ĆWICZENIA LABORATORYJNE Z BIOCHEMII
-
Upload
vuongduong -
Category
Documents
-
view
238 -
download
1
Transcript of ĆWICZENIA LABORATORYJNE Z BIOCHEMII
ĆWICZENIA LABORATORYJNE
Z BIOCHEMII
2016/2017 semestr zimowy
Literatura pomocna w przygotowywaniu sie do ćwiczeń z biochemii:
1. J.M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer: ,,Biochemia" Wydawnictwo Naukowe
PWN, W-wa 2005 (starsze wydanie 1998 r.)
2. L. Kłyszejko-Stefanowicz: ,,Ćwiczenia z biochemii" Wydawnictwo Naukowe
PWN. (W-wa 2005 (starsze wydanie 1999 r.)
3. B. D. Hames, N. M. Hooper, J. D. Houghton "Krótkie wykłady: Biochemia"
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002
Uwaga!
Na wszystkich ćwiczeniach z biochemii obowiązuje znajomość przeliczania stężeń
REGULAMIN ĆWICZEŃ Z BIOCHEMII
1. Ćwiczenia laboratoryjne z Biochemii prowadzone są w formie 7 ćwiczeń.
2. Student ma obowiązek przygotować się samodzielnie do ćwiczeń z zagadnień oraz przebiegu ćwiczenia podanych w instrukcji. Student ma obowiązek posiadać instrukcję opisującą dane ćwiczenie na zajęciach.
3. Student ma obowiązek nosić fartuch przebywając w Sali laboratoryjnej.
4. W przypadku braku fartucha lub/i instrukcji do danego ćwiczenia Student nie będzie miał możliwości uczestniczyć w zajęciach.
5. Obecność na ćwiczeniach jest obowiązkowa.
6. W przypadku nieobecności (np. choroba), Student ma obowiązek dostarczyć na kolejnych zajęciach Prowadzącemu stosowne usprawiedliwienie (zwolnienie lekarskie, opatrzone datą, pieczątką i podpisem lekarza). Dopuszczalna jest 1 usprawiedliwiona nieobecność w semestrze.
7. W przypadku nieobecności, istnieje możliwość odrobienia danego ćwiczenia z inną grupą (o ile liczba osób w danej grupie nie przekroczy 12), ale tylko po wcześniejszym uzgodnieniu z Prowadzącym.
8. Za każde wykonane ćwiczenie Student otrzymuje ocenę, na którą składa się:
a. ocena ze sprawdzianu z materiału obejmującego część teoretyczną i zagadnienia podane w instrukcji;
- sprawdzian może odbyć się przed rozpoczęciem części doświadczalnej (wejściówka) lub w trakcie trwania ćwiczenia (w zależności od przebiegu ćwiczenia).
- uzyskana ocena ze sprawdzianu jest oceną ostateczną, nie ma możliwości poprawy oceny w innym terminie
- na podstawie oceny ze sprawdzianu wystawiana jest ocena końcowa za ćwiczenie
b. poprawne wykonanie części doświadczalnej ćwiczenia, aktywność
- Student może uzyskać dodatkowy punkt za aktywność na zajęciach, wiedzę dodatkową na dany temat oraz za aktywny udział w dyskusji, co może wpłynąć na podwyższenie oceny za ćwiczenie.
- Student może również stracić punkt, w przypadku wyjątkowej bierności i nieprzygotowania do zajęć, co może wpłynąć na obniżenie końcowej oceny za ćwiczenie.
c. zaliczenie sprawozdania z ćwiczenia z poprawnymi wnioskami.
- Student ma obowiązek wykonać sprawozdanie z wykonanego ćwiczenia wg wskazówek Prowadzącego. Sprawozdanie należy oddać na kolejnych zajęciach. Błędnie wykonane sprawozdanie może być jeden raz zwrócone do Studenta w celu poprawy. Poprawione sprawozdanie należy oddać na następnych zajęciach. Nie oddanie sprawozdania lub jego poprawy w terminie, niepoprawne wykonanie sprawozdania (brak uwzględnienia wskazówek Prowadzącego) skutkuje niezaliczeniem ćwiczenia i otrzymaniem oceny 2.0.
9. Zajęcia kończą się kolokwium, obejmującym całość materiału ze wszystkich ćwiczeń. Kolokwium zostanie przeprowadzone po zakończeniu wszystkich ćwiczeń, w terminie ustalonym przez Koordynatora ćwiczeń.
10. Student może zostać zwolniony z kolokwium końcowego jeśli średnia ocen cząstkowych z każdego ćwiczenia wyniesie co najmniej 3.0.
11. W przypadku nieobecności usprawiedliwionej, Student ma obowiązek napisać sprawdzian z danego ćwiczenia, w terminie ustalonym po konsultacji z Prowadzącym ćwiczenie. Ocena ze sprawdzianu jest oceną końcową z danego ćwiczenia.
12. W przypadku nieobecności nieusprawiedliwionej, Student nie ma możliwości napisania sprawdzianu z danego ćwiczenia, a ćwiczenie uważa się za niezaliczone i nie wystawiana jest za nie ocena. Ćwiczenie jest jednak brane pod uwagę przy obliczaniu średniej oceny końcowej (za ćwiczenie niezaliczone z powodu nieobecności nalicza się 0, a sumę ocen cząstkowych z pozostałych ćwiczeń dzieli się przez 7).
13. Podstawą zaliczenia przedmiotu na ocenę pozytywną jest pozytywna ocena z kolokwium końcowego lub średnia ocen cząstkowych min. 3.0
14. Po zakończonych zajęciach obowiązkiem każdego Studenta jest uporządkowanie stanowiska pracy.
15. Student może opuścić salę laboratoryjną tylko na wyraźną zgodę Prowadzącego. Opuszczając salę ćwiczeń Student powinien zdjąć fartuch laboratoryjny.
16. Wszelkie pytania dotyczące organizacji ćwiczeń, proszę kierować do Koordynatora.
Koordynator :
dr inż. Karolina Stojowska-Swędrzyńska
pokój 329A
I. IZOLACJA DNA PLAZMIDOWEGO Escherichia coli METODĄ LIZY
ALKALICZNEJ. ELEKTROFOREZA DNA W ŻELU AGAROZOWYM.
I. WSTĘP TEORETYCZNY
Kwasy nukleinowe (DNA i RNA) są polinukleotydami. Nukleotydy są zbudowane z zasady
azotowej, cząsteczki cukru (pentozy) oraz reszty kwasu fosforowego. Zasadami azotowymi występującymi
w DNA są puryny (adenina i guanina) oraz pirymidyny (cytozyna i tymina). W RNA zamiast tyminy
występuje uracyl. Cukrem wchodzącym w skład DNA jest deoksyryboza, a w RNA ryboza. Zasady
połączone wiązaniem N-glikozydowym z rybozą lub deoksyrybozą tworzą nukleozydy. Nukleozydy z resztą
kwasu fosforowego tworzą nukleotydy. Poszczególne nukleotydy połączone są ze sobą wiązaniami
fosfodiestrowymi.
Kwas rybonukleinowy występuje z reguły w postaci jednoniciowej, ale niektóre cząsteczki RNA
zawierają odcinki komplementarne, co umożliwia tworzenie wewnątrzcząsteczkowych rejonów
dwuniciowych. Natomiast DNA jest helisą, zbudowaną z dwóch owiniętych wokół siebie łańcuchów
biegnących antyrównolegle. Na zewnątrz helisy DNA występuje rdzeń fosforanowo-cukrowy, a wewnątrz
znajdują się zasady, między którymi tworzą się wiązania wodorowe. Adenina tworzy komplementarną parę z
tyminą (dwa wiązania wodorowe), a guanina z cytozyną (trzy wiązania wodorowe).
W komórkach eukariotycznych (jądrzastych) DNA występuje głównie w jądrze komórkowych oraz
w małych ilościach w chloroplastach i mitochondriach. DNA w jądrze jest liniowy i upakowany w postaci
chromosomów.
W komórkach prokariotycznych (bezjądrzastych) DNA występuje w cytoplazmie, ma postać kolistą
(zamkniętą), nazywany jest nukleoidem lub chromosomem bakteryjnym. DNA chromosomu bakteryjnego
przyjmuje postać negatywnie skręconej superhelisy i tworzy kompleksy z białkami podobnymi do histonów.
Komórki bateryjne mogą zawierać dodatkowe, niewielkie cząsteczki DNA, replikujące się
niezależnie od chromosomu, nazywane plazmidami. Plazmidy mogą występować w kilku (niskokopijne) lub
w wielu (wysokokopijne) kopiach w komórce. Zawierają one najczęściej kilka genów, w tym gen (geny)
warunkujące oporność na antybiotyki. W inżynierii genetycznej plazmidy są często wykorzystywane jako
wektory w klonowaniu.
Plazmidy są kolistymi cząsteczkami DNA przyjmującymi formę superheliksu. Superzwinięta,
kowalencyjnie zamknięta, kolista cząsteczka DNA nazywana jest formą CCC (ang. covalently closed
circular DNA). Jeśeli jedna z nici DNA zostanie przerwana, znikają superskręty i powstaje forma OC (ang.
open circular). Po pęknięciu obu nici DNA w tym samym miejscu powstaje cząsteczka liniowa L (ang.
linear).
Izolacja plazmidowego i chromosomalnego DNA z komórek prokariotycznych i eukariotycznych
wymaga odmiennych technik. Obecnie istnieje wiele metod pozyskiwania DNA, których celem jest
odseparowanie materiału genetycznego od innych składników komórki i jego ochrona przed degradacją
przez enzymy komórkowe. Techniki oczyszczania DNA muszą być wystarczająco łagodne, by nie
spowodować uszkodzeń mechanicznych łańcucha DNA.
Różnice w procedurach izolacji DNA plazmidowego i DNA genomowego są zależne od ich różnych
mas cząsteczkowych, pierwszo- i drugorzędowej struktury i z superzwinięcia DNA plazmidowego.
Metody izolacji DNA plazmidowego są znane od ponad 30 lat i do dziś powstało ich kilkanaście,
mimo to większość z nich składa się z podobnych etapów: namnożenie bakterii, liza komórek i oczyszczanie
DNA plazmidowego. Najlepsze są te, które charakteryzują się dużą efektywnością, pozwalającą na
uzyskanie czystego preparatu o wysokim stężeniu i pochłaniają niewiele czasu. Jednym z najbardziej
popularnych sposobów izolacji DNA plazmidowego jest metoda lizy alkalicznej znana od 1979 roku
(Birnboim i Doly). Metoda ta wykorzystuje fakt występowania DNA plazmidowego w formie superzwiniętej
(CCC). W tej metodzie można wyróżnić trzy etapy:
zawieszenie komórek w buforze obniżającym wytrzymałość ściany komórkowej i hamującym
działanie DNaz,
zniszczenie komórek, degradacja RNA, odwracalna denaturacja kwasów nukleinowych
i nieodwracalna denaturacja białek,
denaturacja plazmidowego DNA i oddzielenie go od sprecypitowanego chromosomalnego DNA
i wytrąconych białek.
Najpierw niszczy się ścianę komórkową, następnie doprowadza się do lizy komórek bakteryjnych
przez dodanie roztworu zawierającego detergent SDS (dodecylosiarczan sodu) i NaOH. SDS powoduje
zniszczenie błon komórkowych i denaturację białek, natomiast wysokie pH (ok. 12) powoduje denaturację
DNA do pojedynczych nici, przy czym forma superzwinięta DNA plazmidowego jest nadal spleciona (nici
podwójnej helisy nie oddalają się zbytnio od siebie). Obniżenie pH (neutralizacja) poprzez dodanie
stężonego roztworu octanu potasu prowadzi do precypitacji (wytrącania) genomowego DNA, ponieważ w
tych warunkach renaturacja tak długich fragmentów DNA nie jest możliwa (przypadkowa hybrydyzacja
dwóch komplementarnych nici prowadzi do powstania strątów). Ponadto w tych warunkach następuje
również precypitacja białek i tego RNA, które nie uległo hydrolizie z udziałem RNAazy obecnej w buforze
do zawieszania komórek. Superzwinięte DNA plazmidowe bardzo szybko renaturuje ze względu na bliskość
komplementarnych nici i pozostaje w roztworze. Wirowanie umożliwia oddzielenie supernatantu
zawierającego plazmidy od wytrąconego kompleksu. W celu pozbycia się reszty białek stosuje się ekstrakcję
mieszaniną fenol:chloroform:alkohol izoamylowy lub samym chloroformem. DNA zagęszcza się przez
wytrącenie 96% etanolem. Osad przepłukuje się 70% etanolem, żeby pozbyć się soli. Po odwirowaniu osad
DNA rozpuszcza się w buforze TE, zawierającym EDTA, który chelatuje jony Mg2+
niezbędne do
aktywności nukleaz degradujących DNA.
Elektroforeza jest techniką wykorzystującą przemieszczanie się cząstek obdarzonych ładunkiem w
polu elektrycznym. Technika ta, wykorzystywana przez biochemików i biologów molekularnych od ponad
50 lat, jest szczególnie przydatna do rozdziału, charakterystyki, analizy i oczyszczania kwasów
nukleinowych. Fragmenty DNA rozdzielone w żelu agarozowym można wykorzystać do innych technik
biologii molekularnej np. do ligacji.
Żele agarozowe stosuje się najczęściej w zakresie stężeń od 0,3% do 2%. Procentowość żelu dobiera
się do wielkości rozdzielanych cząsteczek DNA. Fragmenty DNA o długości mniejszej niż 500 pz zazwyczaj
rozdziela się na żelach poliakrylamidowych. Najczęściej stosowanymi buforami w elektroforezie
agarozowej są bufory TAE (Tris-acetate-EDTA), TBE (Tris-borate-EDTA), TPE (Tris-phosphate-EDTA).
Do nanoszenia próbek na żel służą odpowiednie bufory (tzw. bufory obciążające), zwiększające
gęstość próbek, dzięki czemu nie dyfunduje ona do buforu, w którym prowadzi się elektroforezę, lecz opada
na dno studzienki. Dodatkowo bufor do nanoszenia nadaje próbkom zabarwienie, umożliwiając obserwację
ich migracji podczas rozdziału w żelu. Najczęstszym składnikiem buforów do nanoszenia jest błękit
bromofenolowy, nadający niebieskie zabarwienie, a czynnikiem zwiększającym gęstość sacharoza lub
glicerol.
DNA w żelu agarozowym migruje w kierunku elektrody dodatniej ze względu na ujemnie
naładowanie reszt fosforanowych. Szybkość migracji DNA zależy m.in. od: stężenia żelu, składu i siły
jonowej buforu elektrodowego, natężenia pola elektrycznego oraz wielkości i konformacji kwasu
nukleinowego. Mniejsze liniowe cząsteczki DNA migrują szybciej niż większe. Jednak nawet jeśli
cząsteczki mają tę samą masę, mogą poruszać się z różną szybkością ze względu na różnice w konformacji.
W żelach agarozowych ruchliwość elektroforetyczna kwasów nukleinowych nie zmienia się w istotny
sposób w zależności od składu zasad i temperatury rozdziału.
Formy plazmidowego DNA (CCC, OC, L) mają odmienną konformację przestrzenną, zatem mimo
tej samej masy migrują z różną szybkością. W buforze TAE najszybciej migruje forma CCC, potem forma
liniowa i OC.
Położenie fragmentów DNA po rozdziale w żelu agarozowym można określić po wybarwieniu DNA
bromkiem etydyny. Jest to barwnik fluorescencyjny, który interkaluje między zasady i świeci w świetle UV.
W celu wybarwienia DNA bromek etydyny można dodawać bezpośrednio do roztworu agarozy przed
zastygnięciem lub barwić żel dopiero po zakończonym rozdziale.
II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA:
1. Budowa kwasów nukleinowych DNA i RNA (model budowy DNA Watsona-Cricka, pojęcia nukleotyd,
nukleozyd, obowiązuje znajomość wzorów chemicznych; różnice w budowie DNA i RNA).·
2. DNA jako nośnik informacji genetycznej (definicja genu, powstawanie mutacji)
3. Metody przekazywania plazmidowego DNA u bakterii (transformacja, transdukcja, koniugacja).
4. Organizacja DNA w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych.
5. Ogólny przebieg replikacji DNA w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych (etapy, enzymy
uczestniczące w replikacji).
6. Rodzaje i funkcje RNA.
7. Plazmidy (pojecie, funkcje, cechy).
8. Elektroforeza agarozowa DNA (cel, zasada rozdziału).
III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE
1. Mikrowirówka (jedna na grupę)
2. Probówki typu Eppendorf
3. Łaźnia lodowa / lód
4. Pipety automatyczne (2-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl)
5. Końcówki do pipet automatycznych (żółte: do 2-20 µl, 20-200 µl i niebieskie: do 200-1000 µl)
6. Aparat do elektroforezy agarozowej (jeden na grupę)
7. Zasilacz prądu stałego
8. Transiluminator
IV. ODCZYNNIKI
1. Sol I:
50 mM glukoza
25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
2. Sol II:
0.2N NaOH
1% SDS
UWAGA! Roztwór przygotowuje sie bezpośrednio przed użyciem.
3. Sol III:
3MK+
5M CH3COO-
4. Chloroform
5. 96 % i 70 % roztwory etanolu
6. Bufor TE o składzie:
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1 mM EDTA
7. Agaroza
8. TAE o składzie:
40 mM Tris-octan pH 8.0
1 mM EDTA
9. Bufor obciążający do elektroforezy DNA o składzie:
0.25% błękit bromofenolowy
40% sacharoza
10. Wodny roztwór bromku etydyny (5 mg/ml)
11. Roztwór plazmidu wzorcowego
V. WYKONANIE ĆWICZENIA
A. IZOLACJA PLAZMIDOWEGO DNA
1. Osad z 3 ml hodowli bakteryjnej E. coli zawierających plazmid zawiesić w 0. l ml buforu Sol I.
2. Inkubować w lodzie przez 5 min.
3. Dodać 0.2 ml schłodzonego w lodzie roztworu Sol II.
4. Delikatnie wymieszać przez 3-4-krotne odwrócenie probówki.
5. Inkubować w lodzie przez 5 min.
6. Dodać 0.15 ml schłodzonego w lodzie roztworu Sol III.
7. Delikatnie wymieszać jak w p.5.
8. Inkubować w lodzie przez 5 min.
9. Odwirować przez 10 min w mikrowirówce przy max. obrotach/min.
10. Przenieść supernatant do nowej probówki typu Eppendorf, osad wyrzucić.
11. Dodać równą objętość chloroformu. - .
12. Ekstrahować 2-3 min odwracając probówkę,
13. Próby odwirować przez 5 min w mikrowirówce przy max. obrotach/min.
14. Zebrać górną fazę i przenieść do nowej probówki. Uważać, aby nie pobrać
zdenaturowanych białek z interfazy.
15. Dodać 2-krotną. objętość 96 % r-ru etanolu. . ..
16. Dokładnie wymieszać przez 3-4-krotne odwrócenie probówki.
17. Inkubować przez 10 min w -70°C.
18. Próbę odwirować w mikrowirówce przez 15 min. przy max. obrotach/min.
19. Supernatant odrzucić.
20. Osad zawierający DNA przemyć 1 ml 70 % r-ru etanolu.
21. Odwirować 10 min.
22. Ostrożnie usunąć supernatant.
23. Osad wysuszyć i rozpuścić w 20 µl buforu TE.
B. ELEKTROFOREZA AGAROZOWA DNA
1. Przygotować aparat do elektroforezy.
2. Przygotować 1 % agarozę w buforze TAE (rozpuścić przez ogrzanie do wrzenia).
3. Do roztworu agarozy dodać bromek etydyny do stężenia 0,5 µg/ml.
4. Roztwór agarozy o temp. 45-50°C wlać do aparatu.
5. Pozostawić do zastygnięcia.
6. Do preparatu DNA dodać 4 µl buforu obciążającego.
7. 15 µl próbki nanieść do studzienki w żelu.
8. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny DNA przy napięciu 70-80V przez 30-40 min.
9. Oglądać żel w świetle UV.
Uwaga! Bromek etydyny jest bardzo silnym środkiem mutagennym, wszystkie czynności
powinny być wykonywane w rękawiczkach.
VI. WYNIKI I WNIOSKI
1. Opisać etapy oczyszczania plazmidowego DNA (rola poszczególnych roztworów i ich
składników)
2. Zinterpretować obraz rozdziału elektroforetycznego DNA plazmidowego. Opisać poszczególne ścieżki,
wskazać różne formy plazmidowego DNA (o ile widoczne).
(
II. ELEKTROFOREZA BIAŁEK I REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE
AMINOKWASÓW
I. WSTĘP
Białka zbudowane są z 20 aminokwasów o ogólnym wzorze:
Centralnie położony atom węgla α (Cα) jest połączony z grupą aminową, grupą karboksylową,
atomem wodoru i łańcuchem bocznym (grupa R). Wyjątkiem jest prolina, która zawiera drugorzędową
grupę aminową. Łańcuch boczny może zawierać dodatkowe grupy aminowe, karboksylowe,
karboksymidowe, tiolowe, tioeterowe, hydroksylowe lub pierścienie aromatyczne.
Własności chemiczne wspólne wszystkim aminokwasom są uwarunkowane obecnością grupy
karboksylowej i aminowej. Natomiast różnice w budowie łańcucha bocznego decydują o specyficznych
własnościach fizykochemicznych i reaktywności aminokwasów. Dzięki temu niektóre aminokwasy dają
charakterystyczne reakcje barwne, umożliwiające ich wykrywanie nawet w mieszaninie z innymi
aminokwasami.
Poszczególne aminokwasy w białku są połączone wiązaniami peptydowymi, które powstają
miedzy grupą α-karboksylową jednego aminokwasu i grupą α-aminową następnego aminokwasu.
Wiązanie peptydowe prawie zawsze występuje w konfiguracji trans.
Liniowa sekwencja aminokwasów jest nazywana pierwszorzędową strukturą białka. Struktura
drugorzędowa odnosi sie do regularnego pofałdowania rejonów łańcucha polipeptydowego.
Najczęściej występującymi typami struktury drugorzędowej są helisa α i harmonijka β, istnieją
również struktury typu wstęga-zwrot-wstęga oraz pętle. Struktura trzeciorzędowa oznacza przestrzenne
ułożenie wszystkich aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Odpowiada ona natywnej, biologicznie
aktywnej konformacji białka. Struktura czwartorzędowa dotyczy białek zbudowanych z co najmniej
dwóch łańcuchów polipeptydowych i oznacza przestrzenne ułożenie podjednostek polipeptydowych oraz
określa oddziaływania miedzy nimi.
Białka oprócz reakcji charakterystycznych dla łańcuchów bocznych wchodzących w ich skład
aminokwasów, mogą dawać specyficzne reakcje dzięki obecności wiązań peptydowych.
(
Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek
1. Reakcja na obecność cysteiny i cystyny - w środowisku silnie zasadowym z grupy tiolowej cysteiny
lub ugrupowania disiarczkowego cystyny odszczepia się siarkowodór, który następnie reaguje z
octanem ołowiawym i jest wytrącany w postaci czarnego, nierozpuszczalnego siarczku ołowiu.
2. Reakcja ksantoproteinowa - aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny (fenyloalanina,
tryptofan i tyrozyna) zarówno wolne, jak i związane w białku, ulęgają nitrowaniu podczas
ogrzewania ze stężonym kwasem azotowym. Żółte pochodne nitrowe w środowisku zasadowym
tworzą sole o intensywnym zabarwieniu pomarańczowym.
3. Reakcja Hopkinsa i Cole'a - reakcja na obecność układu indolowego (w tryptofanie). W środowisku
kwaśnym tryptofan reaguje z aldehydami (np. kwasem glioksalowym) dając barwny produkt
kondesacji. W kwaśnych hydrolizatach peptydów i białek wynik reakcji jest ujemny ponieważ
podczas kwaśnej hydrolizy tryptofan ulega zniszczeniu.
4. Reakcja na obecność histydyny - pierścień imidazolowy histydyny w środowisku zasadowym ulega
sprzęganiu z jonem p-sulfobenzodiazoniowym. Produktem reakcji jest pomarańczowy barwnik
azowy.
5. Reakcja ninhydrynowa - służy do wykrywania wolnych aminokwasów (peptydy i białka dają bardzo
słaby odczyn). W pH>4 aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają najpierw utlenieniu a
następnie dekarboksylacji i deaminacji. W obecności powstałego amoniaku zredukowana cząsteczka
ninhydryny ulega kondesacji z utlenioną cząsteczką ninhydryny i powstaje charakterystyczny
fioletowoniebieski produkt. Natężenie zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia aminokwasu. W
przypadku aminokwasów - proliny i hydroksyproliny, które nie zawierają grupy α aminowej
produkt reakcji kondensacji ma barwę żółtą.
6. Reakcja biuretowa - pozwala na odróżnienie białek od aminokwasów. W środowisku zasadowym
następuje tautomeryzacja grup przy wiązaniu peptydowym ( -CO-NH- -C(OH)=N- ).
Z sąsiadującymi ze sobą ugrupowaniami tego typu jony miedziowe tworzą kompleksy o barwie
fioletowej. Wolne aminokwasy tworzą również kompleksy z jonami miedziowymi ale produkty
takiej reakcji mają barwę niebieską.
Dzięki obecności grup dysocjujących, aminokwasy i białka posiadają ładunek elektryczny, co
jest podstawą ich rozdziału w procesie elektroforezy. Elektroforeza polega na ruchu naładowanych
cząsteczek umieszczonych w polu elektrycznym, w środowisku przewodzącym, w kierunku
odpowiednich elektrod. Szybkość migracji białka w polu elektrycznym zależy od natężenia pola
elektrycznego, wypadkowego ładunku cząsteczki i współczynnika tarcia.
Elektroforezę białek można przeprowadzić w żelach poliakrylamidowych (PAGE), które działają
jak sito molekularne. Cząsteczki o wymiarach małych w stosunku do wielkości porów żelu migrują
łatwo, natomiast bardzo duże cząsteczki pozostają prawie nieruchome. Elektroforeza w żelu
poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE) umożliwia rozdział białek na podstawie różnic w
ich masach cząsteczkowych. Białka przed naniesieniem na żel denaturuje się, dzięki dodaniu SDS i
czynnika redukującego. SDS (siarczan dodecylu) jest anionowym detergentem, który zrywa prawie
(
wszystkie wiązania niekowalencyjne w białku oraz wiąże się z białkami nadając im wypadkowy ładunek
ujemny, proporcjonalny do masy cząsteczkowej. Wiązania dwusiarczkowe są zrywane dzięki działaniu
czynnika redukującego (β-merkaptoetanol lub ditiotretiol). Ruchliwość elektroforetyczna jest liniowo
odwrotnie proporcjonalna do logarytmu masy. Białka o mniejszej masie cząsteczkowej migrują szybciej.
Najczęściej stosowaną metodą detekcji białek po rozdziale w żelu poliakrylamidowym jest
barwienie kwaśnym alkoholowym roztworem Coomassie Brilliant Blue. Zastosowanie kwaśnego
alkoholowego roztworu powoduje utrwalenie białek w żelu, co zapobiega ich wymywaniu. W wiązaniu
barwnika z białkami uczestniczą wiązania van der Waalsa i wiązania jonowe. Tą metodą można wykryć
0,1-1 µg białka. Znacznie czulszą metodą jest barwienie przy użyciu AgNO3.
SDS-PAGE jest szeroko stosowaną techniką rozdziału białek. Można ją stosować m. in. do
badania jednorodności preparatu lub wyznaczania masy cząsteczkowej białek.
II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Aminokwasy: budowa chemiczna- wzory, podział uwzględniający rożną polarność grup R,
tworzenie wiązania peptydowego, jony obojnacze, punkt izoelektryczny, aktywność optyczna.
2. Białka: skład i wielkość, struktura I, II, III i IV-rzędowa, klasyfikacja białek na podstawie funkcji.
3. Reakcje charakterystyczne aminokwasów i białek.
4. Elektroforeza: istota procesu i typy.
5. Znajomość części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeń).
III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE
1. Mały aparat do elektroforezy poliakrylamidowej białek z kompletem szklanych płytek, przekładek i
grzebieniem
2. Zasilacz prądu stałego
3. Pudełko plastikowe do barwienia żelu
4. Mikropipety nastawne 20-200 µl, 2-20 µl, 20-200 µl 200-1000 µl (1 komplet / grupa / stanowisko do
przygotowania żelu).
5. Mikropipety nastawne 2-20 µl, 20-200 µl ( komplet / zestaw).
6. Rękawiczki gumowe
7. Pipety szklane (5 ml 2 szt./zestaw) + tubus pipet 5 ml przy stanowisku do wylewania żeli
8. Probówki (20 ml- 20 szt.)
9. Lignina
10. Wrząca łaźnia wodna
11. Łapy
12. Nakładki na pipety do 5 ml (1 szt./zestaw)
13. Klamry metalowe (6 szt.)
14. Pipety pasterowskie
15. Zlewki (3 szt. przy stanowisku do wylewania żeli)
(
IV. ODCZYNNIKI
1. 30 % roztwór akrylamidów (29.2 % akrylamid i 0.8 % bis-akrylamid)
2. 1.5 M Tris (pH 8.8)
3. 1 M Tris (pH 6.8)
4. 10 % SDS
5. 10 % nadsiarczan amonu
6. TEMED
7. Roztwór Coomassie Brilliant Blue R-250:
0.25 g Coomassie rozpuścić w 125 ml metanolu, dodać 100 ml H2O i 25 ml kwasu octowego
8. Roztwór odbarwiacza:
metanol: kwas octowy: H2O (stosunek obj. 2:1 :7)
9. Bufor elektrodowy (10 x):
Tris- 15.125 g, glicyna- 72 g, SDS- 5 g/ 0.5 L H2O
10. Bufor do lizy białek (2x) (przechowywać w-20°C):
1 M Tris-HCl (pH 6.8) - 1.5 ml
10 % SDS - 4.8 ml
87 % glycerol - 2. 76 ml
β-merkaptoetanol - 1.2 ml
H2O - 13.74 ml
+ blekit bromofenolowy
11. 0.1 % acetonowy r-r ninhydryny
12. 1 %-owe roztwory wodne aminokwasów: glicyny, cystyny, cysteiny, fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu i
histydyny
13. Plazma krwi bydlęcej (10 x rozc.)
14. 1 % wodny roztwór żelatyny
15. 6N roztwór wodorotlenku sodu
16. Kwas azotowy (stężony)
17. Kwas siarkowy (stężony)
18. 0.5% roztwór siarczanu miedzi
19. 2% roztwór octanu ołowiawego
20. Roztwór kwasu glioksalowego w 2.5% kwasie octowym
21. 5% roztwór azotynu sodu
22. 1 % roztwór kwasu sulfanilowego w 1 N HCl
23. 10% roztwór węglanu sodu
V. WYKONANIE ĆWICZENIA
A. ELEKTROFOREZA BIAŁEK
a. PRZYGOTOWANIE ŻELU POLIAKRYLAMIDOWEGO
Zmieszać przygotowane roztwory wg poniższej tabelki. Katalizatory polimeryzacji, nadsiarczan
amonu i TEMED dodać tuż przed wlaniem mieszaniny między płytki szklane.
(
Żel rozdzielający (dolny)
Końcowe stężenie żelu 12 % 10 ml
30% r-r akrylamidów 4,0 ml
l .5 M Tris (pH 8.8) 2.5 ml
10% SDS 0,1 ml
10% nadsiarczan amonu 0,1 ml
TEMED 0,004 ml
H2O 3,3 ml
Roztworu powinno być tyle, aby pozostało miejsce na grzebień i żel górny (ok. 1 cm wysokości).
Na żel nawarstwić ostrożnie 0,2-0,5 ml wody (aby uniemożliwić dostęp tlenu- inhibitora polimeryzacji) i
pozostawić do polimeryzacji na ok. 10-15 min. W tym czasie przygotować żel zagęszczający (górny) wg
tabeli poniżej. Nadsiarczan i TEMED dodać tuż przed wlaniem żelu między płyty.
Żel zagęszczający (górny)
Końcowe stężenie żelu 5 % 5 ml
30% r-r akrylamidów 0,83 ml
1M Tris (pH 6.8) 0,63 ml
10% SDS 0,05 ml
10% nadsiarczan amonu 0,05 ml
TEMED 0,005 ml
H2O 3,4 ml
Po spolimeryzowaniu żelu dolnego należy usunąć wodę i wlać roztwór żelu górnego.
Natychmiast włożyć grzebień tak, aby nie pozostawić pęcherzy powietrza w żelu. Po spolimeryzowaniu
żelu wyjąć grzebień i umieścić płyty w aparacie do elektroforezy. Górny i dolny zbiornik aparatu
wypełnić buforem elektrodowym (l X). Aparat podłączyć do zasilacza (górny zbiornik do katody [-],
dolny do anody [+]). Po przepłukaniu studzienek buforem elektrodowym nanieść próby (objętość ustalić
z prowadzącym ćwiczenie), które należy przygotować wcześniej.
b. PRZYGOTOWANIE PRÓB DO ELEKTROFOREZY I ROZDZIAŁ
ELEKTROFORETYCZNY
Do próby (osad lub ekstrakt bakteryjny) dodać równą objętość buforu do lizy (2x), probówkę
umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Próby odwirować (5.000 obr./min, 30 sec) i nanieść do
studzienek w żelu. Włączyć zasilacz i prowadzić rozdział elektroforetyczny przy 100 V do momentu,
gdy czoło barwnika znajdzie sie na granicy żelu górnego i dolnego. Następnie zwiększyć napięcie do
150-l80V. Elektroforezę zakończyć, gdy barwnik będzie znajdował sie przy końcu żelu.
(
c. BARWIENIE ŻELU ROZTWOREM COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250
Żel inkubować z wytrząsaniem w roztworze Coomassie przez ok. 30 min. Żel odbarwiać w
roztworze metanol : kwas octowy : H2O (w stosunku obj. 2: 1 :7) do uzyskania wyraźnych prążków. W
odbarwiaczu można umieścić kawałek gąbki, która będzie pochłaniała barwnik.
B. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE
a. REAKCJE NA OBECNOŚĆ CYSTEINY I CYSTYNY
Do pięciu ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno po 100 µl roztworów: glicyny,
cystyny, cysteiny, żelatyny oraz plazmy krwi, a następnie do wszystkich probówek dodać po 4 krople 6N
NaOH i po kropli octanu ołowiawego. Ogrzewać przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej.
b. REAKCJA NA OBECNOŚĆ UKŁADÓW AROMATYCZNYCH (KSANTOPROTEINOWA)
Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 2 krople stężonego kwasu azotowego, a następnie
dodać po 100 µl roztworów glicyny (1), fenyloalaniny (2), tyrozyny (3), tryptofanu (4), histydyny (5),
żelatyny (6) oraz plazmy krwi (7). Probówki ogrzewać nad palnikiem do chwili wydzielania sie
brązowych par tlenku azotu (OSTROŻNIE, otwór probówki skierować pod wyciąg !!!). Po ostygnięciu
do każdej probówki dodać powoli kroplami, mieszając, po około 1.5 ml 6N roztworu NaOH
(OSTROŻNIE).
c. REAKCJA NA OBECNOŚĆ TRYPTOFANU (HOPKINSA I COLE'A)
Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 200 µl roztworów: glicyny (1), tryptofanu (2),
żelatyny (3) oraz plazmy krwi (4). Do wszystkich probówek dodać po 2 krople roztworu kwasu
glioksalowego, a następnie do każdej probówki dodawać ostrożnie stężony kwas siarkowy po ściance
próbówki, nie mieszając. Objętość dodanego kwasu powinna być zbliżona do objętości roztworu
wodnego w probówce. Należy zwrócić uwagę na zabarwienie, na granicy obu warstw.
d. REAKCJA NA OBECNOŚĆ HISTYDYNY
Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 100 µl roztworów: glicyny (1), histydyny (2),
żelatyny (3) oraz plazmy krwi (4). Do wszystkich probówek dodać po 100 µl świeżo przyrządzonej
mieszaniny równych objętości roztworu azotynu sodu i roztworu kwasu sulfanilowego, a następnie po
200 µl roztworu węglanu sodu.
e. REAKCJA NINHYDRYNOWA
Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 100 µl roztworów: glicyny (1), żelatyny (2),
plazmy krwi (3) oraz wody destylowanej (4). Następnie do wszystkich probówek dodać po 100 µl
roztworu ninhydryny i wstawić je na kilka minut do łaźni wodnej o temperaturze 100°C.
(
f. REAKCJA BIURETOWA
Do ponumerowanych probówek odmierzyć po 100 µl: wody destylowanej (1), roztworu glicyny
(2), roztworu histydyny (3), żelatyny (4) oraz plazmy krwi (5). Następnie do wszystkich probówek dodać
4 krople 6N NaOH i po jednej kropli roztworu CuSO4.
VI. WNIOSKI / SPRAWOZDANIE:
a. Zinterpretować wynik rozdziału białek w żelu poliakrylamidowym. Wyjaśnić dlaczego białka uległy
rozdzieleniu.
b. Opisać wyniki reakcji charakterystycznych w tabeli.
nr testu
Glicyna Cysteina
(CysSH) Cystyna Histydyna
Fenyloala-
nina Tyrozyna Tryptofan Żelatyna
Plazma
krwi H2O UWAGI
III. CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA NA ŻELU
SEPHADEX G-75
I. WSTĘP
Chromatografia na żelu Sephadex, określana też jako sączenie molekularne, jest techniką
umożliwiającą analityczny bądź preparatywny rozdział substancji różniących się masą cząsteczkową.
Sephadex jest handlową nazwą preparatu uzyskiwanego przez wytworzenie wiązań poprzecznych
pomiędzy łańcuchami dekstranu. Preparaty żelu, mające postać granulek o średnicy 10-300 µm w zależności
od stopnia usieciowania, różnią się zdolnością wchłaniania wody, co służy za kryterium ich podziału i
decyduje o rozdzielczych właściwościach żelu.
Mechanizm sączenia na żelu przedstawia się schematycznie w sposób następujący. Cząsteczki takie
jak np. blue dextran, które są większe niż pory napęczniałych ziaren żelu nie mogą penetrować do ich
wnętrza, a wiec przechodzą wyłącznie poprzez fazę wodną złoża i są eluowane jako pierwsze. Mniejsze
cząsteczki wnikające w różnym stopniu do wnętrza ziaren, w zależności od swego kształtu i rozmiaru, są
eluowane w kolejności zmniejszania się ich masy cząsteczkowej (w doświadczeniu będzie to najpierw
cytochrom c - 13 kDa, a następnie dwuchromian potasu - 0,3 kDa).
Charakteryzując kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielonych substancji, stosuje
się następujące pojęcia:
objętość swobodna (zerowa) /V0/ - objętość rozpuszczalnika znajdującego się pomiędzy
ziarnami żelu
objętość wewnętrzna /Vi/ - objętość rozpuszczalnika wypełniającego ziarna żelu
objętość matrycy żelu /Vg/
objętość całkowita złoża /Vt/
Vt= V0+Vi+Vg
oraz
objętość elucyjna /Ve/, charakterystyczna dla danej substancji.
Rozpatrując sączenie molekularne na żelu jako szczególny przypadek chromatografii podziałowej,
stosujemy zależność pomiędzy objętością elucyjną substancji /Ve/, a charakterystycznym dla danej
substancji współczynnikiem podziału między fazę stacjonarną i ruchomą:
Ve = V0 + Kd Vi
gdzie: Kd - współczynnik podziału
V0 - faza ruchoma
Vi - faza stacjonarna
W chromatografii na żelu stosuje się dwa różne współczynniki podziału, w zależności od
zdefiniowania fazy stacjonarnej.
Jeżeli jako fazę stacjonarną traktuje się rozpuszczalnik związany z żelem /Vi/ uzyskujemy zależność:
KD = Ve – V0/Vi
Ponieważ w praktyce trudno jest ustalić Vi, jako fazę stacjonarną przyjmujemy całą fazę żelową /tzn.
Vi+Vg/ i otrzymamy zależność:
KAV= Ve – V0/ (Vt -V0)
Wartość KAV (współczynnik dostępności) jest łatwiejsza do wyznaczenia, stąd też częściej jest
stosowana w praktyce.
W pracy laboratoryjnej sączenie molekularne wykorzystuje się do:
1) rozdziału substancji różniących się masą cząsteczkową,
2) odsalania substancji wielkocząsteczkowych
3) wyznaczania ciężaru cząsteczkowego związków.
II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA:
1. Technika chromatografii kolumnowej (formowanie i równoważenie kolumny, nanoszenie próby,
rozwijanie chromatogramu, regulacja przepływu rozpuszczalników).
2. Sączenie molekularne: charakterystyka żeli typu Sephadex, inne rodzaje żeli filtracyjnych m.in.
Sepharose, Sephacryl; mechanizm sączenia molekularnego, pojęcia charakteryzujące stosowaną w
doświadczeniu kolumnę chromatograficzną oraz zachowanie się rozdzielanych związków (Vt, V0, Vi, Vg,
Ve, K), zastosowanie metody sączenia molekularnego.
3. Inne rodzaje metod chromatograficznych (chromatografia jonowymienna, powinowactwa, oddziaływań
hydrofobowych i fazy odwróconej). Mechanizm oraz wady i zalety i wykorzystywania danej metody.
4. Budowa związków rozdzielanych na żelu Sephadex G-75 (blue dextran, cytochrom c, dwuchromian
potasu).
5. Znajomość części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeń).
III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE
1. Kolumna chromatograficzna firmy Sigma-Aldrich (1 cm x 20 cm)
2. Probówki szklane ze skalą - 20 szt.
3. Mikropipeta nastawna 20-200 µl (2 szt./grupa) i 1000 µl (1 szt. /grupa) + pudełko z żółtymi i niebieskimi tipsami
4. Pipety pasteurowskie
5. Zlewki (250 ml)
6. Kolba Erlenmayera (500 ml)
7. Markery
8. Bagietka szklana
9. Spektrofotometry
10. Papier milimetrowy
11. Strzykawki (6 szt./ grupa)
12. Cylindry (50 ml) (6 szt./ grupa)
IV. ODCZYNNIKI
1. Sephadex G-75 w 90 ml roztworu NaCl (moczony przez 24 godz. i następnie odpowietrzony)
2. 0.85% r-r NaCl (500 ml)
3. Próbka do rozdzielenia: 1.5 ml 0.85% r-r NaCl zawierającego: 5 mg Blue dextranu, 10 mg cytochromu C, 9 mg
dwuchromianu potasu, 2% sacharozy (dla całej grupy);
UWAGA! do frakcjonowania próby pobiera się tylko 0.2 ml!
[Masy cząsteczkowe: Blue dextran - 2000000; Cyt.c - 13000; dwuchromian potasu - 300]
V. WYKONANIE ĆWICZENIA
A. FORMOWANIE KOLUMNY Z ŻELU SEPHADEX
Kolumnę szklaną, owiniętą kilkoma kawałeczkami ligniny, ustawić pionowo w ,,łapie" metalowego
statywu, zamknąć jej wylot zaciskaczem i wlać do niej ok. 2 ml NaCl. Następnie ostrożnie wlać (po
bagietce) do kolumny zamieszaną uprzednio zawiesinę żelu Sephadex.
Uwaga! Przed zamieszaniem, zawiesina w zlewce powinna być przygotowana tak, aby 2/3 jej objętości
stanowił osiadły żel, a 1/3 r-r NaCl.
Ostrożnie otworzyć zacisk kolumny. Roztwór soli powinien wypływać z szybkością
1 kropla/sek. Wysokość uformowanego żelu powinna wynosić 14-16 cm. Po uformowaniu warstwy o
żądanej wysokości należy zamknąć wylot kolumny, pozostawiając nad powierzchnią żelu minimum 1 cm
roztworu.
Uwaga! Kolumna uformowana z żelu Sephadex musi zawsze być przykryta warstwą roztworu, aby nie
dopuścić do wyschnięcia górnej powierzchni złoża i jego zapowietrzenia.
B. RÓWNOWAŻENIE KOLUMNY
Do cylindra miarowego przenieść ok. 15-20 ml r-r NaCl. Wykorzystując strzykawkę wzbudzić
przepływ i równoważyć kolumnę z uformowanym żelem Sephadex G-75.
C. FRAKCJONOWANIE NA ŻELU SEPHADEX
Po przemyciu żelu zaznaczyć markerem górną granicę złoża, przerwać dopływ cieczy do kolumny,
po czym zamknąć wylot kolumny, pozostawiając nad powierzchnią żelu warstwę
minimum 1 cm r-ru. Przy pomocy mikropipety nanieść na żel 0,2 ml r-ru badanej próbki podwarstwiając ją
ostrożnie pod r-r NaCl (nie wolno naruszyć powierzchni żelu!). Podstawić pod kranik kolumny
I-szą probówkę ze skalą i ostrożnie podłączyć zbiornik z r-rem NaCl do kolumny. Otworzyć kranik i zbierać
eluat. Pierwsze 4 ml wycieku zbierać do jednej probówki ze skalą (l-sza probówka), następnie zbierać
frakcje o obj. 1 ml również do probówek ze skalą aż do momentu całkowitego zaniku żółtego zabarwienia
eluatu. Przerwać elucję, wypakować żel z kolumny z powrotem do zlewki! Zmierzyć objętość, jaką
zajmował żel, napełniając kolumnę wodą i mierząc cylindrem objętość wody, mieszczącej sie w części
kolumny zaznaczonej uprzednio kreską. Wartość tę (Vt) zanotować.
VI. WYNIKI I OBLICZENIA
Zmierzyć absorpcje frakcji zawierających blue dextran przy długości fali 620 nm a frakcji,
zawierających cytochrom c i dwuchromianu potasu przy 450 nm. Zanotować wyniki:
Nr fakcji/Ve (ml)
Absorpcja
620 nm
(blue dextran)
450 nm
(cytochrom c.
dwuchromian potasu)
1 / 4m
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Sporządzić na papierze milimetrowym diagram elucji w/g wzoru.
Obliczyć dla cytochromu c i dwuchromianu wartość KAV w/g wzoru:
KAV = (Ve – V0)/ (Vt – V0)
gdzie: Ve- objętość elucyjna badanej substancji
V0- objętość elucyjna Blue Dextranu V0 =
Vt- objętość całkowita złoża Vt =
Uzupełnij tabelkę:
Substancja Ve (ml) Ve – V0 (ml) (Ve – V0)/ (Vt – V0)
Cytochrom c
Dwuchromian potasu
II. WNIOSKI
Sporządzić wnioski z ćwiczenia.
IV. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI KWAŚNEJ FOSFATAZY W
HOMOGENACIE Z KIEŁKÓW PSZENICY
I. WSTĘP
Fosfatazy /fosfomonoesterazy/ są enzymami katalizującymi hydrolityczny rozpad estrów kwasu
fosforowego do odpowiedniego alkoholu i kwasu fosforowego. Enzymy te powszechnie występują zarówno
w tkankach roślinnych jak i zwierzęcych. Wyróżniamy dwie klasy fosfataz: kwaśne, które wykazują
maksymalną aktywność przy pH 4-6 oraz zasadowe z maksymalną aktywnością przy pH 8-9.
Kiełki pszenicy są łatwo dostępnym źródłem szeregu enzymów w tym również fosfatazy kwaśnej o
małej specyficzności w stosunku do substratu. Rola fosfatazy kwaśnej w roślinie polega na uwalnianiu
rezerw fosforanu znajdujących się w kiełkujących ziarnach w postaci m. in. sześciofosforanu inozytolu.
Fosfataza kwaśna jest łatwo uwalniana w trakcie mieszania homogenizowanych kiełków w wodzie. Do
oznaczania aktywności enzymu zostanie użyty syntetyczny substrat: nitrofenylofosforan sodu. Reakcja
będzie przeprowadzana w warunkach optymalnych dla fosfatazy - w buforze cytrynianowym o pH 5,3.
Produktem reakcji katalizowanej przez fosfatazę jest nitrofenol, bezbarwny w pH kwaśnym. Dodanie NaOH
zatrzymuje reakcję i umożliwia przekształcenie nitrofenolu w barwny anion nitrofenolanowy.
Ilość produktu reakcji można określić na podstawie pomiaru spektrofotometrycznego. Oznaczanie
aktywności fosfatazy prowadzi się przy stałym stężeniu substratu. Ilość enzymu należy dobrać tak, aby
stężenie substratu nie ograniczało szybkości katalizowanej reakcji. Zawartość enzymu określa się w
jednostkach aktywności, przyjmując za jednostkę taką ilość enzymu, która hydrolizuje 1 µmol
nitrofenylofosforanu w ciągu minuty.
II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Enzymy jako katalizatory reakcji biochemicznych (wpływ enzymów na równowagę reakcji i energie
aktywacji; miejsce aktywne enzymu, kompleksy enzym - substrat, specyficzność substratowa,
klasyfikacja enzymów).
2. Czynniki wpływające na aktywność enzymatyczną (temperatura, pH, kofaktory, stężenie substratu).
3. Pojęcia: kofaktor, koenzym, grupa prostetyczna, holoenzym, apoenzym, izoenzymy, enzymy
allosteryczne, jednostka enzymu (U), aktywność właściwa, aktywność molekularna (liczba obrotów).
4. Kinetyka reakcji enzymatycznej - równanie Michaelisa Menten.
III. APARATURA I SPRZĘT LABORATORYJNY
1. Probówki chemiczne zwykle
2. Pipety (1 ml, 5 ml) + nasadki
3. Statywy do probówek
4. Łaźnia wodna
5. Spektrofotometr
6. Mikser
7. Kolba stożkowa (500 ml)
8. Papier milimetrowy
9. Lejek, sączek
10. Cylinder miarowy (200 ml)
11. Pipety automatyczne (250 µl, 500 µl)
IV. ODCZYNNIKI
1. 0,005 M roztwór nitrofenylofosforanu sodu (przygotować bezpośrednio przed użyciem)
2. 0,1 M bufor cytrynianowy pH 5.3
3. 1 N NaOH
4. 0,5 mM roztwór p-nitrofenolu w wodzie
5. H2O w lodówce do r-row 1 i 4
V. WYKONANIE ĆWICZENIA
A. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU ENZYMATYCZNEGO
Do 2,5 g kiełków pszenicy dodać 200 ml wody destylowanej. Korzystając z miksera przygotować
homogenat z kiełków. Przesączyć. Przesącz należy rozcieńczyć 5 razy. Przesącz zawiera fosfatazę kwaśną,
której aktywność należy oznaczyć.
UWAGA! Otrzymany ekstrakt należy przechowywać w lodzie.
B. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ
a. Przygotowanie krzywej wzorcowej
Do 6 probówek odmierzyć:
Nr probówki 0,5 mM
p-nitrofenol (ml)
1 N NaOH
(ml)
Woda
destylowana
(ml)
1 0,25 1 4,75
2 0,5 1 4,5
3 1 1 4
4 1,5 1 3,5
5 2 1 3
6 3 1 2
Próby wymieszać, zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 430 nm (spektrofotometr wyzerować
względem wody) i sporządzić krzywą wzorcową dla p-nitrofenolu (wykres 1).
b. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych
Do 5 ponumerowanych czystych probówek laboratoryjnych odmierzyć roztwory:
Nr probówki Homogenat z
kiełków (ml)
Woda destylowana
(ml)
Bufor cytrynianowy
(ml)
1 - kontrola 0 2,0 1,0
2 0,5 1,5 1,0
3 1,0 1,0 1,0
4 1,5 0,5 1,0
5 2,0 0 1,0
Próby po dokładnym wymieszaniu wstawić do łaźni wodnej o temp. 37 °C na 10 min. Następnie do
każdej probówki szybko odpipetować po 2 ml 0,005 M roztworu nitrofenylofosforanu sodu o temp. 37 °C i
inkubować próby w temp. 37 °C przez kolejne 10 min. Po tym czasie do każdej probówki dodać po 1 ml 1 N
roztworu NaOH, wymieszać i przeprowadzić pomiar ekstynkcji przy długości fali 430 nm wobec kontroli
(probówka nr 1- próba do wyzerowania spektrofotometru).
Przedstawić krzywą hydrolizy p-nitrofenylofosforanu sodu w obecności kwaśnej fosfatazy (wykres
2) odkładając na osi rzędnych µmole zhydrolizowanego substratu/min, a na osi odciętych ilość dodanego
homogenatu w ml.
Na podstawie uzyskanych wyników, korzystając z krzywej wzorcowej, obliczyć ilość jednostek
enzymu w 1 ml homogenatu z kiełków pszenicy.
VI. WYNIKI i WNIOSKI
Opisz uzyskane rezultaty, wykonaj wykresy i obliczenia, sformułuj wnioski.
V. HAMOWANIE KOMPETYCYJNE I NIEKOMPETYCYJNE
AKTYWNOŚCI DEHYDROGENAZY BURSZTYNIANOWEJ
I. WSTĘP
W kinetyce reakcji enzymatycznej podstawową funkcję odgrywają procesy inhibicji i aktywacji.
Inhibitory to związki obniżające szybkość reakcji enzymatycznej. Mogą to być normalne metabolity
komórkowe, które hamują enzym w ramach naturalnej kontroli odpowiedniego szlaku metabolicznego ale
również substancje obce dla organizmu np. antybiotyki, narkotyki, trucizny i toksyny.
Rozróżnia sie dwa typy inhibicji: inhibicję odwracalną i nieodwracalną. Przykładem inhibicji
odwracalnej jest hamowanie kompetycyjne, kiedy substrat i substancja hamująca (inhibitor) konkurują z
sobą o centrum aktywne enzymu. Centrum aktywne jest częścią enzymu, które dzięki odpowiedniej
strukturze może przyłączyć substrat(y) (i ewentualnie koenzym) i doprowadzić do zajścia odpowiedniej
reakcji. Inhibitor kompetycyjny wypiera substrat z centrum aktywnego enzymu. Przy nadmiarze substratu i
małych stężeń inhibitora dochodzi do cofnięcia efektu inhibicji. Klasycznym przykładem hamowania
kompetycyjnego jest hamowanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian.
Dehydrogenaza bursztynianowa - integralne białko błony mitochondrialnej - enzym uczestniczący w
cyklu Krebsa, katalizuje utlenianie bursztynianu przez koenzym Q (ubichinon). Enzym nie odróżnia
malonianu od bursztynianu ale kompleks enzym-malonian nie ulega rozpadowi i nie uzyskujemy produktów
reakcji.
Przy pomiarze aktywności dehydrogenazy bursztynianowej wykorzystuje się metodę, w której
elektrony, będące jednym z produktów reakcji przenoszone są na sztuczny akceptor, którym w
doświadczeniu jest żelazicyjanek potasu. Redukcji żelazicyjanku do żelazocyjanku towarzyszy zanik żółtej
barwy roztworu.
Efekt hamowania niekompetycyjnego dehydrogenazy bursztynianowej można wykazać przez
dodanie do badanego układu soli metali ciężkich, np.: HgCl2, który blokując grupy SH centrum aktywnego
hamuje aktywność enzymatyczną. W tym przypadku nawet znaczne stężenie substratu nie jest w stanie
cofnąć inhibicji.
II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Ogólna klasyfikacja enzymów.
2. Budowa enzymu (apoenzym, holoenzyrn, koenzym, grupa prostetyczna, centrum aktywne).
3. Cechy enzymu (swoistość działania, swoistość do substratu - typy swoistości -przykłady).
4. Funkcja enzymów, ich znaczenie oraz charakter reakcji enzymatycznej.
5. Kinetyka reakcji enzymatycznej (równanie i krzywa Michaelisa-Menten),
6. Inhibicja enzymów: nieodwracalna i odwracalna (kompetycyjna, niekompetycyjna), hamowanie
allosteryczne
7. Struktura i funkcja enzymów allosterycznych.
8. Dehydrogenaza bursztynianowa- struktura, funkcja, lokalizacja.
9. Znajomość części doświadczalnej (+ przeliczanie stężeń).
III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE
1. Łaźnia wodna o temp. 37 °C
2. Homogenizator
3. Zlewka (200 ml)
4. Probówki (20 ml- 24 szt.)
5. 2 statywy na probówki
6. Lejki (6-12 szt.)
7. Bibuła filtracyjna
8. Pipety (5 ml)+ nasadki na pipety i gumowe gruszki
9. Mikropipety (100 µl, 500 µl, nastawna na 1000 µl)
10. Nożyczki
11. Pęseta
12. Cylinder miarowy (200 ml)
13. Nóż, deska do krojenia
14. Bagietka szklana
IV. ODCZYNNIKI
1. 0, M bufor fosforanowy pH 7.3
2. 0,1 M bursztynian sodu pH 7.0
3. 0,05 M malonian sodu pH 7.0
4. 0,01 M chlorek rtęciowy
5. 0,5 % żelazicyjanek potasu pH 7.0
6. 10 % kwas trójchlorooctowy (TCA)
7. 0,25 M sacharoza
8. Wątroba
V. WYKONANIE ĆWICZENIA
A. PRZYGOTOWANIE PROBÓWEK Z PŁYNAMI INKUBACYJNYMI
Do 12 ponumerowanych probówek odmierzyć płyny inkubacyjne według załączonego schematu
(tabela).
Uwaga! Ze względu na silną toksyczność stosowanych substancji, do nabierania roztworów używać
tylko pipet z nasadką lub z gumową gruszką!
Nr probówki
0,1 M bufor
fosforanowy
(ml)
0,1 M
bursztynian
sodu
(ml)
0,05 M
malonian
sodu
(ml)
0,01 chlorek
rtęciowy
(ml)
0,5%
żelazicyjanek
potasu
(ml)
Woda
(ml)
1 1 0 0 0 0,5 3,0
2 1 0,1 0 0 0,5 2,9
3 1 0,1 0 0 0,5 2,9
4 1 0,1 0 0 0,5 2,9
5 1 0,1 0,1 0 0,5 2,8
6 1 0,1 0,1 0 0,5 2,8
7 1 0,1 0 0,1 0,5 2,8
8 1 0,1 0 0,1 0,5 2,8
9 1 2 0,1 0 0,5 0,9
10 1 2 0,1 0 0,5 0,9
11 1 2 0 0,1 0,5 0,9
12 1 2 0 0,1 0,5 0,9
Probówki nr 1 i 2 służą jako kontrola. Probówka nr 1 nie zawiera substratu dla dehydrogenazy
bursztynianowej. W przypadku probówki nr 2 dodać 2 ml 10% TCA celem wytracenia białek (denaturacja
enzymów czyli kontrola ta nie zawiera czynnego enzymu). Następnie wszystkie probówki wstawić do łaźni
wodnej (37 °C) na 10 min.
B. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU ENZYMATYCZNEGO
Rozdrobnioną porcję wątroby (dla całej grupy) umieścić w cylindrze miarowym i uzupełnić zimnym
0,25 M roztworem sacharozy do obj. 200 ml. Całość przenieść do homogenizatora i homogenizować przez 3
min. Uzyskany homogenat zawiera dehydrogenazę bursztynianową (należy go przechowywać w lodzie lub
lodówce).
C. INHIBICJA
Do każdej probówki umieszczonej w łaźni wodnej (37 °C) dodać po 1 ml homogenatu, wymieszać i
inkubować przez 30 min. Następnie reakcję przerwać przez dodanie do każdej probówki 2 ml 10% TCA (z
wyjątkiem probówki nr 2) i przesączyć przez małe sączki do innych probówek. Zaobserwować, w których
próbówkach nastąpiło odbarwienie płynu i dane umieścić w tabeli:
Nr probówki
Stężenie
molowe
substratu
[mM]
Stężenie
molowe
malonianiu
[mM]
Stężenie
molowe
HgCl2
[mM]
Odbarwienie
roztworu
żelazicyjanku
(obserwacje)
WNIOSKI
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Obliczyć stężenie substratu oraz inhibitorów w poszczególnych próbówkach (przed dodaniem TCA)
i wpisać do tabeli. Na podstawie wyników zestawionych w tabeli zastanowić się, w których próbówkach
doszło do inhibicji. Przeanalizować stężenie użytego substratu i inhibitora i na tej podstawie określić, w
których probówkach doszło do odwrócenia inhibicji.
VI. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA I ILOŚCIOWE
OZNACZANIE CUKRÓW
I. WSTĘP
Chromatografia cienkowarstwowa jest metodą rozdzielania mieszanin substancji przy zastosowaniu
nośników uformowanych w postaci cienkich warstw na powierzchni szklanych płytek. Nośnikami
najczęściej stosowanymi są: żel krzemionkowy, tlenek glinu, ziemia okrzemkowa, celuloza i jej pochodne.
Używa się je w postaci drobno sproszkowanej, czasami z domieszką substancji wiążącej, np.: gipsu. Nośnik
zawieszony w odpowiednim rozpuszczalniku daje się łatwo rozprowadzić na czystej powierzchni, dokładnie
odtłuszczonej i suchej płytki, a po wysuszeniu twardnieje i przylega w postaci cienkiej warstwy do szkła. W
niektórych przypadkach płytki wymagają aktywacji przez ogrzewanie w określonej temperaturze.
W zależności od warunków chromatografii (rodzaj nośnika, układ rozpuszczalników) rozdzielenie
mieszaniny substancji na chromatogramach może odbywać się w wyniku procesów adsorpcji, rozdziału
między dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe lub wymiany jonowej.
W porównaniu z chromatografią bibułową, metoda chromatografii cienkowarstwowej ma szereg
zalet, które decydują o coraz szerszym jej stosowaniu. Najważniejsze z nich to: krótszy czas rozwijania
chromatogramów, większa czułość i dzięki temu możliwość analizowania mniejszych ilości substancji,
dobry rozdział mieszanin związków trudno rozdzielających się metodą chromatografii bibułowej, mniejsze
rozmywanie się plam, możliwość wywoływania chromatogramów stężonymi roztworami kwasów i zasad (z
wyjątkiem płytek celulozowych), możliwość odzyskania substancji z chromatogramu (przez wyskrobanie
nośnika z płytki i elucję substancji z nośnika).
Cukry dzieli sie na dwie grupy:
1) cukry proste (jednocukry, monosacharydy)
2) cukry złożone, do których sie zalicza:
a) kilkocukry (oligosacharydy)
b) wielocukry (polisacharydy)
Do wykrywania i dalszej analizy cukrów wykorzystuje się reakcje oparte na następujących
właściwościach tych związków:
1. Cukrowce o budowie cyklicznej mogą przekształcać sie w pochodne cyklicznego aldehydu - furfuralu i
tworzyć z niektórymi związkami produkty kondensacji.
2. Niektóre wielocukrowce tworzą w obecności jodu kompleksy wielocukrowiec-jod. Kompleksy z jodem
mogą tworzyć tylko cząsteczki o odpowiednio dużych rozmiarach i uporządkowanej strukturze. Do
takich wielocukrów należą skrobia oraz glikogen. Skrobia składa sie z 2 składników: amylozy i
amylopektyny. Amyloza charakteryzuje się nierozgałęzionymi łańcuchami, tworzącymi układy spiralne,
przy czym na 1 skręt przypada 6 reszt cukrowych (α-D-glukozy). Natomiast amylopektyna posiada
budowę rozgałęzioną, przez co odcinki helikalne są krótsze. Barwny efekt reakcji z jodem jest tym
większy, im dłuższe są odcinki o strukturze helikalnej. Amyloza daje intensywną barwę niebieską; w
miarę skracania długości łańcuchów następuje zmiana barwy na fioletowoczerwoną (amylopektyna) i
ciemnoczerwoną (glikogen).
3. Cukrowce z wolną grupą karbonylową redukują niektóre związki i jony.
4. Cukrowce z wolną grupą karbonylową są zdolne tworzyć z fenylohydrazyną osazony.
Cukry można oznaczać ilościowo a także wywoływać na chromatogramach przy pomocy
charakterystycznych substancji barwnych. Ich podstawą jest tworzenie się pochodnych furfuralu z cukrów
(pentoz, heksoz, kwasów uronowych) pod działaniem kwasów mineralnych w podwyższonej temperaturze.
furfural hydroksy metylofurfural metylofurfural
(z pentoz) (z heksoz) (z 6-dezoksyheksoz)
Pochodne te mogą ulegać dalszym przemianom:
Pochodne furfuralu po kondensacji ze związkami zawierającymi grupy fenolowe lub fenyloaminowe
dają produkty barwne. W metodzie oznaczania cukrów wg Dubois stosuje się fenol, produkty kondensacji
mają barwę różową. W próbie antronowej przeprowadza się kondensację z antronem
uzyskując produkty zabarwione na kolor niebieski. Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości
cukrów w próbie (przy ścisłym przestrzeganiu warunków reakcji).
II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA:
1. Węglowodany: budowa i nazewnictwo, podział węglowodanów (mono-, oligo-, polisacharydy,
przykłady, występowanie i funkcje)
2. Właściwości chemiczne i fizyczne cukrów.
3. Wykrywanie cukrów, reakcje barwne.
4. Funkcje pełnione przez węglowodany w organizmie.
5. Chromatografia cienkowarstwowa: zastosowanie, dobór sorbenta i rozpuszczalnika, chromatografia
podziałowa, współczynnik przesunięcia (Rf).
6. Znajomość części doświadczalnej.
III. APARATURA I SPRZĘT LABORATORYJNY
1. Płytki szklane 20 x 10 cm 2 szt.
2. Cylinder miarowy 10 ml 1 szt.
3. Cylinder miarowy 50 ml 1 szt.
4. Bagietka 1 szt.
5. Kolba stożkowa 50 ml 1 szt.
6. Mikropipeta 1 µl 1 szt.
7. Pipety 1 ml 2 szt.
8. Pipety 5 ml 2 szt.
9. Nasadka do pipet 1 szt.
10. Probówki 11 szt.
11. Suszarka 60 °C
12. Suszarka 130 °C
13. Suszarka ręczna
14. Komora chromatograficzne 1 szt.
15. Spryskiwacz 1 szt.
16. Dozowniki 2 szt.
17. Łaźnia wodna
18. Statyw na probówki
IV. ODCZYNNIKI
1. Żel krzemionkowy
2. 0,02 M roztwór octanu sodu
3. 2 % r- ry cukrów: 1) ksylozy, 2) fruktozy, 3) glukozy, 4) sacharozy, 5) laktozy
4. 2 % mieszanina cukrów: 1 + 2+ 3 + 4 + 5
5. Mieszanina rozpuszczalników
chloroform: kwas octowy: woda (30: 35: 5)
6. Wywoływacz: 1 g dwufenyloaminy + 1 ml aniliny + 100 ml acetonu,
dodać 10 ml 85 % H3PO4 bezpośrednio przed użyciem!
7. 1 % r-ry cukrów: (1) glukozy, (2) sacharozy, (3) maltozy, (4) skrobi
8. 20% etanolowy roztwór α-naftolu
9. Stężony H2S04
10. Odczynnik Benedicta
11. Odczynnik Barfoeda
12. Roztwór jodu w jodku potasowym (plyn Lugola)
13. Sok owocowy
Dodatkowe materiały: linijki, ołówki, gumowe rękawiczki, papier milimetrowy
Uwaga! Podczas wykonywania części praktycznej ćwiczenia dotyczącej chromatografii cienkowarstwowej
oraz przy pracy ze stężonym kwasem należy zachować szczególną ostrożność. Wszystkie czynności należy
wykonywać pod wyciągiem.
V. WYKONANIE ĆWICZENIA
A. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA
a. Przygotowanie płytek
Jedną płytkę szklaną (10 x 20 cm) dokładnie oczyszczoną i suchą odtłuścić watą lub ligniną
nasyconą etanolem.
b. Przygotowanie warstwy żelu krzemionkowego
Do kolbki z 3 g żelu krzemionkowego dodać 10 ml 0,02 M octanu sodu. Mieszać delikatnie ruchem
obrotowym około 1 min. Zawiesinę natychmiast wylać na odtłuszczoną płytkę szklaną. Posługując się
bagietką rozprowadzić złoże równomiernie na powierzchni płytki (wyrównać poprzez przechylenie płytki na
boki). Pozostawić w temp. pokojowej dla następnej grupy ćwiczeniowej.
c. Przygotowanie płytek do nanoszenia prób
Płytkę z żelem krzemionkowym obrysować w następujący sposób: 3 brzegi w odległości
5 mm od krawędzi. Nieobrysowany brzeg wąski posłuży jako linia startu dla rozdzielanych cukrów, które
należy nanieść w odległości około 1,5 cm od dolnego brzegu płytki. Należy zachować odległości 1,5 cm
pomiędzy nanoszonymi próbami.
Uwaga! Płytkę z żelem krzemionkowym należy bezpośrednio przed użyciem zaktywować przez ogrzanie 15
min w 60°C!
d. Nanoszenie prób
Nanieś na płytki z żelu krzemionkowego po 1 µl 2 % roztworów cukrów. Kolejność nanoszenia: (1)
ksyloza, (2) fruktoza, (3) glukoza, (4) sacharoza, (5) laktoza, (6) mieszanina cukrów 1 + 2 + 3 + 4 + 5, (7)
zawiązek X (do identyfikacji).
e. Rozwijanie chromatogram6w
Płytkę z żelem krzemionkowym rozwijać w mieszaninie rozpuszczalników:
chloroform: kwas octowy: woda (30: 35: 5)
Chromatogram na żelu krzemionkowym należy wyjąć z komory, gdy front rozpuszczalników
osiągnie górną granicę płytki. Chromatogramy wysuszyć w temperaturze pokojowej.
f. Wywołanie chromatogramów
Płytkę z żelem krzemionkowym spryskać równomiernie wywoływaczem zawierającym: 1 g
dwufenyloaminy, 1 ml aniliny, 100 ml acetonu. Bezpośrednio przed użyciem dodać 10 ml 85 % H3P04.
Spryskaną płytkę ogrzewać przez 15 min w temp. 130 °C.
Obliczyć Rf dla naniesionych cukrów (ksylozy, fruktozy, glukozy, sacharozy i laktozy).
B. ILOŚCIOWE OZNACZANIE CUKRÓW
a. Sporządzenie krzywej wzorcowej
Do 5-ciu ponumerowanych probówek odmierzono roztwór glukozy o stężeniu 100 µg/ml i
uzupełniono wodą wg tabeli. Probówka nr 6 stanowiła kontrolę.
Nr probówki 1 2 3 4 5 6
Objętość roztworu
glukozy [µl] 200 300 400 500 600 0
Objętość wody [µl] 400 300 200 100 0 600
Następnie do wszystkich probówek dodano 600 µl 5% roztworu fenolu i wymieszano. Dodano
(ostrożnie !) po 3 ml H2SO4 i ponownie wymieszano. Reakcję prowadzono przez 10 min w temp. pokojowej.
Poszczególne próby przeniesiono do kuwet i zmierzono absorbancję w spektrofotometrze przy długości fali
λ = 490 nm wobec próby kontrolnej.
Otrzymano następujące wyniki:
Nr probówki 1 2 3 4 5
Absorbancja
490 nm 0,41 0,57 0,75 0,92 1,1
Korzystając z powyższych danych wykreśl krzywą wzorcową dla glukozy:
b. Oznaczenie cukrów w badanych próbach
Masz 3 próby o nieznanym stężeniu cukru: 1, 2, 3. Wykonując doświadczenie jak wyżej otrzymano
następujące wyniki:
1) A490= 0,3
2) A490= 0,8
3) A490= 0,9
Korzystając z krzywej wzorcowej odczytaj zawartość cukrów w próbach 1, 2, 3.
C. REAKCJE CHARAKTERYSTYCZNE
a. Odróżnianie cukrów od innych związków organicznych - reakcja Molischa
Do ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno po 0,5 ml 1 % roztworów: glukozy, sacharozy i
skrobi. Do każdej próby dodać od 1 do 2 kropli świeżo przygotowanego 20% etanolowego roztworu α-
naftolu. Po dokładnym zmieszaniu bardzo ostrożnie, po ściance próbówki, wprowadzić 0,5 cm3 stężonego
roztworu H2SO4 tak, aby była widoczna granica miedzy cieczami.
b. Odróżnianie cukrów redukujących od nieredukujących - reakcja Benedicta
Do ponumerowanych probówek odmierzyć kolejno po 1 ml 1 % roztworów: glukozy, maltozy,
sacharozy i skrobi. Do każdej próby dodać 2,5 ml odczynnika Benedicta i ogrzewać przez 5 min we wrzącej
łaźni wodnej.
c. Odróżnianie cukrów prostych od dwucukrów redukujących
Do probówek odmierzyć kolejno po 1 ml 1 % roztworów: glukozy i maltozy. Do obu prób dodać po
2,5 ml odczynnika Barfoeda i ogrzewać przez 3 min we wrzącej łaźni wodnej.
d. Wykrywanie wielocukrów
Do probówek odmierzyć kolejno po 1 ml 1 % roztworów: skrobi i glukozy. Do obu prób dodać po 1
ml roztworu jodu w jodku potasowym.
VI. WYNIKI I WNIOSKI
Wyniki zanotować i zinterpretować.
VII. LIPIDY
I. WSTĘP
Lipidy (tłuszczowce) stanowią szeroką grupę związków chemicznych o zróżnicowanej budowie. Ich
cechą wyróżniającą jest wyraźny charakter hydrofobowy. Lipidy nie rozpuszczają się w wodzie, natomiast są
dobrze rozpuszczalne w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych. Do lipidów zaliczamy: tłuszczowce
właściwe (triacyloglicerole), fosfolipidy, glikolipidy, woski, izoprenoidy i sterydy.
Znaczenie biologiczne lipidów jest różnorodne: służą one jako materiał zapasowy (tłuszcze
właściwe) występują jako główny składnik błony komórkowej (cholesterol, fosfolipidy) i substancji
mielinowej nerwu (cholesterol), odgrywają istotną rolę w podstawowych funkcjach błon biologicznych,
takich jak: selektywny transport czy powstawanie potencjałów membranowych (fosfolipidy).
Do ekstrakcji lipidów zostanie wykorzystana wątroba, która jest głównym miejscem metabolizmu
lipidów, m. in.· syntezy kwasów tłuszczowych, triacylogliceroli i cholesterolu. Ponieważ prawie wszystkie
rodzaje lipidów rozpuszczają się całkowicie lub częściowo w tych samych rozpuszczalnikach organicznych
izolacja i rozdział poszczególnych lipidów z materiału biologicznego jest zadaniem trudnym. Pierwszym
etapem ćwiczenia będzie odwodnienie tkanki w metanolu, a następnie izolacja mieszaniny lipidów poprzez
przemywanie homogenatu eterem etylowym. Następnie należy wyizolować nierozpuszczalne w zimnym
acetonie fosfolipidy (kwasy tłuszczowe, triacyloglicerole, woski i sterole pozostaną rozpuszczone).
Uzyskany preparat lipidów zostanie poddany hydrolizie zasadowej (zmydleniu tłuszczów), której
produktem jest gliceryna oraz sole kwasów tłuszczowych (mydła). W reakcji H2SO4 z solami kwasów
tłuszczowych powstaną wolne kwasy tłuszczowe.
Ekstrakt lipidów, fosfolipidy, kwasy tłuszczowe oraz wzorcowe preparaty wybranych lipidów
zostaną rozdzielone metodą chromatografii cienkowarstwowej w żelu krzemionkowym.
II. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA
1. Struktura, właściwości i funkcja kwasów tłuszczowych i lipidów.
2. Budowa błon biologicznych.
3. Chromatografia adsorpcyjna i cienkowarstwowa
III. APARATURA I SZKŁO LABORATORYJNE
1. Homogenizator
2. Probówki wirownicze
3. Pipety pasterowskie (10 szt.)
4. Pipety (2 szt./ para 5 ml, 2 szt./ para 10 ml) + nasadki
5. Probówki (10 ml i 20 ml- 20 szt.)
6. Płytki szklane (10 x 20 cm)
7. Komory chromatograficzne
8. Cylindry miarowe (50 ml)
9. Rozdzielacz
10. Bagietka szklana
IV. ODCZYNNIKI
1. Chloroform
2. Eter etylowy
3. Eter naftowy
4. Aceton
5. Etanol
6. Metanol
7. Kwas octowy
8. Żel krzemionkowy
9. Roztwór soli fizjologicznej
10. 2 N H2S04
11. 1 N etanolowy roztwór KOH
12. Nasycony etanolowy roztwór MgCl2
13. 20 % r-r (NH4)2SO4 z dodatkiem H2S04 (wywoływacz)
14. Roztwór wzorcowy cholesterolu (10 mg/ml)
15. Roztwór wzorcowy kwasu linolowego (10 mg/ml)
16. Roztwór wzorcowy lecytyny (10 mg/ml)
UWAGA!!!
1. Podczas wykonywania ćwiczenia należy zachować absolutną ostrożność! Ze względu na stosowane łatwo
palne rozpuszczalniki organiczne używanie palników oraz innych źródeł otwartego ognia jest zabronione!
2. Zużyte lub niewykorzystane resztki rozpuszczalników organicznych należy wlewać do specjalnie oznaczonej
kolby szklanej, a nie do zlewu ! ! !
3. Ze względu na ograniczoną ilość wyciągów, w celu usunięcia nadmiaru rozpuszczalników z probówek
należy stosować odparowywanie w eksykatorach próżniowych. Czasami również stosuje się odparowywanie
rozpuszczalników w łaźni wodnej przy sprawnie działających wyciągach, jest to jednak postępowanie bardzo
niebezpieczne, szczególnie wtedy, gdy jest to rozpuszczalnik o niskiej temp. wrzenia i łatwopalny. Duże ilości
rozpuszczalników usuwa się stosując destylację.
V. WYKONANIE ĆWICZENIA
A. PRZYGOTOWANIE PŁYTEK Z ŻELEM KRZEMIONKOWYM
Płytkę szklaną o wymiarach 10 x 20 cm odtłuścić przecierając watą nasączona metanolem. Z 3 g
żelu krzemionkowego i 7 ml wody destylowanej sporządzić jednorodną zawiesinę i pokryć nią płytkę
szklaną. Po wysuszeniu utworzonej cienkiej, jednorodnej warstwy żelu zaktywować płytkę w suszarce
(105°C, 30 min.).
B. EKSTRAKCJA LIPIDÓW Z TKANKI ZWIERZĘCEJ
Pierwsza grupa Studentów rozpoczynająca ćwiczenie przygotowuje ekstrakt lipidów dla pozostałych
grup laboratoryjnych. 50 g wątroby umieścić w homogenizatorze z 50 ml metanolu. Homogenizować około
10 min. Następnie homogenat przenieść do 100 ml probówek wirowniczych i ogrzewać w łaźni wodnej o
temp. 60°C ok. 10 min (w trakcie ogrzewania homogenat należy kilkukrotnie zamieszać bagietką). Po
wystudzeniu w łaźni lodowej dodać 50 ml eteru etylowego i miesząc bagietką zawartość probówki przez ok.
10 min. w temp. pokojowej. Następnie odwirować (2000 obr./min, 10 min). Supernatant umieścić w
rozdzielaczu na 200 ml, dodać 50 ml soli fizjologicznej i 15 ml eteru etylowego. Całość delikatnie
zamieszać. Pozostawić do rozdzielenia faz. W przypadku słabego rozwarstwienia należy ponownie dodać
eter etylowy (10 ml) i powtórzyć poprzednie czynności. Zebrać górną fazę. Rozpuszczalnik oddestylować.
Do suchej pozostałości dodać 40 ml mieszaniny rozpuszczalników metanol : chloroform (1: 1). Otrzymany
ekstrakt należy oznaczyć "roztwór nr 1 ".
C. ROZPUSZCZALNOŚĆ LIPIDÓW
Do probówek zawierających po 2 ml rozpuszczalników organicznych (metanol, etanol, eter,
chloroform dodać kilka kropli oleju. Zaobserwować różnicę w stopniu rozpuszczalności tłuszczu w
poszczególnych rozpuszczalnikach organicznych.
D. TWORZENIE EMULSJI TŁUSZCZU W OBECNOŚCI EMULGATORA
Do 2 probówek zawierających po 4 ml wody dodać kilka kropli oleju. Do jednej z nich dodać 0,5 ml
roztworu mydła. Zawartość probówek silnie wstrząsnąć. Zaobserwować różnicę w zachowaniu się tłuszczu
w obecności i bez emulgatora.
E. OTRZYMYWANIE WOLNYCH KW. TŁUSZCZOWYCH
Do 10 ml probówki wlać 0,5 ml "roztworu nr 1" i odparować do sucha w eksykatorze próżniowym.
Do suchej pozostałości dodać 0,25 ml 1 N r-r KOH i 0,5 ml etanolu. Próbówkę przykryć folią aluminiową i
pozostawić do inkubacji w łaźni wodnej o temp. 40°C na 20 min. Po inkubacji zawartość probówki
odparować do sucha. Do pozostałości dodać 1,5 ml 2 N r-r H2SO4, miesząc przez kilka minut, a następnie
dodać 1,5 ml eteru etylowego. Górną warstwę zebrać do innej probówki za pomocą pipety pasterowskiej z
gumowym smoczkiem. Eterowy roztwór przemyć 1.5 ml wody destylowanej, tzn. dodać wodę, intensywnie
wstrząsnąć i zebrać eterową warstwę po rozdzieleniu faz do nowej probówki. Taką czynność należy
powtórzyć jeszcze raz. Na koniec odparować roztwór do objętości 0,5 ml lub mniejszej w łaźni wodnej o
temp. 40°C i oznaczyć "roztwór nr 2".
F. OTRZYMYWANIE FOSFOLIPIDÓW
1 ml "roztworu nr 1" umieścić w probówce wirowniczej na 10 ml. Rozpuszczalnik odparować do
objętości ok. 0,5 ml, próbę oziębić umieszczając probówkę w lodzie na 5 min. Dodać 5 ml zimnego acetonu
(wkraplając z jednoczesnym mieszaniem). Następnie dodać 2 krople nasyconego etanolowego roztworu
MgCl2. Probówkę pozostawić w lodzie na 5 min. Osad odwirować (10 min, 2 tys. obr./min), rozpuścić w 0,5
ml mieszaniny metanol : chloroform (1: 1) i oznaczyć "roztwór nr 3 ".
G. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA NA ŻELU KRZEMIONKOWYM
Na zaktywowana płytkę nanieść kolejno po 10 µl roztworów: nr 1, nr 2, nr 3 oraz roztwory
wzorcowe: cholesterolu, lecytyny, kwasu linolowego (po 5 µl). Chromatogram rozwijać w układzie
rozpuszczalników: eter naftowy - eter etylowy - metanol - kwas octowy (90:20:2:3). Po wysuszeniu płytek
na powietrzu, chromatogram wywołać stosując roztwór siarczanu amonu. Płytki umieścić w suszarce o temp.
150°C na kilka minut.
VI. WYNIKI I WNIOSKI
Zinterpretować uzyskany chromatogram
STĘŻENIE NORMALNE
Stężenie normalne jest to liczba gramorównoważników substancji zawarta (rozpuszczona) w
1 dm3 roztworu.
[gR/dm
3]
,
,
STĘŻENIE PROCENTOWE
Stężenie procentowe roztworu jest to liczba gramów substancji zawarta w100 gramach roztworu, wyrażona
w % (procentach)
STĘŻENIE MOLOWE
Stężenie molowe jest to ilość moli substancji rozpuszczonej w 1 dm3 roztworu.
[mol/dm
3]
Oznaczenia:
Cn – stężenie normalne [N]
Cp – stężenie procentowe
Cm – stężenie molowe [mol/dm3]
ms – masa substancji rozpuszczonej [g]
mr – masa roztworu [g]
ma – masa rozpuszczalnika [g]
z - liczba gramorównoważników substancji [gR]
gR - gramorównoważnik substancji
w – wartościowość
Vr - objętość roztworu [dm3]
M - masa molowa (mola) substancji [g/mol] ([g])
n – liczba moli [mol]
GĘSTOŚĆ SUBSTANCJI
[g/dm
3]
MIESZANIE ROZTWORÓW
Mieszanie roztworów o znanym stężeniu procentowym
Cp1 ǀCpx –Cp2ǀ (ilość jednostek masowych roztworu Cp1)
Cpx
Cp2 ǀCpx-Cp1ǀ (ilość jednostek masowych roztworu Cp2)
Mieszanie roztworów o znanym stężeniu molowym
Cm1 ǀCmx –Cm2ǀ (ilość jednostek objętościowych roztworu Cm1)
Cmx
Cm2 ǀCmx-Cm1ǀ (ilość jednostek objętościowych roztworu Cm2)
ZMIANA STĘŻENIA ROZTWORU (rozcieńczanie)
C1 – stężenie początkowe danej substancji
C2 – stężenie końcowe danej substancji
V1 – objętość początkowa danej substancji
V2 – objętość końcowa danej substancji