1

Badania produktów żywnościowych pod kątem zanieczyszczeń drobnoustrojami patogennymi w

ramach urzędowej kontroli żywnościzgodnie z obowiązującymi normami

Normy PN-EN ISO

HANNA PITUCH, MICHAŁ PIOTROWSKI

KATEDRA I ZAKŁAD MIKROBIOLOGII LEKARSKIEJ

WARSZAWSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY

Bezpieczeństwo żywności

• Zanieczyszczenie żywności drobnoustrojami chorobotwórczymi powodującymi zatrucia pokarmowe stanowi zagrożenie dla zdrowia konsumenta

• Grupy ryzyka: małe dzieci, kobiety w ciąży, osoby starsze, chorzy z niedoborami immunologicznymi, chorzy po przeszczepach, chorzy z NZJ

• Na szerzenie się zatruć pokarmowych ma wpływ: – czystość mikrobiologiczna surowca (zanieczyszczenia pierwotne)

– sposób przygotowania potraw (zanieczyszczenia wtórne)- czystośćsprzętu, aparatury, higiena pomieszczeń oraz przechowywanie

– higiena osobista personelu

– transport

Definicja zatrucia pokarmowego

• Aktualna definicja zatrucia pokarmowego (food poisoning= foodborne disease) wg WHO to:

„każda choroba zakaźna lub zatrucie spowodowane przez spożycie

� żywności (foodborne)

� wody (waterborne)

bez względu na to czy objawia się tylko wymiotami lub tylko biegunkąlub wymiotami i biegunką czy też towarzyszą temu objawy spoza układu pokarmowego np. ze strony układu nerwowego.”

Warunki, które muszą spełniać mikroorganizmy aby doszło do zatrucia/zakażenia układu pokarmowego

• zdolne do życia

• przeżywać kwaśne środowisko żołądka i działanie enzymów trawiennych (wiele organizmów nie przeżywa kwaśnego środowiska, ale spożycie wraz z pokarmem, redukuje niekorzystny wpływ pH)

• konkurować z florą naturalną

2

Udział czynników etiologicznych w powodowaniu zatruć pokarmowych w EU

Podział ze względu na rezerwuar

• I. Bakterie komensalne w przewodzie pokarmowym zwierząt - Campylobacter, EHEC, Salmonella inne niżTyphi, Yersinia enterocolitica

• II. Zwierzęta trawożerne: EHEC (wołowina)

• III. Trzoda chlewna- Yersinia sp. (wieprzowina)

• IV. Owoce morza - Vibrio, Areomonas, Plesiomonas

• V. Woda - V. cholerae, Plesiomonas

• VI. Zakażenie od personelu - ETEC, Salmonella Typhi,Shigella sp. Staphylococcus aureus

• VII. Środowisko - Listeria, Clostridium perfringens,

• C. botulinum, Bacillus cereus

Podział patogennych bakterii na kategorie ze względu na sposób oddziaływania

I. Produkcja toksyny w żywności: C. botulinum, B. cereus

(typ emetyczny), Staphylococcus aureus - czas inkubacji 1-6 godzin

II. Produkcja toksyny in vivo: Aeromonas sp., B. cereus (typ biegunkowy), C. perfringens, EHEC, ETEC, Plesiomonas, V. cholerae, V. parahaemolyticus – czas inkubacji od 6 godzin do kilku dni)

III. inwazja: Brucella sp., Campylobacter sp., Listeria

monocytogenes, Salmonella sp. V. vulnificus, Yersinia

enterocolitica – czas inkubacji (od kilku dni do kilku tygodni)

Salmonella sp.

• Gram-ujemne pałeczki, względne beztlenowce, nie przetrwalnikujące, w większości ruchliwe, (z wyjątkiem S. Gallinarum i S. Pullorum); należące do rodziny Enterobacteriaceae

• Do rodzaju Salmonella zgodnie z propozycją międzynarodowego ośrodka referencyjnego Salmonella w Paryżu (1997) należy dwa gatunki: S. enterica i S. bongori

• Gatunek S. enterica podzielono na 6 podgatunków: S. enterica,

S. salamae, S. arizonae, S. diarizonae, S. houtenae i S. indica

Podgatunki podzielono na serowary z których 60% należy do podgatunku S.enterica.spp. enterica

3

Salmonella sp.

• Wzrost: – Temperatura: 5,2-49°C– pH-4-9– aktywno ść wody najlepiej a w>0,94C

• Całkowite zahamowanie wzrostu :– temperatura <5ºC– pH<3,8,– aktywno ści wody < 0,94– ale wyj ątkowo odporne na wysuszenie (anaerobioza). W postac i wysuszonej

S. Mbandaka , S. Choleraesuis mog ą przetrwa ć powy żej 1 roku. Przez dwa lata mog ąprzeżywać w kurzu, w suszonym kale, paszach i żywno ści.

• Wrażliwo ść:– wysoka temperatur ę (70°C) – promieniowanie beta i gamma, środki dezynfekuj ące (czwartorz ędowe zasady

amoniowe, preparaty zawieraj ące chlor, jodofory).– proces pasteryzacji: mleko (71,7ºC, 15 sekund) i so k owocowy (70-74ºC w czasie < 20

sekund).

Salmonella sp.

• Badania ZHW i PIWet w Puławach: głównym źródłem pałeczek Salmonella jest drób a dopiero potem trzoda chlewna i bydło.

• Występowanie Salmonella w żywności pochodzenia zwierzęcego: jaja i produkty je zawierające, drób, mięso, mleko i przetwory mleczne, ciastka, kremy, lody, owoce, soki, herbata a także produkty roślinne nawożone fekaliami

• Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady 2160/2003 z 2003 roku nakłada na kraje członkowskie UE obowiązek zwalczania pałeczek Salmonella u zwierząt, w paszach i w żywności pochodzenia zwierzęcego oraz monitorowania ich oporności na substancje przeciwbakteryjne

Rozporządzenie (WE) 2073/2005

• Zgodnie z rozporządzeniem (WE) 2073/2005 badania, których celem jest wykrycie baterii Salmonella powinny być przeprowadzone dla takich produktów jak:

• surowe mięso,

• produkty mięsne przeznaczone do spożycia na surowo,

• żelatyna,

• sery,

• masło,

• śmietana,

• nie pasteryzowane mleko,

• mleko w proszku,

• jaja, produkty zawierające surowe jaja,

• skorupiaki, mięczaki,

• owoce i warzywa,

• soki nie pasteryzowane,

• preparaty w proszku dla niemowląt,

• żywność dietetyczna specjalnego przeznaczenia medycznego.

Salmoneloza

• Główne serowary w Polsce to: S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Hadar, S. Infantis, Virchov, Agona.

• Typowe objawy to biegunka, bóle brzucha i mięśni, gorączka,

• Okres inkubacji od 5 godzin do 5 dni, przy dawce infekcyjnej 105 objawy pojawiają się już po 12-28 godzinach

• Dawka infekcyjna dla osób zdrowych to 105- 107 komórek

• Dla S. Typhimurium 102 u niemowląt i osób starszych

4

Występowanie Salmonella w żywności pochodzenia zwierzęcego w Polsce w roku 2005 (wg Kwiatka i Hoszowskiego,2006)

Kategoria produktu Liczba próbek badanych

Liczba próbek dodatnich

Odsetek próbek dodatnich

Jaja i przetwory jajowe 1059 19 1,79%

Mięso mielone, wyroby z mięsa mielonego, tusze i mi ęso w elementach (bez drobiu)

11822 114 0,96%

Produkty mi ęsne do spo życia (bez drobiu)

9818 14 0,14%

Mięso drobiowe (tuszki, elementy, mi ęso mielone)

2002 185 9,24%

Produkty z mi ęsa drobiowego

646 3 0,46%

Mleko i przetwory mleczne

4026 0 0%

Ryby i przetwory rybne 1474 0 0%

Środowisko zakładów przetwórstwa

1712 2 0,11%

Pięć serowarów Salmonella najczęściej notowanych w Polsce w 2004 r. z uwzględnieniem źródła izolacji wg Kwiatek 2008

Środki żywienia zwierząt (n=62)

Drób

(n=225)

Trzoda chlewna

(n=36)

Żywność

(n=105)

Ludzie

(wg PZH)

Typhimurium 25,8% Enteritidis 48% Typhimurium 30,6%

Enteritidis 26,7% Enteritidis 82,6%

Mbandaka 14,5% Infantis 10,7% Choleraesuis 19,4%

Infantis 15,2% Hadar 5%

Anatum 11,3% Hadar 8,4% Bredeney 19,4% Hadar 14,3% Typhimurium 3,8%

Infantis 8,1% Typhimurium 6,2%

Infantis 11,1% Typhimurium 10,5%

Infantis 2,7%

Seftenberg 8,1% Mbandaka 5,3% Agona 5,6% Agona 10,5% Virchow 1,9%

Dur brzuszny i dury rzekome

• Dur brzuszny: Salmonella Typhi. Źródłem zakażenia może być woda pitna, produkty spożywcze (mleko, śmietana, ciastka, lody) lub osoby chore i nosiciele. Okres wylęgania 7-28 dni, objawy to bóle brzucha, głowy, wysoka temperatura, wysypka, potem biegunka, może dojśćdo powiększenia śledziony, wątroby, owrzodzenia jelita cienkiego i zapalenia otrzewnej.

• Dury rzekome: S. Paratyphi A, B, C.

• W Polsce najczęściej występuje typ B; A i C niezwykle rzadko

Shigella sp.

• Pałeczki Gram-ujemne należące do gatunków: S. dysenteriae (A), S. flexneri

(typ B), S. boydii (typ C) i S. sonnei (typ D)

• Rosną w temperaturze 10-48°C, dobrze znoszą niskie temperatury, nie sąciepłooporne, giną w 56 °C w ciągu 30 minut.

• Wrażliwe na wysychanie, działanie azotanów, (V), niskie pH, stężenie soli NaCL powyżej 5,2% na promieniowanie jonizujące i powszechnie stosowane środki dezynfekcyjne.

• Najczęstszym źródłem pałeczek Shigella w żywności jest woda stosowana w przemyśle spożywczym

• Najczęściej żywność: pochodzenia morskiego, drób, mleko i przetwory mleczne (masło, śmietana, ser), warzywa i sałatki.

5

Eschericha coli

• Enteropatogenne (EPEC)-woda, mięso, przetwory mięsne

• Enterotoksyczne (ETEC)- sery, wędzony drób, sałatki warzywne, woda

• Enteroinwazyjne (EIEC)- woda, sery, konserwy rybne, sałatki, izolowano z sera francuskiego, tofu

• Shiga toxin-producing E.coli (STEC) - O157H7 (EHEC) i non-O157H7-surowe mięso, nie pasteryzowane mleko i jego przetwory, sałatki

• Enteroagregacyjne (EAEC)- głównie kraje rozwijające się, izolowano z mleka dla niemowląt

• Dyfuzyjno-adherencyjne (DAEC)-głównie kraje rozwijające się

Eschericha coli

• Szczepy E. coli odznaczają się zróżnicowaną wrażliwością na czynniki fizyczne i chemiczne.

• Podwyższona temperatura szybko eliminuje je ze środowiska. Przyjmuje się, że w temperaturze 60oC E. coli ginie w ciągu 20 minut.

• Natomiast warunki chłodnicze (ok. 0°C) powodują przedłużenie żywotności bakterii w wodzie do kilku miesięcy, a w kale nawet do roku.

STEC-O157H7

• Shiga- toxin producing E. Coli (STEC) powodują wybuchy epidemii oraz sporadyczne przypadki zatrucia pokarmowego wywołane przez spożycie skażonej żywności i wody w USA i innych wysokorozwiniętych krajach

• STEC-O157H7 jest epidemiologicznie najbardziej istotny

• Pierwsza izolacja w 1982 roku w czasie wybuchu epidemii po spożyciu hamburgerów w fast-foodach w USA

• 73.000 przypadków choroby wywołanej przez E. coli O157H7 w USA

STEC-O157H7 (EHEC)-biologia

• Temperatura wzrostu 7ºC- 50ºC (temperatura optymalna 37ºC)

• Niektóre szczepy rosną w żywności zakwaszonej (pH=4,4)

• Ulega zniszczeniu w temperaturze powyżej 70ºC w czasie gotowania

• Rezerwuarem jest bydło i inne trawożerne (krowy mleczne, cielęta)

• Surowa lub niedogotowana żywność np. surowe mleko

• Kontaminacja innej żywności przygotowywanej razem z wołowiną

• Epidemie (WHO) po spożyciu: hamburgerów, suszonej salami, nie pasteryzowanego, świeżego soku jabłkowego, jogurtu, sera i mleka. Wzrost zatruć po spożyciu sałatek Coleslaw, sałaty ogrodowej (kontakt z odchodami zwierząt domowych i dzikich)

• Epidemie z powodu skażonej wody zarówno do picia jak i używanej w celach rekreacyjnych (stawy, strumienie)

• Kontakt z osoba chorą jest ważnym sposobem transmisji (droga oralno-fekalna)

• nosicielstwo

6

EHEC O157H7

• Bezobjawowe nosicielstwo

• Biegunki o średniej częstości

• Ostre zapalenie jelita (bez gorączki, leukocytów w kale) do biegunek z krwią

• czas inkubacji 3-8 dni

• po 1-3 dniach rozwija się biegunka krwista u ¼ do ¾ pacjentów i trwa 4-10 dni

• u połowy pacjentów obserwuje się wymioty

• po 7 dniach u 5-10% pacjentów (młodsze dzieci i osoby starsze) rozwija się zespółhemolityczno mocznicowy (ZHM) (Hemolitic uremic syndrom-(HUS)

• Shiga like toxin (Stx) (geny stx1 i/lub stx2) odgrywa rolę w patogenezie HUS

• objawy HUS to: niewydolność nerek, anemia hemolityczna, trombocytopenia

Norma PN-EN ISO 16654: 2002,, Mikrobiologia żywności i pasz-

Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli O157”.

• W niniejszej normie określono horyzontalną metodą wykrywanie Escherichia coli

O157H7.

• Zastosowanie tej normy ograniczono do produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi lub środków żywienia dla zwierząt.

• Definicja Escherichia coli 0157

„Drobnoustroje, których kolonie wyrosłe na powierzchni pożywki w warunkach określonych w niniejszej normie wytwarzają indol i aglutynują specyficznie z surowicą anty 0157”.

Uwaga: szczepy E. coli sorbitolo-dodatnie nie wykrywa się na pożywce CT-SMAC

Stwierdzono indolo-ujemne mutanty.

Norma PN-EN ISO 16654: 2002,, Mikrobiologia żywności i pasz-

Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli O157”.

• Zasada metody:

• I – namnażanie homogenizowanej naważki w zmodyfikowanym bulionie tryptono -sojowym zawierającym nowobiocynę(mTSB+N) 6 godzin potem dalsze 12 godzin w 41,5ºC

• II – separacja i koncentracja drobnoustrojów za pomocą immunomagnetycznych cząstek opłaszczonych przeciwciałami anty - E. coli 0157

• III – izolowanie za pomocą posiewu immunomagnetycznych cząstek z przylegającymi bakteriami (objętość 50µl) na pożywkę agarową McConkey z cefiximem, sorbitolem (CT-SMAC) i na drugą wybraną przez użytkownika selektywna pożywkę (37,5ºC). Kolonie są przezroczyste i słabo zabarwione, z żółtobrązową otoczką

• IV – potwierdzenie kolonii sorbitolo –ujemnych pobranych z pożywki CT-SMAC i typowych kolonii E. coli z drugiej pożywki izolacyjnej z uwzględnieniem wytwarzania indolu i aglutynacji z surowicą E. coli 0157 (dalsza identyfikacja w ośrodku referencyjnym).

• E. coli 0157: indolododatnie, aglutynacja 0157 (+), aglutynacja 0157H7 (+), badanie antygenów rzęskowych, charakterystyka chorobotwórczości. Laboratorium referencyjne.

Yersinia enterocolitica - biologia

• Gram-ujemna pałeczka; 7 biotypów: 1A, 1B, 2, 3, 4, 5, 6;

• nie chorobotwórcze 1A

• Serotypy chorobotwórcze dla ludzi: O:3, O:5,27, O:8 i O:9; w szczególności O:3 na całym świecie w tym w Europie

• W Polsce: 4/O:3-dominuje, 2/O:9 pojedyncze zachorowania, 1B/O:8- „emerging pathogen”

• Dobrze rośnie w temperaturze 22-29°C i pH 4,6-9,0

• Y. enterocolitica namnaża się w temperaturze 4°C i wytwarza ciepłostabilnąenterotoksynę; przeżywa zamrożenie przez długi okres

• Jest ciepłooporna, oporna na duże stężenie soli, oporna na różnice pH

7

Yersinia enterocolitica a żywność

• Głównym źródłem zakażenia jest surowe lub niedogotowane mięso wieprzowe

• W badaniach (Polska) 612 próbek pochodzących od świń oraz 92 próbek pochodzących od dzików ( migdałki podniebienne) wyhodowano 141 szczepów

Y. enterocolitica od trzody chlewnej (tj. 23,2% próbek) i 13 szczepów od dzików.

• Zarówno trzoda chlewna jak i dziki są regularnie rezerwuarem

Y. enterocolitica O:3 i O:9

• Zanieczyszczona woda

• Woda użyta w czasie produkcji żywności (tofu, fasola)

• Produkty mleczne

• Konsumpcja nie przegotowanej wody (czynnik ryzyka –Norwegia, serogrupa O:3)

Kontrola i zapobieganie

• Redukcja kontaminacji i higiena podczas wszystkich etapów obróbki wieprzowiny ponieważ rutynowa kontrola podczas inspekcji sanitarnej jest praktycznie niemożliwa

• Usuwanie jelit w czasie obróbki

• Wycięcie języka, a w szczególności migdałków

• Usunięcie podżuchwowych węzłów

• Informowanie wszystkich osób włączonych w cykl produkcyjny o konieczności zastosowania dobrej praktyki produkcyjnej

• Y. enterocolitica jest wrażliwa na chlorowanie.

Norma PN-EN ISO 10273: 2005/Ap1/Ap2,,Mikrobiologia żywności i pasz-

Horyzontalna metoda oznaczania przypuszczalnie chorobotwórczych Yersinia enterocolitica”.

• Definicja: przypuszczalnie chorobotwórcze Yersinia enterocolitica: psychotrofowe bakterie tworzące charakterystyczne kolonie na stałych podłożach selektywnych i wykazujące właściwości i cechy biochemiczne łącznie z chorobotwórczymi, jeśli badanie przeprowadzono zgodnie z międzynarodową normą.

• Norma ma zastosowanie do:– Produktów przeznaczonych do spożycia przez ludzi i pasz dla zwierząt

– Prób środowiskowych z obszaru produkcji i dystrybucji żywności

• Określenie obecności lub braku obecności tych bakterii we wstępnie określonej ilości produktu, jeśli badanie przeprowadza się zgodnie z międzynarodową normą.

Norma PN-EN ISO 10273: 2005/(Ap1/Ap2),,Mikrobiologia żywności i pasz-

Horyzontalna metoda oznaczania przypuszczalnie chorobotwórczych Yersinia

enterocolitica”.

Zasada działania:

I – namnażanie w selektywnych pożywkach płynnych

Pożywka PSB - bulion z peptonem, sorbitolem i solami żółci (2-3 dni, 22°C)

Pożywka ITC - bulion z irgasem, tykarcyliną, chloranem potasowym (48 godzin, 25°C) tylko dla biowaru 4/ serowar O:3, ale nie dla innych biowarów np. biowar 1/serowar 0:8, 1B/serowarO;8, biowar 2/ serowarO:9, biowar2/serowar O:5,27).

II – przesiew, izolacja i identyfikacja:

Pożywka CIN - agar z cefsulodyną, irgasem i nowobiocyną

Pożywka chromogenna

Inkubacja w temperaturze 30°C, 24 godziny

III. Potwierdzenie: kolonie przypuszczalnie Y. enterocolitica przesiać , w celu wykonania potwierdzających biochemicznych testów, odnośnie biotypu, chorobotwórczości oraz t. serologiczne

8

Wzrost Y. enterocolitica na pożywkach stałych

• Na agarze CIN kolonie są małe (1 mm), gładkie z czerwonym środkiem i półprzezroczystą obwódką, drobnoziarniste

Norma PN-EN ISO 10273: 2005/(Ap1/Ap),,Mikrobiologia żywności i pasz-

Horyzontalna metoda oznaczania przypuszczalnie chorobotwórczych Yersinia enterocolitica”.

• Określenie gatunku: biochemiczne testy potwierdzające: lizyna (-), ornityna (+), ramnoza (-), sacharoza (+), cytrynian (-).

• Określenie chorobotwórczości: wstępne testy chorobotwórczości: eskulina, pirazynamidaza, wapniozależność w 37°C

• Przypuszczalnie chorobotwórcze Yersinia są:

• Trehaloza (+/-)

• Ramnoza (+/-)

• Ksyloza (+/-)

• Eskulina (-)

• Pirazynamidaza (-)

• wapniozależność (+)

• Z mięsa wieprzowego wyizolowano nieliczne chorobotwórcze szczepy Y.

enterocolitica sacharozo-ujemne.

Biotypowanie Y. enterocolitica (biowary)

Biowar Tween

esteraza

Eskulina Pirazina

midaza

Indol Ksyloza Trehaloz

a

1A + + + + + +

1B + - - + + +

2 - - - (+) + +

3 - - - - + +

4 - - - - - +

5 - - - - Sł. -

Podsumowanie dla Y. enterocolitica

• Szczep eskulino i/lub pirazynamidazo dodatni i wapniozależno-ujemny w 37°C jest niechorobotwórczy

• Szczep eskulino i/lub pirazynamidazo ujemny i wapniozależno-dodatni w 37°C jest chorobotwórczy

• Kolonie, których wzrost jest zahamowany w temperaturze 37°C na pożywce ze szczawianem i magnezem są wapniozależne i przypuszczalnie chorobotwórcze

9

Grupa Bacillus cereus

Grupa B. cereus zawiera 6 gatunków

• B. cereus sensu stricto

• B. thuringiensis

• B. mycoides

• B. anthracis

• B. weihenstephanensis

• B. pseudomycoides

Kryteria różnicujące gatunki w grupieBacillus cereus

Gatunek Kolonie Ruch Hemoliza Wrażli. na PEN

Protoksyna

Wirul.

dla myszy

B. cereus Białe + + - - -

B.anthracis Białe - - + - +

B. mycoides Rizoida-lne

- - - - -

B.thuringien

sis

Białe/

szare

+ + - + -

Bacillus cereus jako czynnik zatruć pokarmowych oraz psucia się żywności

Bacillus cereus Gram dodatnia, ruchliwa, tlenowa lub względnie beztlenowa laseczka, wytwarzająca przetrwalniki, bytująca w środowisku.

• Drobnoustrój pierwszy raz wyhodowano z powietrza z obory 1887r

• Zdolny do wzrostu w szerokim zakresie temperatur między 10°C a 50°C, optymalna temperatura wzrostu to 28-35°C

• Niektóre warianty mogą wzrastać w temperaturze 5°C

• pH wzrostu: 4,9-9,3

• Współczynnik aktywności wody aw: 0,91-0,95

• Przetrwalniki odporne na różne czynniki środowiska, między innymi na zamrażanie, ogrzewanie, suszenie i promieniowanie (90% redukcji spor uzyskuje się stosując 1,25-4kGy i 0,17-0,65 kGy w przypadku form wegetatywnych).

• Decymalny czas redukcji w 100°C określono na. 2,2 min.-5,4 min

Bacillus cereus jako czynnik zatruć pokarmowych oraz psucia się żywności

• W 1955 roku Norweg Steinar Hauge rozpoznał i udowodnił, że B.cereus powoduje zatrucia pokarmowe. Wywołał u siebie objawy chorobowe po spożyciu sosu waniliowego, który skaziłszczepem B. cereus wyhodowanym z żywności w czasie zatrucia pokarmowego

• W 1974 roku wykazano, że B. cereus powoduje emetyczny typ zatrucia pokarmowego (Mortimer i McCann, 1974)

• W 2006 roku wykazano, że powoduje biofilm co sprzyja psuciu się maszyn do produkcji żywności.

10

Chorobotwórczość Bacillus cereus

Chorobotwórczość bakterii B. cereus zdeterminowana jest stopniem inwazyjności oraz wytwarzaniem toksyn i enzymów o charakterze toksycznym.

Inwazyjność szczepów Bacillus cereus

Inwazyjność: związana jest z zewnętrznymi strukturami komórek tych bakterii, ich hydrofobowością lub hydrofilnością.

• Białka S - komórki wegetatywne wydzielają białka o krystalicznej budowie w dużych ilościach.

• Rzęski - ułożone perytrichalnie posiadają ruchliwe szczepy.

• Przetrwalniki - stanowią dodatkowy czynnik wirulencji ze względu na: hydrofobową powierzchnię, która ułatwia im przytwierdzanie się do komórek nabłonka jelit oraz do powierzchni roboczych (problemy w przetwórstwie mleczarskim).

• Szczepy wytwarzające przetrwalniki o dużej zdolności adhezji mimo dawki infekcyjnej nie przekraczającej 5X104 spor (200 spor /g) spożytego pokarmu) powodują schorzenia o cięższym przebiegu.

• Warstwa S zwiększa adhezję do kolagenu typu I, lamininy, fibronektyny i fibrynogenu.

Toksyny B. cereus

• Dwa typy białek o charakterze toksyn. Najważniejsze to: enterotoksyny (HBL i NHL) i toksyna emetyczna=cereulid (wymiotna)

• Poza tym różne białka toksyczne:

3 fospolipazy C – powodujące degranulację neutrofili. Każda ma inny mechanizm działania

sfingomielinaza - przyczepia się do sfingomieliny erytrocytów

cereolizyna AB - ciepłolabilna, aktywowana przez grupy tiolowe

hemolizyna II (Hly II) - ciepłostabilna, cytolityczne działanie

hemolizyna III (Hly III) - mechanizm wielouderzeniowy

hemolizyna podobna do cereolizyny

cytotoksyna K (CytK) jest białkiem toksycznym w stosunku do komórek linii Vero i posiada właściwości hemolityczne; duże podobieństwo do α-toksyny Staphylococcus aureus i β-toksyny C. perfringens typ C.

Enterotoksyny B. cereus

Biegunkowy typ zatrucia pokarmowego wywołują dwie enterotoksyny:

• hemolizyna BL (HBL)

• niehemolityczna enterotoksyna (NHE)

11

Enterotoksyny B. cereus-cd

• Hemolizyna BL (HBL)-termostabilna, trójskładnikowa enterotoksyna składa się z trzech komponentów: B (37KDa), L (38 KDa) i L2 (46KDa). Obecność wszystkich 3 komponentów jest konieczna do wywołania objawów. HBL wywołuje działanie dermonekrotyczne, wpływa na przepuszczalność naczyń włosowatych i aktywuje jelitową cyklazęadenylową co powoduje biegunkę

• Niehemolityczna toksyna (NHE) składa się również z trzech komponentów białkowych (NheA-41kDa, NheB-39kDa, NheC- 105 kDa). Najsilniejsze działanie obserwuje się gdy te trzy komponenty występują równocześnie.

Toksyna emetyczna B. cereus –Cereulid

• Toksyna emetyczna (wymiotna) B. cereus tzw. cereulid ma formępierścienia zbudowanego z trzech powtórzeń czterech amino i/lub oksykwasów (dodekapsipeptyd-D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val) posiada masę 1,2 kDa i jest podobna do jonoforu potasowego walinomycyny.

• Wytwarzana jest podczas fazy wzrostu i wydzielana do środowiska

• Produkowana przez system NRPS (non-ribosomal peptide synthetases).

• Ciepło- i kwasoporna, nie ma właściwości antygenu

• Szczepy należące do serowaru H-1 (urzęsione) a także nieliczne H-3, H-5, H-12.

Toksyna emetyczna B. cereus –Cereulid

• Szczepy emetyczne nie rosną w temperaturze 10ºC, wszystkie rosną w temp. 48ºC.

• Spory szczepów Emet+ wykazują wyższą oporność na działanie temperatury 90ºC i kiełkują wolniej w temp. 7ºC.

• Ilość produkowanej emetyny zależy od szczepu, składu środowiska, pH, temperatury i dostępu tlenu (zawartość tlenu <1,6% hamuje produkcjęemetyny)

• Optymalna temp. do produkcji emetyny to 15-30ºC.

• Ilość toksyny emetycznej, która wywoływała wymioty to 0,02-1,28 µg cereulidu/g.

Toksyna emetyczna B. cereus –Cereulid

• Toksyna emetyczna działa jak jonofor transportujący jony K+ do mitochondriów zgodnie z gradientem stężeń i gradientem elektrycznym; unieczynnia mitochondria co wykorzystano w teście ruchliwości plemników (test wakuolizacji)

• Szczepy emetyczne różnią się od innych B. cereus:

– brakiem amylazy, słabą aktywnością hemolityczną, innymi wymaganiami temperaturowymi

– wykazują większą odporność na temperaturę i stanowią zagrożenie w żywności podgrzewanej i przetrzymywanej w temperaturze pokojowej (restauracje, bary); żywność przechowywana w niskiej temperaturze nie powinna stanowić zagrożenia, ponieważ wykazująone mniejszą aktywność w niskiej temp. niż inne szczepy B. cereus.

12

Testy do wykrywania toksyn B. cereus

• Enterotoksyna: BCET-RPLA (Bacillus cereus Enterotoxin Reverse Passive Agglutination test), Tecra BDE-VIA-(Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immuno Assay), techniki genetyczne

• Cereulid: test aktywności plemników (sperm based bioassay-boar spermatozan motility test, metody chromatograficzne (LC-iontrap-MS, HPLC-MS), techniki genetyczne (PCR i RT-PCR)

Inni przedstawiciele grupy B. cereus oraz inne gatunki

• B. thuringiensis i B. mycoides są zdolne do produkcji enterotoksyny

• Szczepy B. licheniformis, B.firmus, B. megaterium,

B. simplex mogą produkować toksynę ciepłooporną przypominającątoksynę emetyczną B, cereus.

• Sugeruje to, że nie tylko B. cereus sensu stricto jest czynnikiem zatrućpokarmowych ale też inne gatunki z rodzaju Bacillus.

Objawy chorobowe zatrucia wywołanego przez B. cereus

• Typ biegunkowy: wodnista biegunka oraz bóle brzucha pojawiające się po 8-16 godzinach; objawy przypominające zatrucie C. perfingens utrzymują się12-24 godzin.; uwalniana w jelicie ciepłolabilna enterotoksyna aktywuje cyklazę adenylową, powoduje sekrecję płynów w jelicie

• Typ wymiotny: wprowadzenie wraz z pokarmem gotowej toksyny -cereulidu; objawy to nudności i wymioty pojawiające się po 0,5-5 godzin po spożyciu i utrzymujące się od 6-24 godzin (przypominają zatrucie enterotoksyną gronkowcową)

• Liczba komórek B. cereus, która może wyprodukować taką ilość cereulidu aby spowodować zatrucie to 105-108 CFU/g żywności, ale nawet 103 /gram żywności może spowodować zatrucie.

Porównanie cech dwóch typów zatrućpokarmowych wywołanych przez B. cereus

Objawy Czas inkubacji Czas trwania choroby

Dawka infekcyjna Żywnośćpotencjalnie skażona

Typ biegunkowy (objawy przypominajązatrucie C.

perfringens)

8-16 godz. 12-24 godz. 103-107 CFU produkty mięsne, zupy, warzywne, budynie, sosy, mleko i produkty mleczne

Typ wymiotny (objawy przypominajązatrucie enetrotoksynągronkowcową)

1-5 godz. 12-24 godz. 105-108 CFU/ gram żywności

smażony, gotowany ryż, makaron, ciastka i makaron

13

Chorobotwórczość B. cereus

Oprócz zatruć pokarmowych B. cereus może powodować inne schorzenia takie jak:

• bakteriemia szczególnie u osób z obniżoną odpornością, narkomanów, niemowląt, osób starszych, alkoholików

• zakażenia oka, rogówki ( np. szkła kontaktowe), wewnętrzne zapalenie oka i zapalenie całej gałki ocznej

• Zakażenia przyranne i pooperacyjne powiązane z produkcjączynnika HBL, czynnika przenikalności naczyniowej martwiczego zapalenia skóry

• Zakażenie ran otwartych

• Martwicza infekcja opon mózgowych

• Szok septyczny

• Nagłe uszkodzenie wątroby spowodowane działaniem cereulidu

• Martwicze zapalenie żołądka.

Epidemiologia zatruć pokarmowych wywołanych przez B. cereus

Dane dotyczące liczby zatruć wywołanych przez B. cereus są ograniczone ze względu na dobrowolny charakter takiej ewidencji.

• Wg danych CDC B. cereus odpowiada za 1% ogniskowych zatrućpokarmowych w USA, a liczba odnotowanych rocznie przypadków waha się między 6-50.

• W Europie 1-2 ogniska zachorowań. Na Węgrzech w 2000 roku 40 przypadków, w Holandii 2%, we Francji 4-5%

• W Polsce od 37 do 313 (średnio 88 rocznie odnotowanych jako ,,inne czynniki” w tym B. cereus i V. parahaemolyticus).

• Typ zatrucia zależy od typu spożywanej żywności: w Japonii typ emetyczny, w Europie typ biegunkowy.

Norma PN-EN ISO 7932:2005,, Mikrobiologia żywności i pasz-

Horyzontalna metoda oznaczania przypuszczalnych Bacillus cereus. Metoda płytkowa.

Przypuszczalne B. cereus - drobnoustroje tworzące kolonie na powierzchni selektywnej pożywki, wykazujące pozytywną reakcję w testach potwierdzających, w warunkach określonych w normie międzynarodowej

• Opisano horyzontalną metodę oznaczania liczby żywych przypuszczalnych

B. cereus metodą płytkową w temperaturze wzrostu 30°C

• Norma przyjęta przez CEN (Comite European de Normalisation) 17 czerwca 2004 roku.

• Zakres normy:

1. Produkty spożywcze i pasze oraz

2. Próbki środowiskowe w obszarze produkcji i obrotu żywności

Norma PN-EN ISO 7932:2005,, Mikrobiologia żywności i pasz-

Horyzontalna metoda oznaczania przypuszczalnych Bacillus cereus. Metoda płytkowa.

• Pożywka MYP:

- Pożywka podstawowa

- Roztwór polimyksyny B

- Emulsja żółtka jaja

• Pożywka agarowa z krwią: pożywka podstawowa i krew barania

• Inkubacja w temperaturze 30°C (18-24 godzin)

• Po inkubacji wybrać płytki zawierające mniej niż 150 kolonii, najlepiej z dwóch kolejnych rozcieńczeń

• Kolonie są duże różowe (mannitolo-ujemne) otoczone strefą zmętnienia, co wskazuje na wytwarzanie lecytynazy

• Z każdej płytki wybrać 5 kolonii i potwierdzić:

• Test na hemolizę na pożywce agarowej z krwią barania

• Kolonie posiać przez wkłucie lub punktowo na powierzchni agaru z krwią (30°C (18-24 godzin)

14

Clostridium perfringens jako czynnik zatrućpokarmowych

Szczepy należące do Clostridium perfingens biotypu A sączynnikiem:

• zgorzeli gazowej,

• zatruć pokarmowych,

• biegunek poantybiotykowych.

Główne biotypy C. perfringens

Szczepy C. perfringens wytwarzają toksyny, które podzielono na toksyny główne (major toxins) i uboczne (minor toxins).

Toksyny główne to:

toksyna alfa (α),

dwie toksyny beta (β1 i β2),

toksyna epsilon (ε)toksyna jota (ι). Toksyny uboczne:

delta (δ),

theta (θ),

kappa, (χ),

lambda (λ)

gamma (γ) i inne.

Niektóre szczepy wytwarzają również białko o właściwościach enterotoksycznych oznaczone w skrócie jako CPE (C. Perfringens

Enterotoxin).

Clostridium perfringens

• Naturalnym środowiskiem bytowania szczepów

C. perfringens biotyp A jest gleba, piasek, osady

rzek i jezior oraz przewód pokarmowy ludzi i zwierząt

• Szczepy należące do biotypów B, C, D i E

są obligatoryjnymi pasożytami i nie spotyka się ich

w środowisku a jedynie w przewodzie pokarmowym

zwierząt i czasem ludzi.

W ustaleniu C. perfringens jako czynnika etiologicznego zatrućpokarmowych należy uwzględnić następujące fakty

• C. perfringens stanowi składnik flory jelitowej u osób zdrowych: u młodych ludzi liczba komórek wegetatywnych może wynosić od 103 do 104/g kału, natomiast u ludzi starszych, szczególnie przebywających w domach opieki, obserwuje sięznaczne zwiększenie ich liczby, nawet do 107/g kału

• Niektóre produkty żywnościowe mogą być naturalnie zanieczyszczone przez laseczki C. perfringnes i mogą zawierać 101-104 komórek/gram żywności

• Tylko 2% do 6% izolatów C. perfringens może mieć gen cpe, co oznacza, że wykrycie genu cpe w izolatach może być problematyczne, jeśli przy użyciu metody PCR bada sięmałą liczbę izolatów (co najmniej 10 izolatów).

15

Kryteria potwierdzające zatrucie pokarmowe C. perfringens

CDC akceptuje różne kryteria przyjmowane w laboratoriach:

• wykrycie co najmniej 105/g komórek wegetatywnych w podejrzanej żywności oraz wykrycie przetrwalników w próbce kału chorego w ilości powyżej 106/g kału (mikroskop fazowo-kontrastowy, lub rozmaz; >5 spor w rozmazie kału)

• wykazanie tego samego serotypu w próbkach podejrzanej żywności jak i w próbkach kału pobranych w ognisku zatrucia pokarmowego

• wykazanie tego samego serotypu C. perfringens w próbkach kału pochodzących od różnych pacjentów

• Wykazanie obecności genu cpe w kale grupy chorych z trakcie epidemii zatrucia pokarmowego.

Charakterystyka C. perfingens z punktu widzenia bezpieczeństwa żywności

• C. perfringens jest drobnoustrojem beztlenowym, ale zakres tolerancji na tlen jest duży i drobnoustrój ten może przeżywać przy potencjale oksydoredukcyjnym:

(Eh) od +350 mV do +400mV

• C. perfringens rośnie w zakresie:

pH 5-9

• Wrażliwy na wysuszenie a współczynnik wilgotności (aw) dla różnych szczepów jest wysoki i wynosi w zakresie:

aw 0,95-0,96

Przeżywalność C. perfringens i kontrola żywności

• W przypadku wystąpienia zatrucia pokarmowego, po spożyciu żywności poddawanej procesom termicznym, główną przyczyną zatrucia jest obecność przetrwalników odpornych na wysoką temperaturę

• Przetrwalniki szczepów CPE+ są bardziej termorezystentne niż CPE-

• Przetrwalniki tworzone przez szczepy mające gen cpe na chromosomie posiadały 60Xkrotnie wyższą redukcję decymalną (D) w 100ºC niż inne szczepy C. perfringens. Były również bardziej odporne na niską temperaturę.

• Zależy to od ilości kwasu pikolinowego (DPA) i stężenia jonów metali

(Mg2+ i Ca2+).

• Rzadziej powodem zatrucia pokarmowego jest obecność form wegetatywnych, które mogą występować w żywności, poddanej nie właściwej obróbce termicznej lub żywności zanieczyszczonej już po zakończeniu tego procesu.

Przeżywalność C. perfringens i kontrola żywności-cd

• W procesie dekontaminacji powierzchni stykających się z żywnością w zakładach gastronomicznych jedynym środkiem chemicznym, skutecznie niszczącym przetrwalniki C. perfringens jest podchloryn sodu (pH poniżej 8,5)

• Można również z powodzeniem zastosować do dezynfekcji powierzchni ultrafiolet (UVC)

• Komórki wegetatywne rozwijają się w żywności bogatej w proteiny w zakresie temperatur od 15°°°°C do 50°°°°C, natomiast optymalna temperatura wzrostu wynosi 43°°°°C-46°°°°C i wówczas czas generacji wynosi 7-8 minut

16

Enterotoksyna C. perfringens

• Enterotoksyna to pojedynczy peptyd o wielkości 35kDa kodowany przez gen cpeulokowany na transpozonie chromosomalnie w szczepach powodujących zatrucia pokarmowe oraz na plazmidzie w szczepach powodujących biegunki poantybiotykowe, biegunki sporadyczne, w szczepach pochodzących od zwierząt

• Peptyd posiada dwie domeny: C-końcowa odpowiada za wiązanie się z białkiem receptorowym jelita, czyli 22 kDa białkiem klaudyny-3 i klaudyny-4 oraz część N-końcowa.

• W pierwszym etapie białko CPE C. perfringens wiąże się z białkiem receptorowym i formuje kompleks i wielkości 50kDa.

• Kompleks wchodzi w interakcję z 70 kDa białkiem formując hydrofobowy kompleks, co powoduje tworzenie por i zmiany w przepuszczalności błony cytoplazmatycznej komórek rąbka szczoteczkowego jelita cienkiego.

• Dochodzi do utraty małych molekuł: nukleotydów, aminokwasów, białek o masie ok. 3,5 kDa i śmierć komórki.

Enterotoksyna a sporulacja

• W 1972 roku przeprowadzono analizę kinetyki sporulacji i syntezy enterotoksyny i udowodniono, że te procesy są ze sobą powiązane genetycznie i czasowo.

• Synteza enerotoksyny indukowana jest w początkowej fazie sporulacji

• Szczepy w fazie wegetatywnej wzrostu posiadają cpe mRNA ale poziom enterotoksyny jest niski i nie jest wykrywany w podłożu, natomiast gwałtownie wzrasta kiedy komórka przechodzi w fazę sporulacji.

• Synteza enterotoksyny jest kontrolowana na poziomie transkrypcji w czasie sporulacji komórki.

• W czasie sporulacji szczepy wytwarzają ok. 1500 razy białka CPE niż ten sam szczep w fazie wegetatywnej wzrostu.

Wytwarzanie enterotoksyny C. perfringens

• Nie wszystkie szczepy sporulują w warunkach laboratoryjnych, prawdopodobnie z powodu obecności w podłożach niewielkich ilości tlenu

• Enterotoksyna jest wytarzana przez szczepy C. perfringens w dużych ilościach podczas fazy sporulacji, a zatem enterotoksynę in vitro można wykryć tylko na podłożach, na których C. perfringens stosunkowo łatwo sporuluje!!!

• W celu uzyskania przetrwalników stosuje się różne podłoża jak np. podłoże Duncan-Strong (DS) (może być z dodatkiem 0,4% rafinozy), podłoże Ellnera, a także podłoże RCM (Robertson Cooked Medium).

Porównanie testów do wykrywania enterotoksynyC. perfringens

TechLab EIA Oxoid (RPLA) Test cyt.

linia Vero

czułość 100% 100% 17%

swoistość 92% 17% 100%

17

Chorobotwórczość szczepów C. perfringens typ C.

• Szczepy C. perfringens należące do typy C stanowią czynnik chorobotwórczy dla zwierząt

• W Papui-Nowej Gwinei chorobę pig-bel wywoływały szczepy biotyp C wytwarzające toksynę β-1.

• Źródłem bakterii była zanieczyszczona żywność

• Powodem, dla którego szczepy te mogły rozwijać się była żywność bogata w proteiny (mięso wieprzowe pochodzące z hodowli trzody chlewnej zakażonej szczepami C.

perfringens typ C) oraz obniżenie poziomu trypsyny z powodu konsumpcji dużych ilości patatów zawierających inhibitor trypsyny. Dodatkowo niski poziom chymotrypsyny zwiększał wrażliwość na zakażenie. Objawy tego schorzenia to bóle brzucha, wymioty, obecność krwi w kale oraz ciężka nekroza jelita cienkiego.

Horyzontalna metoda oznaczania liczby bakterii redukujących siarczany (IV) rosnących w warunkach beztlenowych oraz horyzontalna metoda oznaczania

liczby bakterii Clostridium perfringens. Metoda liczenia kolonii.

W obrębie tego obszaru istnieją normy:

1. Norma PN-EN 1301:2000 ,,Horyzontalna metoda oznaczania liczby C. perfringens.

Metoda płytkowa” Stosowana do oznaczania liczby żywych bakterii C.

perfiringens w żywności i paszach.

2. Norma PN-EN ISO 7937:2005 ,,Horyzontalna metoda oznaczania Clostridium

perfringens-Metoda płytkowa”. Oznacza się liczbę żywych bakterii C. perfringens.

Norma ta ma zastosowanie do produktów spożywczych i pasz oraz próbek środowiskowych w obszarze produkcji i obrotu żywnością.

3. Norma PN-ISO 15213:2005 ,,Horyzontalna metoda do oznaczania bakterii redukujących siarczany (IV) rosnących w warunkach beztlenowych.” Norma ta ma zastosowanie do produktów spożywczych i pasz oraz próbek środowiskowych w obszarze produkcji i obrotu żywnością.

Norma PN-EN ISO 15213:2005 ,,Horyzontalna metoda do oznaczania bakterii redukujących siarczany (IV) rosnących w warunkach

beztlenowych.”

Zasada metody:

• I - przygotowanie podwójnych płytek (lub probówek) z zastosowaniem pożywki z siarczanem (IV) żelaza (III) oraz określonej ilości badanej próbki jeśli produkt jest płynny lub określonej ilości zawiesiny wyjściowej w przypadku innych produktów

• II – inkubacja płytek (probówek) w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C przez 24 godziny do 48 godzin albo w temperaturze 50°C, jeśli podejrzewa się obecnośćtermofilnych bakterii. Liczenie typowych kolonii zabarwionych na czarno.

• III - Oznaczanie liczby bakterii redukujących siarczany (IV) w mililitrze lub w gramie badanej

próbki na podstawie licznby klonii wyrosłych na płytkach

Norma PN EN –ISO:7937:2005 ,,Horyzontalna metoda wykrywania liczby C. perfringens.

Metoda liczenia kolonii.

Definicje:

C. perfringens to bakterie , które tworzą charakterystyczne kolonie otoczone czarną strefą precypitatu spowodowanego redukcją siarczanów (IV) do siarczków co powoduje zaczernienie kolonii w specyficznej pożywce selektywnej oraz wykazują reakcję dodatnią w trzech testach potwierdzających wykonanych jednąz dwóch metod określonych w normie międzynarodowej

18

Norma PN EN –ISO7937:2005 ,,Horyzontalna metoda wykrywania liczby C. perfringens.

Metoda liczenia kolonii.

• Oznaczanie liczby C. perfringens: określenie liczby zdolnych do wzrostu potwierdzonych bakterii C. perfingens w mililitrze lub gramie próbki

• Posiew: metodą posiewu wgłębnego

• Pożywka płynna z tioglikolanem

• I. Pożywka laktozo-siarczanowa (IV) (LS)

• II. Pożywki: agarowa z siarczanem (IV) i cykloseryną (SC)

Testy potwierdzające dla C. perfingens

• Metoda I. Pożywka LS• Przenieść z z pożywki tioglikolanowej 5 kropli hodowli na pożywkę LS.

Inkubować w łaźni wodnej w temp. 46°C przez 18 godzin. Sprawdzićwytwarzanie gazu i obecność czarnego zabarwienia (precypitat siarczku żelaza) rurka Durhama). Reakcja na pożywce laktozowo-siarczanowej po inkubacji w temp. 46°C jest bardzo charakterystyczna dla C. perfingens i

C. absonum

• Metoda II. Pożywka SC• Badanie zdolności ruchu i redukcji azotanów.

• Interpretacja:• bakterie , które tworzą czarne kolonie na pożywce SC, nie wykazują

ruchu, zwykle redukują azotany (V) do azotynów (III) wytwarzają kwas i gaz z laktozy oraz rozpuszczają żelatynę w ciągu 48 godzin są uważane za C. perfingens.

Listeria monocytogenes

• Przed 1982 rokiem znana głównie jako czynnik etiologiczny poronień u zwierząt i zapalenia mózgu u cieląt i owiec

• Gram-dodatnia pałeczka polimorficzna,

• formy pośrednie między pałeczką a ziarniakiem lub dłuższe pałeczki i formy nitkowate

• ruchliwa

• Do rodzaju Listeria należy 7 gatunków:

L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L.grayi, L. seeligeri, L.

welshimeri

• Chorobotwórcze dla człowieka to: L. monocytogenes rzadko L. ivanovii i

L. seeligeri

• 13 serotypów: 95% stanowi 1/2a, 1/2b, 4b

• 4b odpowiada za 33-50% przypadków ludzkiej listeriozy (bardziej wirulentny)

Listeria monocytogenes -biologia

• rośnie w warunkach tlenowych jak i beztlenowych

• temperatura od 0°C-45°C (nawet w 50°C), psychotrof (temp. optymalna 37°C)

• w pH 4,4-9,4

• aktywność wody powyżej 0,92.

• zdolna do namnażania w warunkach chłodniczych (0-4°C)

• wykazują pewną ciepłooporność np. w 80°C przeżywają przez 5 minut

• wysoko oporna na zasolenie, wzrasta w 10% NaCl a przeżywa w 20%-30%

• W wilgotnej ziemi przeżywa nawet 1 rok, w suchej glebie i w kale 2 lata

• szeroko rozpowszechniona w środowisku: gleba, woda, gnijące rośliny, trawa, osady morskie, ścieki, zwierzęta: krowy owce, trzoda, króliki, ptaki i ryby, owady, ,,owoce morza” (<100/gram)

• Nosicielstwo u człowieka 1-5% (10%).

19

Chorobotwórczość Listeria monocytogenes

Chorobotwórczość związana z działaniem toksyn:

• Hemolizyna zwana listeriolizyną O

• Fosfolipaza C, lecytynaza, metaloproteaza

• W większości przypadków listerioza przebiega na ogół łagodnie w postaci rozstroju żołądka i sama ustępuje

• W grupie ryzyka znajdują się kobiety w ciąży, małe dzieci i ludzie starsi, pacjenci o obniżonej odporności

• Objawy listeriozy: zapalenie opon-mózgowo-rdzeniowych, zapalenie wsierdzia, węzłów chłonnych, szpiku, i kości ogólnoustrojowa bakteriemia. Groźna dla kobiet w ciąży ( obumarcie płodu, poronienie i porody przedwczesne)

• Dawka infekcyjna to od 102 –105 bakterii

• Zakażenie drogą pokarmową, czas inkubacji od 11 dni do kilku tygodni; obecnie obserwuje się listeriozę pokarmową po 24 godzinach.

Listeria monocytogenes w żywności

• Dawniej listeriozę stwierdzano rzadko

• W Polsce w 2005 roku było 21 przypadków, w 2006 roku 26 przypadków

• Śmiertelność wysoka od 30% do 50% przypadków

Listeria monocytogenes w żywności

Źródło podstawowe:

• Surowe warzywa i owoce (marchew, brokuły, kalafior, sałata, kapusta i inne)

• Surowe ryby

• Surowy drób

• Nie pasteryzowane mleko

Wtórne zanieczyszczenie

• Sałatki warzywne lub mieszane

• Miękkie sery dojrzewające produkowane z mleka nie pasteryzowanego

• Fermentowane kiełbasy

• Wędzone ryby

• Gotowe produkty mięsne o przedłużonej trwałości

zwłaszcza pakowane próżniowo

• Lody

• Krewetki

• Czekolada mleczna

Listeria monocytogenes w żywności

• dobrze rośnie w płynnych produktach mlecznych w temp. 4ºC-35ºC

• w obecności starterowych kultur kwasu mlekowego wzrost może być częściowo zahamowany

• koncentracja w zsiadłym mleku

Przeżywalność w różnych produktach jest zróżnicowana:

• ser feta, ser Cammembert -namnaża się

• ser biały-ginie

• podczas dojrzewania (Cheddar) liczba komórek obniża się w początkowej fazie

• ser Blu cheese- stabilizacja

Epidemie zatrucia pokarmowego po spożyciu: hot dogów, wędzonych omułków (Nowa Zelandia), pstrągów tęczowych (Finlandia)

20

Kontrola żywności w kierunku Listeria monocytogenes

• kontrola jest trudna

• namnażanie Listeria monocytogenes jest wspomagane przez dużą liczbę czynników między innymi dużą wilgotność i wysoki poziom substancji odżywczych

W kontroli należy uwzględnić:

• czyszczenie

• sanityzację

• rozdział przestrzeni w trakcie obróbki żywności

Staphylococus aureus

jako czynnik zatruć pokarmowych

• Ziarniaki Gram-dodatnie, nieruchliwe, względnie beztlenowe.

• Zdolne do wzrostu w 7ºC-48ºC, fermentujące glukozę, mannitol, trehalozę.

• Głównym źródłem zanieczyszczenia żywności są ludzie (nosicielstwo na skórze, błonach śluzowych, w przewodzie pokarmowym) oraz gronkowce pochodzące od chorych krów z zapaleniem wymion (mleko). Głównym źródłem enterotoksycznych szczepów Staphylococcus jest człowiek (60-80%) a w drugiej kolejności krowy z mastitis (3-50%)

• Odporne na duże zasolenie (10%-20%), wysuszenie, tolerują duże stężenie cukrów (50%-60%)

• Żywność będąca źródłem zatrucia gronkowcowego to: krojone wędliny, mielone mięso, ryby, mleko i produkty mleczne, wyroby garmażeryjne, lody, ciastka, kremy i produkty warzywne.

Hennekinne i wsp. 2012.

Staphylococus aureus

jako czynnik zatruć pokarmowych

• Drugie co do częstości (po salmonelozie) zatrucie pokarmowe w Polsce.

• Jedno z najczęściej występujących zatrućpokarmowych w Europie. (EFSA , 2013).

EFSA, 2013. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2011. EFSA J. 3129

Staphylococus aureus

jako czynnik zatruć pokarmowych-cd

Główne czynniki wirulencji to:

• Hemolizyny, koagulaza, nukleaza, enterotoksyny

• Enterotoksyny określane od SEA do SlV2

• Enterotoksyny klasyczne: SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC2 ,SED, SEE.

• Enterotoksyny nowe: SEG1, SEG2, SEH, SEI, SElJ (SE like toxin), SElK, SElL, SElM, SElN, SElO, SElP, SElQ, SER, SES, SET, SElU, SEU2, SElV.

• Najczęściej wykrywa się enterotoksyny: SEA (75%-87%), w dalszej kolejności SED, SEC, SEB.

• Enterotoksyny produkowane są w żywności zawierającej cukry jak i białka, w zakresie temp. 10-48ºC (opt. 40-45ºC), pH od 5 do 10, w warunkach zarówno tlenowych jak i beztlenowych.

21

Właściwości enterotoksyny gronkowcowej

• Wysoka ciepłooporność uzależniona od czystości chemicznej toksyny. Enterotoksyny ,, crude” wytrzymują ogrzewanie przez 30 minut w temperaturze 100ºC.

• Toksyna SEB ulega inaktywacji dopiero po 20 minutach sterylizacji w 121ºC. Pod wpływem gotowania, pasteryzacji nie ulega inaktywacji.

• Oporność na działanie enzymów trawiennych (trypsyny, chymotrypsyny, pepsyny, papainy) oraz niskie pH oraz wysokie stężenie soli

• Enterotoksykoza występuje po spożyciu produktu, w którym namnożyło się 105-106 CFU/gram lub cm3 żywności

• Enterotoksyna SEA powoduje objawy w ilości 0,2 mg toksyny/kg masy ciała, a SEB 0,3 toksyny/kg masy ciała

• Objawy to wymioty, często gwałtowne, rzadziej biegunka• Okres inkubacji choroby to 6-12 godzin. Ustępują po 24-48

godzinach.

Inne niż koagulazododatnie gronkowce

• Przyczyną intoksykacji mogą być niektóre koagulazoujemne szczepy gronkowców zdolne do wytwarzania toksyny takie jak: S. cohnii, S. epidermidis, S. xylosus, S.

haemolyticus.

• Inne takie jak: S. intermedius, S. caprae, S, xylosus,

S. lentus, S. sciuri, S. hyicus zakażające ludzi izolowane są od zwierząt

• Gronkowce koagulazododatnie mogą występować w żółtkach jaj konsumpcyjnych

• Wśród koagulazoujemnych stwierdza się S. epidermidis, S. warnerii, S. xylosus, S.

lentus, S. capiti, S.hominis, S. hyicus.

• Wymagania mikrobiologiczne w przepisach obejmują przetwory jajowe. Jaja konsumpcyjne podlegają monitorowaniu w kierunku Salmonella sp. natomiast nie w kierunku gronkowców.

Wyjściowa Norma PN-EN-ISO 6888-1:2001. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-

dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków).

• Część 1: Metoda z zastosowaniem pożywki Baird-Parkera

• W 2004 roku dokonano nowelizacji tej normy wprowadzając zmianę w postaci PN-EN- ISO 6888-2: 2001/A1:2004

• W Części 2: Włączenie danych dotyczących precyzji.

• Próbki, które wykazują niewielki stopień zanieczyszczenia (np. produkty suche) bada się wg normy PN-EN-ISO 6888-3:2004 -wykrywanie obecności i oznaczanie małych liczb metodą NPL (najbardziej prawdopodobnej liczby)

Wykrywanie wg PN-EN-ISO 6888-1:2001 obejmuje trzy etapy:

I. namnażanie selektywne w pożywce płynnej

II. różnicowanie na pożywkach stałych

III. badanie potwierdzające (zdolność wytwarzania koagulazy)

Norma PN-EN-ISO 6888-1:2001. Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-

dodatnich (Staphylococcus aureus i innych gatunków).

• Bakterie posiewa się na stałą pożywkę Baird-Parkera (B-P) i oblicza kolonie po inkubacji w warunkach tlenowych w temp. 35ºC lub 37ºC. Wykonuje test na obecność koagulazy.

• Bądź na pożywkę B-P z dodatkiem plazmy króliczej i fibrynogenu (suplement RPF-ang. rabbit plasma fibrinogen) (Norma PN-EN- ISO 6888-2: 2001/A1:2004).

• Pożywka B-P oprócz stałych składników zawiera emulsję żółtka jaja kurzego

• Kolonie na B-P są drobne, czarne lub szare, błyszczące, otoczone przezroczystą strefą. Gronkowce wytwarzają lipazę, co jest widoczne w postaci wytrąconej strefy kwasów tłuszczowych.

• Produkty o niskim stopniu zanieczyszczenia bada się na pożywce Giolitti-Cantoni; inkubacja 24-48 godzin, 37ºC w warunkach beztlenowych (pożywka pokryta agarem wodnym); na obecność gronkowców wskazuje czernienie pożywki i/lub czarno-szary

osad

22

Norma PN-A-82055-9:1994.Badania mikrobiologiczne. Wykrywanie obecności i oznaczanie

liczby Staphylococcus aureus

• W 1 g lub w 1 ml zawiesiny rozdrobnionego mięsa

• Pożywki:

Giolitti i Cantoni (pożywka podstawowa + roztwór tellurynu potasowego).

Bairda-Parkera (podstawowa+ emulsja żółtka jaja kurzego)

Pożywka BHI

Plazma królicza

Posiewy:

p.G-C: ilość próbki i jej kolejnych dziesięciokrotnych rozcieńczeń wprowadzićrównolegle do 3 probówek

Pożywkę zalać agarem wodnym (2-3cm), 37C, 24-48 godz.

Z każdej probówki, w której stwierdzono wzrost przesiać hodowlę na p. B-P

Porównanie zatruć pokarmowych wywołanych przez różne czynniki bakteryjne

Patogen Czas inkubacji

Czas choroby

Objawy Typ schorzenia

Żywność

B. cereus

Typ bieg.

8-16 h 12-24 Biegunka Toksykoin. Mięso, zupy,

warzywa, budynie,

sosy

C.

perfringens

8-16 h 12-24 Biegunka Toksykoin. Mięso i jego przetwory,

sosy

B.cereus

Typ emet.

1-5 h 12-24 Wymioty, biegunka

Intoks. Ryż (bary, żywność na

wynos)

S. aureus 1-5 h 12-24 Biegunka, wymioty

Intoks. Gotowane mięso, drób przetwory mleczne

Clostridium botulinum

jako czynnik zatrucia pokarmowego

Clostridium botulinum Complex (CBC):

• C. botulinum Grupa I- szczepy proteolityczne

• C. botulinum grupa II-szczepy nie proteolityczne

• C. botulinum Grupa III

• Clostridium argentinense (dawniej grupa IV)

Toksyna botulinowa-charakterystyka

• Toksyna botulinowa (BoNT) (toksyna typu A-B) syntetyzowana w postaci pojedynczego polipeptydu o wielkości 150 kDa

• Polipeptyd jest rozcinany przy udziale proteazy na dwie podjednostki : 100 kDa-łańcuch ciężki (HC) i 50 kDa-łańcuch lekki (LC)

• Łańcuchy połączone wiązaniem dwusiarczkowym mają trzy domeny:

• C-końcowa- część HC jest jednostką wiążącą białko toksyczne ze swoistym receptorem

• N-końcowa LH odpowiedzialna za translokację białka toksycznego przez membranę

• Wewnętrzna domena LC podjednostka katalizująca ulega translokacji przez membranę presynaptyczną

23

Toksyna botulinowa-charakterystyka

• Toksyna botulinowa wytwarzana przez laseczki proteolityczne jest rozcinana przez endogenny enzym

• Toksyna botulinowa wytwarzana przez laseczki nie proteolityczne jest aktywowana przez trypsynę ludzką.

• Wyróżnia się osiem toksyn: A, B, C1, D, E, F,G, H. Chorobotwórcze dla człowieka są: A, B, E, F (H)

• Dodatkowe białka to: C2 i C3

Toksyna botulinowa-charakterystyka

• Toksyna botulinowa jest wytwarzana w żywności nie prawidłowo konserwowanej (pasteryzowanej ) o pH zbliżonym do obojętnego; oporna na działanie kwasu żołądkowego i niskiej temperatury

• Toksyna typu A ulega inaktywacji w temperaturze 80°C (6 minut) a typu B w 90°C, typu E w temperaturze 60°C w czasie 5 minut.

Typy botulizmu

• Botulizm klasyczny-intoksykacja

• Botulizm niemowlęcy-toksykoinfekcja

• Botulizm przyranny

• Botulizm po antybiotykoterapii, chemioterapii, u pacjentów z achlorhydrią

Laboratoryjna diagnostyka botulizmu

• Szybka i skuteczna diagnostyka w celu wdrożenia właściwego leczenia

• Wykrycie toksyny w badanym materiale (próbka surowicy, zawartośćżołądka, próbka kału, płyn z wlewu do odbytniczego, sok żołądkowy, materiał pobrany w czasie autopsji, próbki żywności (botulizm klasyczny, botulizm niemowlęcy, w czasie ataku terrorystycznego), wymaz z nosa ( ze wskazań-bioterroryzm), próbki ze środowiska (piasek 5-100 g; woda >100 ml).

• Hodowla. Odpowiednie podłoża CMM (cooked meat medium) do izolacji szczepów proteolitycznych, CCM (chooped meat glucose starch medium) do izolacji szczepów nie proteolitycznych lub TPGYT- tripticase-peptone-glucose-yeast extract broth).

• w celu usunięcia bakteriocyn (botycyny) produkowanej przez spokrewnione laseczki należy do podłóż dodać filtrowana trypsynę

24

Zasady hodowli C. botulinum

• Wszystkie podłoża należy zregenerować w celu usunięcia tlenu poprzez gotowanie płynnych podłóż w temp. 100ºC, lub stałe przechowywanie w warunkach beztlenowych

• Drobny sprzęt laboratoryjny (pipetki, szkło itp.) stosowany do badań C. botulinum musi być pozbawiony tlenu

• Po uzyskaniu hodowli płynnej filtruje się podłoże, a filtrat uzywa się do wykonania testu letalności dla myszki

• Próbki, w których wykryto toksynę posiewa się na podłoża w celu izolacji C. botulinum

• Hodowlę należy prowadzić w dwóch temperaturach tj. 35°C (35-37°C) w celu uzyskania wzrostu szczepów proteolitycznych i w temp. 26°C (25-30°C) w celu uzyskania szczepów nie proteolitycznych.

Norma PN-A-7932:2005,, Mięso i przetwory mięsne”

Horyzontalna metoda oznaczania liczby bakterii redukujących siarczany (IV) rosnących w warunkach beztlenowych

• W zakresie tej normy wchodzi również wykrycie toksyny C. botulinum

• Posiew na podłoże Wrzoska

• Inkubacja w temperaturze 37°C przez 48 godzin warunkach beztlenowych

• Wirować hodowlę 10 minut

• Płyn z nad osadu podać dootrzewnowo po 0,2 ml dwóm dorosłym myszkom

• Kontrola taka sama; inkubować przez godzinę płyn z nad osadu z surowicąantytoksyczną (1 ml)

• Szczep toksynotwórczy jeśli w ciągu 96 godzin padną myszki (próba bez surowicy)

• Żywność homogenizacja próbki z dodatkiem rozcieńczalnika

• Wstawić do lodówki (4°C) na 1-2 godzin

• Wirować przez 10 minut

• Płyn z nad osadu podać myszkom

• Przy podejrzeniu C. botulinum typ E trawić trypsyną

Campylobacter sp.

• Pierwszy opis : Theodore Escherich (1886)

• Rodzaj Campylobacter zawiera od 14 do20 gatunków

• Mikroaerofila pałeczka Gram-ujemna,

• Nie fermentuje cukrów, energie czerpie z rozkładu aminokwasów, kwasów trójkarboksylowych

• Oksydazododatnie (oprócz Campylobacter gracilis)

Campylobacter sp.

• wzrost w temp. 37°C i 42 °C

• Poniżej 30°C nie rosną (brak białek szoku zimna)

• Levin uważa , że powinny być określane jako termotolerancyjne a nie termofilne ponieważ nie tolerują temp. 55°C i powyżej

• De Cesare i wsp. (2003)- C. jejuni przeżywa 4 godziny w 27°C i 60-62% wilgotności na powierzchniach czystych i zabrudzonych

• Te właściwości redukują zdolność Campylobacter do:• namnażania poza organizmem zwierzęcia

• podczas przechowywania i przetwarzania żywności

25

Campylobacter sp.

• Ograniczony wzrost:

• aktywności wody (aw) poniżej 0,987 (wrażliwy na stężenie NaCl powyżej 2%w/v)

• Optymalny wzrost

• (aw)=0,997, stężenie NaCl 0,5%w/v)

• rozmrażanie i zamrażanie łatwo niszczy populację Campylobacter sp.

• Czysta hodowla jest inaktywowana podczas mrożenia w -15°C w ciągu 3 dni.

• Mrożenie nie niszczy łatwo bakterii w żywności

• Nie przeżywa w pH 4,9 i powyżej pH 9,0

• Optymalny zakres pH to 6,5-7,5

• Atmosfera gazowa to: 5%O2, 10%CO2 i 85% N2

Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus

• W 1951 Vibrio parahaemolyticus rozpoznano jako czynnik zatrucia pokarmowego

• Drobnoustrój halofilny• Wiele serotypów• Daje reakcj ę Kanagawa (RK)- hemoliza ludzkich krwinek a nie ko ńskich• Biegunka zazwyczaj wodnista czasem z krwi ą• Objawy po 12 godzinach• Wydaje si ę, że hemolizyna termostabilna odgrywa znacz ącą rolę w

biegunce• Transmisja:• Żywno ść pochodzenia morskiego, świeże ryby źródłem zaka żeń w Japonii• Ostrygi - cz ęsta kontaminacja• Zapobieganie: trudno zapobiega ć ze względu na wyst ępowanie Vibrio

parahaemolyticus w środowisku wodnym• Vibrio vulificus- powoduj ą sepsę i zakażenia ran po kontakcie z

zanieczyszczona wod ą. Osoby z chorobami w ątroby nie powinny je śćostryg i zachowywa ć ostro żność w środowisku wody morskiej.

Norma PN-ISO 8914:2002„Ogólne zasady wykrywania Vibrio parahaemolyticus”

Definicja: halofilne drobnoustroje tworzące charakterystyczne kolonie na powierzchni pożywki selektywnej wykazujące charakterystyczne cechy biochemiczne w testach wykonywanych zgodnie z niniejszą normą

Trzy etapy

I. posiew na pożywki płynne selektywne i namnażające

a.) SBP pożywka bulionowa z solą i polimyksyną B

b.) GST zasadowa woda peptonowa z solą lub pożywka glukozowa z siarczanem dodecylu

Inkubacja w temperaturze 35ºC lub 37ºC przez 7 do 8 godzin

II. Przesiew z hodowli płynnej na:

a.) TCBS - agar z tiosiarczanem, cytrynianem, żółcią i sacharozą

b.) TSAT- agar z chlorkiem trifezylo-tetrazolu i tryptonem sojowym

Norma PN-ISO 8914:2002„Ogólne zasady wykrywania Vibrio parahaemolyticus”

II. Potwierdzenie testy wstępne: oksydaza, badanie mikroskopowe (Gram, ruch).

Testy biochemiczne.

Virbio parahaemolyticus

Sachroza (-)

Oskydaza (+)

Ruch (+)

Glukoza (+)

Wytwarzanie gazu (-)

Lakoza (-)dekarboksylacja lizyny (+)

Wykrywanie indolu (+)

Przyjmuje się, że V. parahaemolyticus są obecne jeśli jedna kolonia zastała potwierdzona jako V. parahaemolyticus

26

Porówanie tolerancji na wysychanie Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica, and Cronobacter sakazakii w

sproszkowanym mleku dla niemowląt

• Patogeny: Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157: H7, Salmonella enterica i Cronobacter sakazakii wykazują długoterminowe przeżycie w/na żywności suchej lub o niskiej aktywności wody (aw)

• W badaniu kinetyki przeżycia czterech patogenów bakteryjnych oddzielnie zaszczepiono sproszkowaną odżywkę dla dzieci i porównano podczas przechowywania w temperaturze 5, 22 i 35 ° C.

• Nie stwierdzono istotnych różnic w przeżywalności między E. coli O157: H7 i

L. monocytogenes.

• Tolerancja na wysuszenie

C. sakazakii> Salmonella> E. coli O157: H7 = L. monocytogenes.

• 256 próbek (194 próbki kału i 62 próbki mleka)

• PCR i hodowla (McConkey)

• 76 próbek pozytywnych w kierunku STEC i/lub EPEC

Farma STEC (stx 1

i/lub stx2)

EPEC (eae) stx + eae

1 24 4 8

2 6 0 0

3 26 8 2

Zwierzęta i żywność pochodzenia zwierzęcego jako źródło genów oporności

• Trzoda chlewna jako rezerwuar MRSA (LA-MRSA)

• ST(398) Europa, Ameryka

• ST(9)-Azja• 0,68% świnie

• 1,28% - środowisko

• 13 szczepów MRSA – gen mec IV, ST 9

• MRSA kraje:– 9,61%-Tajlandia

– 22,7%-Korea

– 26%- Kanada

– 36%- USA

– 39%-Holandia

27

• Obecność E. coli wykryto w 243 (92.4%) próbkach mleka

• Uzyskano 270 izolatów

• Oporność na β-laktamy (31.8%) i tetracyclinę (13.0%)

• MDR - 5.5%

• ESBL potwierdzono w 2 (0.7%) izolatach.

Antimicrobial-Resistant and Extended-Spectrum β-Lactamase–Producing Escherichia coli in Raw Cow's Milk (Czechy) Inne czynniki stanowiące zagrożenie po spożyciu

skażonej żywności.

• Brucella sp.- nie pasteryzowane mleko i produkty mleczne

• Corynebacterium diphteriae – świeże, nie pasteryzowane mleko

• Mycobacterium bovis – świeże, nie pasteryzowane mleko

• Coxiella burnetii - rezerwuar owce, cielęta, kozy, pasteryzacja mleka

• Streptococcus pyogenes - historycznie powszechny środek przenoszenia to mleko ale każdy typ żywności może być skażony

• Plesiomonas shigelloides - wodne wybuchy epidemii w Japonii

• Pseudomonas aeruginosa - woda po spożyciu dużej dawki, ale teżprawdopodobnie żywność (nie udowodniona droga zakażenia)

• Erysipelothrix rhusiopathiae (różyca) - mięso peklowane, wędzone solone (może przetrwać do 170 dni)

• Francisella turalensis - wrażliwa na wysoką temperaturę, promienie słoneczne środki dezynfekcyjne, w tuszy zwierzęcej przeżywa kilka miesięcy.