Ekspresja białek – inżynieria

metabolizmu

Rys historyczny

Inżynieria metabolizmu & Ewolucja

metabolizmu

Definicja

Inżynieria metabolizmu (ME) została

zdefiniowana jako "poprawa komórkowej

aktywności komórki poprzez zmianę

aktywności enzymu/ów, transportu, oraz

funkcji regulacyjnych komórek z

wykorzystaniem technologii rekombinacji

DNA”- Bailey, J. E. (1991). Science, 252:

1668-1674

Inżynieria metabolizmu

• ME jest udowodnioną, skuteczną

metodyką do studiowania i optymalizacji

procesów fermentacji

• Składowe procesu

1. Konstrukcja rekombinantów o

poprawionych własnościach przez

wprowadzenie specyficznych genów

(genotype engineering)

2. Kompleksowa charakterystyka szczepu

dzikiego oraz szczepów rekombinowanych

(Phenotype characterization)

3. Analiza wyników charakterystyki

fenotypowej i zaprojektowanie nowych

targetów do kolejnego cyklu ME

Inżynieria metabolizmu

Inżynieria metabolizmu

Inżynieria

genotypu

Charakterystyka

fenotypu

Analiza

Wybór nowych

targetów

Skrining zasobów

naturalnych

Szczep

produkcyjny

Odwrócona inżynieria

metabolizmu (inverse ME)

Inżynieria ewolucyjna

Odwrócona inżynieria

metabolizmu (inverse ME)• W toku procesu Inverse ME naturalny

proces ewolucji podpowiada nam

rozwiązania oraz kierunek zmian, które

muszą być dokonane w celu poprawy

szczepu

• Dlatego ważne jest dokładne rozeznanie

zmian – dobre metody analiz

Inżynieria metabolizmu

Analizy

• Fluksomika

• Genomika

• Transkryptomika

• Proteomika

• Metabolomika

Inżynieria metabolizmu

Analizy• Fluksomika – badania zmian w szlakach metabolicznych

– badanie obecności i aktywności enzymów, stężeń

kofaktorów, wzajemne zależności szlaków

metabolicznych i systemu przekazywania sygnałów

komórkowych. Badania systemu transportu.

Rozpoznawanie nowych produktów metabolizmu.

• Genomika - dziedzina biologii molekularnej i biologii

teoretycznej (pokrewna genetyce i ściśle związana z

bioinformatyką) zajmująca się analizą genomu

organizmów. Głównym celem genomiki jest poznanie

sekwencji materiału genetycznego oraz mapowanie

genomu, ale również określenie wszelkich zależności i

interakcji wewnątrz genomu.

Inżynieria metabolizmu

Analizy

• Transkryptomika - dziedzina nauk biologicznych (głównie biologii

molekularnej i genetyki), pokrewna proteomice, genomice i metabolomice.

Zajmuje się określeniem miejsca i czasu aktywności genów poprzez

badanie transkryptomu. Nazwa została utworzona poprzez analogię do

słowa "genomika" i podobnie wskazuje na całościowe ujęcie danego

problemu. Transkryptomika teoretyczna stanowi jeden z fundamentów

bioinformatyki.

Inżynieria metabolizmu

Analizy

Inżynieria metabolizmu

Analizy• Proteomika – gałąź nauki zajmująca się badaniem białek -

ich struktury, sprawowanych przez nie funkcji i zależności

między nimi

• Metabolomika - dziedzina nauki

zajmująca się badaniem zestawu

wszystkich metabolitów obecnych w

organizmie, tkance czy komórce -

metabolomu. Jest zaliczana obok

genomiki, transkryptomiki i proteomiki

do biologii systemowej

Inżynieria metabolizmu

Analizy

BIOinformatyka

• Bioinformatyka to dyscyplina zajmująca

się stosowaniem narzędzi

matematycznych i informatycznych do

rozwiązywania problemów z nauk

biologicznych

BioInformatyka

Zadania dla ME

• katalogowanie informacji biologicznych

• analiza sekwencji DNA / analiza sekwencji

genomów, porównywanie genomów

• ustalanie ewolucyjnych relacji pomiędzy

zbiorami sekwencji / organizmów

• genotypowane

BioInformatyka

• analiza ekspresji genów (głównie analiza danych

z mikromacierzy)

• analiza sekwencji białek, nazywana też

proteomiką (porównywanie sekwencji,

wyszukiwanie domen i motywów, przewidywanie

własności fizyko-chemicznych, drugo- i trzecio-

rzędowej struktury białka, lokalizacji w obrębie

komórki, analiza danych z eksperymentow

spektroskopwych)

BioInformatyka

• katagolowanie funkcji genów/białek,

analiza dróg metabolicznych (np

metabolizm lipidów) oraz dróg

sygnałowych (np od receptora na

powierzchni komórki poprzez kaskadę

kinaz do czynników transkrypcyjnych)

• modelowanie układów biologicznych (np

kinetyka szeregu reakcji enzymatycznych

w komórce)

BioInformatyka

• wirtualne dokowanie (ang. virtual docking)

- np. używajac trójwymiarowej struktury

aktywnego centrum enzymu ("zamek" albo

"kieszonka" ang. pocket) przeszukuje się

w komputerze tysiace małych cząsteczek

z których kilka-kilkanaście ('kluczy') będzie

miało kształt mieszczacy się w centrum

aktywnym. Pierwszy krok w kierunku

odkrywania nowych leków.

BioInformatyka

• komputery DNA - W komputerze DNA informacja jest

zakodowana w postaci łańcuchów DNA. Podobnie jak

zwykłe komputery, składa się z bramek logicznych, te

jednak są oparte na enzymach. Enzymy te powodują

reakcje chemiczne między łańcuchami, a ich wynik

stanowi nową informację. Komputer taki jest

probabilistyczny - wynik każdego działania otrzymujemy

jedynie z pewnym prawdopodobieństwem.

Komputer DNA może być stosowany do identyfikacji wirusów lub znajdowania

mutacji w kodzie genetycznym. Można go używać w roztworach

chemicznych i w żywych organizmach, co może umożliwiać diagnozę i

leczenie nawet na poziomie pojedynczych komórek.

BioInformatyka

• morfometria / analiza obrazu

Inżynieria metabolizmu

• Komórki optymalnie wykorzystują swoje możliwości metaboliczne. Szlaki metaboliczne są siecią regulowanych ścieżek dla uzyskania optymalnego wykorzystania dostepnych warunków.

• Inżynieria metabolizmu ma na celu zmianę metabolizmu komórek w celu uzyskania zwiększonej produkcji danego związku lub w celu uzyskania całkowicie nowego produktu, który w normalnych warunkach nie mógłby być produkowany przez poszczególne komórki

„Schemat postępowania”

1. Identyfikacja targetowego fenotypu (wykazującego określoną cechę)

2. Wzrost częstości występowania genu związanego z dana cechą fenotypową1. wzrost częstości mutacji (UV, X/ray, mutageny chemiczne)

2. wprowadzenie dodatkowych genów (występujących w komórce lub całkowicie nowych)

3. wprowadzenie genetycznych elementów w celu aktywacji/dezaktywacji szlaków poprzez przypadkową integrację. Identyfikacja mutantów wykazujących określoną cechę („poszukiwanie i selekcja”)

„Poszukiwanie i selekcja”

• Poszukiwanie:

– automatyzacja procesu

– proces oparty na różnego rodzaju testach

(związanych z własnościami produktu)

• Selekcja:

– stosowanie markerów (ograniczenia!!!)

http://hugroup.cems.umn.edu/Education/Courses/3701/Lecture/Metabolic%20Engineering_no%20audio.pdf

Markery selekcyjne akceptowane przez FAD/

United States Food and Drug Administration

Markery drożdżowe:

• gen oporności na antybiotyk – Phleomycynę – wyłączenie genu i eliminacja przez komplementarny plazmid

• markery auksotroficzne takie jak ura3, trp2, ade2, leu2 itd.

• markery unikalne

- gen acetamidazy (amdS) z A. nidulans – szczep rekombinantowy może rosnąć na podłożach z acetamidem jako jedymyn źródłem azotu

- gen oporności na analogi aminokwasów np. na o-fluoro-fenyloalaniny: syntaza 3-deoxy-d-arabino-heptolusonate-7-phosphate

- gen oporności na siarczki: FZF1 aktywator genu SSU1 opowiedzialnego za wyrzucanie siarczków z komórki

Narzędzia wykorzystywane w inżynierii

komórkowej i metabolizmu

• Systemy pozwalające na transformację mikroorganizmów używanych w przemysłowej produkcji lub w bioprocesach (np. Corynobacterium – produkcja aminokwasów, Pseudomonas – degradacja ksenobiotyków)

• Odpowiednie wektory (promotory!!!), które pozwolą na przeprowadzanie transformacji (drożdżowy retrotranspozon Ty3 zaangażowany w specyficzną integrację genów heterologicznych – stabilizacja, duża ilość fragmentów ulegających transformacji)

Narzędzia wykorzystywane w inżynierii

komórkowej i metabolizmu

• Multicistronowe wektory ekspresyjne

• Metody zwiększające stabilizację klonowanych

genów (integracja z chromosomem)

• Odpowiednie markery do badań i analizy

ścieżek metabolicznych

Narzędzia wykorzystywane do oceny

wprowadzonych zmian metabolicznych

• Hodowla modyfikowanych organizmów

• Optymalizacja stosowanych w hodowli podłóż (wykazano, że Serratia niosąca bakteryjny gen vgb – co miało umożliwić szybszy wzrost oraz uniknąć produktów ubocznych – aktywuje różne szlaki metaboliczne w zależności od składu podłoża)

• Zachowanie równowagi masowej (ilość substratów = ilość produktów – wydajność 100%. Obliczenie faktycznej wydajności pozwala na ocenę postępu zmian w metabolizmie)

• Znakowanie izotopami i analiza mutantów, w których chcemy zablokować poszczególne szlaki – sprawdzenie działania enzymów wchodzących w skład tych szlaków (poprzez sprawdzanie ubytku charakterystycznego substratu i/lub powstawania produktu)

Narzędzia wykorzystywane do oceny

wprowadzonych zmian metabolicznych

– o czym trzeba pamiętać!!!

• Bazy danych sekwencji DNA (oraz odpowiednie oprogramowanie)

• Bazy danych szlaków metabolicznych (włącznie z własnościami kinetycznymi i termodynamicznymi enzymów)

• Narzędzia pozwalające na wyznaczenie teoretycznych wydajności (ze stechiometrii szlaków metabolicznych)

• Narzędzia pozwalające na przewidywanie i analizę ilości powstających produktów w zmodyfikowanych komórkach

Cele inżynierii metabolizmu

• Polepszenie produkcji (ilościowe lub wybiórcze) związków naturalnie produkowanych przez dany organizm

• Zwiększenie zakresu możliwych do wykorzystania substratów i tworzenie nowych produktów

• Dodanie nowych aktywność w celu umożliwienia degradacji związków toksycznych

• Synteza nowych produktów

• Modyfikacje własności komórek

PRZYKŁADY

Przykłady poprawionej produkcji

związków i białek (homogenicznych)

Przykłady poprawionej produkcji

związków i białek (homogenicznych)

• Ksylanaza – Streptomyces lividans – peptyd sygnalny ksylanazy A zostal zastapiony petydem sygnalnym mannanazy A (podniesienie ekspresji 1,5-2,5x)

Przykłady poprawionej produkcji

związków i białek (homogenicznych)• Kwasy organiczne – S. cerevisiae – nadekspresja

dehydrogenazy malonianowej prowadząca do gromadzenia kwasu malonowego, cytrynowego i fumarowego (przy okazji stwierdzono, że karboksylaza pirogronianowa hamuje wytwarzanie kwasu malonowego)

Przykłady poprawionej produkcji

związków i białek

(homogenicznych)• Akumulacja celulozy i zmniejszenie syntezy

ligniny – Aspen (Populus tremuloides – topola osikowa) – supresja szlaku biosyntezy ligniny z użyciem antysensownego mRNA (specyficznej ligazy) – drzewa zawierały 45% mniej ligniny, a w zamian 15% więcej celulozy

Przykłady poprawionej produkcji

związków i białek (homogenicznych)

• Kwas mlekowy – E. coli – nadekspresja

homologicznej fosfofruktokinazy i

kinazy pirogronianowej (zmniejszona

produkcja etanolu, zwiększona

produkcja kwasu mlekowego)

Przykłady poprawionej produkcji

związków i białek (homogenicznych)

• Cefalosporyna – S. cerevisiae – dzięki analizie

kinetycznej wykazano, że nadekspresja jednej z

aminotransferaz prowadzi do zwiększonego

poziomu syntezy tego antybiotyku

Przykłady produkcji związków

i białek nowych dla gospodarza

Przykłady produkcji związków i białek

nowych dla gospodarza

• karotenoidy – Candida utilis –komórki drożdży transformowane operonem ctr Erwinia (synteza karotenoidów)

Przykłady produkcji związków i białek

nowych dla gospodarza

• pregnenolon i progesteron – drożdże – wprowadzenie reduktazy ADR oraz specyficznej dehydrogenazo-izomerazy, oraz zniszczenie dwóch innych enzymów szlaku przemian ergosterolu

Ergosterol

Pregnenolon

progesteron

Przykłady produkcji związków i białek

nowych dla gospodarza

• kwas gamma linoleinowy – tytoń – transformacja rośliny delta 6 dezaturazą cyjanobakterii

Przykłady produkcji związków i białek

nowych dla gospodarza

• globotrioza i UDP-galaktoza - E. coli – ekspresja genów biosyntezy UDP-Gal z Corynobacterium ammoniagenes

Globotrioza

UDP-galaktoza

Przykłady produkcji związków i białek

nowych dla gospodarza

• L-alanina – Lactobacillus lactis – gen dehydrogenazy alaninowej z Bacillus sphaericus

L-alanine + H2O + NAD+ = pyruvate + NH3 + NADH + H+

Zmiana możliwości wzrostu na poszczególnych

podłożach związana z otrzymywaniem

określonego produktu

Bioetanol z odpadów

lignocelulozowych

Dlaczego lignocelluloza?

- Zawiera głównie cukry

- Jest „wszechobecna” /produkcja roczna to 150 miliardów ton rocznie

- Jest produktem odpadowym

Skład:

Heksozy 45%

Pentozy 30%

Inne 25%

Bioetanol

Lignoceluloza (słoma, drewno)

CukryDepolimeryzacja

Fermentacja

Etanol

Enzymy rekombinowane

glukozydazy

Enzymy szlaków metabolicznych

(Fermentacja pentoz)

Bioetanol – Paliwo II generacji

(z celulozy)

Proces jest wciąż nieopłacalny ze względu na:

-Koszty enzymów celulaz i ksylanaz

- Brak szczepów odpornych na hydrolizaty

- Mała wydajność fermentacji

To problemy do rozwiązania dla ME

Do tej pory wykorzystano do produkcji

etanolu z lignocellulozy

• Rekombinantowy szczep E. coli (pdc, adh z Zymomonas

mobilis)

• Rekombinantowy szczep S. cerevisiae (Xyl1, Xyl2 z

Pichia striptilis)

• Rekombinantowy szczep Z. mobilis (tal, tktA, xylA, xylB z

E. coli)

• Rekombinantowy szczep Kliebsiella oxytoca (pdc, adh z

Zymomonas mobilis)

Enzymy cellulolityczneS. cerevisiae może wykorzystać wyłącznie glukozę do produkcji

etanolu

Celuloza

Celobioza

Glukoza

Hemiceluloza

ksylobioza

ksyloza Etanol

Celobiohydrolazy

Endoglukanazy

Trichoderma reseii

Beta-glukozydazy

AspergillusXylanazy

Aspergillus

Beta-xylobiozydazy

Aspergillus

Zestawienie organizmów rekombinowanych produkujących heterologiczne enzymy w celu

degradacji związków zawierających wiązanie glikozydowym

Substrate and

host Enzymes (genes) Substrate Growth or fermentationa

K. oxytoca Endoglucanases (celY and celZ) Avicel Anaerobic SSF with added

cellulase, ethanol yields up

to 22% more than control

Amorphous

cellulos

e

Cellulose fermentation without

added cellulase, ethanol

yields 58-76% theoretical

S.

cerevi

siae

CMCase, ß-glucosidase from Aspergillus aculeatus Cellobiose

(10

g/liter)

Aerobic growth, final optical

density >1.5

CMCase, ß-glucosidase from Aspergillus aculeatus Cellodextrin

s

Aerobic growth, cell number >

control

Amylopullulanase (LKA1), pectate lyase (PEL5),

polygalacturonase (PEH1), endo-ß-1,4-glucanase

(END1), cellobiohydrolase (CBH1), exo-ß-1,3-D-

glucanase (EXG1), cellobiase (BGL1), and endo-ß-D-

xylanase (XYN4)

Cellobiose Aerobic growth, cell number >

control

Endo/exoglucanse from Bacillus sp. strain DO4, ß-

glucosidase genes from Bacillus circulans

Cellodextrin

s

Growth, 2-fold higher cell mass

and greater ethanol

production compared to

control

Endo/exoglucanse from Bacillus sp. strain DO4, ß-

glucosidase genes from Bacillus circulans

Avicel Anaerobic SSF, showed

substantial enzyme

production under aerobic

and anaerobic conditions

Enzymy celulolityczne

Cellulazy z Trichoderma reseii

(tylko nadekspresja homogeniczna)

bo:

• złożoność preparatu

- CBHI, CBHII, EG1, EG2, EGV i inne w tym xylanazy

• wydajność do 50-60 g/litr

Bioetanol, S. cerevisiae i ksyloza

Ksyloza (rośliny)Ksylitol

Ksyluloza

Fosforan ksylulozy Etanol

Izomeraza xylozowa

/Piromyces sp./

Reduktaza xylozowa

/Pichia stripsilis/

Dehydrogenaza xylitolu

/Pichia stripsilis/

Kinaza xylulozy

/S. cerevisiae/

S. cerevisiae nie potrafi utylizować pentoz - ksylozy

Uzyskanie szczepu S.

cerevisiae wydajnie

wykorzystującego ksylozę

wymaga wprowadzenia w/w

genów oraz spontanicznych

zmian /mutacji lub

adaptacji/ w regulacji

ekspresji około 380 innych

genów obecnych w S.

cerevisiae.

Naturalna adaptacja szczepu rozkładającego

ksylozę

Skrobia, bioetanol i S. cerevisiae

1,4-beta-O- glikozydowe wiązanie

cellulozy decyduje o jej krystalicznej

strukturze, co sprawia, że jest oporna

na działanie enzymów (brak dostępu)

wiązanie 1,4-alfa-O-glikozydowe

obecne w skrobii czyni ją substancją

rozpuszczalną w wodzie i

podatną na działanie enzymów

(dostępność dla działanai enzymów)

Skrobia, bioetanol i S. cerevisiae

Skrobia

Glukoza

Etanol

Fermentacja

Kwaśna hydroliza / Metoda nieekologiczna

Hydroliza enzymatyczna

alfa-amylaza

/Bacillus licheniformis/

Glukoamylaza

/Aspergillus/

Nadprodukcja w drożdżach i jednoczesna producja etanolu

Zestawienie organizmów rekombinowanych produkujących

heterologiczne enzymy w celu degradacji związków zawierających

wiązanie glikozydowym

Substrate and

host Enzymes (genes) Substrate Growth or fermentationa

K. oxytoca -Amylase from Bacillus stearothermophilus,

pullulanase from Thermoanaerobium brockii

Starch (40

g/liter)

Anaerobic fermentation, 15

g of ethanol per liter and 1.4

g of cells per liter

S. cerevisiae Glucoamylase (GA1) Soluble

starch

CO2 release comparable to

control with added amylase

-Amylase (amyE), glucoamylase (glaA) Corn starch

(10 g/liter)

Final optical density of 2.0

-Amylase (LKA1) Soluble

starch (20

g/liter)

Aerobic growth, final

optical density >1.5

Glucoamylase from Rhizopus oryzae Soluble

starch (10

g/liter)

Aerobic growth with some

ethanol production, final

optical density >0.9

Amylopullulanase (LKA1), pectate lyase (PEL5),

polygalacturonase (PEH1), endo-ß-1,4-glucanase

(END1), cellobiohydrolase (CBH1), exo-ß-1,3-D-

glucanase (EXG1), cellobiase (BGL1), and endo-

ß-D-xylanase (XYN4)

Starch Aerobic growth, cell

number > control

-Amylase (amyE), glucoamylase (glaA) Soluble

starch (100

g/liter)

Anaerobic growth, 44 g of

ethanol per liter and 8 g of

cells per liter

Bioetanol i serwatka

• Serwatka zawiera około 5% laktozy

• S. cerevisiae utylizuje jedynie produkty

hydrolizy laktozy

Laktoza Glukoza + Galaktoza

Etanol

Bioetanol, serwatka i S. cerevisiae

Laktoza Glukoza + Galaktoza

Etanol

Heterologiczna ekspresja

Beta-galaktozydazy

/E. coli/

Produkcja etanolu przez bakterie

E. coli

• E. coli fermentuje wszystkie pentozy i heksozy

występujące w lignocellulozie: glukozę, ksylozę i

arabinozę

• Ale w wyniku fermentacji powstają metabolity: octany,

etanol, mleczan, wodór, szczawian, CO2

• Podniesienie wydajności produkcji etanolu przez

wprowadzenie genów i ekspresję enzymów

bakteryjnych z Zymomonas mobilis: dehydrogenazy

pirogronianowej (PDC) i dehydrogenazy alkoholowej

(ADH)

• Eliminacja niepotrzebnych metabolitów na drodze

mutagenezy

Ale niezbędna była mutageneza 38 genów

Produkcja ksylitolu

Ksylitol

• alkohol pochodzący z ksylozy

• słodkość zbliżona do sacharozy

• niska kaloryczność

• wysoka wartość 10-12 USD/ 1kg (etanol

0.28 USD / litr)

Rynek:Guma do życia, produkty dla

cukrzyków, zapobiega infekcji uszu

Rekombinowany S. cerevisiae i

ksylitolKsyloza KsylitolReduktaza xylozowa

/Pichia stipitis/

Ale brak energii na wzrost biomasy

Wymagany dodatek glukozy

Glukoza Biomasa+energiaGlikoliza

20g ksylozy + 18g glukozy = 20.1g ksylitolu + 9.52g suchej biomasy

Nowe cechy organizmów umożliwiające

detoksyfikację, degradację i mineralizację

toksycznych związków

Nowe cechy organizmów umożliwiające

detoksyfikację, degradację i mineralizację

toksycznych związków

• toluen, trichloroetylen – dehydrogenazy wklonowane do

Deinococcus radiodurans umożliwiają rozkład związków

organicznych na terenach radioaktywnych

• materiały wybuchowe – tytoń – transgeniczny tytoń

produkujący pentaerytriolową tetraazotową reduktazę z

Enterobacter cloacae może degradować trinitroglicerynę

(i trinitrotoluen), która stanowi powszechne

zanieczyszczenie poligonów

Zmiana własności komórek

Zmiana własności komórek

• zmniejszenie inhibicji fotosyntezy – ryż –

wprowadzenie karboksydazy

fofoenlopirogronianowej z kukrydzy zwiększa

poziom fotosyntezy

• odporność na herbicydy – wprowadzenie genu

EPSPS z petunii do tytoniu

• odporność na niskie temperatury – tytoń – delta

9 dezaturaza z cyjanobakterii wpływa na zmianę

składu lipidów w błonach lipidowych

Wina kalifornijskie

Wino i GM S. cerevisiae

Recombinantowe szczepy S. cerevisiae w produkcji wina stosuje się w celu polepszenia własności smakowych i zapachowych przez wprowadzenie obcych genów odpowiedzialnych za:

• dekarboksylację kwasu malonowego

• wzrost ilości garbnika-resveratrol, kwasu mlekowego i glicerolu

• oraz w celu podniesienia wytrzymałości szczepu na warunki procesu technologicznego

Przykłady:

Wprowadzane do S. cerevisiae geny uszlachetniające wino:

• Enzym odpowiedzialny za produkcję malmleczanu Oenococcus oeni i permeaza malonianowa z Schizosaccharomyces pombe – obniżenie kwasowości wina

• Podniesienie wydajności fermentacji przez wprowadzenia genu xylanazy z Aspergillus nidulans

• Ubogacenie zapachu wina przez nadekspresję genu alkoholowej acetylotransferazy

• i wiele innych modyfikacji

Wino i GM S. cerevisiae