnik) by uruchomić transkrypcję. To się udaje, jeśli sztucznie

doczepione białka ludzkie oddziaływują ze sobą.

7. Proteom

Efektem tych

badań są sieci

oddziaływań

białek,

pokazujące

zwłaszcza te

białka, które

maja najwięcej

partnerów.

7. Proteom

Celem „biologii

systemów” jest

kompleksowy opis

składu i oddziaływania

ze sobą genów,

transkryptów, białek i

metabolitów w całej

komórce, a nawet

organizmie.