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目次

Ion AmpliSeq™ Designer概要

ターゲット領域の指定方法

Ion AmpliSeq™ Designerの使用手順

デザイン結果の確認

ラン設定

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Ion AmpliSeq™ Designer概要

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Ion AmpliSeq™ Designer

LIFE アカウントでログイン

ターゲット遺伝子名を入力するだけで簡単にデザイン

(Gene Symbol 名 、またはBEDファイル)を入力

ヒトとマウスゲノムに対応

48 時間以内にデザイン完了(ターゲットサイズ250kbp以内の場合)

http://www.ampliseq.comIon AmpliSeq Designer

BRAF

Gene Symbol名を入力

ファイルはダウンロードが可能2-48時間以内

専用のウェブサイトでカスタムオリゴをデザイン

• アンプリコンサイズ

– Standard: 125-275bp– FFPE: 125bp-175bp

• 基本的なフィルタリング

– 最適なTm値

– プライマー内に長いホモポリマー領域がないこと(合成の観点で)– GC含量が20%－80%であること

• 生物学的なフィルタリング

– SNP filtering –プライマーの3’末端にcommon SNP(dbSNP 132)を含まない

– Repeat filtering – 既知リピート配列との重複が30%以下

Ion AmpliSeq™ Designerパイプライン(1)

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• オフターゲット増幅の可能性を最小化

• アンプリコン同士の重なりが最小になるセットを選択

• 各アンプリコンの干渉を最小化するようにプール最適化

– プール数最大10

– 1プール当たり最大6144アンプリコン

– 同一プールのアンプリコン間は50bp以上離す

Ion AmpliSeq™ Designerパイプライン(2)

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ターゲット領域の指定方法

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ターゲット領域の指定方法

• 遺伝子名を指定

– CDSのみ

– CDS + UTR

• 領域の位置情報を指定

– BEDファイル

– CSVファイル

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ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/CGP/cosmic/data_export/CosmicCompleteExportIncFus_vxx_xxxxxx.tsv All curated information with and without coding mutations including gene fusion mutations.CosmicCompleteExport_vxx_xxxxxx.tsv All curated information with and without coding mutations.CosmicFusionExport_vxx_xxxxxx.tsv All Gene fusion mutations.CosmicInsMutExport_vxx_xxxxxx.tsv All coding insertion mutations specifying inserted sequence. CosmicMutantExportIncFus_vxx_xxxxxx.tsv All coding point and fusion mutations CosmicMutantExport_vxx_xxxxxx.tsv All coding point mutations CosmicStrucExport_vxx_xxxxxx.tsv Structural Genomic reararrangements

特定のがん種で知られている変異の位置情報

(2)組織、がん種、非同義置換などで選択

Gene name HGNC ID Sample name Primary site Primary histology Histology subtype Mutation ID Mutation CDS Mutation AA Mutation Description genome positionEGFR 3236 V153 lung carcinoma adenocarcinoma 13427 c.2126A>C p.E709A Substitution - Missense 7:55241678-55241678EGFR 3236 V153 lung carcinoma adenocarcinoma 6224 c.2573T>G p.L858R Substitution - Missense 7:55259515-55259515EGFR 3236 V162 lung carcinoma adenocarcinoma 28944 c.? p.H773_V774insPH Insertion - In frameEGFR 3236 V169 lung carcinoma squamous_cell_carcinoma 6224 c.2573T>G p.L858R Substitution - Missense 7:55259515-55259515EGFR 3236 V17 lung carcinoma adenocarcinoma 6224 c.2573T>G p.L858R Substitution - Missense 7:55259515-55259515

(1)COSMICからファイルをダウンロード

(3)csvファイル又はbedファイルに整形

chr13 48936982 48936983chr13 48942684 48942685chr13 48921974 48921976chr13 49039405 49039407

REGION,RB1_COSMIC878,chr13,48936983,48936983REGION,RB1_COSMIC879,chr13,48942685,48942685REGION,RB1_COSMIC144253,chr13,48921975,48921976REGION,RB1_COSMIC144254,chr13,49039406,49039407

領域指定方法

領域名染色体 始点 終点

csvファイル bedファイル

染色体 始点-1 終点

Ion AmpliSeq™ Designerの使用手順

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Ion AmpliSeq Designerにログイン1 Ion AmpliSeq™ Designer にアクセス

2 LIFEアカウントで Sign In

3 利用規約の確認 (初回のみ)

アカウントの取得については、IonCommunityを参照して下さい。http://ioncommunity.lifetechnologies.com/docs/DOC-7018

Designの登録4 新規デザインを作成（DashboardタブまたはMy Designsタブから可能）

「Save」をクリック

ターゲット遺伝子/領域の指定5 ターゲット遺伝子/領域の指定 (遺伝子名(Symbol名)もしくはRegionを指定)

Geneを選択した場合は、遺伝子名(Gene Symbol)を 直接入力

Regionを選択した場合、染色体名 (例: chr1) および開始位置、終了位置を入力

エクソンパディング

6 ターゲット遺伝子/領域の指定 (CSV file、BED fileをアップロードする場合)

ファイルを選択

ターゲット遺伝子/領域の指定

エキソンパディング

ファイルタイプ

デザインの依頼 (Submit Targets)7 デザインの依頼 (Submit Targets)

デザインが完了すると、登録したメールアドレスに確認メールが届きます

デザインを確認後Submit targets をクリック

• Submitの確認 • デザイン完了のお知らせ

デザイン結果の確認

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デザイン結果の確認(1)

デザイン結果の確認(2)

More solutionsをクリックすると、アンプリコンサイズが異なる設計結果を表示

デザイン結果

デザインの詳細

ターゲット→領域→アンプリコン の順でデザインを確認できます

アンプリコンが属するプール

プライマー配列

19

各行をクリック

カバー出来なかった領域の情報

各行をクリック

UCSC Genome Browserでデザインを確認できます

20

ここをクリック

リピート領域のためデザインできなかった例

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InputDesigned

Missed

TP53遺伝子を指定してデザインC’ドメインが欠損するバリアントにのみ存在するエクソンの領域が設計されない

Transposonの領域

デザイン結果の確認

ダウンロードされる圧縮ファイル

IAD46844_087_results.zip

含まれるファイル

プライマー配列と384プレート上の配置

設計を意図した領域毎のアンプリコン数やカバー塩基数

設計全体のカバー状況

設計出来なかった領域設計出来なかった領域(理由を含む)

設計された領域

設計を意図した領域

ランプランを定義するためのファイル

プライマーの注文 画面で価格は確認できません。概算価格の算出等はIonCommunity上の下記ページでご確認下さい。http://ioncommunity.lifetechnologies.com/docs/DOC-7018

既存パネル情報（Panelsタブ）“Ready-to-Use panel” のオーダー、情報の確認、ファイルのダウンロード、カスタマイズ

パネルの種類を選択

既存パネルのオーダーやカスタマイズが可能

AmpliSeq™用のランプランの設定

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Torrent Serverが外部ネットワークに接続している場合(1)(1)Plan Template Runのアイコンをクリック

(2)目的のカテゴリのAmpliSeq.com Importをクリック

(3)AmpliSeq.comのUsename, Passwordを入力してLog-inをクリック

同じPC,同じブラウザで最近AmpliSeq.comにログインした場合この画面が表示されず、次ページの(4)に進みます。

Torrent Serverが外部ネットワークに接続している場合(2)(4)必要なテンプレートのチェックをオンにして、Import Selectedをクリック

(5)実行直後は下記のようにQueuedと表示

(6)ウェブブラウザの再読み込み(reload, , など) をして、下記のようにCompleteになったことを確認

(7)Torrent Browser / Plan画面で目的のテンプレートが追加されたことを確認

Torrent Serverが外部ネットワークに接続していない場合

(2)Torrent Browser / Plan画面で下記リンクをクリック

(1)AmpliSeq Designer の設計済みのカスタムパネルの画面か、又は IonPanels画面からzipファイルダウンロード

同じPC,同じブラウザで最近AmpliSeq Designerにログインした場合はこの画面が表示されません。

Select Fileから、(1)でダウンロードしたzipファイルを選択してUpload

(3)Torrent Browser / Plan画面で目的のテンプレートが追加されたことを確認

www.lifetechnologies.com/seminarsjp

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研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。

All products mentioned in this presentation are for Research Use Only, not intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use.

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