1

ZAKAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej

Wydziau Farmaceutycznego

WICZENIA Z MIKROBIOLOGII DLA STUDENTW ANALITYKI

POD REDAKCJ ELIGII M. SZEWCZYK

d 2014

2

AUTORZY: Boena Dudkiewicz Wioletta Kmieciak Anna Kwaszewska Pawe Lisiecki Maria Sobi-Glinkowska Magdalena Szemraj Eligia M. Szewczyk

ISBN: 978-83-64344-03-9 Wydanie drugie zmienione i poprawione

3

Spis treci: Cz I Rozdzia 1 Morfologia komrki bakteryjnej.5 Rozdzia 2 Poywki do hodowli bakterii.....23 Rozdzia 3 Otrzymywanie czystych hodowli, ocena morfologii wzrostu bakterii...31 Rozdzia 4 Wymagania wzrostowe bakterii...41 Rozdzia 5 Wykorzystanie cech biochemicznych dla identyfikacja bakterii 51 Rozdzia 6 Liczenie bakterii 75 Rozdzia 7 Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenw, przekazywanie plazmidw.87 Rozdzia 8 Oddziaywanie na bakterie w rodowisku. Dezynfekcja i antyseptyka99 Rozdzia 9 Sterylizacja.115 Rozdzia 10 Bakterie w lekach i ywnoci kontrola czystoci mikrobiologicznej.125

Cz II Rozdzia 1 Badanie wraliwoci bakterii na antybiotyki i monitorowanie leczenia.143 Rozdzia 2 Podstawy diagnostyki wirusologicznej167

4

5

Cz I Rozdzia 1

Morfologia komrki bakteryjnej Cz teoretyczna Bakterie to organizmy prokariotyczne. Cech charakterystyczn komrek bakteryjnych jest brak jdra otoczonego bon jdrow i jderka. Ich materia genetyczny w formie nukleoidu, bdcego podwjn nici DNA styka si bezporednio z cytoplazm. Nie posiadaj one rwnie dobrze wyksztaconych organelli komrkowych i ukadu bon wewntrznych, takich jak retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego, lizosomy, mitochondria. Bakterie (poza mikoplazmami) maj cian komrkow, membran cytoplazmatyczn, a w cytoplazmie zawieszone s rybosomy. Niektre gatunki wytwarzaj otoczki, przetrwalniki, fimbrie, ziarnistoci zapasowe, a zdolno ruchu zawdziczaj rzskom lub wknu osiowemu. Z punktu widzenia diagnostyki najistotniejsze s te cechy morfologii komrek bakterii, ktre mona uwidoczni prostymi metodami w mikroskopie wietlnym. Mikroskop elektronowy w laboratorium szpitalnym nie jest przydatny. Cechy morfologiczne komrek bakterii wane dla ich identyfikacji to:

ksztat komrek i ich charakterystyczne dla rodzaju czy gatunku ukady popodziaowe;

budowa ciany komrkowej warunkujca rnicowe barwienie metod Grama;

otoczka;

przetrwalniki;

ziarnistoci zapasowe;

zdolno ruchu.

6

Wielko, ksztat i ukady popodziaowe Bakterie wykazuj znaczn rozpito wymiarw. Wymiar wikszoci komrek bakteryjnych wynosi od 1 m do 10 m. Rozmiar najmniejszych wynosi od 0,15 m do 0,2 m, co jest na granicy zdolnoci rozdzielczej mikroskopu wietlnego. Wymiar najwikszych wynosi od 250 m do 600 m. Przecitna dugo komrki bakteryjnej to 1-5 m, a rednica 1-2 m. Wyrniamy nastpujce ksztaty komrek bakteryjnych: kulisty, cylindryczny i spiralny. Bakterie kuliste, nazywane take ziarenkowcami, mog by uoone pojedynczo lub tworzy charakterystyczne ukady komrek. Powstanie ukadw zwizane jest z paszczyzn i liczb podziaw komrek w trakcie rozmnaania oraz brakiem ich rozdziaw po podziale. Wrd bakterii kulistych wyrniamy nastpujce ukady popodziaowe:

dwoinki (np. dwoinki zapalenia puc) komrki po podziale pozostaj po dwie,

ziarniaki czworacze (Tetracocus) komrki dziel si w dwch paszczyznach,

pakietowce (Sarcina) komrki dziel si w trzech paszczyznach do siebie prostopadych tworzc szecianki,

paciorkowce (Streptococcus) komrki ukadaj si w krtsze lub dusze acuszki,

gronkowce (Staphylococcus) komrki mog si dzieli w dwch lub trzech paszczyznach, tworzc skupiska przypominajce kicie winogron.

Do form cylindrycznych bakterii zaliczamy: paeczki (np. Pseudomonas), laseczki (np. Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prtki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektre formy bakterii cylindrycznych mog tworzy charakterystyczne ukady przestrzenne: dwoinki, krtsze lub dusze acuszki, palisady, ugrupowania w ksztacie liter V, X, Y. Do form spiralnych bakterii zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagit komrk, rubowce (Spirillum), ktre tworz pen spiral, krtki

7

(np. Borrelia, Treponema, Leptospira), rnice si miedzy sob liczb skrtw, gruboci komrki i wygldem jej biegunw. Niektre gatunki bakterii wykazuj tendencj do rnorodnoci morfologicznej i wieloksztatnoci komrek. Ich komrki mog rni si wielkoci i ksztatem. Obok form kulistych mog wystpowa formy cylindryczne i odwrotnie. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem. Ksztat i ukady podpodziaowe bakterii moemy zaobserwowa w preparatach przyyciowych (np. w mikroskopie kontrastowo-fazowym lub w ciemnym polu widzenia, a nawet w zwykym mikroskopie wietlnym), a take w preparatach utrwalonych, barwionych.

ciana komrkowa ciana komrkowa wszystkich bakterii zawiera peptydoglikan (mureina), ktry styka si bezporednio z bon cytoplazmatyczn. Skada si on z acuchw wielocukrowych, poczonych poprzecznie peptydami. Tworzy si w ten sposb charakterystyczne usieciowanie peptydoglikanu. Peptydoglikanu jest skadnikiem ciany komrkowej wszystkich tworzcych j bakterii. ciana komrkowa jednych bakterii (gramdodatnich) jest stosunkowo gruba i wzgldnie jednorodna. Zawiera kilkadziesit warstw peptydoglikanu, co moe stanowi 90% suchej masy ciany. W ich cianie wystpuj ponadto kwasy tejchojowe, lipotejchojowe i biaka. ciana innych bakterii (gramujemnych) jest cienka i ma budow wielowarstwow. Jedn do trzech warstw peptydoglikanu, ktry stanowi tylko 10% suchej masy ciany, pokrywa dominujcy u nich element - bona zewntrzna. Peptydoglikan oddzielony jest od bony zewntrznej przestrzeni peryplazmatyczn. Bona zewntrzna stanowi warstw plastyczn ciany komrkowej; zbudowana jest z fosfolipidw, biaek, lipoproteiny Brauna oraz lipopolisacharydu (LPS). Rnice w budowie ciany komrkowej bakterii s przyczyn rnego ich barwienia w metodzie opracowanej przez Grama. Stao si to podstaw do bardzo przydatnego w identyfikacji, a tym samym diagnostyce, podziau bakterii na gramdodatnie i gramujemne.

8

Otoczka Bakterie mog syntetyzowa i wydziela na zewntrz ciany zewntrzkomrkowe substancje o charakterze polimerw. Jeli polimer tworzy zbit warstw, cile otaczajc komrk i jest mocno z ni zwizany nazywamy go otoczk. Polimer tworzcy lun warstw, swobodnie przylegajc do powierzchni komrki, atwo tracony i znajdowany w poywce, w ktrej wzrastaj bakterie nazywamy luzem. Otoczka moe obejmowa jedn lub dwie komrki. Warstwa luzowa obejmuje zwykle wiele komrek bakteryjnych. Bakteryjne otoczki i luzy najczciej maj charakter polisacharydw. Otoczki tylko niektrych bakterii maj struktur polisacharydowo-peptydow lub peptydow. Otoczki s tworzone w naturalnych miejscach bytowania bakterii. W przypadku bakterii chorobotwrczych, w organizmie czowieka lub zwierzt. Mona je zobaczy w barwionych (np. metod Grama) preparatach wykonanych z zakaonych tkanek. W organizmie otoczki odgrywaj wan rol ochronn przed aktywnoci ukadu immunologicznego. Tylko niektre spord tych bakterii wytwarzaj otoczki take w hodowlach sztucznych. Sprzyja temu dua zawarto cukrw w poywce. Otoczki trudno si wybarwiaj, naley zastosowa specjalne metody. Z hodowli najczciej oglda si je w preparatach barwionych metod pozytywno-negatywn, w zwykym mikroskopie wietlnym. W przypadku badania materiaw klinicznych otoczki maj wane znaczenie, gdy ich skad u drobnoustrojw je wytwarzajcych (np. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis czy otoczkowych Haemophilus influenzae) jest wan cech charakterystyczn i umoliwia identyfikacj serologiczn patogenw (take po ich rozpadzie np. wykrywanie antygenw otoczkowych w pynie mzgowo-rdzeniowym), a take okrelenie serotypw w obrbie poszczeglnych gatunkw. Stosuje si tu testy lateksowe i niekiedy, metod pcznienia otoczek w obecnoci specyficznych przeciwcia.

9

Przetrwalniki Formy przetrwalne (endospory) tworz tylko nieliczne bakterie. Spord bakterii zwizanych z czowiekiem s to laseczki z rodzajw Bacillus i Clostridium. Powstaj one w wyniku rnicowania si komrek wegetatywnych jeden przetrwalnik powstaje z jednej komrki. Proces ten nazywamy sporulacj. Cech charakterystyczn przetrwalnikw jest stan upienia metabolizmu i znacznie wiksza ni u form wegetatywnych oporno na dziaanie czynnikw fizyko-chemicznych. Przetrwalniki zawdziczaj oporno swojej unikatowej budowie: paszczom zewntrznemu i wewntrznemu, z ktrymi wie si oporno na czynniki chemiczne oraz korze, ktra w duym stopniu decyduje o opornoci na wysok temperatur. Wiele bakterii (laseczek) odpowiedzialnych za choroby u ludzi, bytuje w rodowisku w postaci przetrwalnikw. Std dostaj si do organizmu w postaci aerozoli lub po urazach z gleb. Przetrwalnik w rodowisku nieoywionym zachowuje przez dugi czas ywotno, a w dogodnych warunkach (np. w organizmie) kiekuje w komrk wegetatywn, ktra wytwarza toksyny i enzymy odpowiedzialne za chorobotwrczo tych bakterii. W warunkach hodowli laseczki wytwarzaj przetrwalniki w pnej jej fazie. Mona je wtedy oglda w preparatach. Przetrwalnik moe mie ksztat kulisty lub owalny i by umieszczony centralnie, podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik moe mie rednic mniejsz lub wiksz od wymiaru porzecznego komrki. W przypadku, gdy jest wiksza, powoduje znieksztacenie komrki, nadajc jej charakterystyczny ksztat. Przetrwalniki nie barwi si zwykymi metodami. Mona je obserwowa w komrkach nie zabarwionych, szczeglnie dobrze w mikroskopie fazowo-kontrastowym, gdzie s widoczne jako struktury silniej zaamujce wiato ni reszta komrki. Mona je rwnie obserwowa w preparatach barwionych np. metod Grama. W zabarwionej komrce wida wtedy bezbarwny przetrwalnik. Jeli wanie powstaje, jest czasami zabarwiony, a gdy zostanie ju uwolniony z komrki widoczny jest w preparacie jako twr bezbarwny, czasem z cieniutk warstewk barwnika na obwodzie.

10

Ziarnistoci zapasowe W komrkach niektrych bakterii gromadzone s w cytoplazmie materiay zapasowe, nazywane te wtrtami cytoplazmatycznymi lub ciaami zapasowymi. Maj one charakter polimerw, ktre gromadzone s w komrce w czasie jej wzrostu w warunkach nadmiaru substancji odywczych, a zuywane w warunkach godu. Do najczciej wystpujcych u bakterii cia zapasowych naley kwas poli--hydroksymasowy. Bakterie mog take gromadzi polimery glukozy skrobi, glikogen. Wrd bakterii zwizanych z czowiekiem, najwaniejsze s wystpujce u bakterii grupy Maczugowate ziarnistoci polimetafosforanowe, ktre zbudowane s z nieorganicznych fosforanw. Nazywamy je take wolutyn. Wykrywane poprzez odpowiednie barwienie preparatw maj istotne znaczenie taksonomiczne.

Ruch bakterii Dziki rzskom czy wknom osiowym, ktre s elementami budowy niektrych bakterii, zwaszcza cylindrycznych, bakterie te wykazuj zdolno poruszania si w rodowisku pynnym lub ppynnym, a nawet w cienkiej warstwie cieczy na podou staym. Wykazanie zdolnoci ruchu bakterii moe by wan cech identyfikacyjn. W komrkach bakterii wystpuje najczciej jeden z trzech typw urzsienia: monotrichalny jedna rzska na biegunie, lofotrichalny pojedyncza rzska lub ichpczek na obu biegunach, perytrichalny wiele rzsek dookoa komrki. Ruch krtkw warunkuje wkno osiowe, ktre skada si z pczka wkienek przypominajcych budow rzski. Wyrastaj one z bieguna komrki i tworzc wkno osiowe, spiralnie je oplataj. Barwienie rzsek jest trudne i kopotliwe. Dlatego o ich istnieniu dowiadujemy si porednio, obserwujc ruch bakterii. W preparatach mokrych w mikroskopie wietlnym najlepiej temu suy preparat w kropli wiszcej. Ruch ywych komrek bakterii mona take obserwowa w mikroskopie kontrastowo-fazowym oraz w mikroskopie

11

z ciemnym polem widzenia. Ten ostatni jest szczeglnie dogodny dla obserwacji krtkw w przyyciowych preparatach.

Metody

Mikroskopowanie Drobne wymiary bakterii sprawiaj, e do ogldania ich komrek musimy korzysta z mikroskopu. ywe komrki bakterii najczciej obserwujemy w mikroskopie fazowo-kontrastowym i z ciemnym polem widzenia. Preparaty trwae, barwione rnymi metodami, oglda si w zwykym mikroskopie wietlnym lub mikroskopie fluorescencyjnym. Mikroskop fazowo-kontrastowy przeksztaca, niewidzialny dla naszego oka, obraz fazowy na obraz kontrastowy zrnicowany pod wzgldem przechodzcego natenia wiata. Rnice te s rozpoznawalne przez wzrok ludzki. Struktury silniej zaamujce wiato bd widziane jako elementy ciemniejsze na jasnym tle. Mikroskop ten stwarza moliwoci obserwowania ywych, niezabarwionych komrek bakterii, a nawet pewnych ich struktur, np. przetrwalnikw, materiaw zapasowych. W mikroskopie z ciemnym polem widzenia bakterie widoczne s jako jasne obiekty na ciemnym tle. Efekt taki uzyskujemy dziki specjalnemu kondensorowi ciemnego pola, ktry zapobiega przechodzeniu wiata bezporednio do soczewki obiektywu. Obiektyw odbiera tylko promienie wietlne ugite przez elementy preparatu. Ten typ mikroskopu uywany jest do ogldania bakterii ywych i ich ruchu. Do obserwacji bakterii wykorzystuje si przede wszystkim mikroskop wietlny z jasnym polem widzenia, ale komrki nie zabarwione s w nim le widoczne, wic stosuje si rne metody barwienia. Mikroskop fluorescencyjny wyposaony jest w lamp emitujc promieniowanie UV, co pozwala na ogldanie preparatw barwionych rnicowo barwnikami fluorescencyjnymi. Mikroskop taki jest bardzo przydatny w diagnostyce; pozwala na stosowanie metody immunofluorescencji. Preparaty zawierajce bakterie naley oglda przy uyciu obiektywu immersyjnego dajcego powikszenie 100 x i okularw powikszajcych

12

5-10 razy. Pozwala to na osignicie najwikszego powikszenia (1000 x), jakie moemy uzyska w mikroskopie wietlnym. Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w ktrym naley zanurzy soczewk obiektywu przed przystpieniem do ogldania preparatw. Promienie wietlne po przejciu przez szkieko preparatu, wpadajc do warstwy powietrza, ulegaj zaamaniu i wikszo z nich omijaaby soczewk obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakoczeniu mikroskopowania z obiektywu naley usun pozostaoci olejku bawenian szmatk. W przypadku zaschnicia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy olejek specjalnym zmywaczem. Na jako obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie istotny wpyw ma owietlenie ogldanego preparatu. Posugujc si wiatem dziennym, naley zastosowa lusterko paskie, a przy wietle sztucznym lusterko wklse. Preparaty trwae naley oglda przy maksymalnie podniesionym kondensorze. Preparaty przyyciowe majce wykaza ruch bakterii, lub zawierajce inne wiksze ni bakterie elementy mona oglda przy pomocy obiektywu powikszajcego 60 x , wtedy, przy obnionym kondensorze. Preparaty przyyciowe - mokre Preparaty takie mog by wykonywane bezporednio z materiau klinicznego wtedy ocenia si obecno w nim leukocytw i bakterii. W mikroskopie z ciemnym polem widzenia oglda si przyyciowo krtki. Mona take oglda takie preparaty z hodowli. Wicej cech bakterii w tym niektre elementy ich struktury, mona zobaczy w mikroskopie kontrastowo-fazowym. Preparat z "kropli wiszcej" umoliwia obserwacj ruchu bakterii. Wykonuje si go uywajc szkieka podstawowego z wgbieniem ("ezk") i szkieka nakrywkowego. Wykonanie Brzeg wgbienia na szkieku podstawowym smarujemy cienk warstw wazeliny. Na rodek szkieka nakrywkowego nanosimy oczko ezy pynnej

13

hodowli bakteryjnej. Nastpnie odwracamy szkieko podstawowe i przyklejamy je do szkieka nakrywkowego tak, aby kropla hodowli zawisa nad wgbieniem.

Przygotowanie rozmazw do preparatw trwaych Rozmazy wykonuje si na odtuszczonych w pomieniu palnika szkiekach podstawowych. Jeli sporzdza si rozmaz z bakterii zebranych z hodowli staej, na szkieko naley nanie 1 oczko ezy wody, a nastpnie zawiesi w niej bardzo niewielk ilo zebranej ez masy bakteryjnej. Powstaa zawiesina powinna lekko opalizowa. Nie moe by ona zbyt gsta, gdy nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komrek, co jest warunkiem prawidowej oceny ich morfologii. Przygotowanie rozmazu z hodowli pynnej polega na dwu lub trzykrotnym naniesieniu jej ez na szkieko. Kad kropl, przed naniesieniem nastpnej naley wysuszy. Trzeba te pamita o przepaleniu ezy przed powtrnym zanurzeniem jej w hodowli. Przygotowane rozmazy suszy si w powietrzu lub w strumieniu ciepego powietrza, trzymajc szkieko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiga si przez trzykrotne przecignicie spodu szkieka przez pomie palnika. Mona te zala szkieko np. alkoholem metylowym i pozostawi do jego cakowitego odparowania. W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynnoci naley wykonywa w pobliu palnika, pamitajc o opalaniu ezy i wylotw probwek w trakcie pobierania materiau.

Barwienie preparatw trwaych Bakterie najczciej ogldamy w preparatach barwionych. Moemy w nich zaobserwowa cechy morfologiczne komrek bakteryjnych, jak wymiar, ksztat sposb ukadania si komrek i pewne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala take na rnicowanie bakterii i odrnienie ich od skadnikw otoczenia, w ktrym si znajduj. Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwane i barwniki

14

zasadowe. Barwniki kwane to sole, w ktrych kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczciej wykorzystywanych nale: nigrozyna, tusz chiski, kolargol, ziele malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczciej wykorzystywanych zaliczamy: fiolet krystaliczny, fuksyn zasadow, safranin i bkit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komrki i na czeniu si go ze zwizkami chemicznymi, gwnie biakami, wchodzcymi w skad komrki bakteryjnej. W pH hodowli zwykle obojtnym lub lekko zasadowym biaka bakteryjne posiadaj adunek ujemny. Kwasy nukleinowe, z ktrymi te bd czy si barwniki, w tych warunkach rwnie wykazuj ujemne naadowanie. Dlatego wanie do barwienia bakterii uywa si barwnikw zasadowych. Barwniki kwane stosowane s do barwienia ta otoczenia, w ktrym znajduj bakterie. Barwienie komrek bakteryjnych okrelamy barwieniem pozytywnym. Barwienie ta, otoczenia, w ktrym znajduj si komrki okrelamy barwieniem negatywnym.

Barwienie metod Grama Barwienie metod Grama jest podstawowym barwieniem rnicujcym stosowanym w mikrobiologii, dzielcym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje si kolejno nastpujce odczynniki:

barwnik podstawowy fenolowy roztwr fioletu krystalicznego (gencjana);

zapraw w postaci roztworu jodu w jodku potasu (pyn Lugola);

odbarwiacz - alkohol etylowy;

barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwr fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10).

Wykonanie barwienia - Na utrwalony preparat naley nala wieo przesczony przez bibu roztwr gencjany na 2 minuty; - preparat spuka wod; - nala pyn Lugola na 1 minut; - spuka wod;

15

- odbarwia alkoholem przez 15-20 sekund; - spuka wod; - dobarwi przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spuka wod; - osuszy lekko odciskajc w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie fioletowogranatowe, gramujemne - rowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubo warstwy peptydoglikanu ciany komrkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich jest grubsza ni u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje si do wntrza komrki i czc si z jodem tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, ktry zabarwia j na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza bon cytoplazmatyczn bakterii gramdodatnich oraz bon cytoplazmatyczn i bon zewntrzn bakterii gramujemnych. Powoduje on rwnie odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniajc w ten sposb cian komrkow. Grupa warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym, ktry przez cienk warstw peptydoglikanu bakterii gramujemnych wydostaje si na zewntrz. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komrki bakterii gramujemnych na rowo. Barwienie metod Ziehla-Neelsena Barwienie metod Ziehla-Neelsena umoliwia wykrycie bakterii kwaso-alkoholo-opornych (Mycobacterium, Nocardia). Jedynie te przyjmuj i utrzymuj w toku barwienia barwnik podstawowy. W metodzie tej wykorzystuje si kolejno nastpujce odczynniki:

barwnik podstawowy - fenolowy roztwr fuksyny zasadowej (fuksyna karbolowa);

odbarwiacz - alkohol etylowy z dodatkiem 3% HCl (alkohol zakwaszony);

barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwr bkitu metylenowego (bkit metylenowy).

16

Wykonanie barwienia - Na uoony na statywie do barwienia, utrwalony preparat naley nala roztworem fuksyny zasadowej i krtko podgrza szkieko od spodu pomieniem palnika. Ukae si para, gdy zniknie, czynno powtrzy jeszcze dwa razy; - po ostudzeniu preparat naley spuka wod; - zala preparat zakwaszonym alkoholem i pozostawi do cakowitego odbarwienia na ok. 1 minut (czas odbarwiania zaley od gruboci rozmazu); - spuka wod ; - dobarwi preparat bkitem metylenowym przez 2 minuty; - spukany wod preparat naley wysuszy odciskajc go w bibule. Wynik barwienia: Bakterie kwaso-alkoholo-oporne - rowe, inne elementy preparatu, w tym bakterie inne ni kwaso-alkoholo-oporne niebieskie.

Barwienie metod Neissera Barwienie metod Neissera umoliwia wykrycie w komrkach bakterii polifosforanowych (wolutynowych) ziarnistoci zapasowych. W metodzie tej wykorzystuje si kolejno nastpujce odczynniki:

barwnik Neissera zoony z dwch skadnikw czonych bezporednio przed barwieniem: alkoholowo-wodnego roztworu bkitu metylenowego (Neisser I) i alkoholowo-wodnego roztworu fioletu krystalicznego (Neisser II);

wodny roztwr chryzoidyny. W barwieniu tym nie spukujemy barwnikw wod. Wykonanie barwienia - Przed przystpieniem do barwienia naley przygotowa barwnik Neissera przez zmieszanie w cylinderku: dwie czci barwnika Neisser I i jedn cz barwnika Neisser II; - na utrwalony preparat naley nala wymieszany barwnik; - po 5 minutach dokadnie zla barwnik, nie spukiwa wod; - nala na szkieko roztwr chryzoidyny na 10-15 sekund; - po zlaniu barwnika preparat od razu odcisn w bibule. Wynik barwienia: Ziarnistoci wolutynowe s granatowoczarne, komrki te.

17

Barwione metod negatywno-pozytywn Barwienie metod negatywno-pozytywn jest jedn z technik wykrywania otoczek u bakterii. Zabarwiana jest komrka bakteryjna i innym barwnikiem to. W metodzie tej mona uywa rnych barwnikw. Dla zabarwienia komrki - najczciej stosuje si fuksyn z dodatkiem fuksyny karbolowej, dla zabarwienia ta - nigrozyn lub kolargol. Wykonanie barwienia - Na utrwalony preparat nalewamy: roztwr fuksyny i kilka kropli fuksyny zasadowej, a nastpnie lece na statywie do barwienia szkieko podgrzewamy od spodu pomieniem palnika do ukazania si pary; - po ostudzeniu, preparat naley spuka wod i osuszy w bibule; - na brzeg szkieka nanie kropl nigrozyny lub kolargolu i rozcign barwnik rwnomiernie po powierzchni rozmazu krawdzi drugiego szkieka podstawowego; - preparat wysuszy w powietrzu. Wynik barwienia: Komrka barwi si na rowo, to jest szare (nigrozyna) lub tobrzowe (kolargol). Otoczka pozostaje bezbarwna.

Zadania do wykonania Zadanie 1. Mikroskopowanie i ocena preparatw Otrzymujesz gotowe preparaty wykonane z hodowli Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus i Pseudomonas aeruginosa, ktre zabarwione zostay metoda prost. - Nastaw je i obejrzyj pod mikroskopem wykorzystujc obiektyw immersyjny. - Narysuj obraz preparatw widzianych w mikroskopie. - Okrel powikszenie ogldanych preparatw oraz ksztat i sposb ukadania si komrek bakteryjnych. Pamitaj aby w swoich rysunkach uwzgldni rnice w wielkoci komrek ogldanych drobnoustrojw. Do zapisania swoich obserwacji wykorzystaj ponisze tabele.

18

Obraz mikroskopowy (rysunek) Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa

Powikszenie:

Opis obraz mikroskopowego Ogldany drobnoustrj

Ksztat bakterii Sposb ukadania si komrek

Bacillus subtilis

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

19

Zadanie 2. Identyfikacja na podstawie morfologii komrki Otrzymujesz hodowl pynn nieznanych bakterii. - Wykonaj preparat z tej hodowli, zabarw go metod Grama i oce pod mikroskopem. - Narysuj obraz mikroskopowy i zapisz obserwacje w tabeli. - Ile rodzajw bakterii mona odrni? - Okrel ich ksztat, sposb ukadania si komrek i zabarwienie.

Ksztat bakterii i ich ukad (rysunek)

Ksztat bakterii i ich ukad (opis )

20

Zadanie 3. Barwienie metod pozytywno-negatywn Otrzymujesz hodowl sta Klebsiella pneumoniae w pytce Petriego. Bakterie posiane zostay w sposb pasmowy. Wykonaj preparat z tej hodowli i zabarw go metod pozytywno-negatywn. Narysuj obraz widziany pod mikroskopem.

- Czy badany przez ciebie drobnoustrj charakteryzuje si zdolnoci wytwarzania otoczki?

21

- Dlaczego w powszechnie stosowanych metodach barwienia otoczka pozostaje niewybarwiona? Zadanie 4. Kropla wiszca Otrzymujesz pynn hodowl Proteus vulgaris, do ktrej dodano kilka kropli zawiesiny czerwonych krwinek baranich. - Wykonaj preparat z "kropli wiszcej" i nastaw go pod mikroskopem. Pamitaj, e tego typu preparat ogldamy przy obnionym kondensorze z wykorzystaniem obiektywu powikszajcego 40x lub 60x. - Ogldajc preparat zwr uwag na rnic w wielkoci pomidzy poruszajcymi si bakteriami, a nie wykazujcymi ruchu krwinkami czerwonymi.

22

23

Rozdzia 2

Poywki do hodowli bakterii Cze teoretyczna

Czynniki warunkujce wzrost bakterii na podoach Bakterie mog si rozwija tylko w takich rodowiskach, ktre zaspokajaj ich wymagania pokarmowe. Pobrane skadniki s rdem substancji budulcowych komrki oraz energii potrzebnej dla rozmnaania i wzrostu. Do elementw pokarmowych, bez ktrych wzrost nie jest moliwy nale: wgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodr (H). Pierwiastki te wchodz w skad wikszoci zwizkw organicznych tworzcych komrk i okrelane s jako pierwiastki budulcowe lub biogenne. Pewne grupy bakterii, o wysokim stopniu pasoytnictwa, nie s zdolne do wzrostu, jeli nie uzyskuj gotowych zoonych zwizkw, ktre nazywamy czynnikami wzrostowymi. Nale do nich witaminy, szczeglnie z grupy B, ktre s koenzymami lub grupami prostetycznymi niektrych enzymw. Inn grup czynnikw wzrostowych stanowi aminokwasy oraz zasady purynowe i pirymidynowe, ktre wykorzystywane s jako skadniki budulcowe komrki. Czynnikami wzrostowymi niezbdnymi dla niektrych bakterii s: cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy tuszczowe. Bakterie do wzrostu i mnoenia wymagaj znacznych iloci wody. W wodzie rozpuszczone s zwizki odywcze dla bakterii. Woda jest take rodowiskiem, w ktrym zachodz procesy metaboliczne, a take jest istotnym rdem wodoru i tlenu. Wikszo bakterii nie wzrasta, jeli zawarto wody w rodowisku jest nisza ni 20%. Zawarto wody w podoach hodowlanych wynosi 50-90%. Wzrost bakterii zaleny jest take od obecnoci soli mineralnych. Jony Mg2+, Fe 2+, Ca2+ , Mn 2+, Zn2+ s aktywatorami niektrych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymw. Jony Mg2+ stabilizuj struktur ciany komrkowej bakterii gramujemnych. Stabilno struktury i prawidow czynno rybosomw zapewniaj jony

24

Mg2+

i K+

. Jony Ca2+

s niezbdne w procesie wytwarzania przetrwalnikw. Sole mineralne s rwnie czynnikami regulujcymi cinienie osmotyczne komrki.

Podoa do hodowli bakterii Poywki (podoa) bakteriologiczne su do hodowli bakterii w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie skadu podoa pozwala na przeniesienie bakterii z ich naturalnych rodowisk (organizm czowieka, gleba, woda) i namnoenie. Zdolno wyrastania bakterii na okrelonych podoach lub jej brak, jest bardzo wan cech diagnostyczn. Bakterie hodujemy na staych lub w pynnych poywkach, ktre umieszczone zostay w naczyniach hodowlanych (pytki Petriego, kolby Erlenmayera, probwki). Wzrost i rozwj bakterii na poywkach pozwala na ich wyodrbnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i serologicznych. Wikszo bakterii ronie na sztucznych podoach. Nie ma jednak uniwersalnej poywki umoliwiajcej wzrost wszystkim bakteriom. Poywki stosowane do namnaania bakterii powinny:

zawiera odpowiednie skadniki pokarmowe,

mie odpowiedni wilgotno,

mie odpowiednie pH,

mie odpowiednie cinienie osmotyczne,

by jaowe. Biorc pod uwag ich skad chemiczny, podoa bakteriologiczne dzielimy na syntetyczne (cile zdefiniowane chemiczne) i zoone (kompleksowe). Skad poywek syntetycznych jest dokadnie zdefiniowany i oparty na czystych, chemicznych zwizkach organicznych i nieorganicznych. Jest wic zawsze moliwy do dokadnego odtworzenia. Poywki te znajduj niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych. Podoa zoone maj szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych i naukowych. S to podoa zawierajce rne skadniki,

25

w tym surowce pochodzenia naturalnego, ktrych skad nie jest dokadnie okrelony. Skadniki pochodzenia naturalnego najczciej wykorzystywane w poywkach zoonych przedstawiono w tabeli 1. Poywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli drobnoustrojw o maych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone, ktre su do hodowli drobnoustrojw o duych wymaganiach odywczych. Tabela 1. Skadniki pochodzenia naturalnego stosowane w poywkach zoonych.

Ekstrakty misne wodne wycigi z tkanki misnej, serca, wtroby

bogate rdo azotu, wgla i witamin

Ekstrakty z drody dobre rdo azotu, wgla, bogate rdo witamin z grupy B

Peptony produkty czciowej, enzymatycznej hydrolizy biaek

bogate rdo azotu, wgla

Hydrolizaty enzymatyczne lub kwasowe kazeiny, biaek soi, biaek misa.

bogate rdo wolnych aminokwasw (azotu), wgla

Biaka kazeina, elatyna, biaka jaja, surowicy krwi

bogate rdo azotu, wgla, mikroelementw

Podstawow prost poywk pynn jest bulion odywczy, a sta agar odywczy. Bulion odywczy zawiera wycig misny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie 1,5-2% agaru do bulionu odywczego otrzymujemy podoe stae. Agar jest to wielocukier otrzymywany z glonw morskich. Silnie chonie wod, upynnia si w temperaturze 100C, a zestala w temperaturze 45-48C. W temperaturze 37C, a wic optymalnej dla wzrostu wikszoci bakterii, ma konsystencj sta. Suy on do zestalenia poywki. Nie jest wykorzystywany przez bakterie jako skadnik odywczy. Agar odywczy przygotowywany jest w postaci skosw agarowych, supkw lub pytek agarowych. Podoa wzbogacone to najczciej podoa podstawowe zawierajce dodatkowe skadniki. Elementami wzbogacajcymi mog by: wglo-

26

wodany (np. glukoza), biaka zwierzce (surowica lub krew), hydrolizaty biaek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym w badaniach mikrobiologicznych podoem wzbogaconym jest agar z krwi. Zawiera on 5-10% odwknionej jaowej krwi (najczciej baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odywczym. Po wylaniu na pytk Petriego otrzymujemy tak zwan pytk krwaw. Innym czsto wykorzystywanym podoem wzbogaconym jest agar czekoladowy. Zawiera on agar odywczy i zdenaturowan termicznie krew. Po zestaleniu podoa ma ono barw czekoladow, std jego nazwa. Poywki mog zawiera dodatkowe skadniki, ktre wpywaj stymulujco lub hamujco na rozwj hodowanych na nich bakterii. Ze wzgldu na wynikajce z ich skadu zastosowanie, podoa moemy podzieli na:

- namnaajce lub namnaajco-wybircze, - wybircze (selektywne), - diagnostyczne (rnicujce), - transportowe.

Poywki namnaajce lub namnaajco-wybircze s to najczciej podoa pynne, wykorzystywane do namnaania bakterii wystpujcych w niewielkiej iloci w badanej prbce, czsto jako pojedyncze komrki, w licznej populacji bakterii towarzyszcych. Skad poywki i warunki hodowli umoliwiaj namnoenie si tylko bakterii poszukiwanych. Poywki wybircze (selektywne) oprcz skadnikw odywczych zawieraj skadniki, ktre powoduj cakowite zahamowanie wzrostu pewnych gatunkw bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikiem decydujcymi o wybirczoci podoa moe by azydek sodu, sole kwasw ciowych niektre barwniki i antybiotyki. S to najczciej podoa stae. Przykadem podoa wybirczego moe by podoe Loewensteina-Jensena do hodowli prtkw grulicy. Poywki rnicujce (diagnostyczne) pozwalaj na zmierzajce do identyfikacji, rnicowanie bakterii. Zawieraj one substrat diagnostyczny, ktry moe by rozoony enzymatycznie tylko przez okrelone gatunki bakterii. Do podoa czsto dodawany jest wskanik, ktry na przykad zmienia swoje zabarwienie w zalenoci od pH poywki. Dlatego wanie rozkad substratu manifestuje si zmian zabarwienia poywki (podoa

27

stae lub podoa pynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosych kolonii (podoa stae). Stae podoa rnicujce mog by jednoczenie podoami wybirczym dla okrelonej grupy bakterii i s nazywane wybirczo-rnicujcymi. Przykadem takiej poywki moe by podoe SS (Salmonella-Shigella) suce do izolacji paeczek z rodzajw Salmonella i Shigella oraz podoe Chapmana suce do izolacji gronkowcw. Poywki transportowe nie zawieraj skadnikw pokarmowych. Zawieraj wod i skadniki optymalizujce rodowisko dla przeycia bakterii, w tym roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych poywek jest utrzymanie ywotnoci bakterii w prbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego. Na rynku dostpne s podoa o wystandaryzowanym skadzie, jaowe i gotowe do uycia, w jednorazowych naczyniach, o okrelonej dacie przydatnoci. Zastosowanie gotowych podoy znacznie skraca czas przygotowa do bada mikrobiologicznych. Mona te je przygotowywa samodzielnie, korzystajc z poywek w proszku o wystandaryzowanym skadzie i innych chemicznych skadnikw. Wasnorczne komponowanie poywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniajcych powtarzalno ich skadu, pozwalajc na porwnywanie wynikw hodowli otrzymywanych w rnym czasie i w rnych laboratoriach. Bezporednio po przygotowaniu, takie poywki naley wyjaowi (wysterylizowa), stanowi bowiem podoe wzrostu take dla drobnoustrojw licznie obecnych w uytych skadnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje si najczciej w autoklawie lub w aparacie Kocha, a czasem przez przesczenie przez filtr o odpowiednio maych porach.

Czas hodowli W podou zawierajcym niezbdne do wzrostu skadniki, bakterie podwajaj swoj mas i replikuj swj materia genetyczny, co w konsekwencji prowadzi do ich podziau. Czas generacji (okres midzypodziaowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komrek w populacji. Szybko wzrostu bakterii jest cech charakterystyczn

28

rodzaju (gatunku). Zaley ona take od rodzaju podoa wzrostowego oraz warunkw rodowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu w laboratorium okresy midzypodziaowe wikszoci bakterii trwaj od 20 do 40 minut, ale moe te by znacznie duszy - od kilku do kilkunastu godzin. Std, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na poywce tak, aby ich wzrost by widoczny goym okiem jest rny, ale dla wikszoci bakterii chorobotwrczych wynosi 18-24 godziny. S jednak i takie, ktre hodowa trzeba przez wiele dni lub nawet tygodni (np. prtki).

Krzywa wzrostu bakterii w hodowli pynnej Bakterie na podoach pynnych mona namnaa w warunkach hodowli okresowej (zwykej) lub cigej. W hodowli okresowej bakterie namnaaj si w systemie zamknitym (probwki, kolbki, butelki, bioreaktory) do momentu wyczerpania substancji odywczych zawartych w poywce lub nagromadzenia w niej duej iloci toksycznych dla bakterii produktw ich metabolizmu. W hodowli cigej, ktr prowadzi si w specjalnych bioreaktorach, wzrost bakterii mona utrzymywa nieskoczenie dugo. Wzrost bakterii w hodowli okresowej mona przedstawi graficznie pod postaci krzywej, ktr nazywamy krzyw wzrostu hodowli bakteryjnej. Jest to krzywa w ukadzie plogarytmicznym. Opisuje ona zaleno logarytmu dziesitnego liczby ywych komrek bakterii od czasu hodowli i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla wikszoci bakterii jest bardzo podobny i mona w nim wyrni sze faz. Czas trwania poszczeglnych faz wzrostu jest zaleny od rodzaju bakterii i warunkw hodowli. Faza pierwsza, nazywana jest faz zastoju. Bakterie przystosowuj swj metabolizm do nowego rodowiska. Wzrasta ilo rybosomw i zawarto RNA. Pojedyncze komrki powikszaj swj wymiar i przygotowuj si do podziau. Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komrki wykazuj intensywny metabolizm. Rozpoczynaj si podziay komrkowe. Faza trzecia, nazywana faz wzrostu wykadniczego (logarytmicznego), jest okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komrek jest bardzo intensywny. Liczba ywych komrek przyrasta w postpie

29

geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komrki s ywe. W tej fazie wzrostu bakterie s najbardziej wraliwe na dziaanie fizycznych i chemicznych czynnikw rodowiskowych.

Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju, 2 faza przyspieszonego wzrostu, 3 faza wzrostu logarytmicznego, 4 faza zwolnionego wzrostu, 5 faza stacjonarna, 6 faza zamierania Faza czwarta jest faz zwolnionego wzrostu. Rozmiar komrek maleje. Zmniejsza si ilo rybosomw i zawarto RNA. Zwiksza si liczba komrek martwych. Czsto podziaw maleje. Faza pita, nazywana faz stacjonarn (rwnowagi), charakteryzuje si sta liczb ywych komrek w hodowli. Z powodu braku substancji pokarmowych komrki zuywaj wasne materiay zapasowe. Sporadyczne podziay komrkowe rekompensuj ubytki komrek spowodowane ich wymieraniem. Faza szsta zamierania. Wzrasta liczba martwych komrek. Zaczynaj si procesy autolizy, czyli samorozpuszczania si bakterii pod wpywem wasnych enzymw. Zmniejsza si liczba ywych komrek i oglna biomasa hodowli. Brak podziaw komrkowych.

lg liczby ywych komrek

czas hodowli

12

3

4 5

6

30

Wane definicje Populacj bakterii rosnc na podou staym lub pynnym nazywamy hodowl. Hodowl skadajc si z rnych gatunkw bakterii nazywamy hodowl mieszan. Czyst hodowl nazywamy hodowl bakterii jednego rodzaju (gatunku, szczepu). Szczep to populacja drobnoustrojw w obrbie gatunku wyrniajca si okrelonymi cechami. Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komrki nazywamy klonami.

31

Rozdzia 3

Otrzymywanie czystych hodowli, ocena morfologii wzrostu bakterii Cz teoretyczna Posiew na podoa Materia zawierajcy bakterie posiewa si na podoa stae (skos agarowy, pytka agarowa) lub pynne (bulion) jaowymi: ez, pipet lub wacikiem. Kada prbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii, ktr zakaamy wiee podoe stanowi inokulum.

Czyste hodowle W wikszoci przypadkw przy badaniu bakteriologicznym materiaw klinicznych, ywnoci, wody czy lekw spodziewamy si w prbce wicej ni jednego rodzaju drobnoustrojw. Identyfikacja drobnoustrojw wystpujcych w badanym materiale, moe nastpi dopiero po ich wyodrbnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje si metod posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocen morfologii wyrosych kolonii. Zakada si, e kada z nich powstaje z jednej jednostki wzrostowej. A zatem, ile typw kolonii, tyle rodzajw bakterii w hodowli. Poniewa morfologia kolonii rnych gatunkw czy nawet rodzajw moe by zbliona, czasem pomocnym w odrnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na pytk z podoem diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z takiego posiewu prowadzi zwykle do uzyskania hodowli czystej.

Morfologia wzrostu bakterii na podoach Sposb, w jaki bakterie wyrastaj na poywkach jest wan cech, ktra moe by istotna przy ich identyfikacji.

32

Na podoach pynnych bakterie wyrastaj w postaci jednolitego zmtnienia, osadu na dnie naczynia, kouszka lub bonki na powierzchni pynu. Czasami zmtnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagszczenie przy powierzchni, a na granicy faz tworzy si przylegajca do cianek naczynia warstwa biofilmu. Na podoach staych moemy ocenia wygld kolonii bakteryjnych. Istotna moe by te ocena obfitoci wzrostu lub obserwacja zdolnoci bakterii do wzrostu mgawicowego (to cecha bakterii bardzo ruchliwych). Koloni bakteryjn definiujemy jako widoczne makroskopowo na powierzchni lub w gbi staej poywki skupisko bakterii wyrose z jednej jednostki wzrostowej (jtk jednostka tworzca kolonie; CFU ang. colony forming unit). Przez jednostk wzrostow rozumiemy pojedyncz komrk lub kilka komrek bakteryjnych, ktre nie rozdzieliy si po podziale (ukad popodziaowy) albo przetrwalnik. Umiejtno oceny morfologii kolonii jest bardzo wana, gdy w przypadku niektrych bakterii moe w istotny sposb way na ich identyfikacji, jest te istotna przy okrelaniu czystoci hodowli. W okrelonych warunkach rodowiska kolonie charakteryzuj si staymi cechami.

Metody

Posiewy Posiewajc ez, naley j wyjaowi wyarzajc w pomieniu palnika przed i po wykonaniu posiewu. Jeli uywa si jaowych pipet i wacikw naley pamita o ich umieszczeniu w odpowiednich naczyniach (np. w soju z chloramin) po zakoczeniu posiewu. W trakcie posiewania bakterii na podoa pynne naley take pamita o opalaniu wylotu naczy w pomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamkniciem. Ma to zapobiec zakaeniu poywki drobnoustrojami z zewntrz i zapewni bezpieczestwo osobie pracujcej. Posiew na podoe pynne ez polega na uwolnieniu z niej materiau stanowicego inokulum do poywki przez pocieranie o cianki naczynia probwki lub kolbki.

33

Przy posiewaniu do naczy zawierajcych wiksze objtoci poywki konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji midzy wielkoci inokulum a objtoci podoa. Zwykle stosuje si zasad, e inokulum stanowi 5% kocowej objtoci poywki. Posiewu moemy dokonywa pipet wprowadzajc np. 5 mL hodowli stanowicej inokulum do 95 mL poywki. Posiew na podoa stae na pytkach Petriego dokonuje si w rny sposb zalenie od jego celu. Wanym, czsto stosowanym przy izolacji bakterii sposobem, prowadzcym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni pytki znajdowao si coraz mniej bakterii. Sposb wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1. Rycina 1. Posiew redukcyjny

A

B

C

D

34

W poszczeglnych etapach raz naniesiony materia zostaje rozprowadzany na kolejne (zwykle 4) sektory pytki. Kadorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcj ich liczby do takiej iloci, przy ktrej w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii. Czasem wykonuje si posiew redukcyjny z materiau z wacika. Oznacza to, e pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, ktrym np. pobrano materia kliniczny wymaz, a nastpne ju w klasyczny sposb ez z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu. Mona wykona na pytce take posiew pasmowy lub punktowy, ktry pozwala umieci na pytce wiele prbek, ktrych cechy chcemy porwnywa. Polega on na naniesieniu na pytk inokulum z ezy w postaci pasma rnej dugoci. Czasem istnieje potrzeba zasiania caej powierzchni pytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu mona dokona wacikiem (tzw. wymazwk). Inokulum stanowi zwykle prbka pobrana z podoa pynnego (nadmiar pynu z wacika naley w trakcie pobierania odcisn o cianki naczynia), ktr rozprowadza si rwnomiernie na powierzchni podoa w pytce. Czasem zawiesina stanowica inokulum w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposb standaryzowana. Inokulum o okrelonej objtoci, zwykle 0,1 mL mona take rozprowadzi gaszczk lub odpowiednio zagit ez. Przy posiewie na podoe stae w probwce w postaci skosu agarowego naley wprowadzi ez z inokulum do dna probwki i rozprowadzi na powierzchni skosu. Zwykle prowadzi si w tym celu ez zygzakowatym ruchem od cianki do cianki prbwki, przesuwajc j ku wylotowi naczynia. Pskosy posiewa si wkuwajc ez w cz supkow, a dopiero potem wyprowadzajc j zygzakiem po powierzchni skosu ku wylotowi.

Otrzymywanie czystych hodowli Postpowanie zmierzajce do otrzymania czystych hodowli z nieznanych prbek sprowadza si do nastpujcych krokw.

35

Badany materia posiewa si redukcyjnie na odpowiednio dobrane podoe.

Po inkubacji (czasem wyduonej nawet do 5 dni) w temperaturze optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojw ocenia si morfologi wyrosych kolonii. Obecno rnic w ich wygldzie wskazuje, e mamy do czynienia z hodowl mieszan.

Izoluje si wtedy pojedyncze kolonie i posiewa si je redukcyjnie na oddzielne pytki.

Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla moe by uznana za czyst, jeli kolonie posiadaj jednakow morfologi.

Namnoona (na skosie, w poywce pynnej lub w inny sposb) pojedyncza kolonia z takiej pytki moe by materiaem dla wykonywania prb i posieww identyfikacyjnych czy sucych do okrelenia waciwoci fizjologicznych, biochemicznych i antygenowych bakterii.

Szybk, cho czasem zawodn metod sprawdzenia czystoci hodowli pynnej jest ocena morfologii komrek tworzcych j bakterii w preparatach barwionych metod Grama.

Opis kolonii Dla celw diagnostycznych opisuje si kolonie wyrose na podoach, ktre nie powoduj ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaywania zawartych w nich wskanikw czy barwnikw. Niekiedy jednak istotny take bywa opis ich wygldu na podoach diagnostycznych. Naley opisywa kolonie oddalone od pozostaych tak, aby ich wzrost nie by ograniczony przez zbyt liczne ssiedztwo. W opisie kolonii naley wzi pod uwag nastpujce jej elementy:

wielko - rednica (mm);

ksztat - okrga, owalna, nitkowata, rozgaziona nieregularna, ... ;

brzeg - rwny, postrzpiony, falisty, zbkowany, ... ;

powierzchni - gadka, lnica, matowa, pomarszczona, ..;

wzniesienie (profil kolonii) - paska, wypuka, ppkowata, grudkowata, wrastajca w podoe, ... ;

36

przejrzysto - przezroczysta, opalizujca, mtna, ... ;

barw - biaa, kremowa, szara, czerwona, ... ;

otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podoa.

Zadania do wykonania Zadanie 1. Otrzymywanie czystej hodowli

Etap I - Materia z otrzymanej hodowli pynnej posiej redukcyjnie na pytk agarow. - Podpisz pytk, inkubuj w cieplarce (37C, 24 godziny). - Wykonaj preparat barwiony metod Grama z posiewanej hodowli. - Narysuj i opisz obraz mikroskopowy

37

Etap II - Obejrzyj wykonany wczoraj posiew redukcyjny, zwracajc szczegln uwag na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz kady z widocznych rodzajw kolonii.

- Wykonaj z kadej z nich preparat barwiony metod Grama i uzupenij opis kolonii o morfologi komrki.

- Kad z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na now pytk. Opisz pytk, inkubuj w cieplarce (37C, 24 godziny).

Kolonia: Preparat:

Kolonia: Preparat:

38

Kolonia: Preparat:

Oce zgodno otrzymanych obrazw mikroskopowych z preparatem wykonanym w pierwszym etapie dowiadczenia.

Jak oceniasz znaczenie preparatu bezporedniego z hodowli wyjciowej dla okrelenia jej czystoci i rodzaju drobnoustrojw w niej si znajdujcych?

39

Etap III Jeli na kadej z posianych pytek wyrosn kolonie tylko jednego rodzaju, o wygldzie zgodnym z wczeniej wykonanym opisem, otrzymae czyste hodowle tych bakterii czyli hodowle jednego gatunku pochodzce z pojedynczej kolonii, a zatem czyste hodowle poszczeglnych szczepw bakteryjnych. Zadanie 2. Ocena morfologii kolonii bakteryjnej - Obejrzyj pytk z podoem agarowym, na ktrej wyrosy pojedyncze kolonie. Powstay one w wyniku namnoenia si komrek bakterii i przetrwalnikw, ktre opady na podoe (sedymentoway) z powietrza. - Wybierz jedn koloni i opisz j uwzgldniajc wszystkie jej cechy.

40

41

Rozdzia 4

Wymagania wzrostowe bakterii Cz teoretyczna

Wymagania pokarmowe Bakterie, podobnie jak inne organizmy ywe, potrzebuj dostpu do odpowiednich skadnikw odywczych, umoliwiajcych im prawidowy wzrost i rozmnaanie. Wymagania pokarmowe bakterii s bardzo rnorodne, od bakterii skrajnie wymagajcych, ktre maj najmniejsze zdolnoci biosyntetyczne i wymagaj do wzrostu zwizkw wielkoczsteczkowych, poprzez stanowice najwiksz grup bakterie o wymaganiach porednich, do ktrych zalicza si wikszo bakterii chorobotwrczych, a do skrajnie niewymagajcych, ktre wykorzystuj jako rdo wgla CO2. Wymagania pokarmowe s w duej mierze zwizane ze stopniem pasoytnictwa poszczeglnych drobnoustrojw.

rda wgla i azotu Wgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmw ywych. W zalenoci od rde, z jakich bakterie mog go pozyskiwa podzielono je na:

autotrofy czerpice wgiel tylko z CO2 i przeksztacajce go do zwizkw organicznych;

heterotrofy czerpice wgiel ze zwizkw organicznych. Heterotrofy do prawidowego wzrostu potrzebuj w rodowisku co najmniej jednego zwizku organicznego. Najwicej drobnoustrojw ma zdolno do rozkadu glukozy, ale zdarzaj si take bakterie mogce korzysta z mleczanu, bursztynianu, metanu, a take bardziej zoonych zwizkw, jak lignina czy wglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostay podzielone na:

42

- prototrofy drobnoustroje o maych wymaganiach pokarmowych, ktrym do wzrostu wystarczy jeden prosty zwizek organiczny i sole mineralne, co wiadczy o ich duych, gwarantujcych szerokie rozprzestrzenienie, moliwociach enzymatycznych;

- auksotrofy drobnoustroje o duych wymaganiach odywczych, rosnce jedynie w obecnoci co najmniej dwch zwizkw organicznych stanowicych rdo wgla i azotu, ktrych nie s w stanie same syntetyzowa, co w znacznym stopniu uzalenia je od rodowiska.

Zarwno prototrofizm, jak i auksotrofizm, mog by wykorzystywane dla celw diagnostycznych, na przykad w identyfikacji paeczek z rodziny Enterobacteriaceae czy przy ustalaniu gatunku paeczek z rodzaju Haemophilus. Bakterie auksotroficzne czsto wymagaj do wzrostu specjalnych czynnikw wzrostowych, ktrymi mog by aminokwasy, puryny i pirymidyny lub witaminy. Azot, ktry jest wanym pierwiastkiem wchodzcym w skad biaek i kwasw nukleinowych, prototrofy mog pozyskiwa ze zwizkw nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanw i azotynw), a auksotrofy wykorzystuj organiczne rda azotu.

rda energii oraz donatory elektronw Drobnoustroje maj zdolno wykorzystywania energii sonecznej lub energii chemicznej uwalnianej ze zwizkw wysokoenergetycznych. Pozwala to wyrni wrd bakterii:

fototrofy ktre korzystaj z energii sonecznej (bakterie fotosyntetyzujce),

chemotrofy korzystajce z energii pochodzcej z rozkadu zwizkw organicznych i nieorganicznych.

W zalenoci od donatorw elektronw dzielimy bakterie na:

litotrofy - korzystajce z donatorw nieorganicznych,

organotrofy - korzystajce z donatorw organicznych.

43

Zatem, zalenie od wykorzystywanych przez bakterie rde energii i donatorw elektronw, moemy wyrni cztery typy pokarmowe: fotolitotrofy, fotoorganotrofy, chemolitotrofy i chemoorganotrofy. Bakterie stanowice mikrobiota czowieka i te, ktre s dla niego chorobotwrcze, s chemoorganotrofami pozyskujcymi wgiel ze zwizkw organicznych.

Wymagania tlenowe bakterii Bakterie rni si pomidzy sob zapotrzebowaniem na tlen. Bezwzgldnie tlenowe rosn tylko w jego obecnoci, bezwzgldne beztlenowe rosn przy jego braku, a wzgldne beztlenowe rosn zarwno przy dostpie, jak i braku tlenu. Rnice te wynikaj ze sposobu pozyskiwania energii przez bakterie w procesie oddychania. Oddychanie tlenowe jest moliwe tylko u organizmw, w ktrym kocowym akceptorem przenoszonych przez acuch oddechowy elektronw jest tlen czsteczkowy. W przypadku oddychania beztlenowego kocowym akceptorem elektronw w acuchu oddechowym s zwizki nieorganiczne: azotany, siarczany. Moliwe jest jeszcze pozyskiwanie energii w procesie fermentacji, gdzie akceptorem elektronw jest zwizek organiczny. Bakteriom bezwzgldnie tlenowym tlen jest niezbdny do prawidowego wzrostu i rozmnaania. W przypadku braku tlenu gin, gdy przenoszenie elektronw acucha oddechowego zostaje zahamowane i nie jest magazynowana energia. Bakterie te maj enzymy, ktre chroni je przed toksycznym dziaaniem tlenu. Dysmutaza nadtlenkowa wie wolne rodniki z wodorem, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru. Jest on rozkadany przez dwa inne enzymy: katalaz i peroksydaz do wody i tlenu. Do bezwzgldnie tlenowych, chorobotwrczych bakterii zaliczane s m.in. bakterie z rodzajw Mycobacterium, Bacillus, Nocardia. Bakterie wzgldnie beztlenowe mog rosn zarwno w obecnoci tlenu, jak i przy jego braku w rodowisku o obnionym potencjale oksydo-redukcyjnym. Do tej grupy naley wiele bakterii, w tym te chorobo-twrczych. Jeeli tlen jest obecny w rodowisku, mog korzysta z energii pozyskiwanej w wyniku oddychania tlenowego. Przy braku tlenu mog

44

przestawi metabolizm na fermentacyjny, jak np.: Escherichia coli lub na oddychanie beztlenowe. Bakterie bezwzgldnie beztlenowe mog si rozwija tylko i wycznie przy braku dostpu do tlenu. Jest on dla nich toksyczny, poniewa nie maj adnych mechanizmw redukujcych jego szkodliwe dziaanie. Niektre z nich mog rosn w obecnoci tlenu, jednak pod warunkiem obnienia potencjau oksydoredukcyjnego poprzez dodanie do hodowli glutationu, cystyny bd tioglikolanu sodu. Do tej grupy nale liczne bakterie chorobotwrcze dla czowieka, m.in. z rodzajw Clostridium, Bacteroides czy Fusobacterium.

Wymagania temperaturowe bakterii Temperatura ma istotny wpyw na rozwj bakterii. Kady ich rodzaj ma optymaln dla siebie temperatur, w ktrej wszelkie procesy metaboliczne prowadzone s najbardziej wydajnie. Temperatury kardynalne to temperatura minimalna, ktra wyznacza doln granic, poniej ktrej wzrost danego rodzaju zanika i maksymalna, ktra jest temperatur, powyej ktrej bakterie ju si nie dziel. Preferencje dotyczce temperatury dziel bakterie na grupy. Termofile (bakterie ciepolubne) najlepiej rosn w temperaturze 40C do 70C. Bakterie takie jak Geobacillus stearothermophilus, czy Thermoactinomyces vulgaris yj w kompocie, glebie, nawozach organicznych. Znane s take bakterie rosnce w wyszych temperaturach, np. Thermus aquaticus w 65C. Znane s i takie, ktre mno si w temperaturze 90-110C. Okrelane s one jako termofile ekstremalne. Zainteresowanie nimi wynika z moliwoci, jakie ciepoodporne enzymy tych bakterii stwarzaj np. dla biologii molekularnej. Mezofile to najwiksza grupa drobnoustrojw, rosnca w zakresie temperatur 25-45C. Wrd nich s bakterie z optimum rozwoju w temperaturze 37C, blisko zwizane z czowiekiem jako patogeny i komensale (np. rodzaje Streptococcus, Staphylococcus, Salmonella). Niektre z mezofili mog rosn w szerokim zakresie temperatur, jak na

45

przykad dobrze mnoca si w temperaturze lodwki Listeria spp. o spektrum od 1

oC do 45C .

Psychrofile to bakterie zimnolubne, ktrych metabolizm najefektywniej funkcjonuje w niskich temperaturach. S wrd nich psychrofile wzgldne o optymalnej temperaturze 20C, ale mogce te rosn w 0C, wystpujce w gbi oceanw oraz psychrofile bezwzgldne o istotnym znaczeniu dla czowieka. Rosn one dobrze w 0C, mnoc si w ywnoci przechowywanej w chodniach. Powoduj jej psucie i mog by przyczyn zachorowa. Nale tu m.in. niektre gatunki Flavobacterium, Aerobacter, a take Bacillus czy Lactobacillus.

Metody

Badanie zdolnoci wykorzystywania cytrynianu jako jedynego rda wgla Okrelenie przynalenoci bakterii do prototrofw oraz zbadanie zdolnoci do metabolizowania okrelonego zwizku organicznego jako jedynego rda wgla moe mie znaczenie diagnostyczne. Cech t mona zbada na podou Simmonsa. Jest to podoe stae, ktre moe zawiera w swoim skadzie cytrynian sodowy lub np. malonian jako jedyne rdo wga i siarczan amonowy jako rdo azotu. Do poywki dodany jest wskanik pH bkit bromotymolowy, ktry w rodowisku obojtnym, jakie posiada podoe wyjciowe, ma zabarwienie zielone. Na podou wyrastaj jedynie bakterie, ktre maj zdolno wykorzystywania tego organicznego substratu, a alkaliczne produkty ich metabolizmu amoniak i aminy zmieniaj jego barw na niebiesk.

Badanie zdolnoci korzystania z soli amonowych lub aminokwasw jako rda azotu Bakterie posiane na stae podoe niezawierajce rda azotu, na ktre punktowo (na bibuowych krkach czy do metalowych cylinderkw) naniesiono odpowiednio roztwory: NH4(SO4)2 i aminokwasw, wyrosn

46

tylko w pobliu tego rda azotu, ktry mog wykorzystywa. Bakterie o duych moliwociach biosyntetycznych (korzystajce z formy nieorganicznej) zazwyczaj take dobrze przyswajaj azot organiczny.

Metody hodowli bakterii tlenowych Tlen jest wanym czynnikiem warunkujcym wzrost bakterii tlenowych i wzgldnie beztlenowych. Pobieraj one tlen rozpuszczony w poywce. Dostpno tlenu dla bakterii w hodowlach pynnych moemy zwikszy przez ich napowietrzanie. Najprociej osign to przez energiczne wstrzsanie lub mieszanie hodowli na mechanicznych wytrzsarkach. W hodowlach pynnych prowadzonych na skal przemysow stenie tlenu zwiksza si przepuszczajc przez poywk powietrze lub tlen.

Metody hodowli bakterii beztlenowych Obecno tlenu moe uniemoliwi wyhodowanie bakterii bezwzgldnie beztlenowych. Jest wiele sposobw usunicia tlenu z poywki. W przypadku poywki pynnej najprostszym sposobem jest jej zagotowanie, szybkie schodzenie i pokrycie powierzchni podoa pynn parafin. Niektre bakterie beztlenowe dobrze rosn na podoach zawierajcych tkanki zwierzce jako absorbent tlenu. Wiele bakterii mona te wyhodowa na podoach o obnionym potencjale oksydo-redukcyjnym, co jest osigane poprzez dodanie odpowiednich zwizkw chemicznych. W powszechnie uywanym podou Brewera jest to tioglikolan sodu, a w podou Schaedlera chlorowodorek cysteiny. Warunki atmosfery gazowej najlepiej mona dostosowa do potrzeb okrelonych bakterii hodujc je w specjalnych, szczelnych sojach, wewntrz ktrych atmosfer beztlenow uzyskuje si na drodze reakcji chemicznej zachodzcej w specjalnych saszetkach (nazwa zaley od jej wytwrcy). Saszetka zawiera zestaw substancji, z ktrych po jej otwarciu wydzielane s wodr, CO2 lub mieszanina gazw optymalna dla danych bakterii. Jeli wydzielany jest wodr, to reaguje on z tlenem obecnym w soju, tworzc wod. Reakcja ta zachodzi szybko i gwarantuje uzyskanie warunkw beztlenowych. Efektywno tego procesu sprawdza si przy

47

pomocy wskanika, bkitu metylenowego, ktry w warunkach beztlenowych jest bezbarwny. Odczynniki zawarte w niektrych rodzajach saszetek wymagaj do swojej aktywnoci zetknicia z wod. Aby zwikszy szybko czenia si wodoru z tlenem stosuje si wtedy katalizator palladowy umieszczany w specjalnym pojemniku przytwierdzonym do wieka soja. W powietrzu atmosferycznym tlen stanowi 20%. Do namnaania bakterii mikroaerofilnych stosuje si saszetki, ktre pozwalaj uzyska rodowisko o niewielkim steniu tlenu rzdu 7-10%. Niektre bakterie wymagaj do swojego optymalnego wzrostu zwikszonego stenia CO2. Znajduj wtedy zastosowanie saszetki, ktre pozwalaj na uzyskanie rodowiska o podwyszonym steniu CO2 (rednio od 3 do 6%).

Zadania do wykonania Zadanie 1. Wpyw warunkw gazowych na rozwj bakterii na podoach staych w sojach do hodowli beztlenowcw - Otrzymujesz hodowle bulionowe szczepw: Bacteroides fragilis i Escherichia coli oraz podoa dwie pytki zawierajce agar z krwi i dwie pytki wypenione staym podoem Schaedlera wzbogaconym krwi (podoe to stwarza dogodne warunki dla hodowli beztlenowcw, gdy zawiera skadniki obniajce potencja oksydoredukcyjny). - Podpisz pytki nazwami drobnoustrojw: agar z krwi i podoe Schaedlera dla kadego z drobnoustrojw. - Zanurz jaowy wacik w hodowli Escherichia coli, odcinij o cianki probwki i posiej metod redukcyjn na dwie pytki (agar z krwi i podoe Schaedlera). - Szczep Bacteroides fragilis posiej w identyczny sposb. - Posiewy na pytce krwawej inkubuj w cieplarce (37C, 20 godzin) warunki tlenowe. - Dwie pozostae pytki (Schaedlera) wstaw do soja do hodowli bakterii beztlenowych. Przed zamkniciem soja w do niego odpowiedni

48

saszetk np. Gas Pak, a do jego wieczka przytwierd papierek wskanikowy. - Zamknij wieko soja i pozostaw go w temperaturze pokojowej na ok. 30 minut. Zaparowanie soja (wytworzenie wody) wskazuje na powstanie atmosfery beztlenowej. - Posiewy w soju take inkubuj w cieplarce (37C, 20 godzin). - Na podstawie obecnoci wzrostu okrel wymagania tlenowe tych bakterii. - Wyniki zestaw w tabeli. Tabela. Wyniki dowiadczenia

Warunki tlenowe

Warunki beztlenowe

Okrelenie wymaga tlenowych bakterii

agar z krwi

podoe Schaedlera

agar z krwi

podoe Schaedlera

Bacteroides fragilis

Escherichia coli

- Jakie znasz zwizki, ktre dodane do podoa wzrostowego bd obniay jego potencja oksydoredukcyjny?

49

Zadanie 2. Typy pokarmowe bakterii Uzupenij ponisz tabel

Typ pokarmowy

rdo energii rdo wgla Donatory elektronw

Chemoorgano-trofy

zwizki nieorganiczne

CO2 i inne zwizki nieorganiczne

zwizki nieorganiczne

wiato

zwizki nieorganiczne

zwizki nieorganiczne

Fotoorganotrofy

zwizki organiczne

50

51

Rozdzia 5

Wykorzystanie cech biochemicznych dla identyfikacja bakterii. Cz teoretyczna

Metabolizm bakterii Podobnie, jak w innych ywych komrkach, metabolizm bakterii obejmuje anabolizm (reakcje syntezy) i katabolizm (reakcje rozkadu). Oba te procesy s ze sob cile powizane i zachodz w komrce jednoczenie. Reakcje rozkadu zwizkw wysokoczsteczkowych uwalniaj energi, ktra nastpnie jest magazynowana w ATP. W pierwszym etapie due czsteczki wglowodanw, biaek, tuszczy, kwasw nukleinowych ulegaj degradacji do mniejszych czstek: heksoz i pentoz, aminokwasw, glicerolu i kwasw tuszczowych, nukleotydw. W dalszych etapach procesw katabolicznych w wyniku licznych przemian powstaj proste czsteczki, ktre wczane s w cykl Krebsa bdcy kocowym etapem rozkadu. Ostatecznymi produktami s woda, dwutlenek wgla i energia. Umoliwia to przebieg procesw anabolicznych wymagajcych jej nakadu. Energia uzyskiwana jest przez bakterie w procesach katabolicznych polegajcych na utlenianiu biologicznym substratw oddechowych i przenoszeniu elektronw na odpowiednie akceptory. Najbardziej wydajnym energetycznie procesem jest angaujce cykl Krebsa oddychanie tlenowe, w ktrym protony i elektrony s przenoszone poprzez acuch oddechowy na tlen atmosferyczny. Zdolno bakterii do oddychania tlenowego ma istotne znaczenie z punktu widzenia ich identyfikacji, gdy liczne prby biochemiczne pozwalaj na wykrywanie metabolitw porednich cyklu Krebsa oraz obecno enzymw acucha oddechowego. Oddychanie beztlenowe ma podobny przebieg z tym, e ostatecznym akceptorem protonw i elektronw w acuchu oddechowym s zwizki

52

nieorganiczne, np.: azotany, azotyny, siarczany. Wykrywanie produktw ich rozkadu, a take enzymw biorcych udzia w tych procesach take wykorzystywane jest w identyfikacji bakterii. Przykadem jest wykrywanie reduktazy azotanowej przeksztacajcej azotany do azotynw. Oddychanie azotowe moe angaowa jeden z dwch procesw:

denitryfikacj polegajc na redukcji azotanu do podtlenku azotu (N2O) oraz uwalnianego do rodowiska azotu atmosferycznego. Bakterie posiadajce takie zdolnoci to m.in.: Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus licheniformis.

amonifikacj polegajca na redukcji azotanw do azotynw, a nastpnie do amoniaku w formie jonu amonowego NH4

+.

Przeprowadzana jest ona m.in. przez: Escherichia coli, Klebsiella mobilis.

Oddychanie siarkowe polega na redukcji siarczanw bd siarki do siarczkw. Zdolno do redukcji siarczanw maj bakterie z rodzaju Desulfovibrio, natomiast siark redukuj bakterie z rodzaju Desulfuromonas. Trzeci z energiodajnych procesw fermentacja pozwala na metabolizowanie substratw bez udziau czynnika utleniajcego, w ktrym utlenienie jednego zwizku jest rwnowaone redukcj innego. Ostatecznymi akceptorami protonw i elektronw s zwizki organiczne powstae jako produkty porednie, np.: etanol, mleczan, malan, bursztynian, izopropanol. Od tych produktw tworzone s nazwy fermentacji. W identyfikacji bakterii znaczenie diagnostyczne maj: fermentacja mlekowa, propionowa, masowa i mrwkowa.

Fermentacja mlekowa jest prowadzona przez bakterie mlekowe (Lactobacillus spp.), ale take inne bakterie, np. gronkowce. Bakterie mlekowe stanowi mikrobiota przewodu pokarmowego niemowlt, s wykorzystywane jako probiotyki. Stanowi te mikrobiota pochwy u kobiet.

Fermentacja propionowa prowadzona jest przez beztlenowe paeczki z rodzaju Propionibacterium bytujce w przewodzie pokarmowym przeuwaczy, a take na skrze czowieka. Jako produkt podstawowy tej fermentacji powstaje kwas propionowy.

53

Fermentacja masowa prowadzona jest przez beztlenowe bakterie przetrwalnikujce z rodzaju Clostridium, w tym laseczki zgorzeli gazowej. Jako produkty kocowe tego procesu powstaj kwasy masowy, octowy, alkohole oraz CO2 i H2.

Fermentacja mrwkowa jest charakterystyczna dla bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Produktami kocowymi jest wiele zwizkw, a wrd nich kwasy organiczne, etanol, glicerol, acetoina, 2,3-butandiol, a take CO2 i H2. Moliwe s dwa szlaki przemian, a ich cechy wykrywa si dla celw identyfikacyjnych. Pierwszy z nich charakteryzuje si powstawaniem silnych kwasw organicznych, co obnia pH poywki poniej 4,5 (prba Metyl-Red). W innym szlaku kwasy organiczne mog powstawa w mniejszej iloci, a gwnymi produktami s acetoina i 2,3-butandiol (prba Voges- Proskauera).

Jako substrat energetyczny bakterie mog wykorzystywa cukry proste, oligocukry i cukry zoone. Te ostatnie musz ulec strawieniu zewntrzkomrkowemu przy udziale odpowiednich, produkowanych przez bakterie enzymw. Dotyczy to m.in. skrobi, glikogenu czy celulozy. Do komrki transportowane s cukry proste, ktre wykorzystywane s jako gwne substraty oddechowe. Jeeli w podou znajduje si wiele substratw, zwykle pierwszym rozkadanym s cukry proste. W przypadku wikszoci bakterii jest to glukoza. Bakterie metabolizuj wglowodany wedug trzech szlakw. Pierwszym jest glikoliza, w wyniku ktrej glukoza utlenia si do kwasu pirogronowego, przeksztacanego w warunkach tlenowych do CO2 i H2O, natomiast w warunkach beztlenowych podlegajcego dalszym przemianom w procesie fermentacji. Drugi to cykl pentozowy. Jest on alternatywnym sposobem spalania glukozy u bakterii. Dostarcza prekursorw do syntezy wglowodanw, aminokwasw, kwasw nukleinowych. Trzeci: szlak Entnera-Doudoroffa, wystpuje rzadziej, powoduje spalanie glukozy, ale jest mniej wydajny energetycznie, dostarcza prekursorw do syntezy nukleotydw. Metabolitem porednim tych szlakw jest aldehyd 3-fosfoglicerynowy, przeksztacany nastpnie do kwasu pirogronowego. Kwas ten ulega dalszym przemianom na drodze oddychania tlenowego, beztlenowego lub fermentacji.

54

Take biaka i lipidy s zbyt duymi czsteczkami, aby w stanie niezmienionym mogy by przyswajane przez bakterie. Musz one ulec degradacji w rodowisku przy udziale odpowiednich enzymw proteolitycznych czy lipolitycznych. W rozkadzie biaek bior udzia endopeptydazy rozkadajce je do oligopeptydw i egzopeptydazy odczajce aminokwasy, ktre podlegaj dalszym przemianom. Lipidy s zwykle degradowane przez esterazy, enzymy o szerokiej swoistoci substratowej. Niektre bakterie wytwarzaj lipazy o wskiej specyficznoci na przykad lecytynaz. Obecno tych enzymw u bakterii jest jedn z cech wykorzystywanych w ich identyfikacji.

Metody

Diagnostyka bakteriologiczna Standardowe postpowanie zaley od rodzaju materiau i spodziewanych drobnoustrojw. Zwykle rozpoczyna je charakterystyka mikroskopowa badanej prbki. Barwienie metod Grama pomaga oceni materia i wybra rodzaj podoa do pierwszego posiewu. Mona posuy si metodami fenotypowymi, na ktre skadaj si:

charakterystyka wzrostu na podoach, na ktrych dokonano izolacji (pierwszego posiewu materiau);

otrzymanie czystej hodowli i charakterystyka morfologii kolonii oraz opis mikroskopowego obrazu komrek bakterii;

prby biochemiczne badajce waciwoci sacharolityczne, proteolityczne, lipolityczne, utleniajco-redukujce;

badanie waciwoci serologicznych (poszukiwanie charaktery-stycznych antygenw)

lub metodami genotypowymi (badajcymi genom) w ktrych stosuje si techniki biologii molekularnej i poszukuje charakterystycznych dla danych bakterii markerw (sekwencji nukleotydw). Znalazy one swoje miejsce w diagnostyce bakterii odpowiedzialnych za szereg chorb uzupeniajc fenotypowe metody identyfikacyjne, skracajc czas badania, a w przypadku drobnoustrojw wolno rosncych na podoach sztucznych czy te w ogle nie dajcych si na nich hodowa stay si niezastpione.

55

W okrelaniu waciwoci biochemicznych wykorzystuje si przede wszystkim reakcje kataboliczne, a wic zdolno rozkadu szeregu zwizkw, ktry moliwy jest dziki obecnoci w komrkach bakterii odpowiednich enzymw. W identyfikacji bakterii przeprowadzanej metodami fenotypowymi, prby oparte na wykrywaniu cech metabolicznych bakterii odgrywaj bardzo wan rol. Bada si rda wgla i azotu wykorzystywane przez bakterie, poszukuje enzymw biorcych udzia w procesach katabolicznych, oznacza charakterystyczne kocowe produkty metabolizmu. Zwykle diagnostyk prowadzi si w oparciu o wiele, zwykle kilka lub kilkanacie prb dobranych specjalnie pod ktem identyfikacji okrelonych bakterii. Tworzone s w ten sposb schematy diagnostyczne. Istotne miejsce mog w nich mie take takie cechy, jak morfologia mikroskopowa bakterii i morfologia kolonii. Dla wielu rodzajw bakterii okrela si take waciwoci biologiczne. Wrd nich wan rol odgrywa oznaczanie czsto wystpujcych u bakterii hemolizyn (typ hemolizy na agarze z krwi), wytwarzanie enzymw (np. katalazy, oksydazy), czy te charakterystyczne dla mniejszej liczby lub wrcz dla pojedynczych gatunkw prby, takie jak wytwarzanie koagulazy, toksyn i inne. Istotn pomoc w identyfikacji niektrych bakterii (paeczki jelitowe, paciorkowce) stanowi cechy antygenowe wykrywane badaniami serologicznymi.

Prby biochemiczne wykonywane w celu identyfikacji bakterii W praktyce okrela si nastpujce waciwoci biochemiczne:

zwizane z metabolizmem azotowym,

zwizane z metabolizmem wglowodanw,

zwizane z metabolizmem lipidw,

zwizane z procesami oddechowymi (enzymy redukujco-utleniajce). Podoa, na ktrych okrela si waciwoci biochemiczne, nale do grupy poywek diagnostycznych. Niektre prby biochemiczne wykrywajce obecno tych samych enzymw lub produktw czsto moemy wykona w rny sposb. Poniej przedstawiono kilkanacie podstawowych prb w najczciej stosowanych wariantach.

56

Metabolizm azotowy Badanie enzymw proteolitycznych Waciwoci proteolityczne - rozkad elatyny (metoda probwkowa) Poywka z elatyn w temperaturze pokojowej (ok. 22C) ma konsystencj sta, ale w cieplarce (37C) jest pynna. Posiana bakteriami, ktre maj enzym elatynaz, po dugim zazwyczaj okresie inkubacji ulega staemu upynnieniu i nie daje si zestali przez obnienie temperatury. Waciwoci proteolityczne - rozkad kazeiny mleka Zdolno do wytwarzania kazeinazy sprawdza si posiewajc bakterie na podoe agarowe z dodatkiem 10% odtuszczonego mleka. Po 48 godzinach inkubacji w 37C mona zaobserwowa przejanienie wok kolonii produkujcych ten enzym. Badanie rozkadu aminokwasw i wytwarzania produktw ich przemian Deaminacja fenyloalaniny W celu sprawdzenia zdolnoci bakterii do deaminacji fenyloalaniny posiewa si je na podoe z dodatkiem D--fenyloalaniny. Po 24 godzinach inkubacji w 37C nakrapla si 10% roztwr chlorku elazowego. Zielone zabarwienie wiadczy o wyniku dodatnim. Prb mona wykona na podou pynnym lub staym. Dekarboksylacja aminokwasw na podou Falkowa Podoe Falkowa wykorzystuje si do badania zdolnoci bakterii do dekarboksylacji aminokwasw w warunkach beztlenowych. Wyjciowo ma ono barw fioletow, a w swoim skadzie zawiera glukoz oraz lizyn, ornityn bd arginin jako substrat i purpur bromokrezolow jako wskanik. W celu wykonania tego testu bakterie naley posia na dwie probwki: jedn z penym podoem Falkowa, a drug z podoem kontrolnym bez badanego aminokwasu. Obie probwki naley pokry pynn parafin. Po 24 godzinnej inkubacji w 37C ocenia si wynik. Jeli po tym czasie oba podoa s te - wiadczy to o braku zdolnoci do dekarboksylacji w tych warunkach. Za wynik dodatni przyjmuje si te zabarwienie probwki kontrolnej i fioletowe probwki zawierajcej w podou badany aminokwas. W pocztkowym etapie wzrostu bakterie

57

wykorzystuj glukoz, co powoduje zakwaszenie podoa i zmian jego barwy na kolor ty. Pniejsza dekarboksylacja aminokwasu powoduje ponown alkalizacj podoa i powrt do barwy fioletowej. Wytwarzanie indolu z tryptofanu Badane bakterie posiewa si na wod peptonow zawierajc DL-tryptofan. Po 24 godzinnej inkubacji w 37C na podoe naley nawarstwi zmodyfikowany odczynnik Ehrlicha. Zawiera on p-dimetyloaminobenzaldehyd, alkohol amylowy i stony HCl. Jeeli bakterie rozoyy tryptofan, pojawia si ciemnorowa obrczka w grnej warstwie poywki. Rozkad mocznika Zdolno bakterii do wytwarzania ureazy enzymu rozkadajcego mocznik do amoniaku i dwutlenku wgla bada si na podou Christensena z mocznikiem. W podou zawarty jest wskanik pH - czerwie krezolowa. Powstajcy amoniak alkalizuje podoe, co powoduje zmian jego zabarwienia z tego na rowe. Wytwarzanie H2S na podou Kliglera Podoe Kliglera wykorzystywane jest gwnie w diagnostyce bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Suy ono do oceny wytwarzania przez bakterie H2S, ale take zdolnoci rozkadu glukozy i laktozy. Ma ono posta pskosu o barwie ososiowej. Bakterie naley posia do supka i na skos. Wynik odczytuje si po 24 godzinnej inkubacji w 37C. Wytwarzany siarkowodr reaguje z jonami elaza, a powstajcy siarczek elaza powoduje zaczernienie podoa.

Metabolizm wglowodanw Wykrywanie zdolnoci rozkadu cukrw przez bakterie o maych wymaganiach Bakterie posiewa si do probwek zawierajcych wod peptonow z dodatkiem 1% cukru oraz wskanik pH: purpur bromokrezolow (fioletowa w pH obojtnym; ta w kwanym) lub bkit bromotymolowy (zielony w pH obojtnym; ty w kwanym). Dodatkowo do probwek wkadane s dnem do gry tzw. rurki Durhama, w ktrych niekiedy w wyniku rozkadu cukru moe zbiera si gaz. Po 24 godzinnej inkubacji

58

w 37C rozkad cukru prowadzi do zakwaszenia rodowiska i zmiany zabarwienia podoa. Zestaw prb dla kilku cukrw nazywa si zwykym szeregiem cukrowym. Podoe Schaedlera dodatkiem 1% cukru Podoe Schaedlera pozwala na ocen rozkadu cukrw przez bakterie beztlenowe. Zawiera ono wycig misny, wycig drodowy, pepton, chlorowodorek cysteiny majcy na celu obnienie potencjau oksydo-redukcyjnego oraz badany cukier w steniu 1%. Posiane bakterie inkubuje si w warunkach dla nich optymalnych, po czym dodaje si purpur bromokrezolow jako wskanik pH. W przypadku fermentacji danego cukru pojawia si, wynikajce z zakwaszenia te zabarwienie podoa. Wykorzystanie podoa staego dla oceny rozkadu laktozy - podoe MacConkeya Podoe MacConkeya suy do izolacji paeczek gramujemnych. Zawiera ono sole ciowe i fiolet krystaliczny, ktre decyduj o jego sabej wybirczoci i hamuj wzrost bakterii gramdodatnich. Jest to take podoe diagnostyczne, gdy zawarta w nim laktoza, jeli jest rozkadana (przez bakterie laktozododatnie), zakwasza rodowisko, co manifestuje si rowym zabarwieniem kolonii zalenym od wskanika - czerwieni obojtnej. Bakterie laktozoujemne rosn w postaci kolonii w kolorze nieposianej poywki. Wykrywanie drogi rozkadu cukru: fermentacja czy utlenianie, na podou Hugh-Leifsona Bakterie posiewa si do dwch probwek ze wieo przygotowanym, wygotowanym bezporednio przed uyciem podoem. Powierzchnia, jednego z nich pokrywana jest pynn parafin. Podoe jako wskanik pH zawiera bkit bromotymolowy. W przypadku bakterii nierozkadajcych cukru, barwa podoa si nie zmienia. Natomiast, jeli bakterie rozkadaj cukier tylko w warunkach tlenowych, zmienia si barwa poywki w probwce bez parafiny. Zmiana barwy w obu probwkach wiadczy o wykorzystywaniu cukru na drodze fermentacji.

59

Okrelanie produktw fermentacji glukozy - Prba Voges-Proskauera Bakterie posiewa si na podoe Clarka. Zawarta w nim glukoza rozkadana jest do kwasu pirogronowego, a dalej do rnych produktw kocowych m.in. do acetoiny. Acetoin wykrywamy po 48-72 godzinach inkubacji dodajc 0,5 mL roztworu KOH, a po wymieszaniu 0,2 mL alkoholowego roztworu -naftolu. Hodowl po ponownym wymieszaniu odstawia si na 15 minut. Pojawiajce si karminowe zabarwienie powstaje w wyniku utlenienia acetoiny w obecnoci tlenu do diacetylu, reagujcego nastpnie w obecnoci -naftolu z obecn w peptonie reszt guaninow argininy. - Prba MR (Metyl-Red) Prb MR wykonuje si take na podou Clarka. Po inkubacji naley doda do poywki kilka kropli czerwieni metylowej. Pojawienie si barwy czerwonej wiadczy o zakwaszeniu podoa do pH poniej 4,5 powstaego wskutek fermentacji glukozy do silnych kwasw organicznych. Barwa ta wiadczy o pH wyszym ni 4,5 i taki wynik jest uznawany za ujemny.

Metabolizm lipidowy Wytwarzanie lipaz (esteraz) na podou z Tween 80 W celu sprawdzenia zdolnoci bakterii do wytwarzania lipaz posiewa si je na pytk z podoem agarowym z dodatkiem Tween 80 (polietylenosorbitol jednooleinowy) i chlorku wapniowego. Wynik ocenia si po 48 godzinach inkubacji. Wok kolonii bakterii wytwarzajcych lipazy pojawia si strefa zmtnienia. Jest ona wynikiem reakcji uwolnionych przez lipazy kwasw tuszczowych z obecnymi w poywce jonami wapnia, powodujcej powstanie nierozpuszczalnych myde wapniowych. Wytwarzanie lecytynazy na agarze z tkiem jaja kurzego W celu sprawdzenia zdolnoci do wytwarzania przez bakterie enzymu lecytynazy, naley je posia na podoe agarowe zawierajce tko jaja kurzego. Pojawiajca si po 24 godzinach inkubacji w 37C strefa zmtnienia wok linii posiewu lub kolonii wiadczy o wyniku dodatnim.

60

Wytwarzanie enzymw utleniajco-redukujcych

Wytwarzanie reduktazy azotanowej Zdolno bakterii do redukcji azotanw do azotynw mona sprawdzi metod sulfanilow, posiewajc je na poywk zawierajc azotan potasu. Po inkubacji (24 godziny w 37C) do hodowli dodaje si kilka kropli odczynnika Griessa. W skad tego odczynnika wchodz w proporcji 1:1 roztwory kwasu sulfanilowego i -naftyloaminy w kwasie octowym. W rodowisku kwanym kwas sulfanilowy ulega diazowaniu jonami azotynowymi, po czym czc si z -naftyloaminy daje ciemnoczerwon barw. Wytwarzanie katalazy Katalaza rozkada H2O2 do H2O i O2. Jej wytwarzanie sprawdza si poprzez zawieszenie badanych bakterii w kropli 3% wody utlenionej umieszczonej na szkieku podstawowym. Mona take doda wod utlenion bezporednio do hodowli. Pojawiajce si pcherzyki tlenu wiadcz o obecnoci katalazy. Wytwarzanie oksydazy cytochromowej Enzym oksydaza cytochromowa odpowiada za przenoszenie elektronw na tlen w kocowym etapie oddychania tlenowego. Obecno tego enzymu sprawdza si rozcierajc mas bakteryjn pobran z podoa przy uyciu plastikowej paeczki na pasku bibuy zwilonym 1% wodnym roztworem chlorowodorku di- lub tetra-metylo-p-fenylenodiaminy. Nie naley uywa metalowej ezy. Prb mona take wykona przez nalanie odczynnika bezporednio na hodowl bakterii na poywce staej. Granatowe zabarwienie wiadczy o wyniku dodatnim testu. Istotne jest przygotowanie odczynnika tu przed uyciem poprzez rozpuszczenie w probwce substancji - 10 mg w 1 mL destylowanej.

61

Redukcja bkitu metylenowego W steniach nietoksycznych dla bakterii bkit metylenowy moe, pod nieobecno tlenu, peni rol sztucznego akceptora protonw. Jest wtedy redukowany przez niektre drobnoustroje za pomoc dehydrogenaz do bezbarwnego leukozwizku. Prb przeprowadza si na podou pynnym zawierajcym mleko i bkit metylenowy. Hodowle inkubuje si w temperaturze 37C przez 48 godzin. Biae zabarwienie poywki wiadczy o redukcji bkitu metylenowego.

Wytwarzanie fosfatazy Fosfataza jest enzymem katalizujcym odczanie reszty fosforanowej od takich zwizkw, jak tuszcze, biaka czy wglowodany. Jej obecno sprawdza si na podou pynnym lub staym z dodatkiem soli sodowej difosforanu fenoloftaleiny. O wyniku dodatnim wiadczy rowa barwa powstaa po dodaniu kilku kropel NaOH lub stonego amoniaku. Jest ona wynikiem odczenia przez fosfataz reszty fosforanowej i uwolnienia fenoloftaleiny.

Badanie zdolnoci hemolitycznych bakterii

Hemolizyny bakteryjne s cytolizynami, ktre niszcz krwinki czerwone ludzi i zwierzt. Zdolno wytwarzania ich przez bakterie mona wykaza na podou agarowym zawierajcym dodatek 5% odwknionej krwi baraniej lub ludzkiej. Podoe takie jest jednoczenie podoem diagnostycznym, jak i wzbogaconym. Bakterie posiewa si redukcyjnie, a nastpnie inkubuje w optymalnych dla nich warunkach. W pobliu kolonii wytwarzajcych hemolizyny pojawiaj si charakterystyczne zmiany. Wyrnia si dwa typy hemolizy:

hemoliza widoczna jest na pytce krwawej w postaci zielonej strefy wok kolonii, co jest wynikiem czciowego rozpadu krwinek (przeksztacenie hemoglobiny do methemoglobiny);

hemoliza widoczna na pytce krwawej jako pene przejanienie wok kolonii, powstae wskutek cakowitej lizy krwinek i wyugowania barwnika.

62

Wielko stref hemolizy moe by rna dla rnych gatunkw czy szczepw.

Zestawy prb biochemicznych do identyfikacji bakterii W laboratoriach zajmujcych si rutynow diagnostyk mikrobiologiczn do identyfikacji drobnoustrojw stosowane s gotowe, standaryzowane zestawy testw biochemicznych. Najczciej maj one posta pytek pleksiglasowych z dokami lub galeryjek z pojemniczkami wypenionymi substratami dostosowanymi do identyfikacji danej grupy bakterii. Zmiany barwy zawartoci studzienek po dodaniu badanego szczepu, inkubacji i jeli trzeba, odpowiednich odczynnikw, umoliwiaj odczytanie wynikw i przy uyciu ksiki kodowej zidentyfikowanie zwykle do gatunku.

Zadania do wykonania Zadanie 1. Badanie niektrych cech biochemicznych bakterii wykorzystywanych do ich identyfikacji Opisz (narysuj) wszystkie przedstawione na wiczeniach demonstracje:

Metabolizm azotowy

63

64

Metabolizm wglowodanowy

65

Metabolizm lipidowy

66

Enzymy oksydoredukcyjne

Waciwoci biologiczne

67

Szybkie testy biochemiczne

68

Zadanie 2. Okrelanie zapotrzebowa pokarmowych wybranych bakterii. Kwalifikacja podoy - Otrzymujesz hodowle stae: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella mobilis, Salmonella Enteritidis oraz poywki:

- agar z krwi, - agar z 7% NaCl, - podoe MacConkeya, - podoe Chapmana.

- Drobnoustroje posiej ez w sposb redukcyjny (przed posianiem odpowiednio podpisz pytki).

- Na agar z krwi: S. aureus i S. epidermidis; - Na agar z 7% NaCl: S. aureus i Klebsiella mobilis; - Na podoe Chapmana: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis i Klebsiella mobilis; - Na podoe MacConkeya: Salmonella Enteritidis, Klebsiella mobilis i Staphylococcus aureus.

- Inkubuj pytki w 37C okoo 20 godzin. - Oce posiewy, wyniki wpisz do tabeli.

Drobnoustrj Agar z krwi

Agar z 7% NaCl

Podoe Chapmana

Podoe MacConkeya

Wzr

ost

Hem

oliz

a

Wzr

ost

Wzr

ost

Ro

zka

d

man

nit

olu

Wzr

ost

Ro

zka

d

lakt

ozy

S. aureus

69

S. epidermidis

K. mobilis

S. Enteritidis

Zakwalifikuj podoa, na ktre posiewae do odpowiednich kategorii:

Podoe diagnostyczne to: Podoe wybircze to: Podoe diagnostyczno-wybircze to:

70

Zadanie 3. Analiza mieszanej hodowli w podou pynnym Otrzymujesz hodowl pynn. Scharakteryzuj moliwie jak najdokadniej znajdujce si w niej bakterie. Badanie bdziesz wykonywa przez trzy dni.

Pierwszy dzie badania Wykonaj preparat z hodowli, zabarw go metod Grama, oce pod mikroskopem. Narysuj obraz mikroskopowy i zapisz obserwacje w tabeli. Ile rodzajw bakterii mona odrni?

Ksztat bakterii i ich ukad (rysunek)

Ksztat bakterii i ich ukad (opis)

71

- Posiej redukcyjnie badan hodowl na nastpujce poywki: - pytk agarow, - pytk krwaw, - podoe MacConkeya,

- Posiewy umie w cieplarce (37C) na 20 godzin.

Cechy bakterii Wymagania odywcze

pytka agarowa pytka krwawa podoe MacConkeya

Drugi dzie badania - Oce posiewy. Wpisz w tabel najwaniejsze cechy bakterii, ktre moesz oceni za pomoc zaproponowanych pod. - Okrel wygld i liczb rodzajw kolonii na kadej z pytek. - Wykonaj z poszczeglnych kolonii preparaty barwione metod Grama i oce ich obrazy mikroskopowe. Obserwacje zapisz w skonstruowanej przez siebie tabeli pokazujcej wyniki posieww mieszanej hodowli na rne podoa (zaleno: rodzaj podoa, wygld kolonii, obraz mikroskopowy).

72

73

- Posiej redukcyjnie rnice si od siebie kolonie na wybrane, wymienione powyej poywki, dobierajc je tak, aby zbada wszystkie moliwe do okrelenia cechy biochemiczne badanych bakterii. - Posiej bakterie, aby nastpnego dnia mc zbada wytwarzanie przez nie tryptofanazy. - Posiewy inkubuj w temperaturze 37C przez ok. 20 godzin.

Trzeci dzie badania - Oce hodowle na pytkach i odczytaj prb na indol. Sprawd, czy wytwarzana jest katalaza metod na szkieku podstawowym. - Wyniki obserwacji z trzech etapw dowiadczenia wpisz do tabeli.

Cechy mikroskopowe bakterii z badanej hodowli (wyjciowej)

Cechy fizjologiczne bakterii z badanej hodowli (wyjciowej)

ksztat, ukad, barwienie hemoliza laktoza katalaza indol

74

75

Rozdzia 6

Liczenie bakterii Cz teoretyczna Oznaczenie liczby bakterii ma zastosowanie w wielu dziedzinach mikrobiologii. Jest ono wykonywane w diagnostyce laboratoryjnej w ocenie liczby bakterii w moczu, ale take w ocenie czystoci mikrobiologicznej lekw, kosmetykw i ywnoci, w badaniu bakteriologicznym wody, ciekw, powierzchni produkcyjnych i powietrza, przy produkcji szczepionek, w kontroli skutecznoci dziaania rodkw myjcych i dezynfekujcych. Oznacza mona cakowit liczb bakterii, to znaczy cznie komrki ywe i martwe lub tylko liczb ywych komrek. Obliczanie cakowitej liczby komrek mona wykona mikroskopowo przez bezporedni obserwacj i liczenie komrek bakteryjnych

w preparacie barwionym,

w hemacytometrach, np. kamerze Thoma,

na sczku membranowym, przez ktry uprzednio przesczono badan prbk o okrelonej objtoci. Bakterie obecne na sczku barwi si najczciej bkitem metylenowym lub roztworem erytrozyny. Metoda stosowana jest na przykad przy badaniu wody i ciekw.

Mona te posuy si metodami turbidymetrycznymi - porwnujc zmtnienie badanych zawiesin z odpowiednimi wzorcami o znanej liczbie komrek - wzrokowo lub za pomoc fotometru. Przy stosowaniu tych metod potrzebne s krzywe wzorcowe odnoszce liczb komrek (policzonych innymi metodami) do gstoci optycznej zawiesiny. Cakowit liczb bakterii mona te okreli metodami chemicznymi przez oznaczenie cakowitego azotu, fosforu, biaek lub kwasw nukleinowych. Metoda ma zastosowanie gwnie w pracach badawczych. Liczb ywych, to znaczy zdolnych do podziau, komrek bakteryjnych oznacza si wymienionymi poniej metodami hodowlanymi.

76

Metoda posiewu na podoe stae (metoda pytkowa) polega na liczeniu kolonii po swobodnym (pod wpywem si grawitacyjnych - metoda Kocha) lub wymuszonym (metoda aspiracyjna, uderzeniowo-zderzeniowa) osiadaniu bakterii na powierzchni podoa. Metoda stosowana jest przy badaniu czystoci mikrobiologicznej powietrza.

Metoda pytek odciskowych wykorzystuje podoe agarowe, tworzce w pytce Petriego menisk wypuky, ktry przykada si na kilka sekund do badanej powierzchni. Po inkubacji liczy si wyrose kolonie, a wynik ocenia w zalenoci od przyjtych kryteriw. Metoda suy do monitorowania mikrobiologicznego skaenia powierzchni szpitalnych i przemysowych (ciany, podogi, sprzt).

Metoda posiewu powierzchniowego lub gbinowego (pytki lane) jest najczciej stosowana w praktyce laboratoryjnej. Dotyczy przede wszystkim preparatw o spodziewanej duej liczbie drobnoustrojw, dlatego konieczne jest wstpne wielokrotne rozcieczenie badanej prbki.

Metoda posiewu na podoe pynne (metoda probwkowa) jest oznaczeniem najbardziej prawdopodobnej liczby drobnoustrojw (NPL).

Metoda filtrw membranowych - polega na przesczeniu okrelonej objtoci badanego pynnego preparatu przez odpowiedni filtr. Filtr ten nakada si nastpnie na powierzchni podoa staego. Po inkubacji liczy si wyrose na sczku kolonie.

ywe bakterie mona zliczy take innymi metodami. Jedna z nich jest metod mikroskopow (bezporednia epifluorescencja), w ktrej barwi si barwnikiem fluorescencyjnym ywe bakterie na sczku membranowym, przez ktry uprzednio przesczono badan prbk o okrelonej objtoci. Metoda ta stosowana jest w przemyle mleczarskim do oceny bakteriologicznej mleka surowego. Mona take zastosowa metody porednie. S to metody szybkie, poniewa skracaj zwykle 24-48-godzinny (lub duszy) okres inkubacji typowy dla metod hodowlanych, ale wymagaj drogiej aparatury i odczynnikw.

77

Jedn z nich jest luminometria - pomiar chemiluminescencji lub bioluminescencji, bdcej efektem hydrolizy adenozynotrjfosforanu - ATP, obecnego w kadej ywej komrce. Metoda stosowana jest w kontroli czystoci mikrobiologicznej powierzchni produkcyjnych, urzdze i rkawic na rkach pracownikw w przemyle spoywczym, kosmetycznym, farmaceutycznym, przy badaniu ywnoci, czystoci wody pitnej, a take kontroli skutecznoci dziaania rodkw myjcych i dezynfekujcych. Mona take zastosowa metody manometryczne dokonujc pomiaru zuycia O2 lub wytwarzania CO2 przez rosnce drobnoustroje. Metoda hodowlana z uyciem poywki o zmienionych parametrach elektrycznych pozwala na szybkie wykrycie drobnoustrojw, ktre namnaajc si wytwarzaj silnie zjonizowane metabolity. Znajduje ona zastosowanie midzy innymi w biodetektorach sucych do oceny skaenia mikrobiologicznego rodowiska. Kada z tych metod wymaga odpowiedniej standaryzacji, aby pomiar mg by ilociowy.

Metody

Standaryzacja zawiesin bakteryjnych Badania mikrobiologiczne wymagaj niekiedy zastosowania standaryzacji gstoci zawiesin czy hodowli tak, aby do bada uywa prbek o powtarzalnej liczbie bakterii. Najczciej stosuje si standaryzacj wedug powszechnie przyj