Chemia

Laborant Nr 3/201136

Otrzymywanie peptydów jest drogie z definicji. Zużywa się litry rozpuszczalników organicznych, a otrzymuje się zaledwie kilka miligramów czyste-go peptydu. Nie jest to ani ekonomiczne, ani zbyt przyjazne dla środowiska naturalnego. Czy istnie-je możliwość bardziej proekologicznej metody pozyskiwania tej grupy związków?

Peptydy należą do substancji o bardzo dużej aktywności biologicznej. Zwykle do wywołania spodziewanego efektu leczniczego wystarczą ilości miligramowe a w zastosowaniach dia-gnostycznych nawet mikrogramowe. Powoduje to, że przemysłowe otrzymywanie tych substancji równoważne jest ze stosowaniem skali gramowej, maksymalnie kilogramowej w skali świata.

Chemiczna synteza peptydów z powodzeniem udaje się naukowcom od ponad stu lat. Pierwsze polimery złożone z 3 reszt glicyny (Gly-Gly-Gly) otrzymał już w roku 1902 Emil Fisher. Od tego czasu z różnym powodzeniem otrzymuje się pepty-dy trzema niezależnymi sposobami. Jest to izolacja ze źródeł naturalnych, jako pierwszy etap otrzyma-nia biologicznie aktywnego związku chemicznego. Typowa synteza chemiczna oraz metody biolo-giczne, stosujące techniki inżynierii genetycznej to jednak jedne z najprężniej rozwijających się sposobów pozyskiwania peptydów. W związkach peptydowych postrzega się kandydatów na leki dla szerokiego wachlarza schorzeń. Do chwili obe-cnej największy sukces zdobyły leki hormonalne. W trakcie badań klinicznych jest jednak kilkadzie-siąt nowych molekuł o znaczeniu aplikacyjnym.

Metody otrzymywania peptydów

Izolacja ze źródeł naturalnych, synteza chemiczna

Proekologia w peptydach – w ogóle możliwa?

(synteza w roztworze, synteza na nośniku stałym) oraz synteza enzymatyczna to trzy główne sposoby pozyskiwania peptydów.

Trwająca już ponad pół wieku era sukcesów, ale i pasmo niespełnionych oczekiwań, otworzyło syn-tetyczne otrzymanie oksytocyny i wazopresyny przez Vincent du Vigneaud’a w roku 1954. Dzięki temu wzrosło ogromnie zainteresowanie chemią peptydów. Krokiem milowym okazały się jednak próby kotwiczenia pierwszych aminokwasów na stałym nośniku. W roku 1955 Nicholls z powo-dzeniem otrzymał kilka pochodnych dipeptydów przyłączając N-chronione aminokwasy do amino-kwasów zakotwiczonych na wymieniaczu jono-wym Dowex. Rozwinięciem tego podejścia było kotwiczenie pierwszego aminokwasu w sposób kowalencyjny. Kluczowym osiągnięciem okazał się sposób Merrifileda, polegający przyłączeniu C-terminalnego aminokwasu do nierozpuszczalnego nośnika. Metoda ta, zwana później od nazwiska twórcy, metodą Merrifielda została uznana po dwudziestu latach od opracowania na tyle ważna, iż twórca jej otrzymał w roku 1984 nagrodę Nobla. Właśnie metodą syntezy na nośniku stałym otrzy-muje się współcześnie peptydy w laboratoriach naukowych, ale i coraz chętniej w procesach ty- powo przemysłowych. Idea przyłączenia jednego z substratów do nierozpuszczalnego nośnika zo-stała zaadoptowana powszechnie przez laboratoria syntetyczne i jest coraz częściej postrzegana jako jedna z najbardziej proekologicznych metod syn-tezy. Synteza na nośniku pozwala na miniatury-zacje syntezy, czy stosowanie nadmiarów reagentów (jeśli trzeba). Nie bez znaczenia jest też możliwość ograniczenia do minimum kontaktu z odczyn-nikami. Najbardziej toksyczne związki można w sposób bezpieczny podawać np. mikropipetą lub zastosować automatyczne syntezatory peptydów.

Wojciech KamyszLaboratorium Syntezy Peptydów, Lipopharm.pl

Chemia

Urządzenia te, choć stosun-kowo drogie, zapewniają je-dnak bezpieczeństwo oraz po- wtarzalność wyników w przy-padku syntez cyklicznych.

Najważniejszą zaletą jest jednak uniknięcie etapów pośrednich, zwykle przeprowadzanych z uży- ciem ekstrakcji ciecz-ciecz. Pod- czas syntezy na nośniku nie-przereagowane reagenty oraz produkty uboczne usuwa się podczas zwykłego sączenia z użyciem naczyń ze spiekiem szklanym bez niepotrzebnej izo- lacji produktów pośrednich. Sto- pień acylowania bada się kolo- rymetrycznie z użyciem dostę-pnych testów na obecność wol-nych grup aminowych. W przy-padku testu pozytywnego reakcję prowadzi się dalej, w przypadku reakcji negatywnej przechodzi się do następnego etapu.

W ostatnich latach na syntezę na nośniku przeszedł też przemysł. Pomimo, że jest to proces odczynnikowo droższy niż syn-teza w roztworze, to daje wy-mierne efekty w zmniejszeniu kosztów pracy.

Synteza peptydów na nośniku stałym

Syntetyczne otrzymywanie pe-ptydów jest zwykle trudne dla niewprawionych chemików. Problemy pojawiają się zarówno na etapie syntezy, odczepienia od nośnika, ale przede wszystkim podczas oczyszczania surowych produktów. Sama synteza polega na chemicznym przyłączeniu pierwszego aminokwasu do nie-rozpuszczalnego polimeru oraz

www.czasopismolaborant.pl 37

cyklicznym przyłączaniu kolej- nych elementów (tj. amino-kwasów) i każdorazowej depro-tekcji grupy ochronnej blokującej budowany łańcuch peptydowy. Wszystkie reakcje związane z przyłączaniem kolejnych po-chodnych aminokwasowych, deprotekcji osłon ochronnych grupy N-α-aminowych oraz fi-nalnej deprotekcji prowadzi się w środowisku rozpuszczalników organicznych. W trakcie acy-lowania oraz przemywań stosuje się przeważnie dichlorometan oraz dimetyloformamid. Pod-czas odszczepiania peptydu od nośnika wraz z odczepieniem osłon łańcuchów bocznych wykorzystuje się rożne stężenia

kwasu trifluorooctowego, często w obecności tioli. Wszystkie wspomniane rozpuszczalniki stanowią duże zagrożenia dla środowiska naturalnego i należy je utylizować w wyspecjalizo-wanych firmach, a związki lotne absorbować na właściwych pochłaniaczach. Wysokie ceny unieszkodliwiania odpadów postsyntetycznych są związane głównie z obecnością rozpu-szczalników chlorowcopocho-dnych. Około 1/10 kosztów używanych do syntezy odczy-nników to właśnie utylizacja.

Alternatywą dla tych problemów jest możliwość syntezy w roztwo- rach wodnych, a pierwsze do-

Rys. 2. Schemat syntezy peptydów na stałym nośniku polimerowym (P – polimer/nośnik, R1, R2 – łańcuchy boczne aminokwasów, Fmoc – osłona grupy α-aminowej aminokwasów)

Laborant Nr 3/201138

Chemia

niesienia na ten temat pojawiły się już ponad 10 lat temu. Na chwilę obecną pozostaje racjonalna go-spodarka odczynnikami oraz próba optymalizacji każdego z procesów wchodzących w skład całej, często kilkudziesięcioetapowej syntezy.

Zmniejszenie nakładu energii związanej z miesza-niem żywicy (nośnika) i mieszaniny reakcyjnej, ale i potrzebnego czasu można zmniejszyć pop-rzez wykorzystanie wynalazku ostatnich lat jakim są nowoczesne syntezatory. Dużym udogodnie-niem jest bowiem prowadzenie etapów acylo- wania w reaktorach mikrofalowych. Dzięki wyko-rzystaniu promieniowania mikrofalowego można przyspieszyć reakcje nawet dziesięciokrotnie.

Oczyszczanie peptydów

Otrzymanie peptydów w postaci oczyszczonej jest procesem często bardzo trudnym. Zanieczyszcze-nia wchodzące w skład próbki to często bardzo po-dobne związki chemiczne. Dlatego wyodrębnienie czystego produktu pochłania więcej czasu i fun-duszy niż sama synteza. Obecnie najpopularniejszą metodą oczyszczania peptydów jest wysoko-sprawna chromatografia cieczowa w układzie faz odwróconych (RP-HPLC). Jako fazę stacjonarna stosuje się kolumny wypełnione krzemionką mo-dyfikowana łańcuchami alkilowymi (C8 lub C18). Jako eluent podaje się wodę oraz acetonitryl z do-datkiem 0,1% kwasu trifluorooctowego. Proces oczyszczania prowadzi się gradientowo stopniowo zwiększając udział acetonitrylu w fazie ruchomej. W skali laboratoryjnej, z wykorzystaniem typowe-go sprzętu analitycznego (HPLC z przepływem do 10ml/min), ale kolumną semipreparatywną można z powodzeniem oczyszczać jednorazowo ilości nawet do 200-500mg substancji. Odpowie- dnie frakcje analizuje się, a następnie po odparo-waniu acetonitrylu suszy sublimacyjnie z użyciem liofilizatora. Zarówno zlewki po oczyszczaniu jak i odparowywaniu frakcji z acetonitrylu powinny być utylizowane (kiedyś były powszechnie wyle-wane do kanalizacji!). Otrzymywanie peptydów w przemyśle niewiele różni się od skali laboratoryjnej. Stosuje się większe średnice kolumn (a więc i większe przepływy), a acetonitryl zastępuje się etanolem lub izopropanolem. Należy tutaj wspomnieć, że

roczne potrzeby niektórych peptydów (np. oktreo-tydu, despopresyny) w skali świata wynoszą zaled-wie 50-200kg.

Analiza peptydów

Peptydy zarówno w laboratoriach naukowych jak i przemysłowych analizuje się ten sam sposób. Czystość próbki określa się chromatograficznie, tożsamość potwierdza z użyciem spektrometrii mas. W analityce dominuje chromatografia cie-czowa RP-HPLC w układzie gradientowym woda-acetonitryl z detekcją UV, zwykle przy długości fali 214 lub 220m. Stosowanie wypełnień kolumn o klasycznej średnicy porów uziarnienia (100A) w zupełności wystarcza aby analizować nawet małe białka (do 5-6kDa). Często w trudnych przy-padkach wykorzystuje się też detektor masowy, który daje informacje o zawartych zanieczy-szczeniach oraz jednocześnie potwierdza masę cząsteczkowa kluczowego składnika.

W latach 90-tych próbowano wykorzystywać elektroforezę kapilarną (CE), jednak bez większych sukcesów. Obecnie CE, podobnie jak chromatografię jonową stosuje się do oznaczania przeciwjonów w peptydach.

Duże zasługi w określaniu struktury przestrze-nnej większych polipeptydów wnosi dwuwy-miarowy rezonans magnetyczny (NMR) oraz badania dichroizmu kołowego (CD). W praktyce przemysłowej jednak te analizy dotyczą pepty-dów zawierających więcej niż 20-30 reszt i nie są wymagane obligatoryjnie.

Przemysłowe podejście w syntezie

Zgodnie z powszechnie panującym trendem dotyczącym proekologii, przemysł daje wiele rozwiązań jak syntezować ekologicznie a zarazem skutecznie.

Osadzenie na stosowanych nośnikach powinno być maksymalne, w przypadku oligopeptydów nawet 3mmol/g. Same nośniki powinny być odzyskiwane, co możliwe jest w przypadku nośnika 2-chlorotri-

tylowego. Zużycie rozpuszczalników chlorowcopo-chodnych ogranicza się do minimum.

Wszelkie etapy syntezy powinny być zoptyma-lizowane, a pod uwagę powinny być tez brane takie czynniki jak zużycie energii elektrycznej oraz pracochłonność etapów (gdyż pracownik też kosztuje). W oczyszczaniu jako eluent powinno stosować się etanol, co pozostaje też w zgodzie z wytycznymi Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA). Niestety stosowanie tego elu-entu nie pozostaje bez wpływu na wzrost ciśnień podczas rozdziałów. Dużą rolę w oczyszczaniu przemysłowym odgrywa bardzo tania chromato-grafia jonowymienna oraz chromatografia metalo-powinowactwa. Umożliwia ona ograniczenie do minimum zastosowania rozpuszczalników orga- nicznych, a ilości oczyszczane jednorazowo na kol-umnie są nawet 2-5 krotnie większe niż na kolu-

mnie HPLC. Sama elucja z kolumny następuje w gradiencie soli nieorganicznej lub gradiencie pH.

Wielu ekspertów do niedawna skłaniało się ku po-szukiwaniu metod biologicznych wykorzystujących zdobyte osiągnięcia inżynierii genetycznej. Pozyskiwanie peptydów niesie jednak za sobą duże niebezpieczeństwa dla produktów farmace-utycznych, gdyż otrzymywane substancje zwy-kle zawierają ślady fragmentów drobnoustrojów, w których następowała nadekspresja, co wiąże się z opowiedzą układu odpornościowego w trakcie stosowania takich leków. W obecności zawartych też proteaz dodatkowo obniża się trwałość pre-paratów peptydowych. Jedyne co może zostać po syntezie chemicznej i klasycznym oczyszczaniu to ślady rozpuszczalników oraz eluentów, które w sposób bardzo prosty można kontrolować chromatografią gazową.

Chemia

www.czasopismolaborant.pl 39