dr hab. Joanna Cieśla, prof. PW

Wydział Chemiczny PW

Katedra Biotechnologii Środków Leczniczych

i Kosmetyków

Gmach Technologii Chemicznej, pok. 305 (klatka B, III p.)

tel.: 222345576

e-mail: jciesla@ch.pw.edu.pl

Sposób oceny nabytej wiedzy

Kolokwium na ostatnich zajęciach (prawdopodobnie 23.01).

5 otwartych pytań ocenianych w zakresie 0-4 punktów:

Liczba punktów Ocena

11-12 3,0

12.1-14 3,5

14.1-16 4,0

17.1-18 4,5

18.1-20 5,0

Podstawowe źródła wiedzy biochemicznej

1. Wykłady:

http://test.ztibsl.ch.pw.edu.pl/materialy-dydaktyczne/swiat-

makroczasteczek-biologicznych/

1. Publikacje podawane na slajdach

2. J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer. Biochemia, wydanie VI.

Przekład pod redakcją Zofii Szweykowskiej-Kulińskiej i Artura

Jarmołowskiego. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009

3. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff,

Keith Roberts, and Peter Walter. Molecular Biology of the Cell, 4th

edition. New York: Garland Science; 2002.

Joanna Cieśla

ŚWIAT

MAKROCZĄSTECZEK

BIOLOGICZNYCH

Wykład 1. Odkrycie, struktura i właściwości DNA

Makrocząsteczki biologiczne

1. Kwasy nukleinowe

kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)

kwas rybonukleinowy (RNA)

2. Białka

3. Węglowodany (polisacharydy)

4. Lipidy

Systematyka organizmów żywych

Trzy domeny: Jądrowce - Eukarya (Eukaryota, eukarioty, eukarionty) – organizmy mające jądro

komórkowe

Bakterie - Bacteria (dawniej Eubacteria) - organizmy jednokomórkowe,

pozbawione jądra

Archeony - Archea (dawniej Archaebacteria) – organizmy jednokomórkowe,

pozbawione jądra komórkowego, żyjące w nietypowych środowiskach

Organizmy pozbawione jądra komórkowego – Prokaryota (prokarioty, prokarionty)

Komórka W każdej komórce eukariotycznej jest:

cytozol

jądro komórkowe

siateczka śródplazmatyczna gładka i szorstka

mitochondria

aparat Golgiego

peroksysomy

centrosom

błona komórkowa

lizosomy

Charakterystyczne dla komórki roślinnej:

chloroplasty

wakuola

ściana komórkowa

komórka

zwierzęca

komórka

roślinna

Charakterystyczne dla komórki bakteryjnej:

brak jądra, kolisty chromosom

plazmidy (nie u wszystkich)

ściana komórkowa (inna niż u roślin i różna u bakterii

gram+ i gram-) komórka

bakteryjna

Makrocząsteczki mają taką samą budowę w całym świecie ożywionym

20 aminokwasów

białkowych

Białko

Jacques Monod: “What

is true of E. coli is true

of the elephant.”

DNA RNA

Glikogen

Skrobia

KWASY NUKLEINOWE

Odkrycie kwasu deoksyrybonukleinowego

(DNA)

Friedrich Miescher

(1844-1895)

1869 r. – odkrycie nowej substancji -

nukleiny.

Zamek w Tybindze

• Uniwersytet w Tybindze: chemia w

laboratorium Adolpha Streckera, histochemia

pod kierunkiem Felixa Hoppego-Seylera

• Uniwersytet w Bazylei: profesura w wieku 28 lat

• Uniwersytet w Bazylei: medycyna

Miescher zasugerował, że nukleina

może być kwasem, występującym

także w innych tkankach.

Gabryelska MM, Szymański M, Barciszewski J. (2009) NAUKA 2:111-134

Analiza składu atomowego nukleiny wykazała:

Obecność C, H, O, N

Obecność S (zanieczyszczenie białkami)

Obecność P (w niezwykłej proporcji do innych pierwiastków,

niespotykanej w żadnych innych znanych cząsteczkach organicznych)

Spalenie nukleiny i zawieszenie popiołu w wodzie:

Nie było reakcji charakterystycznej dla kwasu fosforowego → fosfor jest

związany organicznie i wyparował podczas spalania.

“We rather have here entities sui generis [= of their own kind] not

comparable to any hitherto known group.”

Miescher F. (1871) Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen. Medicinisch-chemische

Untersuchungen 4:441–460.

Jaką funkcję w komórce może pełnić nukleina?

Magazyn fosforu?

Rezerwuar innych cząsteczek?

Substancja, z której powstaje lecytyna?

Udział w zapłodnieniu?

(Miescher, 1874: „If one [...] wants to assume that a single substance [...] is the specific

cause of fertilization, then one should undoubtely first and foremost consider nuclein”)

lecytyna (fosfatydylocholina)

Miescher zaobserwował:

…“increase in nuclear substances [as] a preliminary phase to cell division in

proliferating tissues, such as tumours”

Miescher F. (1869) Letter V; to Wilhelm His; Leipzig, December 20th 1869. In: His W et al (eds) Die

Histochemischen und Physiologischen Arbeiten von Friedrich Miescher - Aus dem wissenschaftlichen

Briefwechsel von F. Miescher, vol 1. F. C. W. Vogel, Leipzig, pp 39–41.

„Knowledge of the relationship between nuclear substances, proteins and

their closest conversion products will gradually help to lift the veil which still

utterly conceals the inner processes of cell growth.”

Miescher F (1871) Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen. Medicinisch-chemische

Untersuchungen 4:441–460.

Miescher zasugerował również, że wyłączna obecność nukleiny w jądrze

komórkowym jest znacząca i że jądro nie powinno być dalej definiowane

poprzez jego morfologiczne właściwości, ale przez obecność nukleiny, jako

że ten fakt ściślej określa funkcję fizjologiczną tego organellum.

Miescher F (1870) Nachträgliche Bemerkungen. In: His W et al (eds) Die Histochemischen und

Physiologischen Arbeiten von Friedrich Miescher - A. Arbeiten von F. Miescher, vol 2. F. C. W. Vogel,

Leipzig, pp 32–34.

Dalsze ustalenia dotyczące nukleiny

(praca Mieschera na Uniwersytecie w Bazylei)

1. Siarka, znajdowana uprzednio, jest wynikiem zanieczyszczenia

2. Cały fosfor, obecny w nukleinie, występuje w postaci kwasu

fosforowego

3. Nukleina jest kwasem przynajmniej czterozasadowym

4. Nukleina ma dużą masę cząsteczkową

5. Propozycje składu atomowego nukleiny (błędne) : C22H32N6P2O16,

C29H49N9P3O22

6. Obecność nukleiny w próbkach spermy pochodzących z różnych

gatunków (łosoś, karp, żaba, kogut, byk)

Dalsze prace nad DNA

Albrecht Kossel – 1879 r. identyfikacja podstawowych elementów budujących

nukleinę: zasady azotowe (purynowe i pirymidynowe),

cukier i kwas fosforowy. Potwierdzenie, że nukleina

występuje wyłącznie w jądrze komórkowym. Razem z

białkami histonowymi nukleina jest kluczowym

składnikiem chromatyny. Nukleina nie służy ani jako

materiał zapasowy ani źródło energii, lecz jest związana

z syntezą nowej protoplazmy podczas wzrostu.

Nagroda Nobla 1910 r. za badania nad właściwościami

chemicznymi białek i kwasów nukleinowych.

Richard Altmann – 1889 r. Wydzielenie substancji nazwanej kwasem

nukleinowym (Nucleïnsäure). Nie zdawał sobie sprawy

z tego, że jest to nukleina Mieschera.

H

OH

H

O

H H

H

OH

HOCH2

2'-deoksyryboza

N

1 2

3 4

5

6

N

Pirymidyna

N

N 1

2 3 4

5

6

N

N 7

8 9

Puryna

H3PO4

Prace nad dziedziczeniem

Gregor Mendel – 1866 r. dziedziczenie cech grochu jest zgodne z pewnymi

prawami (I – czystości gamet i II – niezależnej segregacji)

Wacław Mayzel – 1873 r. Odkrył mitozę w komórkach zwierzęcych, mitozę w

komórkach roślinnych odkrył Edward Strasburger w 1876. Badania nad mitozą

prowadzili następnie Otto Bütschli (od 1876) i Oscar Hertwig (od 1892). Twórcą

terminu był Walther Flemming.

Oscar Hertwig – 1875 r. Odkrył i opisał mejozę.

Prace m. in. Augusta Weismana, Eduarda Strasburgera, Walthera Flemminga,

Heinricha von Waldeyera i Edouarda Van Benedena

– dziedziczna informacja jest przekazywana tylko przez komórki rozrodcze –

jaja i plemniki. Komórki ciała (somatyczne) nie mogą przekazać informacji

genetycznej do następnego pokolenia.

Terminy: jądro komórkowe, cytoplazma (Strasburger), mitoza (Flemming)

chromatyna (Van Beneden), chromosom (Waldeyer)

1944 r. Przełomowa publikacja:

Oswald T. Avery, Colin MacLeod,

Maclyn McCarty

pokazali, że substancją zdolną do

transformacji niegroźnego szczepu

bakterii w szczep zakaźny jest

kwas deoksyrybonukleinowy

DNA jest nośnikiem informacji genetycznej

Eksperyment Griffitha, 1928 r.

(„substancja transformująca”):

Avery OT, MacLeod CM, McCarty M (1944). J Exp Med 79:137–158.

Dalsze prace nad DNA i dziedziczeniem

Erwin Chargaff – lata 40./50. XX w.

Prawa Chargaffa:

1.W DNA jest tyle samo zasad purynowych (A + G) co

pirymidynowych (C + T), stosunek molowy A/T i G/C wynosi

zawsze ok. 1, ale stosunki A/C, A/G, T/C i T/G mogą się znacznie różnić.

2.Kompozycja zasad DNA różni się pomiędzy gatunkami, czyli (A+T)/(G+C) jest

różny u różnych gatunków.

Kompozycja zasad azotowych oznaczona eksperymentalnie:

Gatunek

Człowiek

Łosoś

Pszenica

Drożdże

Escherichia coli

Pałeczka krwawa

W jaki sposób informacja genetyczna jest

przechowywana w DNA i wiernie replikowana

przed każdym podziałem komórki?

Badania krystalograficzne

Budowa modeli cząsteczki DNA

Podwójna helisa DNA

Cechy wzorów dyfrakcji

promieni rentgenowskich

wskazywały, że DNA

tworzy dwa łańcuchy

zwinięte w regularną

strukturę helikalną.

Rosalind Franklin i Maurice Wilkins –

badania struktury trójwymiarowej DNA

Obraz dyfrakcji promieni X

na uwodnionym włóknie DNA

(Photo-51)

Raymond Gosling

doktorant

Model cząsteczki DNA

James Watson i Francis Crick na

podstawie obrazu dyfrakcyjnego i

innych danych wydedukowali

przestrzenną strukturę DNA (1953 r).

1962 r. – Nagroda Nobla wraz z

M. Wilkinsem

Watson JD, Crick FHC (1953) A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171:737–738. 25 April

Wilkins, M., Stokes, A. & Wilson, H. (1953) Molecular Structure of Nucleic Acids: Molecular Structure of

Deoxypentose Nucleic Acids. Nature 171, 738–740. 25 April

Franklin, R., Gosling, R. (1953) Molecular Configuration in Sodium Thymonucleate. Nature 171, 740–741. 25 April

Watson J, Crick, F. (1953) Genetical Implications of the Structure of Deoxyribonucleic Acid. Nature 171, 964–967.

30 May

Franklin, R., Gosling, R. (1953) Evidence for 2-Chain Helix in Crystalline Structure of Sodium Deoxyribonucleate.

Nature 172, 156–157. 25 July

Najistotniejsze cechy modelu Watsona i Cricka

G C

A T

Komplementarne nici są

antyrównoległe:

5’....…CATTGCCAGT…...3’

3’…....GTAACGGTCA…...5’

Dwa helikalne łańcuchy polinukleotydowe oplatają

wspólną oś. Biegną w przeciwnych kierunkach.

Rdzeń cukrowo-fosforanowy biegnie na zewnątrz.

Zasady purynowe i pirymidynowe są wewnątrz helisy.

Płaszczyzny zasad są niemal prostopadłe do osi

helisy, odległość między sąsiednimi zasadami wynosi

0.34 nm. Całkowity skręt helisy powtarza się co 3.4

nm, czyli co 10 nukleotydów. Zasady są skręcone

względem siebie pod kątem 36˚.

Średnica podwójnej helisy wynosi 2 nm.

DNA jest liniowym polimerem złożonym z czterech rodzajów

monomerów. Ma stały szkielet, z którego wystają podstawniki.

Szkielet: deoksyryboza i fosforan. Podstawniki: 4 rodzaje zasad azotowych

Monomer: deoksynukleotyd złożony z jednostki cukrowo-fosforanowej

i jednej z czterech zasad azotowych

Nukleotydy

OH

OH

H

O

H H

H

OH

HOCH2

H

OH

H

O

H H

H

OH

HOCH2

ryboza

(w RNA)

2'-deoksyryboza

(w DNA)

N

1 2

3 4

5

6

N

PIRYMIDYNA

cytozyna

tymina

uracyl

N

N 1

2 3 4

5

6

N

N 7

8 9

PURYNA

adenina

guanina O

N

zasada

cukier 1’

2’ 3’

4’

5’ CH2 P

O

O-

O-

reszta kwasu

ortofosforowego

DNA: dAMP, dGMP, dCMP, TMP

RNA: AMP, GMP, CMP, UMP

N

Zasady azotowe

(A) (G)

(C) (U) (T)

tylko w RNA tylko w DNA

(Deoksy)nukleozyd – jednostka składająca się

z zasady azotowej połączonej z cukrem

wiązaniem β-glikozydowym.

DNA: deoksyadenozyna, deoksyguanozyna,

deoksycytydyna, tymidyna

RNA: adenozyna, guanozyna, cytydyna, urydyna

(Deoksy)nukleotyd – (deoksy)nukleozyd połączony wiązaniem estrowym z

przynajmniej jedną grupą fosforanową

Miejsce estryfikacji: C-5' cukru

Produkt estryfikacji: (deoksy)nukleozydo-5'-fosforan (lub 5'-fosforan

(deoksy)nukleozydu)

Jednostki nukleotydowe w kwasach nukleinowych:

(deoksy)adenylan, (deoksy)guanozylan,

(deoksy)cytydylan, tymidylan (w DNA), urydylan (w RNA)

Nazewnictwo

9

1’

(d)NMP – (deoksy)nukleozydo-5'-monofosforan

(d)NDP – (deoksy)nukleozydo- 5'-difosforan

(d)NTP – (deoksy)nukleozydo-5'-trifosforan deoksyadenozyno-5’-fosforan (dATP)

W komórce są:

Fragment łańcucha kwasu nukleinowego

Przyjęto, że kolejność zasad

zapisuje się w kierunku 5' → 3'

wiązanie β-

glikozydowe

5’

3’

wiązanie

fosfodiestrowe

Donory i akceptory wiązań wodorowych

w zasadach azotowych

Pary A-T i G-C mają podobną geometrię

i wymiary

Tautomeryczne formy

zasad azotowych

Jedna z przyczyn

mutacji w DNA

https://www.golifescience.com/dna-damage/

Duży i mały rowek

(bruzda) w helisie typu B

Wiązania glikozydowe nie leżą dokładnie

naprzeciwko siebie – każda para zasad ma stronę

która wyznacza duży rowek helisy i drugą,

wyznaczającą mały rowek.

Każdy z rowków jest pokryty atomami, które

będąc potencjalnymi donorami lub akceptorami

podczas tworzenia wiązań wodorowych stwarzają

możliwości oddziaływania z białkami.

Siły utrzymujące DNA w postaci

dwuniciowej helisy

1. Oddziaływania między zasocjowanymi

warstwowo parami zasad (hydrofobowe)

2. Oddziaływania elektrostatyczne (grupy

fosforanowe).

3. Wiązania wodorowe

Oddziaływania

elektrostatyczne

w DNA

Gdy nici łączą się, wiązania wodorowe z cząsteczkami

wody ulegają zerwaniu i tworzą się między zasadami.

Wiązania wodorowe między nićmi DNA

4. Oddziaływania van der Waalsa.

Asocjacja warstwowa zasad

w dwuniciowej helisie DNA

Topnienie dwuniciowej helisy

Dwie nici rozdzielają się, gdy zostaną zerwane wiązania

wodorowe między zasadami azotowymi – topnienie DNA

W warunkach

laboratoryjnych:

• temperatura

• alkalizacja

W komórce:

• helikazy

Efekt hipochromowy:

ssDNA absorbuje wydajniej

przy 260 nm niż dsDNA.

Absorbancja roztworu DNA przy

260 nm wzrasta, gdy dwuniciowa

helisa topi się do dwóch

pojedynczych łańcuchów.

Po obniżeniu temperatury poniżej Tm rozdzielone

komplementarne łańcuchy DNA spontanicznie reasocjują

odtwarzając strukturę podwójnej helisy.

Temperatura topnienia

(Tm) – temperatura, w

której dochodzi do

utraty połowy helikalnej

struktury.

Denaturacja DNA przez dodanie zasady

pKa > 9

Do roztworu zawierającego dwuniciową

helisę dodajemy stężoną zasadę:

wzrasta pH, ale nie zmienia się

znacząco stężenie podwójnej helisy

przy pH ~ 9 helisa zaczyna

dysocjować na pojedyncze nici

składowe

przy pH 10 nici ulegają całkowitej

dysocjacji.

Dlaczego?

Reakcje typu kwas-zasada mogą

rozerwać dwuniciową helisę

OH- OH- OH-

OH-

OH-

OH-

1

Odebranie protonu biorącego udział w wiązaniu wodorowym

między zasadami destabilizuje podwójną helisę

Drugorzędowa struktura dwuniciowej helisy DNA

B-DNA A-DNA

W komórce DNA przyjmuje głównie

strukturę B-DNA.

Strukturę przypominającą A-DNA

przyjmują dwuniciowe fragmenty RNA

oraz niektóre hybrydy RNA-DNA

Antyrównoległe nici tworzące

prawoskrętną helisę

Dwuniciowa helisa DNA może przyjmować różne formy strukturalne

Z-DNA

Strukturę typu Z przyjmują krótkie fragmenty oligonukleotydowe

zbudowane z następujących po sobie na przemian reszt purynowych

i pirymidynowych (np. dCGCGCG).

Nici są antyrównoległe, ale helisa jest lewoskrętna.

Trzeciorzędowa struktura dwuniciowej helisy DNA

Na jeden skręt helisy przypada 10.4 par zasad, a więc odcinek o długości 260 par

zasad utworzy 260 : 10.4 = 25 skrętów

Lk (linking number, liczba opleceń )– ile razy w

kolistym DNA nić DNA owija się prawoskrętnie

wokół osi helisy sprowadzonej do prostej leżącej

na płaszczyźnie

Tw (twisting number, liczba skrętów)

odzwierciedla helikalne wzajemne skręcenie

pojedynczych nici względem siebie.

Wr (writhing number, liczba zwojów) – miara

zwinięcia osi dwuniciowej helisy -

superhelikalność. Prawoskrętne zwinięcia –

ujemna wartość Wr, lewoskrętne – dodatnia.

Dwuniciowe helisy DNA mogą tworzyć struktury trzeciorzędowe

dzięki superhelikalności

Większość komórkowego DNA ma negatywne superhelikalne skręty.

Co się stanie jeśli przed połączeniem DNA w strukturę kolistą odwiniemy 2

skręty helisy?

Struktury topologicznie identyczne mogą różnić się

liczbą skrętów (Tw) oraz liczbą zwojów (Wr).

Lk = Tw + Wr

Topoizomery DNA

różnią się wyłącznie

liczbą opleceń Lk

Struktury topologicznie identyczne, lecz różne geometrycznie:

Topologia – gałąź matematyki zajmująca się właściwościami strukturalnymi,

które nie ulegają zmianom podczas zginania czy rozciągania.

Eukariotyczny DNA jest

związany z histonami

Histony – małe, silnie

zasadowe białka (1/4 reszt

aminokwasowych to Arg lub Lys) Histony: H2A, H2B, H3, H4 (i histon H1)

Chromatyna zbudowana jest z powtarzających się jednostek

(nukleosomów) , z których każda zawiera 200 pz DNA i po dwie kopie

histonów H2A, H2B, H3 i H4. Białka te tworzą wspólnie oktamer histonowy.

Mikrografia elektronowa chromatyny z

uwidocznionymi nukleosomami (koraliki

nanizane na sznurek). Każdy koralik

(nukleosom) ma średnicę ok. 10 nm.

Budowa chromatyny

Stuktura nukleosomu: 8 białek histonowych oplecionych DNA

widok z boku

widok z góry

schemat

Cząsteczka DNA tworzy oplatającą rdzeń

lewoskrętną superhelisę.

Ogony aminowych końców histonów zawierają

znaczną liczbę reszt Lys i Arg, które podlegają

modyfikacjom kowalencyjnym – funkcje

regulacyjne.

Struktura chromatyny

wyższego rzędu (solenoidu)

Histon H1 ma inną budowę niż pozostałe histony.

Oddziałuje z DNA łącznikowym, znajdującym się

pomiędzy nukleosomami (spaja nukleosom).

Solenoid: helisa utworzona z łańcucha nukleosomów.

Umożliwia wielokrotne skrócenie długości DNA

(kondensację). W metafazie długość DNA zostaje

skrócona 10 000 razy.

Długość DNA w pojedynczym jądrze komórki: ok. 2 metrów.

Całkowita dł. DNA w organizmie człowieka: kilka mln km.

Upakowanie DNA

Oplatanie DNA wokół rdzenia

histonowego umożliwia

przechowywanie ujemnych

skrętów.

Rozprostowanie DNA

nukleosomu rozplata

podwójną helisę

Przekazywanie informacji genetycznej

Replikacja semikonserwatywna:

jedna nić pochodzi z cząsteczki

rodzicielskiej, a druga jest dobudowana

na zasadzie komplementarności zasad

Rodzicielska cząsteczka DNA

Pierwsze pokolenie cząsteczek potomnych

Drugie pokolenie cząsteczek potomnych

Watson JD, Crick FH (1953) Genetical implications of the

structure of deoxyribonucleic acid. Nature 171:964–967

Kolejność nukleotydów jednej nici

precyzyjnie określa kolejność

nukleotydów w drugiej nici.

Mathew Meselson i Franklin Stahl, 1958 r. – "the most beautiful experiment in biology"

Doświadczalny dowód na semikonserwatywną replikację DNA

Hodowla wielu pokoleń E. coli na pożywce z 15NH4Cl jako jedynym

źródłem azotu, a następnie szybkie przeniesienie bakterii do

środowiska ze zwykłym izotopem azotu 14N.

Zbadanie rozdzielenia się 14N-DNA i 15N-DNA metodą wirowania

równowagowego w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Izolacja i wirowanie DNA z

bakterii w różnym czasie od

przeniesienia do pożywki 14N

Rozpuszczalność kwasów nukleinowych

Dobrze w roztworach zasadowych (charakter polianionowy DNA i RNA), słabo w

rozcieńczonych kwasach i wodzie

W roztworach wodnych tworzą koloidy, które łatwo wytrącić czynnikami

odwadniającymi (etanol, izopropanol)

Chemiczna hydroliza kwasów nukleinowych

DNA: oporny na działanie mocnych zasad – brak produktów hydrolizy w 1M NaOH,

40 h w temp 37°C

RNA: całkowity rozpad do mieszaniny 2’ i 3’-monofosfonukleozydów w powyższych

warunkach (obecność grupy OH przy C2’ rybozy umożliwia powstawanie nietrwałych

cyklicznych nukleozydo-2’,3’-fosforanów)

Działanie mocnych kwasów mineralnych (72% HClO4, 100°C, 1 h) na DNA i RNA:

uwolnienie zasad purynowych, pirymidynowych, pentoz i kwasu fosforowego

Krótkotrwałe działanie rozcieńczonych kwasów (1M HCl, 100°C, krótko) na DNA i

RNA: początkowo powstają kwasy apurynowe (w nukleotydach purynowych wiązania

glikozydowe są bardziej labilne niż w pirymidynowych), po 1 h uwalniają się

mononukleotydy pirymidynowe, pentozy i kwas fosforowy.

Własności kwasów nukleinowych

Chemiczna denaturacja DNA i RNA

W obojętnym pH – kilkumolowe stężenia mocznika lub formamidu – rozerwanie

wiązań wodorowych i usuwanie cząsteczek wody spomiędzy zasocjowanych zasad

Lepkość i sztywność cząsteczki

Szerokość: 2 nm, długość: w µm, mm, a nawet w cm → DNA jest cząsteczką

sztywną, przez co roztwory DNA są lepkie. Sonikacja powoduje fragmentację DNA

Gęstość

1.7 g/ml – podobna do gęstości 8 M CsCl

Możliwość oczyszczania DNA za pomocą

wirowania równowagowego

Odróżnienie DNA od RNA

Opiera się na wykrywaniu różnych pentoz – rybozy lub deoksyrybozy)

Wykrywanie DNA metodą Dischego:

w środowisku kwaśnym deoksyryboza

tworzy z difenyloaminą niebieski produkt

kondensacji

Wykrywanie RNA metodą

orcynową (reakcja Biala):

pentozy i fosfopentozy wolne oraz

związane w nukleotydach

purynowych przechodzą podczas

ogrzewania ze stężonym HCl w

furfural, który tworzy z orcyną zielony

kompleks. W tych warunkach

deoksyryboza reaguje 10x słabiej niż

ryboza furfural orcyna

Barwny

kompleks

Wykazanie obecności puryn w hydrolizacie

Zasady azotowe reagują z jonami Ag+ (lub Cu+), tworząc nierozpuszczalne sole

kompleksowe. Reakcję prowadzi się w obecności amoniaku w lekko alkalicznym

pH. Wytrąca się osad soli srebrowych puryn nierozpuszczalnych w amoniaku

Wykazanie obecności kwasu fosforowego

Kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecności HNO3 – powstaje

żółty osad fosfomolibdenianu amonu

Spektrofotometria nukleotydów i kwasów nukleinowych

Kwasy nukleinowe, nukleotydy, nukleozydy i zasady azotowe pochłaniają światło

UV z max = 260 nm. Reszty monocukrowe i grupy fosforanowe nie mają wpływu

na tę absorbancję.

Efekt hipochromowy – absorbancja DNA nie jest addytywną sumą absorbancji

jego pochłaniających światło składników. Rzeczywista molowa absorpcja jest ok.

40% niższa niż wyliczona na podstawie składu.

A260/A280 ~ 1.8 → wolny od zanieczyszczeń białkiem DNA

A260/A280 ~ 2 → wolny od zanieczyszczeń białkiem RNA

A260/A230 ~ 2 - 2.2 → brak zanieczyszczeń substancjami absorbującymi przy

230 nm lub mniej (np. fenolem)

Preparat DNA o wartości A260/A280 > 1.8 może być zanieczyszczony RNA, a

A260/A280 < 1.8 wskazuje na zanieczyszczenie białkami lub fenolem

A260 = 1 → 50 µg/ml dsDNA;

40 µg/ml ssDNA lub RNA

20 µg/ml oligonukleotyd

Podsumowanie

Wszystkie żywe organizmy, pomimo różnorodności form i różnic

fizjologicznych, są jednorodne pod względem biochemicznym.

Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) został odkryty przez szwajcarskiego

badacza Friedricha Mieschera w 1869 r.

Strukturę DNA ostatecznie rozwiązali Amerykanin James Watson i Anglik

Francis Crick w 1953 r.

DNA jest biopolimerem złożonym z deoksyrybonukleotydów.

Większość DNA w komórce występuje w postaci podwójnej helisy.

W podwójnej helisie nici biegną antyrównolegle, na zewnątrz jest szkielet

cukrowo-fosforanowy, a wewnątrz 4 rodzaje zasad azotowych łączących się

wiązaniami wodorowymi A=T i G≡C.

Komplementarność łączenia się zasad umożliwia wierną, semikonserwatywną

replikację materiału genetycznego.

W komórkach eukariotycznych DNA związany jest z zasadowymi białkami –

histonami i upakowany w chromosomach podczas podziału komórki.