Ćwiczenie 18

T: Diagnostyka zaburzeń gospodarki lipidowej

A. Oznaczanie stężenia cholesterolu całkowitego w surowicy krwi metodą CHOD-

PAP

Zasada oznaczenia: Metoda kolorymetryczna, enzymatyczna z esterazą i oksydazą

cholesterolu

esteraza cholesteroluestry cholesterolu + H2O cholesterol + kwasy tłuszczowe

oksydaza cholesterolucholesterol + O2 cholesten-3-on + H2O2

peroksydaza2H2O2 + 4-aminoantypiryna + fenol chinonoimina + 4H2O

(czerwone zabarwienie)Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

spektrofotometr, probówki Eppendorf, pipety automatyczne

Materiał badany i odczynniki:

surowica badana

odczynnik roboczy do oznaczania stężenia cholesterolu całkowitego (Boehringer

Mannheim)

Wykonanie:

opisać probówki, odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów – jak

podano w poniższej tabeli:

Badana Ślepa odczynnikowa

Surowica [mL] 0,01 -

Odczynnik roboczy

[mL]

1,0 1,0

Wymieszać, inkubować 10 minut w temp. 25°C

Zmierzyć absorbancję przy =500 nm (wobec próby ślepej odczynnikowej)

Obliczenia:

obliczyć stężenie cholesterolu całkowitego ze wzoru:

stężenie cholesterolu całkowitego [mg/dL] = AB x 575

B. Oznaczanie stężenia triacylogliceroli w surowicy krwi

1

Zasada oznaczenia: Kolorymetryczna metoda enzymatyczna z oksydazą

glicerolofosforanową

lipaza lipoproteinowatrigliceryd + H2O glicerol + kwasy tłuszczowe

kinaza gliceroluglicerol + ATP 3-fosfoglicerol + ADP

oksydaza glicerolofosforanowa3-fosfoglicerol 3-fosfodihydroksyaceton + 2H2O2

peroksydaza2H2O2 + parachlorofenol + 4-aminoantypiryna chinonoimina + 4H2O

Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

spektrofotometr, probówki Eppendorf, pipety automatyczne

Materiał badany i odczynniki:

surowica badana, odczynnik roboczy do oznaczania stężenia triacylogliceroli

(bioMerieux)

Wykonanie:

Badana Wzorcowa Odczynnikowa/zerowa

Surowica [mL] 0,01 -

Wzorzec [mL] - 0,01

Odczynnik roboczy [mL]

1,0 1,0 1,0

Wymieszać, inkubować 10 minut w temp. 25°C

Zmierzyć absorbancję próby wzorcowej i badanej przy =505 nm (wobec

próby ślepej odczynnikowej)

Obliczenia:

obliczyć stężenie triglicerydów ze wzoru:

Stężenie triglicerydów [mg/dL] = x stężenie wzorca w

C. Oznaczanie stężenia triacylogliceroli w surowicy krwi (BioMaxima)

Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

spektrofotometr, probówki Eppendorf, pipety automatyczne

Materiał badany i odczynniki:

2

surowica badana, odczynnik roboczy do oznaczania stężenia triacylogliceroli

(Biomaxima)

Wykonanie:

Badana Wzorcowa Odczynnikowa/zerowa

Surowica [mL] 0,01 -

Wzorzec [mL] - 0,01

Odczynnik roboczy [mL]

1,0 1,0 1,0

Wymieszać, inkubować 10 minut w temp. 25°C

Zmierzyć absorbancję próby wzorcowej i badanej przy =500 nm (wobec

próby ślepej odczynnikowej)

Obliczenia:

obliczyć stężenie triglicerydów ze wzoru:

Stężenie triglicerydów [mg/dL] = x stężenie wzorca w

D. Oznaczanie stężenia cholesterolu HDL w surowicy krwi metodą strąceniową

Zasada oznaczenia: Lipoproteiny o bardzo niskiej (VLDL) i niskiej (LDL) gęstości ulegają

wytrąceniu pod wpływem kwasu fosforowolframowego w obecności jonów magnezu. W

powstałym po odwirowaniu supernatancie pozostaje frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości

(HDL), w której cholesterol można oznaczyć metodą enzymatyczną(podpunkt A).

Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

wirówka, spektrofotometr, probówki Eppendorf, pipety automatyczne

Materiał badany i odczynniki:

surowica badana, odczynnik strącający (HDL-C) (Biomaxima lub inny)

Wykonanie:

do probówki wirówkowej odmierzyć 250 L surowicy oraz 250 L odczynnika

strącającego

dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej

odwirować w ciągu 10 minut, 4000 obr/min

supernatant przenieść do probówki Eppendorf

wykonać oznaczenie cholesterolu HDL

Badana Odczynnikowa/zerowa

3

Supernatant [mL] 0,1

Woda destylowana [mL]

- 0,1

Odczynnik roboczy [mL]

1,0 1,0

Wymieszać, inkubować 10 minut w temp. 25°C

Zmierzyć absorbancję próby wzorcowej i badanej przy =500 nm (wobec

próby odczynnikowej)

UWAGA! Jeżeli supernatant nie jest klarowny należy próbkę rozcieńczyć 2-krotnie 0,9%

NaCl i wykonać oznaczenie cholesterolu – wynik należy pomnożyć przez 2

Obliczenia:

Stężenie choleresterolu HDL [mg/dL] = AB x 219,2

D. Oznaczanie stężenia cholesterolu LDL w surowicy krwi metodą pośrednią

Zasada oznaczenia: Podstawienie oznaczonych wartości stężeń cholesterolu całkowitego

(ChT), cholesterolu HDL (Ch-HDL) i triglicerydów (TAG) do wzoru Friedewalda:

TAG Ch-LDL = ChT – Ch-HDL – [mg/dL]

5

4