Dr hab. n. med. Sylwia KwiatkowskaKlinika Gruźlicy i Chorób Płuc

Łódź 2003

Bakteriologia Bakteriologia gruźlicygruźlicy

Klasa - Schizomycetes

Rodzaj - Mycobacterium

Rząd - Actiomycetales

Rodzina - Mycobacteriacae

Klasyfikacja prątków

M. tuberculosis

M. bovis

M. microti

M. africanum

M. canettii

atenuowana forma M. bovis BCG

Mycobacterium tubeculosis complex

Grupa prątków atypowych Przedstawiciele

I Prątki fotochromogenne M. kansasii

II Prątki skotochromogenne

M. aquaeM. scrophulaceum

M. marinumM. gordonae

III Prątki niefotochromogenneM. avium

M. intracellulare

IV Prątki szybko rosnące

M. fortuitumM. phlei

M. smegmatisM. vaccae

Podział prątków atypowychwg Runyona

Materiały, w których poszukujemy prątkówu chorych na gruźlicę płuc

Plwocina spontaniczna Plwocina indukowana

Popłuczyny żołądkowePopłuczyny krtaniowe

Specimeny bronchoskopowe

Bronchoaspiratmateriał z cewnikowaniamateriał ze szczoteczkowaniaBALF

Metody wykrywania prątków

Bakterioskopia

Met. Ziehl-Neelsena

Met. fluorescencyjna - auramina - rodamina - oranż akrydyny

Wynik

+ - pojedyncze prątki w preparacie++ - pojedyncze prątki w poszczególnych polach widzenia+++ - liczne prątki w poszczególnych p.w.

1.

Bakterioskopia

Met. Bakterioskopii – szybka, tania, o niskiej czułości i swoistości

Nie odróżnia prątków gruźlicy od prątków atypowych, w tym saprofitycznych

Złoty standard w diagnostyce bakteriologicznej gruźlicy

Czułość 80-85% - wykrywa 10 prątków w 1 ml badanego materiału

Swoistość 98-100%

Uzyskany tą metodą wzrost prątków umożliwia ich dokładną identyfikację

Wyhodowanie prątków umożliwia przeprowadzenie testów lekowrażliwości

Uzyskanie hodowli prątków umożliwia za pomocą metod genetycznych prześledzenie łańcucha epidemiologicznego

Metoda hodowli2.

Metoda hodowli

Najczęściej używane podłoże to podłoże Lowensteina-Jensena

Prątki rosną wolno 3-8 tygodni

Ocena nasilenia prątkowania

(+) - do 20 kolonii, wynik podawany jest liczbą+ - liczba kol. 20-100++ - 100-200, wzrost policzalny+++ - powyżej 200 kol., wzrost zlewny, niepoliczalny

Prątki widoczne nierosnące – bacillus visibles non viables

Są widoczne w badaniu mikroskopowym, ale nie rosną na odpowiednich podłożach

Ich obecność łączy się ze skuteczną terapiąLiczba ich wzrosła po wprowadzeniu rifampicyny

Metoda hodowli

Hodowla prątków w systemie Bactec 460

Metoda Bactec 460

Metoda jest szczególnie użyteczna w wykrywaniu prątków w materiałach skąpoprątkowych:

• płyn opłucnowy• płyn mózgowo-rdzeniowy• plwocina od chorych ze zmianami

minimalnymi w płucach

Wzrost prątków występuje pod koniec pierwszego tygodnia, test lekowrażliwości trwa następny tydzień (dotyczy leków pierwszej linii terapii)

Metoda MB/BacT

Prątki rosną na podłożu Middlebrooka 7H9, a wytwarzany dwutlenek węgla powoduje zmianę zabarwienia sensora umieszczonego w dnie butelki z zielonej na żółtą

Sygnał detekcyjny w sposób ciągły przekazywany jest do komputera, który rejestruje intensywność wzrostu prątków

 MB/BacT Bactec 460 L-J

Mycobacterium tuberculosis complex

84,5 91,2 70,9

Odsetek dodatnich wyników w różnych metodach hodowli

Metody serologiczne

Odpowiedź humoralna w gruźlicy nie ma charakteru ochronnego. Odpowiedź humoralna rośnie wraz ze wzrostem zaawansowania zmian.

Badania serologiczne istotne w gruźlicy wieku dziecięcego oraz pozapłucnej.

Stosowana jest metoda ELISA oceniająca obecność przeciwciał w stosunku do antygenu 38kDa i A60.

Czułość tej metody 30-70% (w płynie opłucnowym 50%)

Metody genetyczne

Oparta jest na zjawisku hybrydyzacji pojedynczej nici kwasów nukleinowych z komplementarnym łańcuchem polinukleotydowym.

Sondy mogą być różnej długości, znakowane są izotopami i wykrywane przy pomocy licznika scyntylacyjnego, lub fosfatazą alkaliczną i wykrywany w reakcjach barwnych, lub za pomocą fluorescencji (oranż akrydyny).

1. Sonda genetyczna

Warunkiem jej przeprowadzenia jest znajomość sekwencji nukleotydowej otaczającej powielany fragment tak, aby można uzyskać jego komplementarny odcinek – tzw. „starter” (primer).

Najczęściej powielanym fragmentem genomu prątka jest sekwencja insercyjna IS 6110, a w następnej kolejności IS 986, gen kodujący HSP 65 kDa

2. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Metody genetyczne

PCR polega na wielokrotnej amplifikacji wybranych odcinków genomu prątka

Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Metody genetyczne

denaturacja w temp 95oC 1-3 min z uzyskaniem pojedynczej nici DNA

dołączenie w temp 50-72oC starterów (0,5 – 3 min)

synteza DNA przy pomocy termostabilnej polimerazy Taq w temp 72oC (0,5 – 3 min)

Liczba cykli 30-40.Zamplifikowany produkt wykrywa się przy pomocy znakowanych sond.

Przebieg reakcji łańcuchowej polimerazy

Metody genetyczne

Również swoista dla M. tuberculosis complex.

Amplifikuje się sekwencją kwasu nukleinowego kodującą antygen b (PAB).

Dwie pary oligonukleotydowych znakowannych sond hybrydyzują z komplementarną nicią DNA.

Termostabilna polimeraza wypełnia brakujący odcinek pojedynczej nici DNA.

3. Reakcja łańcuchowa ligazy

Metody genetyczne

Ligaza kowalencyjnie łączy dwie sąsiadujące sondy.

Zamplifikowany produkt absorbowany jest na mikrocząsteczkach.

Detekcja odbywa się w oparciu o reakcję fluorescencji w specjalnym analizatorze.

Reakcja łańcuchowa ligazy

Metody genetyczne

Wykrywa prątki M. tuberculosis complex żywe i martwe.

Średnia czułość 70-100%.

W materiałach skąpoprątkowych waha się pomiędzy 46 a 70%.

Dolna granica wykrywalności 10 prątków w badanym materiale.

Reakcja łańcuchowa polimerazy i ligazy

Metody genetyczne

Identyfikuje poszczególne szczepy prątków, wykorzystywana zwłaszcza w badaniach epidemiologicznych.

Ocenia ona ilość oraz umiejscowienie w genomie prątka sekwencji insercyjnej IS 6110 (1355 par zasad).

4. Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

• ekstrahowanie DNA z komórek prątków• poddanie go działaniu enzymów

restrykcyjnych• rozdzielenie fragmentów restrykcyjnych

na żelu agarozowym• przeniesienie rozdzielonego materiału

na nylonowe membrany• hybrydyzacja ze znakowanymi sondami

komplementarnymi do 245 par zasad fragmentu IS 6110

• odczyt komputerowy – układ i ilość linii • odpowiada wielkości poszczególnych

fragmentów.

Etapy RFLP

Metody genetyczne

Warunkiem zastosowania w badaniach epidemiologicznych określonego markera genetycznego (np. IS 6110) jest - z jednej strony - jego zmienność, występująca wystarczająco szybko, aby szczepy niezwiązane łańcuchem epidemiologicznym były różne. Natomiast - z drugiej strony – powinien on być na tyle stały, aby szczepy połączone ze sobą były identyczne. Okres półtrwania dla IS 6110 wynosi 3-4 lata i wydaje się spełniać te wymogi.

Metody genetyczne

Wynik metody RFLP

Gran Canaria

1991-1996 rok 960 chorych

56%Reactivatio endogenesnie zakończyli leczenia opornośc na leki

44%Reinfectio egzogeneszakończyli prawidłowo leczenie

18 chorych 2× zachorowałow okresie co najmniej 12 m-cy

Wsk. zap. 30

Am. J. Respir. Crit. Care Med.. 1994 r.

Metody chromatogaficzne

Liczba i rodzaj kwasów mykolowych są charakterystyczne dla każdego gatunku.

Rozdział wyekstrahowanych kwasów mykolowych na specjalnych kolumnach a uzyskane wzory elucyjne są swoiste dla danego gatunku prątka

Chromatografia płynna wysokociśnieniowaHPLC (High Preassure Liquid Chromatography)

pierwotna

lekooporność

wtórna

1987-1991 rok 17 chorych HIV+ prątkujących w posiewie co najmniej 1 rok

I grupa (ten sam szczep) zachowana wrażliwość na leki p. prątkowe

(ten sam szczep) lekooporność pierwotna i wtórna

4 chorychI-szy szczep – zachowana wrażliwość na lekiII nowy szczep wielolekooporny (lekooporność pierwotna wtórnie nabyta)

New York N Engl. J. Med. 1999 r.

Lekowrażliwość prątków

W Polsce badanie lekowrażliwości przeprowadza się:

1. Metodą wskaźnika RR (Resistance Ratio) = minimalne stężenie leku hamujące wzrost szczepu badanego / minimalne stężenie leku hamujące wzrost szczepu H37RvRR > 4 dla hydrazydu i strepromycynyRR > 8 dla PAS

2. Metodą proporcji z oceną krytycznego odsetka oporności

szczepy oporne