diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics

2012 • Volume 48 • Number 1 • 41-49

Praca oryginalna • Original Article

41

HE4 i CA 125 - porównanie metod oznaczeń

HE4 and CA 125 – comparison of determination methods

Jan Kanty Kulpa, Ewa Wójcik, Urszula Rychlik, Krystyna Sobolewska, Jadwiga Tarapacz

Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej, Centrum Onkologii – Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie

StreszczenieNiska swoistość diagnostyczna wyników oznaczeń CA 125 ogranicza możliwości wykorzystania badań tego markera w dia-gnostyce raka jajnika, szczególnie w różnicowaniu tego nowotworu ze zmianami niezłośliwymi. Obecnie duże możliwości po-prawy efektywności diagnostyki różnicowej wiąże się z oznaczeniami antygenu HE4. Celem podjętych badań było porównanie dwóch metod oznaczeń tych markerów. Badania porównawcze przeprowadzono w próbkach surowic pochodzących od 30 zdrowych kobiet i 88 chorych na raka jajnika w różnych stadiach zaawansowania, przed i w trakcie leczenia. Wyniki oznaczeń CA 125 uzyskiwane z analizatora cobas e411 i przeznaczonych do niego zestawów odczynnikowych są istotnie niższe aniżeli uzyskiwane z analizatora Architect i1000. Nie stwierdzono natomiast istotnych różnic pomiędzy oboma systemami pomiaro-wymi w wynikach oznaczeń stężenia antygenu HE4. Użyteczność diagnostyczna wyników oznaczeń CA 125 obu systemami pomiarowymi jest zbliżona, natomiast obserwuje się tendencję do wyższej użyteczności oznaczeń antygenu HE4 przy użyciu analizatora cobas e411.

SummaryLow diagnostic specificity of CA 125 results limits the use of this marker in the diagnostics of ovarian cancer, especially in dif-ferentiating this neoplasm from benign tumors. Currently a great potential to improve the differential diagnostics is associated with HE4 antigen determinations. The aim of presented study was the comparison of determination methods of both markers. The comparative studies were carried out in serum samples from 30 healthy women and 66 patients with ovarian cancer in different stages of disease, before and during treatment. The results of CA 125 obtained from the analyzer cobas e411 and reagent kits for use on this analyzer were significantly lower than those obtained from the analyzer Architect i1000. There were no significant differences between the concentrations of HE4 obtained from both analytical systems. The diagnostic utility of CA 125 determinations from both analytical systems is similar, but there is observed a tendency to higher HE4 diagnostic utility results obtained with the use of cobas e411 analyzer. However reliable assessment can be made in a much more numerous group of serum samples from both healthy women and ovarian cancer patients.

Słowa kluczowe: CA 125, HE4, zestawy odczynnikowe, analizatory immunochemiczne, porównanie wyników

Key words: CA 125, HE4, reagent kits, immunochemical analyzers, comparison results

WstępRak jajnika to jeden z poważnych problemów współczesnej onkologii. Od szeregu lat obserwuje się tendencje do wzro-stu zachorowań, a pomimo doskonalenia metod leczenia śmiertelność z powodu tego nowotworu nadal pozostaje wysoka. W 2005 r. zarejestrowano w Polsce 3355 nowych zachorowań i 2357 zgonów z powodu raka jajnika [1]. Ponad 90% przypadków raka jajnika stanowią nowotwory nabłon-kowe, cechujące się znacznym zróżnicowaniem typów hi-stologicznych [2]. Wysokie wskaźniki śmiertelności wiązane są w znacznej mierze z faktem rozpoznawania nowotworu u ok. 70 % chorych w zaawansowanych stadiach choroby, dla których wskaźniki przeżyć 5-cio letnich kształtują się na

poziomie poniżej 30% [3]. Istotny postęp w diagnostyce raka jajnika przyniosło wdrożenie do praktyki oznaczeń antyge-nu nowotworowego 125 (carcinoma antigen 125 – CA 125), po raz pierwszy opisanych przez Bast i wsp. w 1983 r. [4]. Antygen jest heterogenną mieszaniną, o wysokim ciężarze cząsteczkowym, glikoprotein błon komórkowych, której epi-topy reagują swoiście z mysimi przeciwciałami monoklonal-nymi OC125 i M11. Jego ekspresję stwierdza się w wielu komórkach nabłonkowych, a obecność w krwiobiegu wy-kazano w różnych nowotworach złośliwych, a szczególnie w raku jajnika [5, 6]. U 99% zdrowych kobiet stężenie CA 125 nie przekracza 35 U/ml [4]. Czułość diagnostyczna wyników oznaczeń CA 125 u chorych na raka jajnika jest oceniana

HE4 i CA 125 - porównanie metod oznaczeń

42

na 70 – 80%, jednak swoistość diagnostyczna jest relatyw-nie niska i wynosi ok. 40%, podwyższone stężenia markera spotyka się w szeregu nowotworów o innej lokalizacji, zmia-nach niezłośliwych, zwłaszcza u kobiet przed menopauzą, a także w niektórych chorobach o innej etiologii [7]. Zbyt ni-ska czułość i swoistość diagnostyczna oraz dodatnia wartość predykcyjna u chorych we wczesnych stadiach raka jajnika (FIGO I) wyklucza możliwość wykorzystania oznaczeń CA 125 jako samodzielnego testu w badaniach przesiewowych. Jednak rozważa się możliwość wykorzystania w tym celu badań antygenu łącznie z badaniem ulstrasonograficznym oraz fizykalnym [8, 9]. O ile powszechnie jest akceptowana użyteczność oznaczeń CA 125 w monitorowaniu chemio-terapii chorych na raka jajnika, to opinie odnośnie wartości prognostycznej tego markera są niejednoznaczne [7, 10]. Jedną z sugerowanych możliwości poprawy efektywności diagnostyki raka jajnika stanowi wskaźnik RMI (risk of ma-lignancy index), wyliczany na podstawie stężenia CA 125 oraz punktowej skali informacji wyznaczonych na podstawie badania USG i oceny stanu hormonalnego badanych ko-biet [11]. Jakkolwiek wartości RMI cechuje wyższa czułość i swoistość diagnostyczna, a także ujemna i dodatnia war-tości predykcyjnej w porównaniu z CA 125, to nie uzyskano w ten sposób radykalnej poprawy efektywności diagnostyki różnicowej raka i zmian niezłośliwych jajnika [12]. Podejmo-wane próby weryfikacji użyteczności diagnostycznej szere-gu innych markerów nie dały satysfakcjonujących rezultatów [13, 14]. Dopiero obecnie pojawił się marker, budzący duże nadzieje na wyraźną poprawę wydolności diagnostyki róż-nicowej i wykrywania raka jajnika we wczesnych stadiach zaawansowania, jest to glikoproteina typu 4 (HE4), której ekspresja w komórkach najądrzy wiązana jest z procesami spermatogenezy [15]. Nadekspresję tego białka wykazano w komórkach szeregu nowotworów złośliwych, w tym szcze-gólnie w komórkach raka jajnika [16, 17]. Białko HE4 jest uwalniane do krążenia i wykazano, że podwyższone jego stężenie spotyka się u znacznego odsetka chorych na raka jajnika, natomiast znacznie rzadziej aniżeli podwyższone stężenia CA 125 u chorych z niezłośliwymi zmianami w jaj-nikach [18].Celem podjętych badań było porównanie wyników oznaczeń HE4 i CA 125 wykonanych przy użyciu zestawów odczyn-nikowych i automatycznych analizatorów immunochemicz-nych pochodzących od dwóch firm.

Materiał i metody Oznaczenia HE4 i CA 125 wykonywano zestawami odczyn-nikowymi produkcji Abbott Laboratories oraz Roche Diagno-stics na analizatorach immunochemicznych odpowiednio Architect i1000 i cobas e 411. Wyniki oznaczeń obu mar-kerów przy użyciu zestawów odczynnikowych i analizatora Architect i1000 ze względu na ich rutynowe stosowanie, przyjęto jako układ odniesienia. Pierwszy etap badań obej-mował ocenę precyzji i dokładności oznaczeń HE4 i CA 125 na dwóch analizatorach. Wykorzystano w tym celu kalibra-

tory i materiały kontrolne dostarczone przez producentów odczynników. Kalibratory firmy Abbott Diagnostics przygoto-wane w roztworze buforu fosforanowego i albuminy bydlęcej z dodatkiem środka konserwującego ProClin 300 zawierają odpowiednio dla HE4 antygen o stężeniach 0, 30, 100, 250, 750 i 1500 pmol/l i są wystandaryzowane względem stan-dardów Fujirebio Diagnostics, Inc., zaś dla CA 125 o stęże-niach: 0, 20, 75, 225, 500 i 1000 U/ml. Próbki kontrolne są monoparametryczne i zawierają pochodzące z ludzkich linii komórkowych antygeny rozpuszczone w sztucznej matrycy z dodatkiem środków konserwujących (bufor TRIS i albu-mina wołowa). Kalibratory do oznaczeń HE4 w zestawach odczynnikowych firmy Roche Diagnostics zawierające anty-gen - pochodzący z linii komórkowej OvCar-3 raka jajnika - o stężeniach 4,24 pmol/l i 189,0 pmo/l, również wystandary-zowane są względem standardów Fujirebio Diagnostics ,Inc, i przygotowane w postaci liofilizowanej w matrycy białkowej, którą stanowi surowica końska. Kalibratory do oznaczeń CA 125 o stężeniach 33,20 U/ml i 495,0 U/ml wystandaryzowa-ne względem CA 125 II RIA firmy Fujirebio Diagnostics, przy-gotowane są natomiast w surowicy ludzkiej i dostarczane w postaci ciekłej. Próbki kontrolne są przygotowane w po-staci liofilizowanej; do oznaczeń HE4 wykorzystano Preci-Control HE4 1 i 2, zawierający badany antygen w ludzkiej surowicy, a do oznaczeń CA 125 wykorzystano wielopara-metrowy materiał kontrolny „PreciControl Tumor Marker 1 i 2” przygotowany również w ludzkiej surowicy. Badanie precyzji dla obu markerów przeprowadzono zgod-nie z wytycznymi protokołu CLSI, oznaczając stężenie an-tygenu w próbkach o dwóch różnych poziomach, 2-krotnie w ciągu jednego dnia, w co najmniej 2 godzinnych odstę-pach czasu, w dwóch powtórzeniach i przez 5 kolejnych dni (n + 20) [19]. W ocenie poprawności wyników oznaczeń oceniono stopień zgodności pomiędzy średnim stężeniem uzyskanym z 20 oznaczeń surowicy kontrolnej, a wartością metrykalną (stężeniem podanym przez producenta).Oznaczenia porównawcze HE4 i CA 125 wykonano na dwóch analizatorach w 118 próbkach surowicy, pozostałych po wykonaniu badań zleconych przez lekarzy, pochodzą-cych od zdrowych osób (N=30) oraz chorych na raka jajnika (N=88) zarówno przed jak i w trakcie leczenia chemicznego (I i II rzutu). W opracowaniu wyników korzystano z pakietów statystycz-nych MedCalc oraz StatSoft 9,0. Dla oceny zależności po-między wynikami oznaczeń wykonywanymi na obu analizato-rach posłużono się rachunkiem korelacji wg Person i analizy regresji metodą Passing i Bablok. Uzupełnienie obliczeń w tym zakresie stanowiła porównawcza ocena graficzna uzy-skanych wyników wg Bland i Altman oraz „mountain plot” [20, 21, 22]. W ocenie istotności różnic pomiędzy wynikami na obu analizatorach korzystano z testu t dla par zależnych, na-tomiast w weryfikacji użyteczności diagnostycznej wyników oznaczeń obu markerów na dwóch różnych analizatorach wykorzystano krzywe ROC (Receiver Operating Characteri-stics) i ocenę istotności różnic pól powierzchni pod nimi.

43

WynikiWyniki precyzji i poprawności oznaczeń stężenia antygenów HE4 i CA 125 na analizatorach cobas e411 i Architect i1000 przedstawiono w tabeli I. Uzyskane współczynniki zmienno-ści dla obu systemów pomiarowych (zestawy odczynniko-we i analizatory immunochemiczne) i ocenianych markerów były niższe od 5%. Poprawność wyników oznaczeń HE4 na analizatorze cobas e411 była nieznacznie lepsza aniżeli na analizatorze Architekt i1000, natomiast dla oznaczeń CA 125 na obu analizatorach była bardzo zbliżona i wysoce sa-tysfakcjonująca.Wyniki wykonywanych równoczasowo na obu analizato-rach oznaczeń HE4 i CA 125 w badanych próbkach surowic

stężenia przedstawiono w tabeli II. O ile stężenia CA 125 oznaczane na analizatorze cobas e411 były istotnie niższe aniżeli na analizatorze Architect i 1000, to nie stwierdzano istotnych różnic w poziomach HE4. Współczynnik korelacji dla zależności pomiędzy wynikami oznaczeń HE4 na obu porównywanych systemach pomiarowych wynosił 0,9939, a równanie regresji prostoliniowej przedstawiało się nastę-pująco HE4[cobas 411]=20,32+0,902 HE4 [Architect i1000] (ryc. 1). Dla CA 125 współczynnik korelacji opisujący zależność pomię-dzy wyniki oznaczeń uzyskanymi z obu systemów był rów-nież wysoki i wynosił 0,9935, a równanie regresji wynosiło: CA 125(cobas 411)=20,02+0,746 CA 125 (Architect i1000) (ryc. 2).Ze względu na znaczne różnice w stężeniach obu markerów

Tabela I.Wyniki precyzji i poprawności oznaczeń HE 4 i CA 125 na analizatorze cobas e411 i Architect i 1000.

Precyzja Poprawność

Próbka kontrolna Wartość nominalna

średnia min max SD CV% bias % bias

Cobas e411

PC1 HE4 48,8 47,505 44,30 51,50 2,005 4,220 - 1,295 - 2,66

PC2 HE4 358,0 358,935 335,40 378,80 13,520 3,767 0,935 0,26

TM1 CA 125 34,3 34,971 33,69 36,65 0,706 2,019 0,671 1,96

TM2 CA 125 86,5 86,584 84,53 89,75 1,515 1,750 0,084 0,10

Architect i1000

L HE4 50,0 47,505 44,30 51,50 2,005 4,220 - 2,495 - 4,99

H HE4 700,0 648,460 620,30 696,20 21,723 3,350 - 51,54 -7,36

L CA 125 40,0 39,421 34,34 42,69 1,867 4,736 - 0,579 - 1,45

H CA 125 300,0 299,886 262,58 328,15 12,648 4,218 - 0,114 - 0,04

Tabela IIPorównanie oznaczeń HE 4 i CA 125 na Analizatorze cobas e411 i Architect i 1000- wyniki testu t dla par zależnych.

analizator N Mediana zakres wahań średnia SD p

HE4 Architect i1000 118 69,85 26,1 – 3856,7 291,05 547,19 N.S

HE4 cobas e411 118 80,83 32,46 – 3394,00 282,96 496,81

CA 125 Architect i1000 118 86,09 3,75 – 2199,59 221,53 380,00 0,0002

CA 125 cobas e411 118 76,80 4,09 – 1595,0 185,17 285,15

Rycina 1.Zależność pomiędzy wynikami oznaczeń HE 4 (pmol/ml) na analiza-torze Architect i1000 i cobas e411.

Rycina 2. Zależność pomiędzy wynikami oznaczeń CA 125 (U/ml) na analiza-torze Architect i1000 i cobas e411.

HE4 i CA 125 - porównanie metod oznaczeń

44

w badanych próbkach surowic dokonano analizy wyników w trzech podgrupach wyodrębnionych dla węższych zakre-sów stężeń (A, B, C). Dla HE4: podgrupa A zawierała próbki o stężeniach w zakresie 20 do 90 pmol/l, podgrupa B - 90,1 do 500 pmol/l i podgrupa C wyższe od 500 pmol/l. W pod-grupie A (N=71) obserwowano liniową zależność pomiędzy

wynikami oznaczeń HE4 uzyskanymi z obu analizatorów, współczynnik nachyleniowy równania regresji wynosił 1,054. W tej podgrupie wyniki uzyskane na analizatorze cobas e411 były istotnie wyższe (p=0,027) aniżeli z analizatora Architect i1000 (ryc. 3. A1). Analiza graficzna wg Bland i Altman nie wykazała jednak istotnych zależności wartości średniej par

Ryc

ina

3.

Por

ówna

nie

ozna

czeń

HE

4 na

ana

lizat

orze

Arc

hite

ct i1

000

i cob

as e

411.

A -

zakr

es s

tęże

ń: 2

0 –

90 p

mol

/l; B

– z

akre

s st

ężeń

: 90,

1 –

500

pmol

/l; C

- za

kres

stę

żeń:

500

,1 –

386

0 pm

ol/l;

ko

lum

na: 1

– ró

wna

nie

regr

esji

wg

Pas

sing

i B

ablo

k; 2

– w

ykre

s ró

żnic

wg

Bla

nd i

Altm

an; 3

– p

erce

ntyl

owy

rozk

ład

różn

ic –

„mou

ntai

n pl

ot”.

45

wyników oznaczeń HE4 na obu systemach pomiarowych w poszczególnych próbkach surowic względem różnicy ich stężeń; współczynnik nachyleniowy dla równania opisują-cego tę zależność (-0,066) był bliski zeru (ryc. 3. A2). Per-centylowy rozkład różnic pomiędzy wynikami oznaczeń HE4 uzyskanymi na analizatorze cobas e411 i Architect i1000

oceniany metodą „mountain plot „ cechował się znaczną sy-metrycznością, przy medianie wynoszącej -5,92 pmol/l 95% percentylowy zakres różnic wahał się jednak w szerokim przedziale od -19,36 do 5,13 (ryc. 3. A3).W podgrupie B (N=30) - stężenia HE4 od 90,1 do 500 pmo-l/l - zależność pomiędzy wynikami oznaczeń uzyskanymi

Ryc

ina

4.

Por

ówna

nie

ozna

czeń

CA

125

na a

naliz

ator

ze A

rchi

tect

i100

0 i c

obas

e41

1. A

- za

kres

stę

żeń:

0 –

100

U/l;

B –

zak

res

stęż

eń: 1

00,1

– 5

00 U

/l; C

- za

kres

stę

żeń:

500

,1 –

220

0 U

/l;

kolu

mna

: 1 –

rów

nani

e re

gres

ji w

g P

assi

ng i

Bab

lok;

2 –

wyk

res

różn

ic w

g B

land

i A

ltman

; 3 –

per

cent

ylow

y ro

zkła

d ró

żnic

– „m

ount

ain

plot

”.

HE4 i CA 125 - porównanie metod oznaczeń

46

na obu analizatorach wykazywała również charakter linio-wy, współczynnik nachyleniowy równania regresji wynosił 0,910 (ryc. 3. B1). W tej podgrupie nie stwierdzano istotnych różnic pomiędzy stężeniami HE4 oznaczonymi na obu ana-lizatorach. Nie obserwowano również istotnych zależności pomiędzy wartościami średnimi par wyników z obu analiza-torów a różnicą stężeń HE4 uzyskanych z analizatora Ar-chitect i1000 i cobas e411, dla tak utworzonych zmiennych współczynnik nachyleniowy równania regresji był bliski zera (ryc. 3. B2). Ten układ potwierdza także symetryczność wy-kresu „monutain plot”, 95% percentylowy zakres różnic mie-ścił się w przedziale od -97,23 do 105,23 pmol/l, przy media-nie wynoszącej -12,3 pmol/l (ryc. 3. B3). Do podgrupy C zaliczono tylko 17 wyników. Stężenia HE4 uzyskane z analizatora cobas e411 wykazywały tendencje do niższych wartości aniżeli uzyskiwane z analizatora Ar-chitect i1000. Analiza regresji wykazała liniową zależność pomiędzy wynikami HE4, współczynnik nachyleniowy wy-nosił 0,892 (ryc. 3. C1). Potwierdzenie tego układu stano-wiło równanie regresji dla zależności średnich z wyników z obu systemów pomiarowych względem ich różnic, którego współczynnik nachyleniowy wynosił 0,139 i był istotnie róż-ny od zera (p=0,01) (ryc. 3. C2). Przy medianie wynoszącej 105,2 pmol/l, przedstawiony w postaci „mountain plot”, 95% zakres różnic mieścił się w szerokim przedziale od – 283,4 do 462,7 pmol/l (ryc. 3. C3). Również dla wyników oznaczeń stężenia CA 125 w ba-danych próbkach surowic wyodrębniono trzy podgrupy, A – stężenia w zakresie 0 do100 u/ml, B – 100,1 do 500 U/ml, C – powyżej 500 U/ml. W podgrupie A (N= 62) wyniki z anali-zatora cobas e411 były zbliżone do uzyskiwanych z analizato-ra Architect i1000. Analiza regresji wykazała liniową zależność pomiędzy wynikami oznaczeń CA 125 z obu systemów pomia-rowych; współczynnik nachyleniowy wynosił 0,908, (ryc. 4. A1).

W analizie graficznej wg Bland i Altman stwierdzono istotne zależności pomiędzy wielkością różnic w wynikach uzyska-nych z obu analizatorów a wartościami średnimi dla par wyni-ków; współczynnik nachyleniowy wynosił 0,087 i istotnie różnił się od zera (ryc. 4. A2). Percentylowy rozkład różnic pomiędzy wynikami z analizatora cobas e411 i Architect i1000, oceniany metodą „mountain plot”, był niesymetryczny (ryc. 4. A3). O ile mediana różnic była bliska zeru i wynosiła -0,86 U/ml, to 95% zakres różnic wahał się od -9,55 do 14,00 U/ml.W podgrupie B wyniki oznaczeń z analizatora cobas e411 były również niższe aniżeli z analizatora Architect i1000. Analiza regresji wykazała liniową zależność pomiędzy wy-nikami z obu systemów pomiarowych; współczynnik nachy-leniowy wynosił 0,895 (ryc.4. B1). Wykres wg Bland i Altman wskazywał na istotne zależności pomiędzy różnicami wy-ników oznaczeń CA 125 z obu analizatorów a wartościami średnimi dla par wyników, współczynnik nachyleniowy wy-nosił 0,143 i był istotnie różny od zera (p=0,001) (ryc. 4. B2). Potwierdzenie stanowiła również obserwowana prawosko-śność percentylowego rozkładu różnic przedstawiona na wykresie „mountain plot”, 95% zakres różnic kształtował się w granicach od -9,36 do 81,96 U/ml, a mediana wynosiła 16,74 U/m (ryc. 4. B3). W podgrupie C o stężeniach przekraczających 500 U/ml znalazło się 17 wyników. Również w tej podgrupie stężenia CA 125 z analizatora cobas e411 były istotnie niższe aniżeli oznaczane na analizatorze Architect i1000 (p=0,001). Współ-czynnik nachyleniowy równania regresji wynoszący 0,670 był istotnie niższy od jedności (ryc. 4. C1). W tej podgrupie obserwowano istotną tendencję do wzrostu wielkości różnic pomiędzy wynikami z obu analizatorów wraz ze wzrostem stężeń. Współczynnik nachyleniowy wynosił 0,394 i istotnie różnił się od zera (p = 0,001) (ryc. 4. C2). Niesymetryczny był również percentylowy rozkład różnic pomiędzy wynikami

Rycina 6Krzywe ROC dla CA 125 wykreślone u chorych na raka jajnika wzglę-dem grupy referencyjnej. Architect i1000 [−−] i cobas e411 [- -].

Rycina 5Krzywe ROC dla HE 4 wykreślone u chorych na raka jajnika wzglę-dem grupy referencyjnej. Architect i1000 [−−] i cobas e411 [- -].

47

uzyskanymi z obu analizatorów, (ryc. 4. C3), mediana róż-nic wynosiła 117,56 U/ml, a 95% zakres różnic mieścił się w szerokim przedziale stężeń od 0 do 600 U/ml. W analizie porównawczej wykorzystano 118 próbek surowic, z których 30 pochodziło od osób zdrowych, a 88 od cho-rych na raka jajnika. W celu weryfikacji użyteczności dia-gnostycznej oznaczeń markerów wykreślono krzywe ROC. Dla antygenu HE4 pole powierzchni pod krzywymi ROC dla oznaczeń na analizatorze cobas e411 było istotnie większe aniżeli na analizatorze Architect i1000 (ryc. 5). Natomiast dla CA 125 stwierdzono brak różnic w polach powierzchni pod krzywymi ROC wykreślonymi dla wyników oznaczeń na analizatorze Architect i1000 i cobas e411 (ryc. 6). W bada-nej grupie chorych na raka jajnika znajdowały się zarówno chore przed leczeniem jak i w trakcie chemioterapii. Dla obu systemów pomiarowych obserwowano istotne zależności pomiędzy stężeniami CA 125 a HE4, współczynnik korelacji Persona wynosił dla oznaczeń na analizatorze cobas e411 r=0,353 (p=0,0001), a dla analizatora Architect i1000 r=0,334 (p=0,0003). Analiza porównawcza krzywych ROC wykazała istotnie większe pole powierzchni pod krzywymi ROC dla CA 125 aniżeli HE4 na obu systemach pomiarowych. Dla ozna-czeń na analizatorze cobas e411 pola powierzchni wynosiły dla CA 125 i HE4 odpowiednio: 0,953±0,02 i 0,881±0,03; p=0,025 a dla oznaczeń na analizatorze Architect i1000: 0,959±0,02 i 0,828; p=0,001.

DyskusjaRak jajnika często może rozwijać się w sposób utajony, a wczesne objawy są zbliżone do obserwowanych w różne-go typu chorobach narządu rodnego o niezłośliwej etiologii, zmianach łagodnych. Stąd u znacznego odsetka chorych nowotwór jest rozpoznawany późno i stadium zaawansowa-nia obok typu histologicznego nowotworu oraz stopnia histo-logicznej złośliwości uznawane jest za podstawowy wskaź-nik prognostyczny [8]. Ta sytuacja os szeregu lat stymuluje wysiłki badawcze celem poszukiwania metod pozwalających na wykrycie nowotworu we wczesnych stadiach zaawanso-wania. Rozwój badań ultrasonograficznych, przezpochwowe USG z kolorowm Dopplerem, a także wdrożenie oznaczeń antygenu CA 125 nie przynosiły radykalnej zmiany sytuacji tym zakresie. Zarówno badania USG jak i oznaczenia CA 125 cechuje ograniczona czułość i swoistość diagnostyczna dla wykrywania raka jajnika u bezobjawowych kobiet [23]. Podwyższone stężenia CA 125 stwierdza się u 80% całej populacji chorych na raka jajnika, ale tylko poniżej 50% cho-rych w stadium FIGO I i II [6, 7]. Istotny problem stanowi re-latywnie niska swoistość diagnostyczna wyników oznaczeń markera, jego podwyższone stężenia spotyka się u znaczne-go odsetka kobiet w innych nowotworach narządu rodnego (śluzówka macicy, szyjka macicy), o innej lokalizacji narzą-dowej (rak płuca, rak piersi) a także w szeregu niezłośliwych chorobach takich jak cysty i stany zapalne jajnika, mięśniaki macicy [24]. Ponadto stężenia CA 125 może przejściowo wzrastać w przebiegu ciąży jak i cyklu miesiączkowego [25].

Jednak przez długi czas uznawano, że badanie ginekolo-giczne, USG z kolorowym Dopplerem oraz wyniki oznaczeń CA 125 stanowią u kobiet po menopauzie kompleks badań diagnostycznych mogących znaleźć zastosowanie w bada-niach przesiewowych [26, 27]. Oprócz zastrzeżeń wnoszo-nych odnośnie ograniczone przydatności oznaczeń CA 125 dla wykrywania raka jajnika we wczesnych stadiach zaawan-sowania, diagnostyki różnicowej guzów w obrębie miednicy mniejszej również przedmiotem kontrowersji jest wartość prognostyczna wyjściowego stężenia markera [7].Celem podniesienia efektywności diagnostyki biochemicz-nej chorych na raka jajnika weryfikowano użyteczność dia-gnostyczną wielu markerów nowotworowych. Jednak przez długi okres te badania nie przyniosły oczekiwanych rezulta-tów, użyteczność żadnego z badanych markerów nie okaza-ła się istotnie wyższa w porównaniu z CA 125. Jedynie ich badania mogły być wykorzystywane jako komplementarne w stosunku do CA 125. Dopiero wdrożenie do praktyki dia-gnostycznej oznaczeń HE4 wydaje się wnosić istotną popra-wę efektywności diagnostyki różnicowej zmian niezłośliwych i raka jajnika [28, 29]. Przy zbliżonej do CA 125 czułości wy-niki oznaczeń HE4 cechują się wyraźnie wyższą swoistością diagnostyczną. O ile podwyższone stężenia CA 125 spotyka się u 20 – 30% kobiet z niezłośliwymi zmianami w jajnikach, to wyższe od wartości odcinającej stężenia HE4 obserwu-je się tylko u nieznacznego ich odsetka [30, 31]. Wysuwa-ne są nawet sugestię, że prawidłowy poziom HE4 u kobiet z podwyższonym stężeniem CA 125 u blisko 98% z nich wy-klucza inwazyjny nowotwór [32]. Istotny postęp w diagnosty-ce różnicowej przyniosły badania HE4 zwłaszcza u kobiet przed menopauzą, u których relatywnie często spotyka się stężenia CA 125 wyższe od 35 U/ml [33, 34]. Dalszy postęp w diagnostyce różnicowej zmian niezłośliwych i raka jajnika przyniosło opracowanie w oparciu o wyniki oznaczeń HE4 i CA 125 algorytmu ROMA (Risk of Ovarian Malignancy Al-gorithm). Pozwala on na oszacowanie prawdopodobieństwa obecności nowotworu złośliwego u kobiet ze stwierdzanymi guzami w obrębie miednicy mniejszej [35, 36]. Przeważa-ją opinie, że czułość i swoistość diagnostyczna a także ich ujemna i dodatnia wartość predykcyjna wskaźnika ROMA jest wyższa aniżeli wyników oznaczeń samych markerów. Wartościom tego wskaźnika jest przypisywane istotne prak-tyczne znaczenie przy kwalifikacji chorych do zabiegów ope-racyjnych i wyboru placówki, w której powinny one być prze-prowadzane z uwzględnieniem stanu hormonalnego kobiet i prawdopodobieństwa zmian o charakterze złośliwym [37]. Przez dłuższy czas możliwym było wykonywanie badań stężenia HE4w surowicy krwi jedynie metodą ELISA na mi-kropłytkach, co w znacznej mierze ograniczało dostępność ich wyników. Zestawy odczynnikowe do badań przy użyciu automatycznych analizatorów immunochemicznych opraco-wała pierwsza firma Abbott Laboratories Ltd. Stąd w prezen-towanych badaniach wyniki oznaczeń przy zastosowaniu tego systemu pomiarowego, rozumiejąc pod tym terminem zestawy odczynnikowe i analizator immunochemiczny, dla

HE4 i CA 125 - porównanie metod oznaczeń

48

którego są adresowane, uznano jako pewnego rodzaju układ odniesienia.Zestawy odczynnikowe do oznaczeń CA 125 oraz HE4 obu firm cechuje znaczne podobieństwo tak pod względem ukła-du odniesienia dla standaryzacji kalibratorów jak i stosowa-nych przeciwciał. Zestawy do oznaczeń CA 125 w obu przy-padkach należą do metod drugiej generacji tzn. stosowane są w nich przeciwciała OC125 i M11. Różnice w wynikach uzyskiwanych obu metodami można wiązać ze stosowanymi w obu analizatorach odmiennymi wersjami metod immuno-chemicznych, składem matryc białkowych, a także technolo-gią opracowania wyników.W oznaczeniach markerów na analizatorze Architect i1000 stosowana jest metoda chemiluminescencyjna (CMIA) wy-korzystująca jako znacznik ester akrydyny [38]. W pierw-szym etapie antygen obecny w badanej próbce wiąże się z opłaszczonym na mikrocząsteczkach paramagnetycznych przeciwciałem monoklonalnym 2H5, skierowanym przeciw-ko jednej determinancie antygenu HE4. W drugim etapie, po wypłukaniu niezwiązanych mikrocząsteczek, dodawane jest znakowane estrem akrydyny drugie przeciwciało monoklo-nalne 3D8, skierowane przeciwko innej determinancie HE4. W kolejnym etapie kuweta reakcyjna zostaje umieszczana w polu magnetycznym, gdzie dochodzi do separacji kom-pleksów: przeciwciało 2H5 – antygen HE4 – przeciwciało 3D8/ester akrydyn, powstałych na mikrocząsteczkach para-magnetycznych. Po kolejnym cyklu przemywania do miesza-niny reakcyjnej dodawany jest nadtlenek wodoru, utleniający znacznik do ketokwasu, oraz wodorotlenek sodu hydrolizują-cy go do N-metyloakrydonu. Powstały związek jest nietrwały i rozpadając się emituje światło o długości fali 429 nm. Sys-tem optyczny dokonuje pomiaru wyemitowanych fotonów światła przez ustalony okres czasu, a uzyskane względne jednostki świecenia RLU służą do obliczenia stężenia an-tygenu w badanej próbce. Zakres pomiarowy oznaczeń na analizatorze Architekt i1000 dla antygenu HE4 wynosi 20-1500 U/ml, a dla CA 125: 0,0 do 1000,0 U/ml.W oznaczeniach antygenu HE4 i CA 125 na analizatorze co-bas e411 wykorzystano technikę eletrochemiluminescencyj-ną (ECL), metodę, w której za emisję światła z wzbudzonych cząsteczek odpowiedzialny jest szereg reakcji rodnikowych, które zachodzą na powierzchni elektrody platynowej [40]. W pierwszym etapie antygen obecny w badanej próbce wiązany jest przez dwa monoklonalne przeciwciała, jedno sprzężone z biotyną, a drugie z kompleksem rutenu [Ru (bpy)3]+2. Po 9 minutowej inkubacji do mieszaniny reakcyj-nej dodawane są cząsteczki paramagnetyczne opłaszczone streptawidyną. Wysokie powinowactwo streptawidyny do biotyny sprawia, że powstałe kompleksy immunologiczne zostają zakotwiczone na fazie stałej. Mieszanina reakcyjna zostaje następnie przetransportowana do cell pomiarowych, w których cząsteczki paramagnetyczne z kompleksami: streptawidyna/biotyna-przeiwciało1:antygen - przeciwciało 2-[Ru (bpy)3]+2 wychwytywane są przez znajdujący się pod elektrodą platynową elektromagnes [39]. Po etapie wymy-

wania niezwiązanych składników z mieszaniny reakcyjnej i dodaniu ProCell zawierającego trójpropyloaminę (TPA) impuls elektryczny inicjuje reakcję utleniania i redukcji rute-nu – znacznika kompleksów immunologicznych na elektro-dzie platynowej oraz TPA. Powstaje kompleks rutenu: [Ru (bpy)3]+3 oraz kation trójpropyloaminowy (TPA+) wykazujący właściwości redukcyjne, który spontanicznie uwalnia pro-ton (H+), tworząc niestabilny rodnik TPA*. Rodnik przepro-wadza kompleks rutenu [Ru (bpy)3]+3 w stan wzbudzony [Ru (bpy)3]+2*, który przy powrocie do stanu podstawowego emituje światło o długości fali 620 nm rejestrowane przez fotopowielacz. Poziom antygenu wyliczany jest z krzywej wzorcowej zapisanej w kodzie paskowym kalibratorów oraz dwupunktowej rekalibracji wykonanej przez użytkownika. Zakres pomiarowy oznaczeń na analizatorze cobas e411 dla antygenu HE4 wynosi 15-1500 U/ml, a dla CA 125 od 0 do 5000 U/ml.O ile dla CA 125 wyniki uzyskane z obu analizatorów ce-chuje znaczne podobieństwo, czego wyrazem jest również wielkość pól powierzchni pod krzywymi ROC, to dla wyników oznaczeń HE4 na analizatorze cobas e411 pole powierzch-ni pod krzywą ROC było istotnie większe w porównaniu do wykreślonego na podstawie wyników z analizatora Architekt i1000. W analizie przyczyn tego stanu można rozważać wpływ różnic w zakresach stężeń kalibratorów stosowanych w obu systemach pomiarowymi. Jak wykazano współczyn-niki nachyleniowe równań regresji opisujące zależności po-między wynikami oznaczeń tego markera przy użyciu obu analizatorów zależą od zakresu mierzonych stężeń. Podsumowując należy stwierdzić, że przedstawione wyni-ki potwierdzają opisywaną użyteczność oznaczeń CA 125 i HE4 w diagnostyce biochemicznej chorych na raka jajnika. Z punktu widzenia użyteczności diagnostycznej obserwowa-ne różnice pomiędzy porównywanymi systemami pomiaro-wymi nie mają zasadniczego znaczenia, ponieważ badania CA 125 i HE4 u poszczególnych chorych z założenia musza być wykonywane przy użyciu zestawów odczynnikowych i analizatorów immunochemicznych, pochodzących od tego samego wytwórcy. Co więcej, dotyczą one relatywnie nie-licznych grup zdrowych kobiet i chorych na raka jajnika, przy czym głównie w zaawansowanych stadiach choroby. Koniecznym jest w trakcie systematycznie prowadzonych badań u zdrowych kobiet, pacjentek z niezłośliwymi guzami w obrębie miednicy mniejszej jak i chorych na raka jajnika przy uwzględnieni szerokiego panelu parametrów klinicz-nych, gromadzenie danych dla ustalenia wartości odci-nających oraz oceny w sposób wiarygodny użyteczności diagnostycznej oznaczeń obu markerów, szczególnie dla różnicowania pomiędzy zmianami niezłośliwymi i rakiem jaj-nika.

PiśmiennictwoDidkowska J, Wojciechowska U, Zatoński W. Nowotwory zło-1. śliwe w Polsce w 2009 roku. Centrum Onkologii Instytut, War-szawa 2010.Hennessy BT, Coleman RI, Markman M. Ovarian cancer. Lancet 2.

49

2009; 374: 1371-1382.Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics. CA Cancer 3. J Clin 2007; 57: 43-66.Bast RC, Klug TL, St John E, et al. A radioimmunoassay using a 4. monoclonal antibody to monitor the course of epithelial ovarian cancer. N Eng J Med 1983; 309: 169-171.Kabawat SE, Bast RC, Bhan Ak, et al. Tissue distribution of 5. coelomic-epithelium- related antigen recognized by the mono-clonal antibody OC125. Int J Gynecol Pathol 1983; 2: 275-285.Jacobs I, Bast RC, The CA 125 tumour-associated antigen: a 6. review of the literature. Hum Reprod 1989; 4: 1-12.Duffy MJ, Bonfrer JM, Kulpa J, et al. CA 125 in ovarian cancer: 7. European Group on Tumor Markers guidelines for clinical use. Int J Gynecol Cancer 2005; 15: 679-691.Jacobs IJ, Menon U. Progress and challenges in screening for 8. early detection of ovarian cancer. Molecular Cellular Proteomics 2004; 3: 355-366.Jelovac D, Armstrong DK. Recent progress in the diagnosis and 9. treatment of ovarian cancer. Ca Cancer J Clin 2011; 61: 183-203.Fritsche HA, Bast RC. CA 125 in ovarian cancer: Advances and 10. controversy. Clin Chem 1998; 44: 1379-1380.Jacobs I, Oram D, Fairbanks J, et al. A risk of malignancy index 11. incorporating CA 125, iltrasound and menopausal statis for the accurate pre-operative diagnosis of ovarian cancer. Br J Obstet Gynecol 1990; 97: 922-929.Moolthiya W, Yuenyao P. The Risk of Malignancy Index (RMI) 12. in diagnosis of ovarian malignancy. Asia Pacifi J Cancer Prev 2009; 10: 865-868.Gadducci A, Cosio S, Carpi A, et al. Serum tumor markers in 13. the management of ovarian, endometrial and cervical cancer. Biomed Pharmacother 2004; 58: 24-38.Rein BJD, Gupta S, Dada R, et al. Potential markers for de-14. tection and monitoring of ovarian cancer. J Oncol 2011; doi10.1155/2011/475983Kirchhoff C. Moleculatr characterization of epididymal proteins. 15. J Reproduc Fertility 1998; 3: 86-95.Bingle L. Cross SS, High AS, et al. WFDC2 (HE4): A potential 16. role in the innate immunity of the oral cavity and respiratory tract and the development of adenocarcinoma of the lung. Respir Res 2006; 7: 61 doi:10.1186/1465-9921-7-6Galgano MT, Hampton GM, Frierson F. Comprehensive analy-17. sis of HE4 expression in normal and malignant human tissues. Modern Pathol 2006; 19:847-853.Moore RG, Miller RC, Steinhoff MM, et al. Serum HE4 levels 18. are less frequently elevated then CA 125 in women with be-nign gynecologic disordes. Am J Obset Gynecol 2012; 206. doi:10.1016/j.ajog.2011.12.029Garrett PE, Lasky FD, Meier KL. User protocol for evaluation of 19. qualitative test performance: Approved guideline – Second edi-tion. CLSI EP121-A2 2008 www.clsi.org.Passing H, Bablok W. A new biometrical procedure for test-20. ing the equality of measurements from two different analytical methods. Appication of linear regression procedures for method comparison studies in clinical chemistry. Part I. Clin Chem Clin Biochem 1983; 21: 709-720Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agree-21. ment between two methods of clinical measurement. Lancet 1986; 307-310Krouwer JS, Monti KL. A simple, graphical method to evaluate 22. laboratory assays. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 1995; 33: 525-527. Fishman DA, Cohen I, Blank SV, et al. The role of ultrasound 23. evaluation in the detection of early-stsage epithelial ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol 2005; 192: 1214-1221.Bast RC, Badgwell D,Lu Z, et al. New tumor markers: CA 125 24. and beyond. Int J Gynecol Cancer 2005; 30: 274-281.

Anastasi E, Granato T, Marchei GG, et al. Ovarian cancer 25. marker HE4 in differently expressed during the phases of the menstrual cycle in healthy young women. Tumor Biol 2010, 31: 411-415.Buys SS, Partridge E, Greene MH, et al. Ovarian cancer screen-26. ing in the Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian (PLCO) cancer screening trial: Findings from the intial screen of a randomized trial. Am J Obstet Gynecol 2004; 193: 1630-1639. Rosenthal AN, Menon U, Jacobs IJ. Screening for ovarian can-27. cer. Clic Obstet Gynecol 2006; 49: 433-447. Park Y, Lee J-H, Hong DJ, et al. Diagnostic performance of HE4 28. and CA 125 for the detection of ovarian cancer from patients with various gynecologic and non-gynecologic disease. Clin Biochem 2011; 44: 884-888. Partheen K, Kristijansdottir B, Sundfeldt K. Evaluatiom of ovar-29. ian cancer biomarkers HE4 and CA-125 in women presenting with a suspicious cystic ovarian mass. J Gynecol Oncol 2011; 22: 244-252. Molina R, Escudero JM, Auge JM, et al. HE4 a novel tumour 30. marker for ovarian cancer: comparison with CA 125 and ROMA algorithm in patients with gynaecological diseases. Tumor Biol 2011; 32:1087-1095.Moore RG, Miller RC, Steinhoff MM, et al. Serum HE4 levels 31. are less frequently elevated then CA 125 in women with be-nign gynecologic disordes. Am J Obstet Gynecol 2012; 206. doi:10.1016/j.ajog.2011.12.029Holcomb K, Vucetic Z, Miller C, et al. Human epididymis protein 32. 4 offers superior specificity in the differentiation of benign and malignant ednexal masses in premenopausal women. Am J Ob-stet Gynecol 2011; doi:1.1016/j.ajog.2011.05.07 Bolstad N, Oijordsbakken M, Nustad K, et al. Human epididymis 33. protein 4 reference limits and natural variation in a Nordic popu-lation. Tumor Biol 2012; 33: 141-148. Moore RG, Miller MC, Eklund EE, et al. Serum levels of the 34. ovarian cancer biomarker HE4 are decreased in pregnancy and increase with age. Am J Ostet Gynecol 2012; doi: 10.1016/ajog 2011.12.028. Montagnana M, Danese E, Ruzzenente O, et al. The ROMA 35. (Risk of Ovarian Malignancy Algorithm) for estimating the ris of epithelial ovarian cancer in women presenting with pelvic mass: is a really useful? Clin Chem Lab Med 2011; 49: 521-525.Plebani M, Melichar B. ROMA or death: advances in epithelial 36. ovarian cancer diagnosis. Clin Chem Lab Med 2011; 49: 443-445. Kadija S, Stefanovic A, Jeremic K, et al. The utility of human 37. epididymal protein 4, cancer antigen 125, and risk for malig-nancy algorithm in ovarian cancer and endometriosis. Inter J Gynecol Cancer 2012; 22: 238-244. Ognibene A, Drake ChJ, Jeng K-YS, et al. A new modular 38. chemiluminescence immunoassay analyser evaluated. Clin Chem Lab Med 2000, 38: 251-260.Richter MM. Electrochemiluminescence . Chem Rev 2004; 104: 39. 3003 – 3036.Kuramitz H. Magnetic microbead-based elektrochemical immu-40. noassays. Anal Bioanal Chem 2009; 394: 61-69.

Zaakceptowano do publikacji: 29.02.2012

Adres do korespondencji:Prof. dr hab. Jan Kanty KulpaZakład Analityki i Biochemii KlinicznejCentrum Onkologii, Oddział w Krakowie31-115 Kraków, ul. Garncarska 11z5jkulpa@cyfronet.pl