Kwasy nukleinowe jako leki

Cz. II – nośniki terapeutycznego DNA

Technologia

Zastoso-wanie

Selektywność tkankowa

Wydajność (skuteczność trans- fekcji i ekspresji)

Trwałość ekspresji

Chemiczna: liposomy; wytrącanie Ca3(PO4)2

Fizyczna: mikroinjekcja; elektroporacja; particle bombardment Biologiczna: niewirusowa (ligand/receptor); wirusowa (retro-, adeno-, AAV)

ex vivo/ in vivo ex vivo/ in vivo ex vivo/ in vivo ex vivo/ in vivo

Nie

Nie

Tak

Częściowa

Niska

Średnia

Niska – średnia

Średnia - wysoka

Przejściowa/ Stała Przejściowa Przejściowa Przejściowa/ stała

Technologie transferu genów w somatycznej terapii genowej

Wektory adenowirusowe• Dwuniciowe DNA, ok.36 kpz. • geny kodujące białka regulatorowe indukujące

replikację wirusa;• geny kodujące białka kapsydu;• kapsyd

wektor I generacji - delecja w regionie kodującym

białko niezbędne do replikacji;wektor II generacji - delecja w regionie kodującym

białka ulegające ekspresji przed replikacją; wektor III generacji - najmniej immunogenne, ponieważ

nie zawierają praktycznie żadnych sekwencji wirusowych.

nie następuje integracja chromosomalna (łatwość eliminacji, ale brak niebezpieczeństwa mutagenezy insercyjnej); można transfekować komórki nieproliferujące (np. neurony lub hepatocyty), także in vivo.

Wektory retrowirusowe • Genom - jednoniciowy RNA;

• cykl życiowy jest stosunkowo złożony;

• lipidowa otoczka;

• rozpoznają swoiste

receptory na

powierzchni

infekowanych

komórek;

Wektory retrowirusowe

• Geny wirusowe zastąpione genami terapeutycznymi – wirus nie ulega dalszej replikacji w komórkach docelowych;

• po wniknięciu, RNA jest przepisywane na DNA

i odwrotny transkrypt jest wbudowywany w genom gospodarza w trakcie mitozy;

• transgen do 10 kpz• duża wydajność transfekcji• długotrwała ekspresja transgenu;• ryzyko wystąpienia mutacji insercyjnych i aktywacji

onkogenów;• wprowadzanie do komórek dzielących się; głównie ex

vivo.

Wektory lentiwirusowe • Należą do rodziny retrowirusów;

• najczęściej stosowany wektor na bazie wirusa HIV-1;

• usuwa się materiał

odpowiedzialny

za właściwości

patogenne;

Wektory lentiwirusowe

• Zdolność do infekowania limfocytów;

• aktywnie transportowane do jądra komórkowego przez pory jądrowe;

• możliwość stosowania w komórkach

nie dzielących się;

• dodanie glikoproteiny G z wirusa VSV daje możliwość wprowadzania zrekombinowanych wirusów do innych typów komórek, w sposób in vivo.

Wirusy towarzyszące adenowirusom (AAV)

• Należą do parwowirusów; nie są patogenne• genom AAV - jednoniciowy DNA liczący ok. 5 kpz.;• Potrzebna koinfekcja wirusem pomocniczym –

adenowirusem lub wirusem opryszczki;• gen rep - integracja latencyjna DNA wirusa z

sekwencjami znajdującymi się na dłuższym ramieniu 19 chromosomu

- nie indukują odpowiedzi immunologicznej;

ekspresja trwa bardzo długo;- łączą zalety wektorów retrowirusowych – zdolność do integracji z genomem komórki i wektorów adenowirusowych – transdukcja komórek nie dzielących się.

Wirus opryszczki typu pierwszego HSV-1

• Dwuniciowy DNA, duży genom - (152 kpz), zawierający 84 geny, replikacja zachodzi nawet

po usunięciu połowy z nich;• możliwość wprowadzenia bardzo długich

transgenów w różne miejsca wektora;• nie integruje się do genomu;• infekuje szeroki

zakres komórek;• neurotropizm.

Wirus opryszczki typu pierwszego HSV-1

• Defektywne mutanty z delecją w genach odpowiedzialnych za występowanie cyklu litycznego. Wektory takie nie są cytotoksyczne

i są zdolne do przechodzenia w stan podobny

do latencji w neuronach i innych tkankach;

• Wektory warunkowo replikujące się, z delecją kilku genów - zakażają wybrane komórki.

Hybrydowe wektory wirusowe

• Kombinacja adenowirusów z wektorami AAV - genom AAV zamykany w kapsydzie adenowirusa. Uzyskuje się zdolność do integracji z genomem komórki docelowej w określonym miejscu, dzięki genowi rep.

• Wektory łączące elementy adenowirusów

i retrowirusów – w kapsydzie adenowirusa

z materiałem retrowirusa. Otrzymuje się dużą wydajność transdukcji i zdolność integracji

z genomem komórki docelowej.

Idealny wektor wirusowy • Łatwość wyprodukowania w dużych ilościach,

a także zachowanie trwałości podczas transportu i przechowywania;

• utrzymywanie ekspresji transgenu na stałym poziomie lub precyzyjna regulacja;

• brak odpowiedzi immunologicznej; • duża pojemność wprowadzania genów;• integracja z genomem w ściśle określonym

miejscu;• zdolność wprowadzania materiału genetycznego

do szerokiego zakresu komórek dzielących się

i nie dzielących się.

Nośniki niewirusowe

• Składają się z syntetycznych związków chemicznych lub wysoko oczyszczonych substancji pochodzenia naturalnego;

• nie ma tu ryzyka aktywacji onkogenów;

• mniejsza wydajność transferu związana z ujemnym ładunkiem plazmidowego DNA i jego wielkością – potrzebna kondensacja w cząsteczkach nośnika.

Somatyczna terapia genowa – nośniki polipeptydowe

Somatyczna terapia genowa - nośniki

Somatyczna terapia genowa - nośniki

Terapia genowa

Przykłady eksperymentalnych terapii wykazujących wysoką skuteczność

-wprowadzanie genu kodującego czynnik wzrostowy VEGF-2 lub FGF-2 bezpośrednio do komórek mięśnia sercowego pacjentów z zawansowaną niestabilną chorobą wieńcową. Efekt – indukcja neoangiogenezy.

-zastosowanie wirusa Onyx-015 jako pomocniczego czynnika terapeutycznego u pacjentów z rakiem krtani. Wirus selektywnie rozpoznaje i niszczy komórki ze zmutowanym białkiem p53 (45 – 70% w komórkach raka krtani).

-zastosowanie adenowirusów przenoszących gen TIMP-3 (koduje Tkankowy Inhiibitor Metaloproteinazy-3), dla zapobiegania nawrotom arteriosklerozy u pacjentów po zabiegach angioplastyki.

-zastosowanie rekombinowanych genów kodujących czynniki krzepliwości VIII lub IX w AAV jako nośniku, dla leczenia hemofilii. Gen kodujący czynnik VIII w wersji skróconej.