Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym

Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich

przydatność w monitoringu terenowym

Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Dr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka,

FederalFederalna Agencja Środowiska,na Agencja Środowiska, Berlin, Berlin, Niemcy Niemcy

EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, 2009 Selinka

Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnym


WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality

ADENOVIRUSADENOVIRUS

NOROVIRUSNOROVIRUS

ROTAVIRUSROTAVIRUS

Spożycie (z płynami)

Wdychanie i aspiracja (z aerozolami)

Kontakt (podczas mycia)

Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne)

Żołądkowo-jelitowa Oddechowa

Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy

Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp.

Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy

Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii

Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia

Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni*

ADENOADENOWWIRUSIRUS

NORONOROWWIRUSIRUS

ROTAROTAWWIRUSIRUS

Ocena ryzyka

*Podstawy naukowe

Zarządzanie ryzykiem

*Zgodnie z polityką

Komunikowanie ryzyka *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka

Źródło:Źródło: WHO Food Safety WHO Food Safety


Struktura ramowa analizy ryzyka

odpowiednie metody


Dzisiaj nie będę mówić o…

Liczba kolonii DIN EN ISO 6222E. coli DIN EN ISO 9308-1 DIN EN ISO 9308-3

DIN EN ISO 9308-1 Enterococci DIN EN ISO 7899-2 DIN EN ISO 7899-1 DIN EN ISO 7899-2Pseudomonas DIN EN 12780aeruginosa

Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach

... ale raczej o:

starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii

(wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody, badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…)

- badania liczebności i zakaźności bakteriofagów

DNA i RNA

- pobieranie próbek wody do analizy wirusów

- oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu

filtra z włókna szklanego

- ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa

- rola inhibitorów środowiskowych

- wykrywanie wirusów metodami PCR

- badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej


Phage MS2

http://viperdb.scripps.edu/Texmol/2ms2.png

Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagów

Fagi somatyczne DIN EN ISO 10705-2:2001

Fagi F+RNA DIN EN ISO 10705-1:2001


Fagi F+RNAF-Pilus

Fagi somatyczne

Bacterium Bacterium

Fagi B. fragilis DIN EN ISO 10705-4:2001

F+

Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowym


Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Fagi F+RNA Fagi somatyczne

DIN 10705-1 10705-02-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Szczep Salmonella thyphim. E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC 12484 ) lub ( WG5; ATCC 700078 ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC 23631 )

Dolny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar Modif. Scholten‘s Agar (TYGA) ( MSA )Górny agar: ssTYGA (0,8% agar) ssMSA (0,8% agar)

Kwas nalidyksowy: 100 µg/ml 250 µg/ml

Granica wykrywalności: 1 pfu/50 ml 1 pfu/50 ml

Fag wzorcowy: MS2 PhiX174-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------


MS2

Fag138

PhiX174


PRD1

Morfologia płytek bakteriofagów

Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych:

zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii

Morfologia płytek bakteriofagów


C.Fuchs

Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego


„Karta przewodnia” Kolifag somatyczny PhiX 174 Ar + Bri

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

20

.4.0

8

10

.5.0

8

30

.5.0

8

19

.6.0

8

9.7

.08

29

.7.0

8

18

.8.0

8

7.9

.08

27

.9.0

8

17

.10

.08

6.1

1.0

8

26

.11

.08

16

.12

.08

Data

pfu

/ m

l

x-3s x-2s x x+2s x+3s

Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml


Monitorowanie wirusów – pobieranie prób

Związki chemiczne

Wirusy

Rozkład statystyczny

Skupiska!

Próbobranie


Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowej

próbka

wody surowej

100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów

Próbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii

( DNA / RNA )

Infectivity assays

Wykrywanie wirusa metodą PCR

10-litrowa próba wody

1. Pobieranie prób wody o dużej objętości 2. Zmniejszenie objętości próbek (1:1000)3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów 4. Testy wykrywające wirusy


Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wody

Cechy wirusa Metody

Polarność powierzchniowa

kapsydu Adsorpcja / Wymywanie

Rozmiar cząsteczki Filtracja membranowa (Ultrafiltracja)

Gęstość Ultrawirowanie



Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanego


W terenie…

Włókno szklane – badania polowe dużych objętości

Próba wody: 10 litrów 1000 litrów



Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiska

liza etapy mycia elucja

kroki powtarzane 5 razy

Próbka 5ml

Bufor do lizy

Krzemionka

2x 50 µl Bufor do elucji

5 min 60°,1400 rpm


Oczyszczanie DNA i RNA

Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludzi

Zdjęcia: dzięki uprzejmości J.Y. Scro

Wirus DNA

Wirus RNA


5’---CTCAGCGTTACCAT---3’3’---GAGTCGCAATGGTA---5’

5’---CUCAGCGUUACCAU---3’

N---Leu-Ser-Val-Thr---C

DNA

RNA

BIAŁKO

Transkrypcja

Translacja

DNA RNA Białko

Amplifikacja informacji genetycznej wirusów


Odwrotna transkrypcja

Wykrywanie wirusów metodami PCR

konwencjonalne PCR(jakościowe)

PCR czasu rzeczywistego

(ilościowe)

DNA / RNA


Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR)

Wirusy DNA Wirusy RNA

PCR RT-PCR


NOROWIRUS(nested RT-PCR)

ADENOWIRUS(nested PCR)

WZW A WIRUS

(nested RT-PCR)(Mediagnost R)

Nested (RT)-PCR


Real-Time TaqManTM PCR

- Potrzebne są tylko: (1) matryca (próbka DNA)

(2) nieoznaczona para dla starterów

(3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana

2 fluorochromami (np. reporter FAM i wygaszacz TAMRA)

(4) Mastermix (koktail odczynników)

Łączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu

Adenowirus 41 wzorzec

102 - 106 kopii



1. 5 µl próbka 2. 5 µl próbka + Ad Wzorzec 3. 10 µl próbka 4. 10 µl próbka 1:10

Testy / próbki:

Real-time PCR

Na amplifikację kwasów

nukleinowych z próbek pobranych

ze środowiska często negatywnie

wpływa obecność inhibitorów.

Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych

• Komórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa

• zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach

• następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR „Integrated Cell Culture PCR“ (ICC-PCR)

Badanie zakaźności adenowirusa


(A. Heim)

Metody wykrywania wirusa

O zwiększonej czułości

Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli

Wykrywa jedynie żywe organizmy

Wykrywa zakaźnego wirusa

Skraca czas wykrywania

ICC-PCRRT-PCRHodowla komórkowa

Metoda wykrywania

Odporna na wpływ substancji hamujących PCR


a) Test TCID50 b) Test łysinkowy

Badanie zakaźności enterowirusa

kontrolna CVB3

Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych


Podstawowe techniki monitorowania wirusów


Techniki zaawansowane:

- wydajna metoda koncentracji wirusów

- skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA

- systemy PCR dopasowane do wirusów

( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR )

- systemy hodowli komórkowych do badania

zakaźności

- Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa


Dziękuję Państwu!

Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym

Documents

Transcript of Laboratory jne metod y wykrywania w irus ów i ich przydatność w monitoringu terenowym