Heteroduplex Heteroduplex mobility assay
description
Transcript of Heteroduplex Heteroduplex mobility assay
HeteroduplexHeteroduplex mobility assay
Biotechnologia III rokSylwia BorkowskaMałgorzata Gawlik
Piotr Gawroński
Definicja
Heteroduplex jest dwuniciową molekułą kwasu nukleinowego powstającą podczas rekombinacji homologicznej z pojedynczych komplementarnych nici, pochodzących z różnych źródeł, np. z dwóch homologicznych chromosomów, czy nawet z dwóch różnych organizmów.
Jednym takim przykładem jest heteroduplexowe DNA tworzone w czasie hybrydyzacji materiałów genetycznych organizmów w celu ustalenia ich pokrewieństwa czy pochodzenia ( badania filogenetyczne).
Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji:(w kompleksie synaptonemalnym podczas
koniugacji poprzedzającej mejotyczny crossing-over )
Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji:
● Heteroduplexy powstające in vivo w czasie rekombinacji umożliwiają wymianę genów, a przez to także naprawę uszkodzonych jednostek .
Zastosowania
●badania filogenetyczne●analizy epidemiologiczne, np odnośnie Cryptosporidium wyizolowanych od ludzi i zwierząt●badania screeningowe dotyczące wielu groźnych wirusów: HIV-1, WZW typu C, enterowirusów, w celu identyfikacji ich podtypów●wykrywanie mutacji głównie punktowych i chorób genetycznych z nimi związanych (można analizować tylko krótkie odcinki kwasów nukleinowych, bo przeważnie na wstępie stosuje się PCR, nie wykryjemy tą metodą mutacji chromosomowych i genomowych).
Podstawowe założenie:
● Nici DNA tworzące Heteroduplexy różnią się od siebie pewnymi sekwencjami i nie tworzą tak stabilnych układów jak homoduplexy, czyli molekuły dwuniciowego DNA komplementarne do siebie.
Chcąc wykryć w mieszaninie, po reakcji PCR, Heteroduplexy (odróżnić je od homoduplexów)
możemy posłużyć się się metodami:
● DGGE- (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)- elektroforeza w żelu z gradientem denaturującym, która jest najdokładniejsza- ma 95 % skuteczność, ale i najdroższa ●mismatch cleavage (rozłupywanie się niedopasowań)●DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)- Szybka chromatografia w roztworze denaturującym
Opis DHPLC przy wykrywaniu mutacji
Szybka chromatografia w roztworze denaturującym
DHPLC● mieszanina po reakcji PCR zawierająca DNA wzorca-
niezmutowane i DNA organizmu badanego- potencjalnie obarczone mutacją)
● Denaturacja (podgrzanie)
● Renaturacja (ochłodzenie)
● tworzą się homo- i heteroduplexy
DHPLC● Rozdział Hetero- od Homoduplexów jest osiągany poprzez
działanie częściowo denaturujących czynników (temp. 57 °C)● Rejestrowane są mikronapięcia towarzyszące przechodzeniu przez
urządzenie cząsteczek DNA
DHPLC
● DNA jednoniciowe będzie pochodziło z heteroduplexów i jeżeli zostanie wykryte przez detektor w odpowiednio wysokim stężeniu, będzie to świadczyło o mutacji w obrębie DNA badanego
● Jeśli DNA organizmu badanego będzie homozygotą pod wzlędem mutacji, to otrzymamy największy udział Heteroduplexów w mieszaninie po PCR, a stężenie nici pojedynczych wykrytych podczas DHPLC będzie wysokie,
● W przypadku heterozygotyczności pod względem mutacji DNA badanego otrzymamy mniejsze stężenie pojedynczych nici i dlatego dobrze jest wtedy powtórzyć DHPLC bez obecności wzorca-nie jest ona wymagana, bo DNA badane jest Heteroduplexem
● brak mutacji-brak heteroduplexów.
Wynik DHPLC
● DHPLC detection of mutation in the Fanconi anemia gene, exon-4 in Ashkenazi population.
Źródła informacji:
● NCBI● Wikipedia