2019-02-24

1

Inżynieria genetyczna- 6 ECTS

Część I• Badanie ekspresji genów• Kolokwium (14pkt)

Część II• Podstawy klonowania

i różnicowania transformantów• Klonowanie ekspresyjne• Od genu do białka• Kolokwium (26pkt)

EGZAMIN 55pktbonus: 5pkt

DNAmRNAbiałko

• Informacje o ekspresji genów• Informacje o odpowiedzi komórkowej na zadany czynnik• Informacje o produkcji białka (nie zawsze)• Dokładna liczba kopii genu• Wykrywanie kopii wirusów i patogenów• Wykrywanie metylacji DNA• Wykrywanie mutacji

Rodzaje reakcji ABSOLUTE QUANTIFICATION• Krzywa standardowa• Standardem musi być dobrze mianowany roztwór patogenu• Reakcja najczęściej stosowana do obliczania ilości kopii wirusów• W przypadku posiadania krzywych uniwersalnych również

bakterii

RELATIVE QUANTIFICATION• Krzywa standardowa• Standardem jest wielokrotnie rozcieńczana matryca• Reakcja najczęściej stosowana do badania ekspresji genów

2019-02-24

2

RQ-ANALIZA EKSPRESJI

Reakcja Real-Time PCR

Analiza wyników

Izolacja RNA

Odwrotna transkrypcja

ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR

Reakcja amplifikacji DNA na matrycy RNA- odwrotnatranskrypcja (Reverse Transcription)

• enzym używany w reakcji RT-PCR to odwrotna transkryptaza• powstały DNA jest komplementarny do RNA i nazywany jest

cDNA (complementary DNA)• w badaniu ekspresji genów cDNA powinien powstawać na

matrycy mRNA• cząsteczki mRNA (w przeciwieństwie do rRNA) są w naturalny

sposób zakończone „ogonkami poliadeninowymi” AAAAAAAAdołączanymi w czasie transkrypcji za kodonem STOP

ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR

• Obecność ogonkówpoliadeninowych (poli-A)jest wykorzystana jakonaturalne miejscewiązania ze starterami„oligo dT” (dTTP)<TTTTTTTT>

2019-02-24

3

ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR

• w reakcji RT- PCR na jednej kopii RNA powstaje jedna kopiacDNA!

Startery typu Oligo dT to:o oligonukleotydy składające się zazwyczaj z 24 nukleozydów

zawierających tyminę. Przyłączają się one do ogonków poli-Aw mRNA

LUBo oligonukleotydy składające się z 23 reszt tyminowych i

dodatkowego nukleotydu kotwiczącego A, C lub G, w tensposób ich przyłączenie następuje przy fragmencie łączącymogonek poli-A z 3’ UTR

ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR

Startery typu „random hexamer” to:o mieszanina oligonukleotydów reprezentująca wszystkie

możliwe kombinacje sześcionukleotydowe

Oligo dT Random HexamerStosowane jedynie dla organizmóweukariotycznych i retrowirusówzawierających ogonki Poli-A

Stosowane dla wszystkich organizmów

Tylko dla mRNA Dla wszystkich rodzajów RNAPrzydatne przy krótkich fragmentach,zwłaszcza zlokalizowanych przy 3’ końcumRNA

Przydatne przy długich fragmentach RNA(>2000pz) oraz przy RNA o słabej jakości

ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR

www.thermofisher.com

2019-02-24

4

ODWROTNA TRANSKRYPCJA- RT PCR

Czy można stosować proteinazę K podczas izolacji RNA?

Czy izolując RNA można wyizolować DNA? Kiedy? Dlaczego?

Jak można pozbyć się DNA z izolatu RNA? Na jakim etapie?

Czy wyizolowany podczas ekstrakcji DNA może mieć wpływna wydajność reakcji RT PCR?

Czy można sprawdzić wydajność reakcji RT PCR przy pomocyelektroforezy?

Rodzaje technik wyzwalania świecenia

Rodzaje technik wyzwalania świecenia

wydłużanie

5’ 3’

5’3’

Wzbudzenie świecenia

5’ 3’

5’3’

Taq

Taq

3’

5’3’

Taq

Taq

Brak świecenia po denaturacji

ID ID

ID IDID

ID ID ID

ID ID

λ λ λ

λλ

ID ID

ID ID

www.biorad.com

2019-02-24

5

Rodzaje technik wyzwalania świecenia

5’ 3’

RQ

5’ 3’

TaqQ

R

5’ 3’

Q Taq

R

5’

5’ 3’

TaqR

5’

5’ 3’

TaqR

5’

λ

Wydłużanie

Hydroliza sondy

Wzbudzenie świecenia

www.biorad.com

Filtr 1 2 3 4 5

Fluorochrom •FAM•SYBRGreen

•JOE•VIC

•TAMRA•NED•Cy3

•ROX•Texas Red

•Cy5

SPEKTRA

Wykładnicza◦ Jeżeli wydajność reakcji wynosi 100%– to każda z dwóch nici matrycy

jest podstawą do replikacji; najwyższa precyzja i specyficznośćpowielania

Liniowa◦ Zmienna. Matryca zaczyna ulegać rozpadowi i wydajność reakcji

zaczyna się pogarszać

Plateau◦ Reakcja zatrzymuje się, a przeprowadzana dalej będzie degradować

wytworzone produkty

Fazy reakcji PCR

2019-02-24

6

[DNA]

Cykl #

PCR phases in linear view

Wykładnicza

Liniowa

Plateau

Fazy reakcji PCR

liniowo logarytmicznie

Fazy reakcji PCR

NUMER CYKLU LICZBA KOPII DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512

10 1 02411 2 04812 4 09613 8 19214 16 38415 32 76816 65 53617 131 07218 262 14419 524 28820 1 048 57621 2 097 15222 4 194 30423 8 388 60824 16 777 21625 33 554 43226 67 108 86427 134 217 72828 268 435 45629 536 870 91230 1 073 741 82431 1 400 000 00032 1 500 000 00033 1 550 000 00034 1 580 000 000

0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

1400000000

1600000000

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR CYCLE NUMBER

AM

OU

NT

OF

DN

A

2019-02-24

7

Z założenia replikacji semikonserwatywnej = 2

◦ Przy założeniu powstawania niespecyficznej długościamplikonóww pierwszych cyklach lub obecności inhibitorów reakcji < 2

◦ Przy uwzględnieniu produktów „nieprzewidzianych”(niespecyficzne wiązanie starterów, primer-dimer) >2

◦ Zoptymalizowanie reakcji wymaga wykonania krzywejstandardowej

Wydajność reakcji PCR

◦ Krzywa standardowa pokazuje zależność pomiędzypoczątkową ilością (liczbą kopii) lub koncentracją matrycya ilością otrzymanego produktu reakcji

◦ Najczęściej jest to regresja liniowa(na danych zlogarytmowanych)

◦ Y=bX+a, której współczynnik (b) określa wydajność reakcji

◦ b- współczynnik regresji (określa poziom nachylenia krzywej)◦ a- stała (określa punkt przecięcia z osią y – stężenie lub liczbę

kopii matrycy która jest niewystarczająca do otrzymaniaproduktu PCR

Wydajność reakcji PCR

Cykl Moja Wasza

23 250 000 1 000 000

24 500 000 2 000 000

25 1 000 000 4 000 000

Wydajność reakcji PCR

2019-02-24

8

Wydajność reakcji PCR

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Wydajność reakcji PCR

Cykl Moja Ich

25 1 000 000 125 000

26 2 000 000 250 000

27 4 000 000 500 000

28 8 000 000 1 000 000

Wydajność reakcji PCR

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

2019-02-24

9

Wydajność reakcji PCR

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

2325

28

CT (threshold cycle)= CP (crossing point)= Cq (quantification cycle)

0,251

Treshold line

CT values: 23; 25; 28

threshold

CT

1mln

100tys10tys

1tys100

101

Krzywa standardowa reakcji PCR

WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- wydajność reakcji

powtórzenie Quantity Log Cq MCq Diff1 10 1 21,372 10 1 22,053 10 1 21,854 10 1 21,925 10 1 21,666 10 1 21,83 21,78 3,541 100 2 17,572 100 2 18,433 100 2 18,254 100 2 18,275 100 2 18,046 100 2 18,89 18,24 3,391 1000 3 14,162 1000 3 15,053 1000 3 14,914 1000 3 14,945 1000 3 14,836 1000 3 15,22 14,85 2,841 10000 4 11,732 10000 4 12,003 10000 4 12,104 10000 4 12,135 10000 4 11,776 10000 4 12,32 12,01

Wzr

ost r

ozci

eńcz

enia

pró

bek

y = -3,2705x + 24,897R² = 0,991

0

5

10

15

20

25

0 1 2 3 4 5

Cq

Cq

Liniowa (Cq)

E=10(-1/nachylenie krzywej)

2019-02-24

10

WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- wydajność reakcji

E=10(-1/nachylenie krzywej)

1,89

1,91

1,93

1,95

1,97

1,99

2,01

2,03

2,05

2,07

2,09

2,11

2,13

-3,70 -3,60 -3,50 -3,40 -3,30 -3,20 -3,10 -3,00

nachylenie krzywej

wyd

ajno

ść

Maksymalnawydajność = 2

Maksymalna wydajność reakcjiodpowiada wartości nachyleniakrzywej z przedziału 3,1-3,6

3,3210 000 1 000 (2,84)1000 100 (3,39)100 10 (3,54)

Krzywa

Intercept – punktprzecięcia z osią y

Współczynnik nachylenia(informuje o wydajnościreakcji)

R2 – współczynnikdeterminacji(miara dopasowaniaoszacowanego modeluliniowego do zmiennej)

Ef=10(-1/nachylenie krzywej)

1,89

2,09

WYDAJNOŚĆ REAKCJI PCR

2019-02-24

11

2,21

2,17

Ef=10(-1/nachylenie krzywej)

WYDAJNOŚĆ REAKCJI PCR

WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- co jest potrzebne?

UDANE DOŚWIADCZENIE: specyficzne startery do genu badanego specyficzne startery do genu referencyjnego cDNA o znanej i określonej koncentracji odrobina RNA/DNA bardzo czysta woda zoptymalizowane warunki pracy: miejsce/ pipety/ plastiki/ czas APARAT do RealTime-PCR

UDANA ANALIZA: zoptymalizowane warunki reakcji duża liczba powtórzeń reakcji- wszystkie obliczenia mają charakter statystyczny!!! znana wydajność reakcji dla wszystkich genów

2019-02-24

12

Real Time PCR

Real Time PCR

Przebieg reakcji

• 50˚C, 2 min - 1x• 95˚C, 10 min - 1x• 95˚C, 15 s

60˚C, 1 min - 40x

2019-02-24

13

NORMALIZACJA W BADANIU EKSPRESJI GENÓW

1. Normalizacja jakości izolatu RNA- w wyizolowanych próbach brak DNA

2. Normalizacja ilości (i jakości) RNA przepisywanego na cDNA

do przepisania należy wziąć tyle samo RNA z każdej próby

jakość (integralność) RNA wszystkich przepisywanych prób powinna być

taka sama

ta sama ilość przy różnej jakości będzie fałszować wynik reakcji RT PCR

3. Normalizacja ilości cDNA- każda próba analizowana w reakcji Real Time PCR

powinna zawierać tę samą ilość matrycy

optymalna koncentracja dobierana jest w krzywej standardowej

4. Normalizacja wyniku reakcji PCR- każdą reakcję PCR należy powtórzyć

minimum trzykrotnie z tą samą matrycą na tej samej płytce!

KONTROLE W BADANIU EKSPRESJI GENÓW

1. NTC – wszystkie reagenty oprócz matrycy

2. -RT- wszystkie reagenty, matrycą jest RNA nieprzepisany na cDNA

3. Pasywna referencja (tylko dla wybranych termocyklerów)- substancja

dodana do KAŻDEJ próbki, która wykazuje stały poziom świecenia np. ROX

4. NAC- wszystkie reagenty z inhibitorem reakcji zamiast matrycy

pasywna referencja

2019-02-24

14

spektra

Początek reakcji Koniec reakcji

FAM FAMROX ROX

wykres amplifikacji

wykres amplifikacji

2019-02-24

15

WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW- powtórki reakcji!

NAJCZĘSTSZE PROBLEMY W BADANIU EKSPRESJI GENÓW

Zła matryca + niespecyficzne startery= katastrofa!

Krzywa topnienia- denaturacja produktu reakcji PCR- pokazuje specyficznośćstarterów i zoptymalizowanie przebiegu reakcji- tylko dla reakcji z SYBR green!

Reakcja OK- startery o tej samej temperaturzetopnienia- brak niespecyficzności

Problem - startery o różnej temperaturze topnienia-brak niespecyficzności

Problem - startery o tej samej temperaturzetopnienia + primer-dimer

Problem - startery o tej samej temperaturzetopnienia + primer-dimer + produkt niespecyficzny

Względna różnica poziomu ekspresji badanego genu (T-target) i genukontrolnego, referencyjnego (R-reference), znormalizowana względem„kalibratora”. Wynik to wielokrotność ekspresji kalibratora.

WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW

2019-02-24

16

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

-1000

0

1000

2000

3000

4000

5000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45

referencja

WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW-ΔΔCq

Tkanka traktowana

Tkanka nietraktowana

Gen badany

HKG

2019-02-24

17

Geny kontroli endogennej- referencyjnej

• Prezentowane są we wszystkich badanych tkankach• Powinny mieć zawsze stały poziom ekspresji

Kalibratory• Geny, z których ekspresją będzie bezpośrednio

porównywany badany gen• Kontrola endogenna może być również kalibratorem!

Wybór kontroli endogennej

2019-02-24

18

Wybór kontroli endogennej

WZGLĘDNA (RELATYWNA) ANALIZA EKSPRESJI GENÓW

KALIBRATOR

Tkanka nietraktowana

Tkanka na początkueksperymentu

Inny gen

Uśredniona ekspresja genubadanego lub innego

Gen referencyjny lubuśredniona ekspresja wielu

Uniwersalna krzywakalibracyjna

GEN REFERENCYJNY

GAPDH

βAktyna

Cyklofilina

RPLPO

18sRNA

Wiele innych

ANALIZA EKSPRESJI- jeden gen/ jedna tkanka*/ różne rodzaje traktowania

Tkanka traktowana 1 Tkanka nietraktowana

Tkanka traktowana 2

Tkanka traktowana nOBSZAR BADANEGO GENU

Tkanka traktowana 1 Tkanka nietraktowana

Tkanka traktowana 2

Tkanka traktowana nOBSZAR GENU REFERENCYJNEGO- HKGhousekeeping gene

K

T

T

T

R

R

R

R

2019-02-24

19

ANALIZA EKSPRESJI- wiele genów/ jedna tkanka/ różne rodzaje traktowania

Tkankatraktowana 1-G1 Tkanka nietraktowana-G1

OBSZAR BADANYCH GENÓW

Tkanka traktowana 1 Tkanka nietraktowana

Tkanka traktowana 2

Tkanka traktowana nOBSZAR GENU REFERENCYJNEGO- HKG

Tkankatraktowana 2-G1

Tkankatraktowana n-G1

Tkankatraktowana 1-G2

Tkankatraktowana 2-G2

Tkankatraktowana n-G2

Tkanka nietraktowana-G2

ANALIZA EKSPRESJI- jeden gen/ wiele tkanek/

Tkanka 1

Tkanka 2

Tkanka nOBSZAR BADANEGO GENU

Tkanka 1

Tkanka 2

Tkanka nOBSZAR GENU REFERENCYJNEGO- HKG

ANALIZA EKSPRESJI- wiele genów/ wiele tkanek/

Tkanka 1-G1

OBSZAR BADANYCH GENÓW

Tkanka 1

Tkanka 2

Tkanka nOBSZAR GENU REFERENCYJNEGO- HKG

Tkanka 2-G1

Tkanka n-G1

Tkanka 1-G2

Tkanka 2-G2

Tkanka n-G2