f tNSTYTUT CHEMII BIOORGAN ICZNEJPolskiej Akademii Nauk

ul. lloskowstiego 1214.61-704 Pozn itel.: centrala 61 852 85 03. sel@tanal 61 852 89 19

faks:61 852 05 32, e-mail: ibch@ibdr.poznan.pl

REGON 0@849327 NrP 777{0{2{62http ,/www.ibch.po2nan.pl

Profl dr hab. Jerzy BoryskiZaklad Chemii Komponentow Kwas6w Nukleinowych

Pomai, 22 kwietnia 2020 r

Recenzja rozprawy doktorskiej mgr ini. Lukasza Przypisapt. ,,Synteza i wlaSciwo5ci pochodnych urydyny

modyfikowanych ukladem fluoroforowym'

Przedstawiona mi do recenzji praca dokorska mgr in2. Lukasza Przypisa zostala wykonana podkierunkiem profesora dr hab. in. Krrysztofa Walczaka w Katedrze Chemii Organicznej,Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziafu Chemii Politechniki SQskiej w Gliwicach. Jest onapoSwigcona syntezie nowych fluoryzuj4cych pochodnych urydyny, jednego z cderechpodstawowych nukleozyd6w wchodz4cych w sklad kwas6w rybonukleinowych. celem pracy byloopramwanie i zoptymalizowanie metod syntetycznych pozwalaj4cych na otrzymanie nukleozyd6wposiadajqcych grupg fluoroforow4 w pozycji 5 reszty uracylowej, ze szczegolnym uwzglgdnieniempodstawnika 3 -karbazoilowego.

Rozprawa doktorska mgr ia. tr ukasza Przypisa zostala napisana w ukladzie tradycyjnym i liczya:2 258 stron zapisanych drukiem o malej czcionce, jest wigc prac4 bardzo obszern4. Podzielona jestona ra trzy gl6wne czgsci: czg56 Literaturow4 (47 stron), czgs6 Badawcz4 (93 stron) oraz czg{cEksperymentalng (71 stron). Spis cytowanej literatury obejmtje atz 417 pozycji.

Na pocz4tku rozprawy Autor formuluje cel niniejszej pracy - opracowanie nowego t)rpupochodnych urydyny, kt6re wykazywatyby wla6ciwo6ci fluorescencyjne, a tt6re po wl4czeniu dolaricucha oligonukleotydowego moglyby znalezi zastosowanie jako sondy molekulame. Dlaaealizowania tego celu zaproponowano wprowadzanie fluoroforu o strukturze karbazolu oraz jegor6znie podstawionych pochodnych, poprzez wyworzenie wi4zania c-N lub c-c. w pierwszymwypadku byloby to wiqzanie migdzy c-5 uracylu i N-9 karbazolu, a w drugim - mipdzy c-5 uracylui C-3 karbazolu.

czgs6 Literaturowa wprowadzajqca w zagadnienia objgte rozprawa przedstawia nastgpuigcezagadnienia: podstawowe informacje o zjawisku fluorescencji, przyklady nukleozyd6wwykazujqcych fluorescencjg wraz z ich po&ialem pod wzglgdem strukuralnym, oraz om6wieniesyntezy i wla6ciwo6ci fluorescencyjnych ukladu karbazolowego. w tej tez czgsci sporo miejscaposwigcil Autor na om6wienie metod wytwarzania wiezania wggiel - wggiel, takich jak reakcjesprzggania wedfug wariant6w suzuki, Hecka czy Sonogashiry, oraz w metodzie wittiga. Ta czq!;(,doktoratu jest przygotowana dobrze i do66 wyczerpuj4co informuje czytelnika o "-gadnieniach kt6rebgd4 rozwijane w ramach pracy eksperymentalnej. Literatura cytowana w tej czgsci jest doi6 dobrze(z pewnymi wyjqtkami) dobrana i obejmuje u2,286 pozyqi.

Badania wlasne Doktoranta zostaty przedstawione w rozdaale zatytulowanym Czgsc Badawcza.

Po la6tkim om6wieniu strategii planowanych syntez koniugatow urydyny i jej pochodnych

z karbazolem oraz z jego podstawionymi analogami, Autor przechodzi do opisu otrzymywania obu

tych grup synton6w. W przypadku pochodnych uracylu oraz 2'-deoksyurydyny i jej acyklicznych

analog6w otrzymano l4cznie 11 zuri4zk6w posiadaj4cych w pozycji 5 gn pe formylow4 podstawnik

jodowy i w jednym przypadku grupe E-2-karboksywinylow4. W tej cz96ci pracy najbardziej

interesuj4ce osiEgnigcie to otrzymywanie zwi?zkow 5-formylowych na drodze utleniania tymidyny.

Przy ol,azji chcialbym zauwa2y6,2e pochodna 1-(2,3-dihydroksy)propylowa ma asymetryczny atom

wggla, zatem zostda otrzymana jako racemat, co powinno byd uwidocznione przez dodanie

w nazwie symbolu (&S)

Z kolei otrzymanie odpowiednich prekursor6w karbazolowych to najobszerniejsza czgS6 tego

doktoratu. Zadnie to okazalo sig trudniejsze i wymagalo doS6 zmudnego dopracowywania metod

i warunk6w reakcji. Autor poradzil sobie z tym dobrze: uzyskal N-alkilowane i N-arylowane

pochodne karbazolu, ktore byty nastgpnie modyfikowane w czgSci benzenowej. W pozycjg 3

wprowadzono nastgpuj4ce podstawniki, formyl, hydroksymetyl, hydroksyl, podstawnik nitrylowy,

karboksyl, karboksymetyl, grupg nitrow4, aminowq azydkow4, bromow4 czy wreszcie jodowq. Ten

ostatni miqzet,3-jodo-N9-etylokarbazol zostd wykorzystany jako substrat do otrzymania kolejnych

pochodnych, np. metylowej, metoksylowej czy boranowej. Otrzymane zostaly rownie2 liczne

pochodne z dwoma lub wigksz4liczbq podstawnik6w w obu pierScieniach benzenowych. Metodami

sprzggania uzyskano takhe produkty z podstawnikami nienasyconymi, jak pochodne 3-winylowa

i 3-etynylowa.

W dalszym ci4gu pracy otrzymane zostdy pochodne podstawione w pozycji 2 karbazolu.

PoniewiuZ mipzek ten nie ulega bezpoSrednim modyfikacjom w tej pozycji, Autor zaproponowal,

w wyniku analizy retrosynteycznej, modyfikacjg ,,rozcigtych" analog6w karbazolu, w kt6rych oba

pier$cienie bybby pol4czone albo wiq.zaniem C-C, albo przez grupe aminowq C-NH-C. Po

wprowadzeniu grupy bromowej, udalo sig przeprowadzi6 na drodze rdukcyjnej cyklizacji ukladu

nitobifenylowego 2-bromokarbazol. Zwiqzek ten moze sfuzyi do syntezy innych 2-modyfikowanych

analogow. W sumie Autor uzyskal kilkana6cie r6znie podstawionych prekursor6w karbazolowych.

Dysponuj4c dosc pokazn4 liczbq prekursor6w urydynowych oraz karbazolowyctU pan l-ukasz

Przypis przyst4pil do realizacji zasadmczego zadanra doktoratu, czyli otrzymywania koniugat6w

karbazolowych urydyny. Jako modelowy substrat wybral 5-jodo-2'-deoksyurydyng.

W systematyczny i racjonalny spos6b studiowal wplyw r6znych czynnik6w na reakcjg sprzggania:

temperatury, rodzaju i ilosci katalizatora palladowego, rodzaju stosowanej zasady oraz doboru

rozpuszczalnikow. W rezultacie, wychodz4cych z r6imych boroorganicznych pochodnych

karbazolowyctr, Autor otrzymal w reakcji Suzuki 14 nowych pochodnych orydyt y z wydajnoSciami

3z-BlYo. W podobny spos6b reagowaly inne pochodne 5-jodourydyny, ale 5-jodourcyl wymagal

wprowadzenia gnrpy ochronnej w pozycji Nl. Badania objgly tez inne metody sprzggani4 takie jak

reakcje Sonogashiry, Hecka czy Wittiga. N-qcnne udalo sig otrzymaO 24 nowe pochodne uracylu

i deoksyurydyny oraz jej acyklicznych analogow.C{(,

oLPU)

CzgS6 syntetyczi4 pracy kofczy opis otrzymywania acyklicznego analogu nukleozydu

karbazolu, kt6ry Autor nazywa ,,karbazolowym mimetykiem nukleozydu". Otrzymane zwi4zki tego

typu posiadaty grupg 2-hydroksyetylow4 na azocie karbazolowym, oraz pod*awniki arylowe lub

heteroarylowe w pozycji 3 karbazolu. W przypadku pochodnej 3-tiofenowej uzyskano odpowiednifosforynoamid, kt6ry ptzyl4czono w terminalnej pozycji 5' oligomer6w, zar6wno w serii DNA jaki RNA. Po otrzymaniu odpowiednich struktur dwuniciowych z komplementamymi oligomerami(9-mery i l5-mery) badano trwdo6d termodynamicznq powstdych dupleksow. Stwierdzono wyralnywplyw stabilizuj4cy nukleozydu karbazolowego na trwalo66 dupleks6w, wigkszy nav/et niZ

w przypadku obecno6ci jednostki typu LNA w modelowym dupleksie. Wedfug Autor4 tenstabilizujqcy wplyw,,mo2ra przypisa6 korzystnemu ustawieniu ukladu aromatycznegoi oddzialywaniu typu n-stacking z odpowiednimi nukleozasadami".

Z pewnoici4 to bardzo interesrj4cy fragment rozprawy, ale odcanwam tu pewien niedosyt. Autorotrzymal bowiem kilkanascie fluorescencyjnych koniugat6w karbazolu z deoksyurydynq wigcbyloby bardzo interesuj4ce, jak takie sondy wptywaj4 na trwalos6 dupleksow po wprowadzeniu ichw dowoln4 pozycjg laricucha, a nie tylko terminalna. odpowiedz na to pytanie znajduje sig na str.133: ,,w niniejszej pracy nie zostaly przedstawione badani4 w k6rych wlfirane koniugaty bytybadane pod k4tem ich interakcji z DNA,/RNA (obecnie jeszcze pracujg nad tym tematem wewspolpracy z University of Southem Denmark)". Ta odpowiedi zupelnie mnie satysfakcjonuje.Rozprawa jest juz i tak bardzo obszem4 I chyba dobrze, jesli praca doktorska nie jest tylkozamknigtym dzielem samym w sobie, ale stanowi punlt wt'Scia do dalszych badaii.

Wazn4 czg66 tego doktoratu stanowi4 analizy spektralne wlaiciwoSci emisyjno-absorpcyjnych.Fluorescencig badano zar6wno na poziomie polqczeh deoksyurydyny z karbazolerq jak i napoziomie modyfikowanych oligonukleotyd6w. W przrTpadku tych ostatnich zostda przeprowadzonar6wnie2 analiza z wykorzystaniem dichroizmu kolowego. Interesui4ce sq takze renitatymodelowania komputerowego pigciu wybranych koniugat6w urydyny i karbazolu, przeprowadzonez wykorzystaniem programu Gausian0g, co doprowadzilo do uzyskania najbar&iejprawdopodobnych struktur przestrzennych.

Ponadto wszystkie uzyskane zwiezki chemiczne zostdy scharakteryzowane za pomocQspektrometrii protonowego i wgglowego rezonansu magnetycznego (tH i t3c NMR), niestety wczpsci eksperymentalnej nie z.,atazly sig interpretacje poszczeg6lnych widrn, tj. przypisania danegosygnafu do konkretnego jqdra atomowego. Wigkszo5d produkt6w za*ala takze scharakreryzowanaza pomoc4 analizy elementarnej lub spektrometrii mas.

Reasumui4c, mgr inz. Lukasz przypis osi4gn4l wszystkie zamierzone cele swojej dysertacji.wykonal naprawdg olbrzymi4 liczbg eksperyment6w, a ich opis swiadczy, ze jest juzdoswiadczonym badaczem, kt6ry samodzielnie mo2e roztxi4rywat, skomplikowane zadanianaukowe. zrgcznie porusza sig migdzy r6znymi typami reakcji w chemii organicznei, potrafi4codpowiednio dobrai wlasciwe metody. wnikliwie i cierpliwe studiuje warunki reakcyjne, copozwala mu osi4ga6 bardzo dobre rezultaty w optymalizacji zaplanowanych syntez. wykazuje sporeumiejgtnosci w proponowaniu i analizowaniu mechanizm6w reakcji chemicznych. Dla ustalenia c11strukury otrzymanych produk6w potrafi zastosowa6 cal4 gamg analitycznych metod aparaturowych Eczy komputerowych. E

Pozwolg sobie teraz przedstawil zauwa;Zone minusy tej pracy. Moja gl6wna uwaga krytyczna

dotycry braku cytowania i przedstawienia kilku istotnych pozycji literaturowych, zar6wno

w przegl4dzie pi6miennictwa, jak i w om6wieniu badafr wlasnych. Pomysl, aby otrzymad koniugaty

fluoryzuj4cego kaxbazolu i komponent6w kwas6w nukleinowych nie jest nowy. Ju2 w roku 1976

w grupie J-L. Imbacha otrzymano rybonukleozyd karbazolu, w ktorym Cl' cukru polEczony byl

z Nl fluoroforu. (o i p anomery). Byl to wigc pierwszy karbazolowy mimetyk karbazolu. Trzydziefici

lat p6imej czysty p anomer w serii 2'-deoksy, nazu{any nukleozydem Il zostal wl4czony do

oligonukleotydow. Wykazano, 2e mo2e on uczestniczyt w fotoindukowanym transferze elektron6w

i naprawie dimer6w tymidynowych (Yoshimura i Fujimoto, 2006). Bardzo ciekawy zlwjrqzek

otrzymali w roku 1996 Matteucci i von Krosigk - byla to pochodna deoksycytydyny, w ktorej

pirymidynowa nukleozasada zastgpowala jeden z pierscieni benzenowych karbazolu. Na poziomie

oligonukleotydu tworzyl on komplementarn4 par1 z dG. Natomiast w roku 2018 X. Jia et al.

przedstawili reakcjg sprzggania metod4 Suzuki pinakoloboranowych pochodnych N-alkilokarbazolu

z 5-jodourydyna.

Kilka dalszych uwag krytycznych. Zyjemy w czasactq kiedy literaturg naukowq na Swiecie

zdominowal jE yk angielski, co oczywiScie jest dla nauki korzystne. W tym jezyku czytamy

i piszemy publikacje naukowe, co pozwala na szybk4 wymiang informacji. Gorzej, kiedy trzeba

przygotowa6 naukowe opracowanie w jgzyku ojczystym. Nie wiem, jak sobie radz4ztym naukowcy

w innych krajach, ale w Polsce, zvilaszcza dla mlodych adeptow nauki, to coraz trudniejsze

wyzwanie. Z tym wyzwaniem nie do kofca poradzil sobie Autor omawianej rozprawy doktorskiej.

Nie bgdg poruszal tu typowo polonistycznych btgdow, dotycz4cych interpunkcji, gramatyki czy

prostych blgdach edytorskich wynikaj4cych z niestarannej korekty, atakie wszechobecnego zargonu

laboratoryjnego, np. ,,zazzotowana kolba" (str. 169). Lista bylaby dfuga...

Skupimy sig jednak na nazewnictwie chemicznym. Zacnnjmy od boru: ,6vti4zkiboronoorganicznd' czy zwiqzki boroorganiczne? W jgryku polskim slowo ,,boron" nie wystgpuje -to angielska nazluta. boru. Podobnie nieprawidlowe jest wigc uZycie przez Autora sl6w ,,borony",

,,boronowod6f' czy,,kwas boronowy" zamiast borany, borowod6r, kwas borowy. Wplyw igzykaangielskiego zauwaayt te| moima w przypadku innych pierwiastk6w, np. rtgcl czy cyny. Nie ma

w jgzyku polskim takich sl6w jak ,,chloromerkurourydyna" czy ,,arylostannanopochodne" (str. 42).

Z kolei slowa ,,protekcja" czy ,,deprotekcja" nie mogq byc u2yte w znaczeriu wprowadzanie

i usuwanie grup ochronnych (lub blokuj4cych). Nie uzywa sig r6wnie2 w jezyku polskim

przymiotnika,,roentgenowski" (str. 16), lecz wersji spolszczonej: rentgenowski.

Nie mozna te2 w jgzyku polskim uzyd okreSlenia,,annulowane nukleozasady" (str. 25). W jgzyku

angielskim naz-rya sig je ,,expanded nucleobases", co mozna byloby tfumaczy6 jako ,,rozci4gnigte",

,,powigkszone" lub ,,rozsrerzone". Ja natomiast nukleozydy tego typu, np. l,It'-etenoadenozyng czy

nukleozydy ptolof2,34)pirydynowe nazywam analogami nukleozydowymi o dodatkowym

pier6cieniu w czgsci zasadowej. Mo2na te2 stosowae r:.azwy takie jak bicykliczne pochodne

pirymidyn, tricykliczne pochodne puryn, itp. Je6li ju| chodzi o nazewnictwo nukleozyd6w, to

Kandydat w bardzo wielu miejscach rozprawy nie rozr62nia w opisie nukleozyd6w od nukleozasad

czy ich analog6w. Dla przykladu. podpis pod rys. 7: ,,WlaSciwoSci absorpcyjno-emisyjne

2-aminopuryfly", & rysunek przedstawia rybonukleozyd tej zasady. To samo na rysunkach 8-10, 12,

st(ucoPa

14-17. Oczywiscie ten brak rozr62nienia wystgpuje tez wielokrotnie w tekscie, np. ,,6-Amino-7-

deazapuryna jest analogiem adenozyny", a powinno byi: adeniny. S4 tu te2 inne blgdy, np. podpis

pod rys.17: ,,Emisyjne analogi pirymidyn pol4czone bezpoSrednio z nukleozasad4" - prawidlowy

podpis to np. ,,Wykazuj4ce fluorescencjg analogi nukleozyd6w pirymidynowych, w kt6rych

fluorofor jest poleczony bezpoSrednio z nukleozasad4". Na marginesie, nie spotkalem sig nigdy

z okreSleniem ,,emisyjne nukleozydy" - czy nie lepiej po prostu u2y6 ,,fluoroscencyjne nukleozydy",

bo przex;iel o to w tej pracy chodzi. Poza tym pojpcie ,,emisja" jest bardzo szerokie i obejmuje np.

emisjg ciepla lub emisjg promieniowania gamma.

W ten sposob dochodzimy do wa2nego zagadnienia w tej rozprawie, jaki. se fluorofory. Autor

rozprawy podaje tak4 jego definicjg: ,,Fluorofor jest cz1steozk4 kt6ra posiada wla6ciwoSci emisyjne

po wzbudzeniu (wiatlem; wprowadzony do ukladu, kt6ry nie jest emisyjnyq nadaje mu wla6ciwoSci

fluorescencyjne". Nie to kofica sig z tym zgadzam, gdyz wedfug mnie fluorofor jest fragmentem

cz4steczki (b4dz grup4 funkcyjn4), odpowiedzialnym za ilawisko fluorescencji, a nie jest cz4sleczk4.

I jeszcze uwaga dotycz4ca redakcji tej

widzian4 przeze mnie rozprawe doktorskq

chemiczne nie s4 numerowane. Bardzo topreparatyk w Czg6ci Eksperymentalnej dlaprz),tak nracznej obiQtoSci rozprawy. Czynumeracjg?

pracy. Rozprawa p. I-ukasza Przypisa jest pierwsz4

z chemii organicznej, w kr6rej wystgpujqce zwi4zkiutrudnia czytanie i np. wyszukiwanie odpowiednichopisywanych w Czg6ci Badawczej reakcji, zulaszczam6glbym sig dowiedziec, w jakim celu pominigto tg

Przedstawione uwagi krytyczne nie wlywaj4 zasadniczo na moj4 pozytywn4 ocenQ

recerzowanego doktoratu. Mam nadziejg, 2e mog4 byd one przydatne przy przygotowaniu publikacjiczy wyst4piei seminaryjnych w jgzyku polskim.

W konkluzji stwierdzem, i;e rozpnwe doktorske mgr ini Lukesza Przypise pt. ,,Syntezri wlafciwo3ci pochodnych urydyny modyfikowanych ukhdem fluoroforowym" spelniaustrwowe warunki stewiane kendydatom ubicgejlcym sig o nadenie stopnir doldon- Dlrtcgownioskujg do Wysokiej Rady Wydzialu Chemii Potitechniki Sl4skiej w Gliwicacho dopuszczcnie mgr ini, Lukasza Przypisa do dalszych etap6w przewodu doktonkiego.

/Jerzy Boryski,/

LNco