Caracterización de proteínas G en Trypanosoma cruzi · Caracterización de proteínas G en...

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Tesis de Posgrado

Caracterización de proteínas G enCaracterización de proteínas G enTrypanosoma cruziTrypanosoma cruzi

Coso, Omar Adrián

1992

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasBiológicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Coso, Omar Adrián. (1992). Caracterización de proteínas G en Trypanosoma cruzi. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_2513_Coso.pdf

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A mi familia

no le dedico esta tesis

sino el gusto de trabajar

que de ellos aprendí

y que puede producir muchas cosas,

además de esta tesis

No soy buen matemático. pero quisiera hablar sobre algunosnúmeros que me han estado molestando los últimos años. Ellos sonel 0 y el 1.

Primero echemos un vistazo a 0. Nadie quiere ser un 0. Ser un 0significa ser nada o nadie. Ser "de última".

Por eso es que casi todo el mundoquiere ser número 1. Eso significa ser un ganador, ser excelente, estar en la cima del mundo.

No les resulta a Uds. extraña esta lógica de los números ?

Bien, yo opino que el problema con estos dos números es que,estan tan cerca, que se parecen.

Y no dejan espacio para la gente de verdad.

(Tomadodel monólogo inicial de Laurie Andersonen "Home of The Brave")

El maestro mediocre. dice.Un buen maestro, explica.Un maestro superior, demuestra.Y el verdadero maestro, inspira.

(A Florencio E.; Maestro antes que Dr.)

DESEO AGRADECER:

- A la Dra. Mirtha Maria Flawiá por la oportunidad de trabajaresta tesis en su laboratorio, por su comprensión y por todo loque junto a ella pude aprender.- Al Dr. Hector Norberto Torres por su constante apoyo verbalpara con estos experimentos, por mantener activo el INGEBIpese alas crisis económicas y por su parsimonioso buen humor.

- Al Dr. Alberto Rodolfo Kornblihtt por las horas de docenciacompartidas y. demas esta decir, disfrutadas, hayamosestado delmismo o de lados opuestos del "mostrador".

- A la Dra. Maria Teresa Tellez de Iñon (Tia Tere) por consejosvarios.—Al Dr. Gerardo Glikin por críticas, y esperanzas mutuas.- A1 Dr. Alejandro Paladini (jr ) "Amodel instituto" por sucolaboración directa o indirecta en el funcionamiento y/ooperación de casi todo aparato.- Al Dr. Luis Jimenez de Azua por sus contundentes palabras deapoyo, reforzadas por sus particulares verborragia y vocabulario.Tambienpor ser fuente de inspiración de alguna futura novela.- Al Dr. Alejandro Mentaberry.- A la Comision de Investigaciones Científicas de la Provincia deBuenos Aires.

— EN EL "GRUPO CICLASA":—A Alberto Diaz Añel por saber, calladamente, dejar con

stancia frente a sus pares de su confiabilidad para trabajar,discutir y convivir.

— A Jorge Prometeo Muschietti por Técnicas BioquímicasVarias, por el recíproco fluir de ladridos, por ser oreja (en elmejor sentido) y por haberme permitido cumplir con algo que miabuelo no ha podido.

—A mi querido compañero Horacio Martinetto, entre otrascosas, por no haber cumplido, al menos hasta ahora, con supermanente promesa de matarme.

—A Marisa Farber y Diego Fraidenraich.—A Marcelo ("Academia") Kazanietz, por poner un poco de

celeste y blanco en un laboratorio tan rojo.— A todos ellos pero especialmente al primero por su

colaboración en el laboratorio.

- Al equipo que ayuda a sostener todo esto aunque no firme ningunpaper: Norberto Malarini, Tito Contreras, Luis Acosta, NenéParodi, Maria Julia Alvarez, Leonor Acevedo, Irma Gelmi, GabrielPaissan, Marta Judewicz, Adriana Urman (la que zafó del Borda) yMariano Rodriguez (El Hombreque Volvió de la Muerte II).

—A mis compañeritos "de la primera hora":Andrés Muro: Porque nos vimos subir y bajar de los pedestales ingebianos y siempre buscamos la oportunidad para comentarlo.Fernando Bravo: Por mil y una preguntas respondidas con la mejorde las voluntades. Pablo Rabinowicz: Por aquellos relatos asombrosos. Mercedes Goin, Vivi Bernath, Betina Orman, AlejandroShijman (con "S" de entropía) y Patricia Levy-Yeyati.

- A Laura Moratinos, quien también pasó por "aquello"

- A las Ingenieras Nora Paños y Claudia Ochatt por su hospitalidad.- A la eméritas Rita Ulloa, Silvia Cabral y Sonia Lafón.—A los Jóvenes Anabella Srebrow ("la“ ayudante de mi últimocuatrimestre de cátedra . . . . ..por ahora), Gustavo Pesce, por lasganas envidiables (acompañadas por esa musiquita de vidriosrotos) que pone en el aula, en el laboratorio y en todo y mi cocromático Claudio Alonso.—A Dan Kaplan, Martin Vazquez, y Alfredo Panebra. A SandraOgueta, Pablito Nalz, Ximena Ares, Gaby Calamante, FlorenciaRodriguez y demás compañeros del INGEBI.

— A los que se fueron, al primer mundo, a otras realidades o allimbo y quien sabe cuando volveran: Javier Caceres, Leo Erijman,Enrique Mesri, Malala Gomez, Graciela Bianchini, Liliana Haim,Roxana Celnik y Alvaro Estevez de Azua.—A Clarita Rubinstein, Alejandra Mandel. Valentina Carricarte,Alejandro Gutman. Gabriel Aisemberg y Pedro de Mendoza.- A los profetas de los que a veces pude y otras no supeaprender: DannyAltschuler, Ricardo Attar, Erich Grotewold yGuillermo "Tacho" Taccioli: Tachito: Jamás olvidaré la "parábolade la bijouterie“.

—A los alumnos y a mis compañeros docentes de Genética Bacteriana, Introducción a la Biología Molecular y Celular,Regulación Metabólica e Ingenieria Genética; quienes tienenmuchísimo que ver en mi formación en estos años.

Por último, especialmente, a Edith (Diti. Emi) Kordon:

- Por su aún no asumida generosidad.

- Por la "serena seguridad" de apariciones fugaces peroclaves.

- Por saber 'jugar (y haberlo hecho conmigo estos últimosaños) aquello de hablar, escuchar, enseñar y aprender.

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INTRODUCCION

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INTRODUCCION - 2 —

SISIEMAS_DE_IBANSDHQQIQN_DE_SEEALES

Las células que conforman los seres vivientes estan formadas poruna serie de entidades moleculares rodeadas por un entorno acuosodelimitado por una bicapa lipídica a la cual se denomina membranaplasmática. La actividad de una célula esta determinada por distintas reacciones bioquímicas que ocurren en su interior. Muchasde ellas estan dadas en respuesta a señales externas a la célulaen si. Para que dicha señal sea reconocida por la maquinaria bioquímica interna debe existir un sistema que permita la transducción de esa señal a traves de la membrana.

Los diferentes organismos han desarrolado una serie deestrategias moleculares para transducir señales extracelulares(Figura 1; Bourne y De Franco, 1989).

Z

Cytoplasm

ExtracellularFluid

Sl 82 S3 S4 85 SG

Sl nos muestra el sistema mas simple en el cual la señal hormonales lo sufucientemente liposoluble comopara atravesar la bicapalipídica y encontrarse con un receptor en el citoplasma celular(Ej.: cortisol u hormonastiroideas).

Un receptor ubicado en la membranacelular puede transportarhacia el interior una molécula no liposoluble que se una a su

INTRODUCCION — 3

cara externa. Ese mecanismo (82 en la figura) se llama endocitosis mediadapor receptor y es la estrategia utilizada para internalizar colesterol transportado por lipoproteinas de baja densidad.

En algunos casos la llegada del mensaje a la cara externa delreceptor produce un cambio conformacional en el mismoque resultaen una actividad enzimática del lado interno de la misma molécula(83) comoocurre para los receptores de factores de crecimientocomo EGFy PDGFque por unión del ligando adquieren la capacidadde fosforilar residuos de tirosina (Y) en proteínas.

En sinapsis y uniones neuromusculares la llegada de la señaldirectamente regula la apertura (S4) de un canal iónico.

Las señales que regulan la forma celular (85) son componentes dela matriz extracelular que, por unión a un receptor de membrana,se conectan con componentes del citoesqueleto.

El 90% de las señales extracelulares que actúan a traves dereceptores estan acopladas a proteinas que unen e hidrolizan GTPllamadas proteínas G (86).

Las proteínas G pertenecen a un grupo muy amplio de proteínas conlas que comparten un diseño estructural común. Este grupo ha sidodenominado "la superfamilia de las GTPasas" (Bourne et a1, 1990).Cada una de estas proteinas posee la capacidad de cambiar suafinidad por distintas macromoleculas. Debido a esto actúan comotransmisores de información entre las entidades con las cualesinteraccionan. Todas ellas son activadas por la unión de GTP ydesactivadas por su hidrólisis, produciendo modificaciones conformacionales que cambian su afinidad por las distintasproteínas. Undeterminado estimulo externo provoca el reemplazo


del GDPresultante de dicha hidrólisis por una nueva molécula deGTPcon lo cual recomienza el ciclo. (Figura 2).

Membranaplasmática

Actividad fosfatasade la subunidad G.

H20

Reacción de intercambiode nuclcótido de la GDFsubunidad G.

Dimero GFGTPG .

Existen tres grupos principales dentro de la superfamilia de lasGTPasas:

—Los productos de los oncogenes y proto-oncogenesras, proteinas de peso molecular 21.000 aproximadamente.

- GTPasas que participan en la síntesis deproteínas por los ribosomas como el factor de elongación bacteriano, EF-Tu.

—Las subunidades a de las proteinas G heterotriméricas.

En esta introducción nos referiremos principalmente a este últimotipo y brevemente a los otros dos.

INTRODUCCION - 5 WWELa literatura cientifica publicada en el último decenio muestraun número aún creciente de sistemas en los cuales una señal externa es transformada en una reacción bioquímica en el interior_deuna célula para producir una respuesta fisiológica. Comoacabamos de ver en el esquema 86 de la figura 1 para que esosuceda debe existir una molécula receptora ubicada en la membranaplasmática que detecte la señal y la transfiera hacia el ladocitoplasmático. Se ve ademásI en el mismoesquema, la existenciade una entidad intermediaria que se encarga de interaccionar conla molécula efectora propiamente dicha. Estas etapas sonnecesarias para que 1a información a transmitir sea detectada,decodificada, amplificada, integrada y transformada en una señalbioquímica intracelular.

Dentro de este esquema las proteinas G son las encargadas detransducir la señal desde el receptor hasta el efector.

Tres tipos de subunidades con los siguientes pesos molecularesconforman las proteínas G:

—subunidades a: entre 39 y 52 kDa.- subunidades B: de 35 o 36 kDa.- subunidades 3: entre 6 y 10 kDa.

Hasta el momentose ha reportado la existencia de 20 subunidadesa distintas y un número menor de subunidades B y 3.

Las subunidades a poseen las siguientes caracteristicas generales:

- Localización en la membranaplasmática.—Un sitio de unión para nucleótidos de guanina.—Actividad GTPásica.

Capacidad de unir cationes divalentes como elMg2+al cual se une en condiciones fisiológicas

INTRODUCCION — 6 —

- Residuos específicos susceptibles de ser covalentemente modificados por el agregado de grupos ADP-ribosa apartir de NAD+.Esta reacción conocida comoADP-ribosilación escatalizada por toxinas bacterianas.

auhnnLdadeLQs

La subunidad aa de proteinas G fue la primera en ser descriptapor su capacidad de activar la adenilil ciclasa. Esta primeradefinición a nivel funcional (Rodbell et al, 1971a; Rodbell etal, 1971b) surgió al ver la necesidad de la presencia de GTPparala activación de la adenilil ciclasa por glucagón (actualmente sesabe que ao puede activar adenilil ciclasas a través de otrosagonistas como ACTH,LH, TSH, etc). Los resultados de Rodbellsugurieron la existencia de una molécula (ver "Adenilil Ciclasa”)capaz de transducir una señal desde el receptor hasta ese efector. Masadelante, se veria que esa actividad descripta por Rodbell estaba dada por una mezcla de dos polipéptidos a diferentes(de 45 y 52 kDa.) con subunidades B y 3 indistinguibles (Northupet al, 1980; Sternweis et al, 1981).

La puesta en práctica de las técnicas de clonado molecularpermitió aclarar el panoramasobre la identidad de las subunidades as. Diversos grupos aislaron cDNAsa partir de materialbovino o humano (Harris et al, 1985; Robishaw et al, 1986 a y b;Nukadaet al, 1986). Todas las proteinas codificadas por dichoscDNAs caen en dos grupos de 45 y 52 kDa.

A partir de una biblioteca de cDNAhumano se obtuvieron clonescorespondientes a las dos formas (Matera et al, 1986) .generadassegun sus autores por un mecanismode 'splicing alternativo. 4'cDNAs diferentes de la subunidad as de cerebro humano fueronencontrados (Bray et al, 1986), correspondiendo los nombres asLaaa, asa y asa a las proteinas de 394 (52 kDa), 395 (52 kDa), 379(45 kDa) y 380 (45 kDa) aminoacidos respectivamente. Dichaheterogeneidad fue adjudicada al uso alternativo de un exon y de


un sitio aceptor secundario para el splicing , dato que fue confirmado con el clonado a partir de una biblioteca genómica(Kozasa et al, 1988).

Si bien el gen de as parece ser un gen de expresión permanentedada la función que cumple la proteina existen reportes quemuestran que el tratamiento con glucocorticoides aumenta losniveles de mRNAde as (Chang et al, 1987) mientras que con etanollos disminuye (Mochly-Rosen et al, 1988). Existe ademas unaregulación específica de tejido: mientras cerebro e hígado contienen ambas formas (52 y 45 kDa), en eritrocitos sólo aparece laforma de menor peso molecular. De lo que se ha visto hasta ahorase desprende que aal sería la ao más expresada en diferentestipos de células.

A pesar de que ambas proteínas (45 y 52 kDa) interactúan demanera similar con 1a adenilil ciclasa, con las subunidades BSycon sus respectivos receptores, la velocidad de disociación delGDP de la forma de 52 kDa es alrededor de 2,5 veces más rápidaque la de 45 kDa. Esto implicaría que la activación de laadenilil ciclasa producida por la proteína de 52 kDa (aal) es másrápida que la llevada a cabo por la de 45 kDa (aa4) (Graziano etal, 1939).

Tanto a45 como a5: pueden ser ADP-ribosiladas por toxina delcólera, dicha modificación se produce en el residuo Arg-201 yprovoca una activación permanente de la adenilil ciclasa(Graziano et al, 1987) debida a la inactivación de la GTPasaendógena del complejo G.

Se ha comprobado que las 4 especies de as humanas pueden activartanto la adenilil ciclasa comocanales de Ca2+ (Brownet al,1988; Mattera et al, 1989). Esto muestra un nuevo rasgo de losmecanismos de transducción de señales ya que queda en claro quelas proteinas G no sólo pueden interactuar con diferentes receptores pasando la información a un solo efector, sino que tambiénactivan múltiples efectores ampliando —ycomplicando a la vez suestudio- las posibilidades de la transferencia de la información.


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ai fue originalmente conocida al estudiar la inhibición de laadenilil ciclasa en una línea celular, S49, que era deficiente enGa (Hildebrandt et al, 1983a y b). Más tarde. se identificó a Gicomoel primer sustrato de la acción ADP-ribosilante de la toxinade Bordetella pertussis, y se la caracterizó comoun heterotrimero con subunidad a entre 40 y 41 kDa (Bokoch et al, 1984;Codina et al. 1983).

El uso del nombre Gi (correspondiendo la "i" a inhibición de laadenilil ciclasa) es genérico y para emplearlo debe hacerse lasiguiente aclaración: nunca se ha demostrado, realmente, una acción inhibitoria sobre los niveles basales de dicha enzima, sinosólo una inhibición de la estimulación de la adenilil ciclasaproducida por Ga.

Estudios de clonado molecular revelaron que a diferencia de loque ocurre con Ga las tres distintas Giconocidas provienen detres genes distintos: au.(Nukada et al, 1986), ai: (Itoh et al,1986), y aaa (Jones et al, 1987). Tanto au.como ai: tienen unpeso molecular de 41000, mientras que aiz. 40000. Las secuenciasde aminoácidos deducidas a partir de los cDNAs muestran unahomologia mayor al 85%. Por experimentos de Southern-blot se havisto que cada uno de estos genes se encuentra como copia únicapor genoma haploide humano (Kaziro et al, 1991). Los tres tiposde Gi son sustrato de la ADP-ribosilación ya mencionada lo queresulta en un bloqueo de su actividad.

Tanto por experimentos de Northern-blot como por uso deantisueros contra secuencias específicas que permitan diferenciarlos tres subtipos, se encontró que au (41 kDa) está distribuidade modo mas heterogéneo, siendo mas abundante en cerebro yeritrocitos y que ai: (40 kDa) y ai: (41 kDa) aparecen en diferentes tejidos de modo mas homogéneo (Bray et al, 1987; Brann etal, 1988; Codina et al, 1988). El significado funcional de estadistribución no se conoce aún.

INTRODUCCION - 9

Ademásde su acción sobre adenilil ciclasa, se ha reportado(Yatani et al, 1988) que los tres subtipos de Gi son capaces deactivar canales de K+en músculo atrial con la misma potencia.indicando esto su multifuncionalidad. Debidoa esta actividad selas ha bautizado tambien como Gk (Yatani et al, 1987) y asi se laencuentra en diversas citas bibliográficas.

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Intentando purificar Gi de cerebro bovino dos grupos descubrieronen forma casi simultanea Gao, la cual mostró tener las características de una proteina G y ser también sustrato de la toxinade B. pertussis (Sternweis et al, 1984)(Neer et al, 1984). Esta"otra" proteina (por eso llamada Gao), resultó tener un pesomolecular de 39000, y ser la responsable de la altísima actividadde binding de GTPX[3SS]en cerebro.

La subunidad Gao es una de las principales proteínas de membranaen el tejido nervioso y constituye aproximadamente el 1%de laproteína de membrana (Asano et al, 1987). Esto sugiere que Goestaría involucrado en funciones que se encuentran altamente expresadas en cerebro. Sin embargo, su distribución no es homogéneaya que es más abundante en corteza, tálamo, hipotálamo y cerebeloque en médula. También se lo ha reportado en retina (Terashima etal, 1987)

La secuencia codante completa de Gao ha sido reportada (Jones yReed, 1987; Van Meurs et al, 1987) y tiene una homologia del 82%(73% de identidad) con Gan y menor con la otras Ga. Se hareportado tambien el clonado de una variante de ao. producida porel splicing alternativo de un mensajero primario (Hsu et al,1990; Murtagh et al, 1991).

Nose conoce a ciencia cierta la función de ao, pero existen algunos datos experimentales de reconstitución que han mostrado queGao es incapaz de interactuar con los componentes del sistema deadenilil ciclasa (Roof et al, 1985; Katada et al, 1986b) pese a

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que en otros sistemas Gao y Gai funcionan de modo similar (Bockaert et al, 1990). La evidencia de que no interacciona con laadenilil ciclasa (comosí lo estaban las hasta ese momento conocidas as y ai) asi comosu localización en cerebro, produjo ungran impacto entre los estudiosos del tema ya que planteaba laposibilidad de un papel mucho más amplio de la familia deproteinas G.

Distintos experimentos de reconstitución heteróloga han mostradoque Goestaria involucrada en el enlace bioquímico de:

- receptores quimioatractantes y fosfolipasa C bloqueadapor toxina de B. pertussis (Kikuchi et al, 1986)

- receptor adrenérgico a2 (Cerione et al, 1986)- canales de Ca2+ regulados por opiodes (Hescheler et al,

1987)—estimulación de 4 canales distintos de K+ (Van Dongen et

a1, 1988)—incremento del Ca2+ intracelular luego de la inyección en

ovocitos de XEnopuslaevi activando a la enzima fosfolipasa C(Moriarty et al, 1990).

Snbnnidadea_aq

Durante un tiempo se estudió la posibilidad de la participaciónde proteinas G en la transducción de señales a las fosfolipasas Casociadas a membranaplasmática. Dichas sospechas estaban basadasen hechos comola activación de esta por nucleótidos de guanina(Cockcroft et al. 1985), su estimulación por agonistas en un mododependiente de GTP y la capacidad de los análogos nohidrolizables de GTPde mimificar ese efecto (Smith et al, 1985).Moriarty y colaboradores (Moriarty et al, 1988) aportaron un datointeresante sobre la existencia de un heterotrimero análogo alque participa de la transducción de señales a adenilil ciclasa almostrar que altas concentraciones de 9%bloquean la estimulaciónde fosfolipasa C por el agonista.


La sensibilidad de dicho camino a la acción de toxinas bacterianas ha sido reportada en trabajos contradictorios. En 1989,se mostró la existencia de dos vias que comunican distintosreceptores a la hidrólisis de fosfoinosítidos dentro de una mismacélula, siendo una via sensible y la otra insensible a la acciónde toxina pertussis (Ashkenazi et al, 1989).

En 1990 fue purificada una proteina de cerebro de rata cuyo pesomolecular resultó de 42 kDa.. Dicha proteína mostró tener laszonas consenso de proteinas G y no ser sustrato de ADPribosilación por toxina pertussis (Pang et al, 1990) y fuebautizada aq. Por clonado molecular fueron encontradas variasnuevas subunidades Ga (Strathmann et al, 1989). Una de ellas(all) difiere solo un 12 Z en secuencia aminoacidica con respectoa aq y ambas son idénticas a la proteina de 42 kDa. ya mencionada.

En experimentos de reconstitución, aq aisladas de distintostejidos resultaron estar involucradas en la regulación de la actividad de PLC-BI pero no de los isotipos PLC-8 o PLC- (Smrckaet al, 1991; Blank et al, 1991).

Otros tres isotipos pertenecientes a la familia aq han sido encontrados en distintos tipos celulares. Se ha postulado que estosnuevos miembros llamados a14, als, y als interactuen con distintos miembrosde la familia de las fosfolipasas (Simon et al,1991).

SsibnnidadethWEn los segmentos externos de los bastones (células de la retinaparticipantes del mecanismo de vision) existe una proteína Gheterotrimérica involucrada en la transducción de las señalesvisuales. Su subunidad a tiene un peso molecular de 39 kDa (Fung,1983; Yamazakiet al, 1987) y tiene la particularidad de no estarasociada a la membranacelular sino a la membranade los discos(ver mecanismode visión). representando hasta el 50%de las

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proteínas solubles o debilmente asociadas a membranasen su tipocelular (Chabre y Deterre, 1990). Es ADP-ribosilable por lastoxinas cólera y pertussis y su molécula efectora es la Fosfodiesterasa de GMPc.

Su estructura no difiere de otras G a tal punto que anticuerposanti-ai reconocen a: y que sus subunidades B son idénticas a lasde aa y ai (Codina et 31,1986). Muchas de las cosas que actualmente se saben de la bioquímica de las proteínas G fué observadoprimero en la transducina.

WLMUna proteina G nueva ha sido recientemente caracterizada (agustducina) por clonado a partir de tejidos especializados en elsentido del gusto (Mc-Laughlin et al, 1992). Su expresión selimita a aquellas zonas de la lengua involucradas en el sentidodel gusto. Su estructura la asemeja muchoa las transducinas deconos y bastones. Sus últimos 38 aminoácidos son idénticos lo queindica que gustducina podria interactuar con receptores para luzcomorodopsina. La presunción de que gustducina transduce señalesde gusto, de un modosimilar al cual emplea transducina paratransducir señales lumínicas, esta apoyada por el hecho de quepodría tener comoefector la Fosfodiesterasa de AMPc.

Snbnnidadeuou

Muchos datos han sugerido que AMPces el segundo mensajero en laactivación de neuronas del sistema olfatorio (Lancet y Pace,1987). La respuesta a olores es especifica de tejido y de ligandoy dependiente de GTP, como se esperaría para una enzimageneradora de segundos mensajeros acoplada a una proteina G. Hasido aislado y secuenciado un cDNAespecífico de neuroepitelioolfatorio que codifica para una proteina Gas-like (Jones y Reed,1989). Dada su expresión aparentemente limitada a neuronas ol


fatorias, fue bautizada Gaolí. La proteina aolf tiene 381 aa y un88%de identidad con aaa. Expresión de Gaou en células cyc- dellinfoma S49 permitió restituir la estimulación de adenililciclasa a través del receptor B-adrenérgico y en presencia deGTP-X-S o NaF, lo cual confirma que puede funcionar como Gas. Sudistribución particular lleva a pensar que esta proteína podríajugar un papel en la transducción de señales olfatorias aunque eneste caso lo haría a traves del aumento de los niveles de AMPcadiferencia de gustducina.

WKAunquelas proteínas G contienen tres polipéptidos, pueden considerarse dímeros funcionales, ya que las subunidades B y X solose disocian por desnaturalización y actuan juntas, como unaunidad.

El principal rol conocido de estas subunidades seria el modularla actividad de las subunidades a.

Contrastando con la diversidad que se ha observado para distintassubunidades a y la cantidad de datos obtenidos sobre ellas. menosse sabe de la naturaleza y variedad de las subunidades BSque lasacompañan. Estudios llevados a cabo para medir la actividad de HXsugieren que estas son funcionalmente intercambiables entre distintas proteinas G. (Katada et al. 1984; Neer et al, 1984)

Existen al menos dos formas de la subunidad B (BI de 36 kDa. y BZde 35 kDa), codificadas por distintos genes (Amatruda et al,1988) las cuales presentan diferencias inmunológicas peromuestran una gran homologia a nivel de secuencia. Rastreandobibliotecas de cDNAde retina humana y bovina, fue aislada unatercera forma de 37 kDa. codificada por un gen no alélico con losotros dos (Levine et al, 1990). Existiria una cuarta formaabundante en cerebro y pulmón pero escasa en otros tejidos (vonWeizsacker et al, 1991).

INTRODUCCION - 14

Hasta el momentose han clonado 5 G3 distintas: El de retinabovina (Hurley, J B., 1984), 32 de glandula adrenal y cerebrobovino (Robishaw et al, 1989), 33 tambien de cerebro bovino, X4de retina y riñon murino (Gautam et a], 1990) y 35 de hígado yplacenta humanos (Fisher y Aronson, 1992)

Las subunidades B y X estan firmemente asociadas a membranas encasi todos los tejidos en que se las ha estudiado con excepciónde retina, y solo pueden ser solubilizadas desensamblando la membrana con detergentes. No se ha reportado que la entidad 63 unamoléculas pequeñas o metales pesados.

El agregado de 83 libre puede resultar en inhibición de la actividad de adenilil ciclasa previamente activada via Gas (Northupet al, 1983). En neutrófilos. un exceso de BBlibre resulta ensupresión de la actividad de adenilil ciclasa (Bokoch, G.M.,1987). Inicialmente se propuso que esa inhibición era producidapor el secuestro de subunidades a por el exceso de BB, sin embargo en 1986, Katada propuso la existencia de un mecanismo aindependiente.

Dos trabajos recientes (Federman et al, 1992 y Tang y Gilman,1991) muestran la influencia de las subunidades B y 3 sobre laactividad de adenilil ciclasa. El primero de elos indica que bajociertas condiciones B y X provenientes de la disociación de otrostrímeros como el de Gai pueden estimular adenilil ciclasa II siesta es previamente estimulada por Gas. Tang y Gilman obtienen elmismo resultado y ademas ven inhibición de la actividad deadenilil ciclasa I mediada por el dímero 83.

Otro efecto directo de Bbsobre efectores ya reportado, es la activación de fosfolipasa A2de retina para producir ácido araquidónico (Jelsema y Axelrod, 1987). Actualmente se estaestudiando la influencia del dímero sobre la actividad de fosfolipasa C-X (Sue Goo Rhee, comunicación personal).

INTRODUCCION - 15 WYWWMMLos sistemas de transducción de señales mediados por proteínas Gheterotriméricas estan difundidos entre una amplia gama de seresvivos. Lo conveniente de estos sistemas es que poseen lassiguientes características sobresalientes: direccionalidad yamplificación.

La direccionalidad esta dada por la actividad GTP-ásica; lahidrólisis irreversible del GTPimpide que el ciclo funcione enreversa entre efector y receptor. Esto es lo que diferencia aeste proceso del alosterismo en el cual la inactivación se da porun proceso inverso a la activación. En el caso de las proteínas Gpara volver al estado unido a GTPdebe existir una nueva interacción con el receptor (Heideman y Bourne, 1990).

La amplificación se da por dos mecanismos: Por un lado, la activación de una molécula de receptor puede activar muchasproteínas G, tal como sucede en el mecanismo de visión en que unarodopsina fotoactivada, activa 500 moleculas de transducina (Fungy Stryer, 1980).

El segundo mecanismo esta dado por el hecho de que la moléculaefectora, produce muchas moléculas de segundo mensajero antes deque la proteína G que la regula, se inactive por hidrólisis deGTP. Este fenómeno se produce aunque el receptor active una solaG y puede durar mas tiempo de lo que dura la interacción ligando—receptor.

La Figura 3 muestra como el "factor de amplificación" (10!)aumenta 5 o 6 ordenes desde la llegada de la señal hasta que seproduce la respuesta celular.


1

7. CHANGE INCELLBEHAmHRELEASE OF GLUC(

1.HRST ' ' " xMESSENGER /"—‘ÏSÁ -*

EPINEPHRINE fi a E(AAÏD'PE E 5.55MBTRIPHOSPHATE) ‘

6.ENZYMÁT'CCASCADE

El mecanismogeneral por el cual ejercen su acción las proteínas


G heterotriméricas está esquematizado en el siguiente dibujo(Figura 4):

«¿- ena 1%De no mediar ninguna estimulación de por medio, las evidenciasindican que las proteínas G se encuentran comotrímeros unidos aGDPconformando el complejo inactivo a-(GDP)BB. Esta forma es laque se une al receptor activado (3*). La activación se producepor unión del agonista pal receptor y cataliza el intercambio deGDP por GTP. El complejo a-(GTP)58 se separa del receptor activado (R*) el cual puede provocar la entrada de GTPa otrotrímero. Inmediatamente, a-(GTP) se separa de BEy se une alefector, el cual pasa a su forma activa (E*). Dicha formaresponde produciendo moléculas del segundo mensajero (A-——>B)(sise trata de un efector enzimático). Toda subunidad a tiene una

INTRODUCCION - 18

actividad GTP-ásica intrínseca que transforma a-(GTP) en a-(GDP).Esta segunda entidad ya no puede seguir estimulando al efector,por lo tanto se libera de él y se reúne con un dimero 83 libre.El heterotrímero reconstituido esta asi listo para iniciar otrociclo.

Se ha desarrollado un modelode la estructura tridimensional delas subunidades Ga basado en las estructuras de la proteína Ras ydel factor de elongación TU (de Vos et al, 1988 y Jurnak st al,1985). Entre los productos p21 de los oncogenes ras y este factorinvolucrado en la síntesis protéica se han identificado 4regiones altamente conservadas en la secuencia primaria (Hallidayet al, 1984) a las que se las llamó A, C, E y G (Figura 5).

Zonas deHalllday A ' - c G lNHa(:-:-:-:-::Ï’COOH

IToxlna ToxlnaCólera Formula

Esas mismas regiones están conservadas entre todas las Ga y sonlas que les confieren las características comunesa la familia delas GTPasas, mientras que las zonas en las cuales las secuenciasdivergen, estan involucradas en las funciones particulares decada una de ellas‘

INTRODUCCION - 19

Existe un modelo esquemático de como se ordenarian espacialmentelos distintos dominios de las proteinas Ga, basado en lacristalografía de EF-Tuy de p21ras (Masters et al, 1986), elcual no representa a ninguna Ga especifica sino que pretende serun "promedio" (por eso se lo llama Gapto) de lo que serian lasestructuras de las distintas Ga. En la Figura 6 se ve como esemodelo ubica espacialmente las 4 zonas de Halliday y el lugar queocupa la molécula de GTP.

lun

La region A forma un rulo que se ubica cerca de los fosfatos a yB del nucleótido. Esta región estaria involucrada en laregulación (y quizás en la catálisis) de la hidrólisis del GTPunido. La secuencia de aminoacidos GXXGXGKSesta presente enmuchas proteinas que unen GTPy en particular en las proteinas Gase ajusta a GAGESGKS.En p21ra9 la mutación que reemplaza a la

INTRODUCCION - 20

glicina de la posición 12 (correspondiente a la glicina 49 deGapro) por casi cualquier otro aminoácido puede provocar latransformación maligna de fibroblastos (Seeburg et al, 1984). Lamisma mutación tambien inhibe la capacidad de la proteína Ras dehidrolizar GTP(Barbacid, 1987).

La región C (DXXG)en EF-Tu está compuesta de una lámina B conectada por un rulo a una hélice a. Un residuo de aspartato (D) enla lámina B (correspondiente a Asp227 en apro) interactúa con uncatión Mg++(Pai et al, 1990) el cual a su vez esta coordinadocon los fosfatos del GDP.El protón de la glicina (G) formaría unpuente de hidrógeno con el fosfato 8 del GTP. La conformación deesta zona es muydiferente dependiendo de que la molécula esteunida a GTP o GDP.

Los cambios conformacionales asociados a la unión a GTPo GDP sehan visto claramente al obtener formas cristalográficas de p21rasunidas a esos nucleótidos (de Vos et al, 1988; Pai et al, 1989).El mas claro se ve en la región comprendida entre la Asp39 y laThr74 (Jurnak et al, 1990).

La región E contiene aminoácidos hidrofóbicos (FXAAL)Y Junto ala zona G (NKXD)forman un bolsillo en el cual se ubica el anillode guanina; este bolsillo "a medida" es lo que confiere a laproteina especificidad de nucleótido. Los oxígenos del carbonodel aspartato (D), interactuarían con el grupo 2-amino del anillode guanina y los protones de asparragina (N) y lisina (K)estabilizarian la unión. Mutacionesen ese aspartato conservado(Asp297 en apto) impiden discriminar entre GDPe IDP (Sigal etal, 1986).

El aspecto general que ofrece apto es el de un núcleo en el cualqueda delimitado el bolsillo donde se ubica el nucleótido y zonasperiféricas involucradas en la interacción con los componentesubicados antes y después en la cadena de transmisión de la señal.

El extremo amino-terminal de las subunidades Ga es el que se encargaría de interactuar con B y X, dado que por proteólisis de

INTRODUCCION — 21

ese extremo se pierde esa propiedad (Neer et al, 1988) (ver tambien: Modificaciones Post-Traduccionales). La interacción con elreceptor estaria dada por el otro extremo de la molécula.Anticuerpos dirigidos contra el extremo carboxi-terminal de algunas Ga también bloquean la interacción con receptores (Dereticet al, 1987).

Las interacciones Ga-efector han sido estudiadas mediante la construcción de subunidades Ga quiméricas, los resultados parecenindicar que la zona carboxi-terminal sería la que determinaespecificidad de efector (Masters et al, 1988; Osawaet al, 1990;Gupta et al, 1990). En estas subunidades Ga los residuos 236-356de as comprenden el menor segmento lineal requerido para la activación de adenilil ciclasa (Berlot y Bourne, 1992). Dentro deesos 121 aminoácidos, los autores encuentran cuatro regiones quepor mutación previenen la activación del efector. Noexiste información disponible sobre las zonas determinantes de activacióndel efector en otras Ga, pero las similitudes en estructuraprimaria sugieren que comparten una estructura tridimensionalWWEn líneas celulares clonadas usando distintas sondas se han encontrado en la misma célula mRNAspara Gas, Gail, Gaia, Gao, Gaz,Gaq y Ga11 (Simon et al, 1991). La diversidad de las subunidadesB y 3 (4 y 3 respectivamente encontradas tambien en célulasclonadas) asi comola posibilidad de que exista intercambio entrelas BSasociadas a distintas Ga apuntan a que el dímero tendríauna importante función en la integración de los varios circuitosmediados por G. Mas aún, si todas estas subunidades se pudiesenasociar de modo azaroso, habria casi cien distintas Gheterotriméricas que podrían interactuar con un númerosimilar dedistintos receptores, potenciando la utilidad del sistema.

Si bien parece probable la existencia de estas redes o "G-proteinnetworks", la reunión combinatoria de distintas subunidades G no

INTRODUCCION - 22

se da totalmente al azar. Experimentos de reconstitución hanmostrado la afinidad diferente de Gas, Gai y Gat por distintosdimeros ax (Casey et al, 1989 y Konhken et al, 1989). El mododiferente de eluir de una columna de agarosa-Bx por parte de distintas Ga, lleva a la mismaconclusión (Pang et al, 1989). Partesdel sistema intracelular podrian servir de escudos para impedirel "diálogo" entre distintos caminos de transducción. Existenevidencias de compartamentalización de sistemas (Strittmatter etal, 1990) y ademas se han reportado ubicaciones intracelularesdistintas para Gaiz y Gaia (Ercolani et al, 1990). Por otro ladosubunidades Ga comoGaia y Gao activadas por distintos receptoresy con distintos efectores, pueden interactuar con otros efectorescon menor afinidad, lo cual habla en favor de la existencia deredes.

Futuros estudios llevarán a la luz hasta que punto podrian interaccionar distintos caminos de transducción de señales mediadospor proteinas G pero ya existen ejemplos en sistemas descriptostales comoel aprendizaje asociativo en Aplysja el cual esmediado por múltiples caminos G (Volterra et al, 1988).

anggenmLG

La aparición de oncoproteinas G fué anticipada hace ya unos años(Bourne, 1987; Mc Cormick, 1989). La idea de que mutaciones activantes de proteinas G pueden causar transformación celular escoherente con los diversos datos acumulados gue relacionan alsistema con eventos como la diferenciación o proliferacióncelular.

La primera evidencia directa en ese sentido fue el descubrimientode mutaciones en la subunidad Gas en un tumor pituitario (Landiset al, 1989). Estas mutaciones caen en dos sitios: Arg-201 y Gln227. El primero es el sitio de ADP-ribosilación por toxina delcólera y el segundo equivale a la Gln-Gl de ras-p21. Ambasdestruyen la actividad GTP-ásica intrínseca de Gas manteniendola

INTRODUCCION — 23

en su estado activo unida a GTP.

Buscando en forma sistemática en distintos tumores mutaciones queinhibieran la actividad GTP-ásica se encontró un nuevo grupo demutantes (Lyons et al, 1990). Algunos tumores de corteza adrenalmostraron mutaciones en Gaia.

Mutaciones que activan Gac resultan en un aumento de los nivelesde AMPcintracelulares mientras que mutaciones en Gaia los disminuyen. El hecho de que la mutaciones en Gao y Gaia sean muyrestringidas y no se superpongan, implica que estas proteínas Gno transducen la señal mitogénica de un modogeneral sino quecumplenpapeles especificos en cada tejido (Cantley et al, 1991).WWWWLa reacción de ADP-ribosilación es una modificación proteicaampliamentedistribuida en la naturaleza. La trasferencia de ungrupo ADP-ribosa a partir de NAD+como sustrato es parte de unmecanismomolecular diseñado para modular la estructura y la actividad de distintas proteinas (Ueday Hayaishi, 1985)

En vista de la importancia de las proteínas G en la transducciónde señales y en la regulación de caminos metabólicos no es sorprendente el hecho de que alteraciones en su función sean lacausa de enfermedades. En particular, dos bacterias producen enfermedades en el hombre mediante la acción de toxinas por ellasproducidas. La ADP-ribosilación de Gs y Gi produce finalmentealteraciones en los contenidos de AMPccelulares. Paradojicamenteeste fenómeno que tanto ha dañado a muchos individuos de laespecie humana, provee por otro lado una herramienta para elestudio de las proteinas G.

La toxina de Bordetella pertussis bloquea la inhibición de la actividad de adenilil ciclasa mediante la adición covalente de un

INTRODUCCION - 24

grupo ADP-ribosa a Gai.

La toxina pertussis es una proteína oligomérica de 117 kDa. comPuesta por 5 subunidades 81-85 de pesos moleculares 28, 23, 22,17 y 9,3 kDa. respectivamente (Tamura et al, 1982). El componenteB o componente de binding tiene la forma [(Sz-S4)(Ss)(Sa-S4)]. La

actividadessubunidad 81 es el componente funcional (A) y poseede ADP-ribosiltranferasa y NAD-glicohidrolasa (Tamura et al,1982; Katada et al, 1983).

latente y debe ser,La actividad de la subunidad Sl in

vitro es activada por incubación previa conditiotritol (DTT)(Moss et al, 1986).

El NAD+está formado (Figura 7) por una ADP-ribosa unida medianteun enlace de alta energia a un grupo nicotinamida (Zatman et al,1963; Ueda et al,la ADP-ribosa a un aceptor como H20 o una proteina.

1985). La toxina cataliza la transferencia de

H

ProteínaGa.)“(CH2)3_ N\ (43 ¡aC=NH2 + NADV/

lfiN

(MI OH

Derivado ADP-ríbosílado de un residuode arginina cn la proteína GM

INTRODUCCION - 25

Los sustratos clásicos de esta toxina en el laboratorio hanresultado ser: Gai, Gao y Gat. El sitio de modificación es unaminoácido (Cys) ubicado cerca del extremo carboxi-terminal. comose ha visto en el nonapéptido Glu-Asn-Leu-Lys-Asp-Cys-Gly-Leu-Phe(West et al, 1985).

La toxina del cólera (cuyo componente activo es llamado"Colerágeno") es el producto secretorio de Vibrio choleraeresponsable de la diarrea producida en los pacientes coléricos.Su efecto bioquímico es la activación permanente de Ga y consecuentemente de la enzima adenilil ciclasa que resulta en unaumento drástico de los niveles de AMPc. Dicha modificaciónderiva en una alteración del flujo iónico de las membranas decélulas intestinales y finalmente en el síndrome señalado.

Esta toxina tambien es un oligómero y esta compuesto por una subunidad A (84 kDa.) y cinco subunidades B (11,6 kDa.) asociadas demodono covalente (Gill, 1976).

El pentámero B es responsable de la unión de la holotoxina a lasuperficie celular interaccionando con un monosialogangliosido(GMI) (Richards et al, 1983; Kanfer et al, 1973).

La subunidad A esta compuesta por dos cadenas unidas por unpuente disulfuro (A1 de 23,5 kDa. y A2 de 5,5 kDa.) y la actividad catalítica residente en A1se activa químicamente contioles en el laboratorio o por una enzima (proteina disulfurotiol reductasa) presente en muchascélulas animales (Moss et al,1980). La formación de A1 libre es el paso que determina lavelocidad de la reacción (Chang et al, 1983).

La acción de esta toxina se efectúa sobre muchasproteínas y sela ha visto correlacionada con la cantidad de residuos argininapresentes (Moss y Vaughan, 1978). La reacción crítica quedetermina la activación de adenilil ciclasa y la intoxicación decélulas de la mucosa intestinal, que desemboca en la conocidadiarrea, es la ADP-ribosilación de Gao (Northup et al. 1980). Entransducina se ha identificado a la arginina blanco por digestión

INTRODUCCION — 26

tríptica en el péptido Ser-Arg-Val-Lys. Esa arginina (ArgZOl)esta conservada en todas las Ga que son sustrato de ADPribosilación por toxina colérica.

Se ha visto en elgunos reportes que la trasferencia de ADP-ribosade NAD+a Gas requiere además de la catálisis por la toxina delcólera, de la colaboración de una proteína de 21 kDa. llamadafactor de ADP-ribosilación (ARF) (Kahn, 1990). La mayoria de lasmoleculas de ARFestan presentes en el citosol aunque tambien selo ha purificado de membranas (Kahn et al, 1988).

La caracteristica saliente de ARFes que se trata de una entidadcapaz de unir GTP. La secuencia de su CDNAcompleto ha sido obtenida (Sewell y Kahn, 1988) y se han encontrado homologías significativas con proteínas de las familias Ga y ras; sin embargoninguna de las otras proteínas de 21 kDa. que unen GTP hanmostrado actividad ARF(Kahn, 1990). También se le ha asignado unrol en la formación de vesículas controlado por la hidrólisis deGTP(Serafini et al, 1991).

a .1 .5

Por expresión de los cDNAcorrespondientes en células en cultivose ha visto que las subunidades Ga clásicas, excepto as (ai, ao yat) sufren miristoilación en sus extremos amino-terminales (Joneset al, 1990; Mumbyet ¿1,1990). La capacidad de Gao expresada enE. coli de interaccionar con subunidades HXes dependiente de lacoexpresión de una N-miristoil-transferasa en las mismascélulas,lo cual sugiere que esta modificación post-traduccional es importante para dicha interacción (Linder et al, 1990 y 1991).

Todas las subunidades x son modificadas por el clivaje de lostres aminoácidos del extremo carboxi-terminal adjacente acisteína y por la carboximetilación e isoprenilación de dichacisteína (Clark et al, 1988; Gutierrez , 1989). El isotipo GX;(que se encuentra asociado a fotoreceptores) forma complejos inactivos con B si no esta isoprenilado (Fukada et al, 1990) lo

INTRODUCCION - 27

cual indica que dicha modificación post-traduccional podría estarinvolucrada en la regulación de la transducción de la señal.

Subunidades E extraídas de cerebro también resultaron serisopreniladas aunque por una entidad de 20 carbonos en vez de 15comoen el caso anterior. Tal adicion sería la responsable delanclado de la subunidad X a la membranacelular (Yamane et al,1990; Mumbyet al, 1990).

ReceptorNH2

EXTRACELLULAR :‘j':-:—:-:-:-:-:-:-:-:———

/ :ï:Í:Í:ï:ï:ï:ï:ï:ï:ï:ï:

/ ZZZZZZÍ:.':Í:Í:Í:Í:Í:I:Í

/ :ï:Í:Í:Í:ï:f:f:f:f:f:f:

x ïiïifzïz}:f:}:ff:f:f:}

INTRACELLULAR c=o ‘cl:=o s' 132¿1¿2¿2¿I¿Z¿2:2:2;2¿2

Effector

G Protein

INTRODUCCION - 28

Se han identificado mas de 100 receptores acoplados a proteinas Gen mamíferos, si se incluyen diferentes receptores que unen almismo ligando. El número de estos aumenta rapidamente gracias alas técnicas de clonado molecular (Dohlman et al. 1991 hacen unarevisión interesante).

Entre ellos se cuentan los receptores a y B-adrenérgicos. BI y Baestimulan a la enzima adenilil ciclasa via Gas mientras que elreceptor a2 la inhibe por medio de una Gai. El receptor a1participa de la transducción de señales a fosfolipasa C (Lefkowitz y Caron, 1988). Tambien estan acoplados a proteinas G,receptores dopaminérgicos, muscarínicos y los receptores para laluz ubicados en las células de retina: rodopsina en bastones ylas opsinas para los tres colores primarios en conos.

El hecho de que exista una conservación en la estructura de lasproteinas G hace que no sea sorprendente el hecho de que susreceptores tambien pertenezcan a una familia con caracteristicascomunes (Bourne y De Franco, 1989): Una cadena polipeptídica queatraviesa 7 veces la membranaplasmática, con su extremo aminoterminal en el lado extracelular y su extremo carboxi-terminaldel lado citoplasmático (Figura 9).

El extremo carboxilo terminal tiene varios residuos susceptiblesde ser fosforilados por quinasas especificas, produciendo unadesensibilización del receptor.

Las vueltas o "loops" que conectan cada paso intermembrana con elsiguiente del lado extracelular, participan de la interacción deestos receptores con el ligando. La unión del ligando provoca enel receptor un cambio conformacional, que trasladado al otro ladode la membrana permite la transducción del mensaje. El séptimodominio hidrofóbico de los receptores adrenérgicos a2 y Bz es

INTRODUCCION - 29

determinante en la especificidad de unión a agonistas yantagonistas.

Oligosacsharidel

I l AAA ML!+

Extracellular

mm e 1 WWWWM f y 1 HMHMMM

Cytosolicside

COO‘

Las opsinas llevan unido un cromóforo llamado 11-015 retinal elcual se encuentra paralelo a la membranaplasmática, en un bolsillo formado por las regiones transmembranosas del receptor. Esprobable que los ligandos para los otros receptores de la familiase unan a bolsillos de unión en membranasimilares. Varios de losprimeros cinco dominios hidrofóbicos contribuirían a esa unión.Del lado interno los receptores transmiten la señal a proteínas Gque la llevaran hasta los efectores. Construyendoquimeras entrereceptores de los tipos a2 y Dz se ha visto que la especificidadpara el acople a las proteinas G está dada por las zonas transmembranaV y VI y por el tercer "loop" citoplasmático (Kobilka etal, 1988).


El .].] c. 1

El estudio de la transferencia de información en la superficiecelular a segundos mensajeros citoplasmáticos fué reportado porprimera vez en 1956 (Rall et al, 1956). En 1962 se reportó la existencia de una adenilil ciclasa, enzima capaz de convertir ATPen AMPC, molécula que actúa como segundo mensajero en larespuesta a muchas hormonas y neurotransmisores (Sutherland yRall, 1957).

ATP AMPddkowAMP)

Dadoque la hormona que llega a la célula no debe entrar al interiorv para producir su efecto, se propuso la existencia de unamolécula receptora en la membrana y, además, de un elementotransductor ubicado entre el receptor hormonal o discriminador yel efector o amplificador (Rodbell et al, 1971a)(Figura 11).

V \

I

\ \ KATPl

DISCRIMI- 'TRANSDUCTOR ’ AMPLIFICADOR

\ l\ ‘ AMPC\ X

}—————MEMBRANAPLASMATICA———-|

INTRODUCCION — 31

El requerimiento de GTP para obtener estimulación de adenililciclasa por glucagon en membranas de higado (Rodbell et al,1971b), fué la primera evidencia del papel regulatorio de esenucleótido en sistemas de transducción de señales. Luego se vioque análogos no hidrolizables de GTP podian mantener la activación (Londos et al, 1974). Trabajando con eritrocitos depavo, Cassel y Selinger mostraron que la hidrólisis del GTPsirvepara terminar con la activación de adenilil ciclasa, adjudicandola reactivación por medio del complejo hormona-receptor a lasalida del GDPresultante (Cassel y Selinger, 1978). Estas observaciones llevaron a proponer el modelodel ciclo regulatorio delGTP (Figura 12) en el cual E es la enzima efectora adenililciclasa.

GTP External Stimulus GDF.

lnactive GGDP GG -E Active

PI

El alto interés en caracterizar el sistema de proteínas G, transductoras de señales, hizo que paradójicamente la propia enzimablanco fuese la que mas se tardó en caracterizar. En la décadadel 80 se purificó adenilil ciclasa partiendo de distintostejidos (miocardio de conejo, cerebro de rata, cerebro bovino ohigado porcino), por solubilización de membranas y pasaje porcolumnas de afinidad como forskolina-sefarosa o calmodulinasefarosa (Pfeuffer y Metzger, 1982; Wescott et al, 1979; Smigel,


1986). Tanto la adenilil ciclasa de cerebro (sensible a calmodulina) como la de higado (insensible a calmodulina), parecenmigrar en geles de SDScomo proteinas de 120-130 kDa., dato confirmado por experimentos de “binding” de ATPradioactivo. Pordeglicosilación enzimática de la enzima de higado se ha visto quecontiene azúcares unidos a un esqueleto de proteína de 110 kDa.

Por fin, rastreando una biblioteca de cDNAde cerebro bovino, selogró clonar el correspondiente a una adenilil ciclasa (Kuprinski

1989). La lapredice una pasos

et al, secuencia de 1134 aminoacidos resultante detraducción estructura protéica con variostransmembrana (Figura 13).

xevavLssExtracellularspace

0

5 en R A °vL A n

Lc EG o A

n E e ene R PAF E o 9 GAk F s G ”E A E eLC e G

E P A GGG Cytoplasm

En la figura se ve como las dos mitades, cada una de ellas conseis zonas hidrofóbicas, están unidas por un largo dominiocitoplasmático el cual podria estar involucrado en la unión alnucleótido y en la catálisis de la reacción. Existen zonas con

INTRODUCCION - 33

senso para la fosforilación por PKC y PKA y su similitudtopológica con algunas proteínas transportadoras o canales iónicos ha llevado a postular su participación en la exportación deAMPC.

Las adenilil ciciasas que estan acopladas a proteinas G soncaracteristicas de eucariotes superiores y utilizan ATP-Mn++oATP-Mg++comosustrato, a diferencia de las adeninlil ciclasas debacterias y algunos eucariotes inferiores, que no tienen componente regulatorio sino solo el catalítico y presentan actividadsolo con ATP-Mn++.

La Figura 14 muestra los pasos que siguen desde la llegada de unaseñal hormonalhasta la activación de la adenilil ciclasa.

___r—‘{4 /7/Capila/// Hormona//G,“ (au /

Membrana celular

Proteína receptora )Adenilato (b)de membrana Proteína 'G‘ ciclasa

(inactiva)

Proteína Gs

INTRODUCCION - 34

Citoplasma

El CAMP activa aciertasproteínasen /el interior de la célula

La Figura 15 muestra como el AMPcresultante de dicha activaciónpuede actuar sobre otros componentes celulares comoen estela quinasa de proteínas dependiente de AMPC.

Proteínaquinasa inactiva\

VProteínaquinasa activa

caso


La enzima adenilil ciclasa se encuentra distribuida entre losseres vivos en un amplio rango evolutivo como muestra lasiguiente tabla:

bacterias Escherichia coli (Aiba et 81.1984)Bordetella pertussis (Ladant, D.,1988)Anabaena sp. (Bianchini et al, 1990)

hongos Dictyostellium discoideum (Kachatrian et a1,1987)Saccharomyces cerevisiae (Kataoka et a1,1985)Neurospora crassa (Flawiá et al,1872ayb)MUoorrouxii (Cantore et al,1982)

protozoos Trypanosomacruzi (Torruella et al,1986)

plantas Médicagosativa (Carricarte et 31,1988)

mamíferos B. taurushígado (Pohl et al,1969)cerebro (Coussen et 81,1985)eritrocitos (Davorenet a1,1963)

El gráfico (Figura 16) muestra en sus distintas ramas los componentes caracterizados hasta el momentoen distintos organismos.

INTRODUCCION - 36

CGR CGR CGR CGR CGR CGR ? C CG C CAH S "(PHLES MAMIFEROS ANFISIOS PECES INVERÏEBRADCIS PLANVAS ALGAS HONGOS BACH ¡HAS

Pnorozoos n c

l HONGOSrussuoos

Joa . uo‘a

REPHLESPRIMITIVOS

NETAZOOS

EUCARIOTESPRIHH’IVOS

PROCARIDÏESPRINIÏIVDS

¡son - 10‘

C,Gy R significan componentecatalitico, regulatorio y receptorrespectivamente.

En eucariotes inferiores la enzimaadenilil ciclasa presentacaracterísticas intermedias, en algunos casos se ha verificado suasociación a GTPasas y en otros no.

En estos organismos se ha visto que variaciones en los niveles deAMPc están asociados a procesos tales como conidiación,elongación de hifas, agregación celular, germinación de esporas,etc. (ver tambien PROTEINAS G EN DIVERSOS ORGANISMOS).

En Mucor rouxii el nivel de AMPCaumenta cuando se alarga eltubo germinal (Cantore et al, 1980) y cuando se pasa de unaatmósfera anaeróbica a una aeróbica, se produce una transición delevadura a forma filamentosa con disminución de los niveles deAMPc(Paveto et al, 1975).

Los estudios en Néurospora crassa muestran que, la adenililciclasa esta unida a membranasen forma débil, depende de ATP

INTRODUCCION - 37

Mn++, no responde a GTP (Flawiá y Torres. 1972a; Flawiá y Torres,1972b; Flawiá y Torres, 19720), y es activable por Ca++—calmodulina (Reig et al, 1984). Experimentos de reconstitución desistemas heterólogos indican que además de las caracteristicasmencionadas, la ciclasa de N. crassa es capaz de interactuar confactores regulatorios. Acoplandola in vitro a rodopsina y transducina (receptor y proteína G del sistema de transducción visual)se vio que es capaz de convertir un estímulo lumínico en unaumento en la producción de AMPc(Muschietti et al, 1989).

Otros eucariotas inferiores. comoSaccharomycescereviciae y Dictiostellum discoideum, tambien tienen actividad de adenililciclasa acoplada a proteinas G (ver PROTEINASG EN DIVERSOSORGANISMOS).

QanalesJánicos

La caracterización de los canales iónicos transmembrana hademostrado que no están solo regulados por diferencias de potencial sino que también lo estan bioquímicamente. La modulacióndependiente del tiempo (horas) de la actividad de los canales,está dada por la sintesis y degradación de las proteínas que losconforman, mientras que las modificaciones rápidas (rango desegundos a minutos) podrian darse por los siguientes procesos(Herscheler et al, 1990):

—Interacción de moléculas señalizadoras intracelulares con los canales.

—Fosforilación de las proteínas del canalestimulada por mensajeros intracelulares.

Interacción de los canales iónicos conproteínas G.

E1 método experimental mas usado para este sistema es la técnicade "patch-Clamp" (Hammil et al, 1981) la cual provee un modo conveniente para la medición de corrientes transmembrana. Por estemedio se puede estudiar el transporte a través de una pequeña

INTRODUCCION - 38

porción de membrana ( patch ) que cubre la entrada a una micropipeta. Agregando diferentes compuestos dentro de la pipeta odentro del recipiente en el cual esta se sumerge, es posiblesometer a uno u otro lado de las membranas a distintas condiciones químicas.

Existen diversos estudios que ligan a proteínas G del tipo Gi, Goy Gk en el control de la actividad de canales de Ca++ y K+, delos cuales existen interesantes revisiones (Herscheler et al,1990; Yatani et al, 1990; Rane y Dunlap, 1990).WLa enzima fosfolipasa C (PLC) específica de fosfatidilinositol(PI) fué descripta por vez primera en los trabajos de Dawson yKemp (Dawson, 1959; Kempet al, 1961) y se la encuentra tanto enprocariotes comoen eucariotes (Shukla, 1982).

La ocupación de ciertos receptores celulares, comolos de factores de crecimiento o neurotransmisores, por sus agonistas esseguida por activacion de PLC, la cual cliva a los diferentesfosfatidilinositoles para dar inositolfosfatos y 1,2diacilglicerol. Este último activa a la quinasa de proteinas C lacual interviene en distintas reacciones de fosforilación. Los inositolfosfatos elevan la concentración de Ca++intracelular loque facilita una variedad de reacciones.

Todas las formas de PLC descriptas hasta hoy utilizan comosustratos fosfatidilinositol (PI), fosfatidilinositol 4-fosfato(PIP) y fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) (Wilson et al,1984; Ryu et al, 1978b; Rebecchi y Rosen. 1987b) los cuales compiten por la enzima. La actividad de PLCen células de mamíferose encuentra principalmente en el citoplasma aunque existenreportes de PLCasociada a fracciones particuladas en cerebro(Lapetina y Mitchell, 1973; Lee et al, 1987). Existen múltiplesformas descriptas de PLC. La mayoria de los tejidos contienenvarias formas que se pueden distinguir por cromatografía. Los


distintos pesos moleculares reportados incluyen variaciones dentro de un mismotipo de tejido proveniente de distintas especies.Si a esto se suma el hecho de que la nomenclatura es ambigua enlos distintos reportes se entiende que hasta el momentosea imposible determinar cuantas PLCse conocen (Deckminet al, 1990).

Hasta el momentola actividad de las enzimas PLCse ha visto influida por: [Ca++], pH, entorno de lípidos y proteínas G.

El aumento de [Ca++], favorece la utilización de PI comosustratoel cual no es utilizado en ausencia de Ca++, mientras que algunasformas de PLCpueden hidrolizar PIP y PIPz en esas condiciones(Wilson et al, 1984). El pH óptimo es 5,2 a 5,5 pero en presenciade deoxicolato aumenta a 7.

La participación de proteinas G en la regulación de la actividadde PLCya ha sido tratada en esta Introducción (ver ” aq“) ypuede verse en la Figura 17.

Espacioextracelular

Membranaplasmática

0“Io-cono'moooeoo

fá‘á‘á‘fi’®

C

ll‘

Citosol

Retr'culoendoplásmico

C3®NWW> Respuestacelular P_l

CanaldeCa® .ï


Resta agregar que podría existir un mecanismode inhibición dePLCmediada por proteínas-G. Dopamina previene la formación deinositolfosfatos en células pituitarias estimuladas porangiotensina II (Enjalbert et al, 1986). Si las células sonpreviamente tratadas con toxina pertussis la inhibición se bloquea (Journot et al, 1987). Este hecho sumadoa la descripción deuna aq estimulatoria de 42 kDa. ya mencionada (Pang et a1, 1990)podría completar el paralelismo entre los sistemas de regulaciónde PLCy adenilil ciclasa.

H i l . ..

El mecanismo de visión comienza con la entrada de luz por laabertura del ojo. El haz de rayos luminicos debe atravesar lacórnea y el cristalino, verdaderas lentes biológicas que proyectan la imagen sobre la retina.

La transducción de señales luminicas se desarrolla en las célulasfotorreceptoras del oJo que están ubicadas precisamente en la superficie de la retina. Cada una de ellas, recibe información deun punto de la imágen. La integración en el cerebro, de la información aportada por cada célula constituye lo que nosotrospercibimos.

Estas células son:

— bastones, que forman imágenes en blanco ynegro bajo luz débil.

conos, los cuales son responsables de lavisión en colores.

INTRODUCCION

La Figura 18 muestra la estructura de una célula bastón.

Outersegment

Innersegment

NF

Discs

Plasmamembrane

Cytoplasmicspace

lntradiscalspace

Cilium

Mitochondrion

Golgiapparatus

Endoplasmicreticulum

Nucleus

Synapticterminal

41

INTRODUCCION - 42

El segmento externo de los bastones se encuentra organizado endiscos. En las membranas que delimitan los discos se produce larecepción de la señal. Cerca de 2000 discos se apilan unos sobreotros en el interior de los bastones y están exteriormenterodeados por la membranaplasmática celular.

La membranacelular externa separa soluciones con distintas concentraciones de iones: Mayorconcentración de K+en el citoplasmay mayor concentración de Na+en el medio externo. Este gradientees mantenido en oscuridad por una "bomba Na+/K+" dependiente deenrgia. La membranadel fotoreceptor es permeable al K+, por lotanto este tiende a salir al medio extracelular generando unpotencial interno negativo en la célula. Tambien, en oscuridad,el fotoreceptor presenta una apreciable permeabilidad al ión Na+,a través de los canales de Na+, ubicados en la membrana celular(Cook et al, 1989), cuya apertura es dependiente de GMPc.

Los fotones que llegan hasta la retina son registrados por unreceptor con siete pasos de membrana (ver la sección de receptores). llamado rodopsina. ubicado en la membranade los discos.Dada la imposibilidad de los fotones de difundir en el medio comolo hacen las hormonas que interactúan con los receptores (porejemplo, B-adrenérgicos), la concentración de rodopsina en membranas es 1000 veces mayor a la de aquellos. En oscuridad elcromóforo permanece en su forma inactiva 11-cis-retinal y latransducina se encuentra como trímero at(GDP)BXt.

Por acción de la luz el cromóforo pasa a su forma "todo-trans" locual induce cambios conformacionales en la rodopsina; el mas importante de ellos permite exponer el sitio de interacción con latransducina (Fung, 1983). Comoresultado de dicha interacción, elGDPes intercambiado por GTP y el complejo se disocia en rodopsina activada (que permanece en la membranadel disco) y at(GTP)y Büt que difunden hacia el citoplasma. at(GTP) activa entonces ala fosfodiesterasa de GMPc(PDE-GMPc). Dicho fenómeno mas que unaactivación es un bloqueo de una inhibición, dado que at(GTP) interactúa con el inhibidor de la PDE-GMPc,dejando a la enzimalibre (Deterre et al, 1986) para hidrolizar el GMPc.


Así, por fotoexcitación de una sola molécula de rodopsina, luegode 0,2 seg. se produce la hidrólisis de 105 moléculas de GMPc yeso redunda en el cierre de todos los canales de Na+,dependientes de GMPC,en un entorno de 5pm.

La interrupción del flujo de iónes produce, entonces, una hiperpolarización de membrana suficiente para generar un impulsoeléctrico que es transmitido a las neuronas del aparato visual.

La integración de las señales producidas en cada neurona por elmecanismoaqui descripto resulta en la formación de una imágenen el cerebro.

El sistema de transducción de señales mediado por proteínas G,presenta caracteristicas altamente versátiles, tal es asi que elnúmerode procesos caracterizados que utilizan dicha via paratransducir información a través de la membranaplasmática aumentadia a dia. Lo que sigue es una breve reseña de algunos de ellos.

—En 1983 se sugirió que la hormona insulina podría ejercer almenos parte de su acción interactuando con el sistema deproteínas G (Heyworth et al, 1983; Huoslay y Heyworth, 1983).Desde entonces se ha acumulado bastante información apoyando esateoría pero aun resta saber si existe una hipotética Ginaespecífica de insulina o si la acción se produce simplemente pormodificación de proteínas G ya conocidas (Houslay. 1990).

—Los caminos de transducción asociados a factores de crecimientopodrian involucrar uno o una red de caminos G. Una reseña de loconocido ha sido publicada por J. Pouyssegur (Pouyssegur, 1990).

—La idea de que el GTPpodría ser un mediador intracelular desecreción nació de frustraciones en probar un mecanismo demovilización de Ca++ con hidrólisis de fosfatidilinositol (PI)

INTRODUCCION — 44

(Gomperts, 1983). Desde entonces se han conocido dos actividadesdependientes de GTPen el proceso de exocitosis. A la que actúaen estadios tempranos del proceso se la ha llamado Gp y a la queactúa mas tardíamente se la ha llamado Ge (Gomperts et al, 1986).Existen ahora evidencias de que proteínas G están involucradas enprocesos de exocitosis estimulados y constitutivos. tanto encélulas de mamífero como en levaduras (MelanCon et al, 1987; Salminen y Novick, 1987)

—El péptido somatostatina inhibe crecimiento celular y estimulala actividad de 1a enzima fosfotirosin-fosfatasa. Recientementese ha mostrado la participación de una proteína G mediando eseproceso de activación (Pan et al. 1992).

La reconstitución de sistemas heterólogos constituye básicamentela formación de un nuevo sistema de transducción de señales. Esenuevo sistema se forma por el reemplazo o agregado de un nuevocomponente en una determinada via.

Los componentes mas comunmentereemplazados sonzlas proteínas receptoras, las proteínas G o las enzimas efectoras. Lo que se obtiene son sistemas mixtos en los cuales se conserva el mecanismode acción a pesar de que se genera una respuesta final, diferentea la fisiológica, frente a un mismoestimulo inicial.

Las técicas mas utilizadas para lograr dicho fin son:

— fusión de membranas puras mediada porpolietilenglicol 6000; se produce la mezcla de las proteínas deambas membranaspudiéndose generar nuevos sistemas heterólogos.

- electrofusión de células.- extracción con detergente de proteínas de

membranay posterior adición a otras membranas.- armadode vesículas fosfolipidicas utilizando

los componentes purificados y generando el sistema deseado.

INTRODUCCION - 45

Mediante el uso de dichos sistemas se ha logrado:

- reconstituir el sistema de receptor Badrenérgico, proteína, Gay adenilil ciclasa en vesículas fosfolipidicas, a partir de sus constituyentes purificados, y lograrreproducir fielmente las respuestas de la enzima, obtenidasnormalmente en su entorno fisiológico (membrana plasmática)(Cerione et al. 1984).

- rearmar en vesículas fosfolipídicas las interacciones entre el receptor B-adrenérgico, rodopsina, proteinasGa, Gi y Gt. Utilizando esta técnica se comenzóa evidenciar que,a pesar de que actúen todas de igual manera, no son. lasproteínas G, intercambiables para cualquier sistema; por ejemplo,transducina y Ga interaccionan de manera muydébil con el receptor B-adrenérgico y rodopsina, respectivamente (Cerione et al,1985). '

- diferenciar funcionalmente las subunidades 8%de Gi y 53 de transducina, sugiriendo un potencial papelregulatorio a las subunidades X (Cerione et al, 1987).

- reconstituir funcionalmente un sistema en elque receptores para opiodes interactúan con Gi y Go de cerebrobovino (Ueda et al, 1988) y en el que receptores muscarinicosinteraccionan con Go (Florio et al. 1989).

La información aqui citada fue obtenida purificando y utilizandoproteínas del mismotejido (es decir, que interactúan fisiológicamente), o a lo sumode diferentes tejidos pero siempre dentrodel mismo ser vivo.

Unanálisis similar ha permitido hecer inferencias sobre la conservación evolutiva de los constituyentes protéicos.Reconstituyendo sistemas en los cuales células animales proveianlas moléculas efectoras y transductoras y las células deeucariotes inferiores (Nburospora crassa o Trypanosonacruzi), lamoléculaefectora (adenilil ciclasa), se logró ver interacción deestas ciclasas con componentesregulatorios de vertebrados. Unaadenilil ciclasa de N. crassa (exclusivamente dependiente de ATPMn2+para formar AMPcíclico) funcionó en presencia de ATP-Mg2+y

“"73

mostróagonistas B—adrenérgicos(Flawiá et al,

activación

‘ EMBRANAS. ..cruz¡o N.crussa

'A}

CAMP

INTRODUCCION — 47

Mastarde se vió por electrofusión de células que T. cruzi escapaz de proveer Gas a un sistema desprovisto de ese componentecomoes el de las células de la variante cyc- del linfoma S49(Eisenschlos et al, 1986b).WWWEn organismos multicelulares simples se han encontrado variasproteinas G que se encuentran claramente relacionadas con lasdescriptas en mamíferos (Simon et al. 1991).

En Drosophila se han caracterizado a nivel molecular varios segmentos de DNAque codifican para proteínas G. Se ha encontradoque sus secuencias son similares a las subunidades a de Go, Gi,Ga, Gq y G12. Ademas se ha reportado la presencia de un gen quecodifica para una subunidad B (Yarfitz et al, 1988). Una proteínaGao-like de 40 kDa. con 87%de identidad con la de vertebrados esabundante en las cabezas de Drosophila. Su expresión en neuronasy a menornivel en ojos sugiere su participación en la transmisión del impulso nervioso (Thambi et al. 1989). Tambien se haencontrado una proteína Gas-like que guarda una 71%de similitudcon la de vaca (Quan et al, 1989). El producto del gen DGal esidéntico en un 78% a la proteina Gail bovina (Provost et al,1988). Varias evidencias entre las que se destaca el hecho de quela mala regulación de los niveles de AMPcprovoca defectos en eldesarrollo de Drosophila (Bellen et al. 1987), asi comosu expresión principal en embriones y pupas, ha llevado a sus descubridores a destacar la importancia que este gen podria tener enestadios tempranos del crecimiento de estas moscas. Un gen importante durante el proceso de gastrulación es el cta. Este gen hasido clonado y secuenciado y ha resultado codificar para unaproteína Ga-like (Parks et al, 1991).

En Cbenorhabditis elegans se han identificado por clonadomolecular varias proteinas Ga. Algunas de ellas han sidoidentificadas como homólogos de proteinas G de mamíferos, una deellas es 87%idéntica en secuencia aminoacídica a otras Gao con

INTRODUCCION — 48

ocidas. Otras dos han resultado ser 48%iguales entre sí a nivelde aminoácidos pero no han podido ser clasificadas en alguna delas subfamilias de proteinas G conocidas por lo que resultan serexclusivas de este nematodo (Lochrie et al, 1991).

En plantas tambien hay reportes de proteinas G. Un gen para subunidad a (GPAI)ha sido reportado en Arabidopsis thaliana, elcual codifica para una proteina de 44,5 kDa. con un 73% dehomologia con Gai de mamíferos (Ma et al, 1990). En Medicagosativa existe un sistema de proteinas G, de las cuales hastaahora han sido detectadas entidades a y B por medios bioquímicose inmunológicos. Dicho sistema estaria relacionado con la transducción de señales lumínicas (Muschietti et al. enviado a publicar).

Dictyostelljum discoideum pasa durante su ciclo de vida por unaserie de estadios morfologicamentediferentes. Bajo condicionesen las cuales el alimento es escaso, amebas libres unicelularescomienzan a agruparse en un cuerpo multinucleado que resulta de1a fusión de 105 individuos. Este proceso espontáneo se producepor la unión de AMPca receptores ubicados en la membrana celular(Devreotes P., 1989). A su vez cada célula es capaz de sintetizary secretar AMPcen respuesta a esa estimulación, lo que resultaen la formación de centros de agregación. Dichos centros derivanen el agrupamiento ya mencionado. Por último, este se transformaen un cuerpo fructífero que libera formas unicelulares.

Tres serían los procesos desencadenados por las señales externastransducidas al interior celular: quimiotaxis, agregación ydiferenciación a esporas. Los caminos activados tambien seriantres, los cuales involucran: adenilil y guanilil ciclasas y fosfolipasa C. Estos caminos se conectarian entre si y ademas notodos serían escenciales para cada proceso dado que mutantes incapaces de activar adenilil ciclasa no pueden formar agregadospero si moverse quimiotacticamente (Firtel, R.A., 1991).

Durante los últimos tres años se han clonado genes para cuatroreceptores de AMPcy seis proteínas Ga en Dictyostelium, cada unode ellos con un patrón de expresión distinto durante el desar

INTRODUCCION - 49

rollo lo que indica que funcionan en distintos pasos del ciclo devida (Pupillo et al, 1989; Hadwiger et al, in press; Saxe et al,1991a; Saxe et al, 1991b). La comparación de las secuencias delas Ga muestra que la identidad es baja excepto en las zonasaltamente conservadas entre todas las Ga conocidas. Se hapropuesto que una de ellas (Gaz ligada al receptor cARl) activafosfolipasa C y posiblemente guanilil ciclasa, mientras que inVivoes indispensable para la activación de adenilil ciclasa,aunque no se conoce si se acopla a esta enzima directamente;otras Ga podrian cumplir esta función con la colaboración, poruna via indirecta, de Gaz. Por otro lado Ga4 sería esencial en elproceso de formación de esporas (Hadwiger J., 1991). Las funciones de las otras subunidades Ga no están aun determinadas y seestan realizando experimentos para conocerlas. Pese a todo lo queaun resta por estudiar sobre la fisiología de la diferenciaciónen este organismo, ya no caben dudas sobre la importancia delsistema de transducción de señales mediado por proteinas G en eldesarrollo de Dictyostellium díscoídeum.

Saccharomycescerevisiae presenta un ciclo de vida con alternancia de fases haploide y diploide. En la fase haploide se puedendistinguir dos grupos de conjugación llamados a y a. Cada uno deellos produce un factor que lleva el mismonombre y posee unreceptor para el opuesto. Dicha caracteristica permite que individuos de grupos opuestos conjuguen entre si para dar inicio ala fase diploide a/a. Los receptores mencionadosson codificadospor los genes STEZ(factor a) y STE3 (factor a) (Jenness et al,1983; Hagen et al, 1986; Blumer et al, 1988). El estudio de laestructura de dichos receptores ha mostrado que poseen 7 dominiosque atraviesan la membranaplasmática, tal comotodos los receptores acoplados a proteinas G.

Algunos genes codificando para polipeptidos Ga-like han sidoreportados en levaduras. GPAlcorresponde a una proteina de 54kDa. (Nakafuku et al, 1987), la cual es específica del estadiohaploide y esta involucrada en el camino de transducción de lasseñales de feromonas a y a (Miyajima et al. 1987). Un segundogen, GPA2, para una proteína de 50.5 kDa. (Nakafuku et al. 1988)

INTRODUCCION — 50

esta relacionado con la regulación de los niveles de AMPc.

El sistema de transducción de señales relacionado con lasensibilidad a feromonas en Saccharomycescerevisiae no solo contiene proteínas análogas a las Ga, sino que los productos de losgenes STE 4 y STE 18 de estas levaduras son proteínas estructuralmente similares a B y X respectivamente. Estos últimos dosproductos tendrian una influencia positiva en la respuesta deconjugación ya que mutantes defectivos en cualquiera de ellos sonincapaces de conjugar o de dar respuesta alguna a las feromonas(Whiteway et a1, 1989). Por otro lado la falta de subunidades aresulta en una respuesta constitutiva que deriva en un arrestodel ciclo celular (Dietzel y Kurjan, 1987). Si lo analogamos alos sistemas de mamíferos, en este caso la activación del receptor de feromonas implicaría disociación del trimero y activaciónpor 63 de una enzima aún desconocida. En este caso la subunidad aactuaria comomodulador negativo a diferencia de la gran mayoríade los otros sistemas regulados por proteinas G descriptos, enlos cuales es la subunidad a la que interacciona con el efector.Sea cual sea la entidad que interacciona con el receptor, estesistema se asemeja al de Dictyostelium en el sentido que unheterotrímero G participa de pasos decisivos entre las distintosestadios del ciclo de vida en un eucariote inferior.

Un trabajo recientemente publicado muestra el clonado del genCAGIen el hongo Cándjda albicans 'utilizando una sonda de SCGl(un alelo de GAPl). Dicho clon contiene un marco de lecturaabierto de 429 aminoacidos con identidad del 65%con la proteínade Saccharomyces cerevisiae (Sadhu et al, 1992). La disrupción deese gen no provoca un fenotipo detectable. Sin embargo, en Sabcharomyces es capaz de revertir defectos en las funciones de conjugación. Aun no se conoce una forma sexual de Candida albicans,pero está descripto un cambio en la forma de crecimiento que pasade células libres que se reproducen por brotes (como laslevaduras) a hifas que forman un micelio. Dicho cambio se produceen respuesta a una serie diversa de factores ambientales, y sibien estos no han sido caracterizados todavía no es osado pensarque en este hongo debe existir un sistema de transducción de esas

INTRODUCCION — 51

señales que dispare el cambio en el desarrollo indicado. Futurosexperimentos nos dirán si el producto de CAGlparticipa o no deese proceso .

En Tïwpanosomacruzi también se han encontrado proteinas G (Verel capitulo correspondiente de esta introducción y los resultadosde esta tesis).WLos genes ras fueron identificados por primera vez como los oncogenes responsables de los sarcomas virales murinos Harvey yKirstein (Ha-MSV y Ki-MSV). Desde entonces se han encontradogenes homólogos en una variedad de organismos y se ha visto suresponsabilidad en ciertos tumores humanos (Barbacid, M., 1987).Su capacidad de unir e hidrolizar GTPasí comosu asociación conmembranas sugiere la participación de las proteinas RAS enprocesos de transducción de señales.

Los genes ras de mamíferos codifican para proteínas de 21 kDa.,las cuales tienen una alta homología. Sus primeros 85 aa sonidénticos y los siguientes 80 se parecen en un 85% (Mc Cormick,F., 1989). Estos 165 aa forman la zona de unión al nucleótido dela cual se conoce su estructura cristalina (de Vos et al, 1988).Entre los aa 165 y 185 las secuencias difieren, lo cual indicaque cada una de estas proteínas tiene una función exclusiva. Enlos extremos carboxilo terminales existe un residuo de cisteínasusceptible de ser poli-isoprenilado (Hancock, et al, 1989).Dicha modificación es lo que le permite asociarse a membranas.

El termino "genes ras (rat sarcoma virus)" ha sido extendido atoda una familia de genes que codifican para proteínas de un pesomolecular entre 21 y 26 kDa. entre los cuales se encuentran loscorrespondientes a las subfamilias ras, ¡fio y rab.

Pese a los muchos datos bioquímicos, biológicos y estructurales

INTRODUCCION — 52

sobre las p21 de mamíferos que se han venido acumulando en estosaños, todavía no se conoce cual es su función exacta, aunquevarias lineas de evidencia la relacionan con proliferacióncelular. Por microinvección de anticuerpos neutralizantes contraras en células en cultivo se ha visto que se bloquean varioscaminos de transducción de señales (Hall, 1990). El mismo autorseñala una serie de experimentos que vinculan a ras con la transducción de señales iniciadas por factores de crecimiento, aunqueno queda claro en que consiste esa participación.

En donde se conoce un poco mas sobre las funciones de ras es enSaccharomyces cerevisiae. Dos genes homólogos Rasl y Rasz(codificando para proteínas de peso molecular 45 kDa.) han sidoencontrados en estas levaduras. RASZestimula la actividad deadenilil ciclasa del modoque lo hace Gas en mamíferos (Gibbs etal, 1989). Pese a la diferencia de tamaño, existe ciertahomología a nivel funcional dado que ras de mamíferos o viralespueden reemplazar a los de levaduras en sus funciones esencialesy una versión de RASl con una mutación oncogénica (RASlVal-9)transforma células de mamífero (DeFeo-Jones et al, 1985).

En Neurospora crassa se ha encontrado y clonado un gen quecodifica para una proteína de un peso molecular de 24 kDa(Altschuler et al, 1990) que contiene:

las cuatro secuencias conservadas para la unióncon GTP.

— el sitio de unión para el anticuerponeutralizante Yl3-259.

—los residuos Gly17, Glle, Ala34 y Gln66 característicos de las posiciones 12, 13, 59 y 61 de las proteínas Hras-l normales de humanos cuyos cambios eliminan la actividadGTPasa.

La reunión de todas estas características determinó la incorporación de “NC-ras" como un nuevo miembro de la familia ras.

INTRODUCCION — 53

En la búsqueda de candidatos para ser el efector de ras, fue encontrada una proteina de 125 kDa. capaz de estimular la actividadGTP-asa de Ras p21 en extractos crudos de ovocitos de XGnopus(Trahey y McCormick, 1987). Bautizada GAP(Proteina activadorade la GTPasa) su actividad fue detectada en muchos tejidos ylíneas celulares. GAPes la única proteína bien caracterizada queinteractúa en forma directa y especifica con ras p21. Se hapropuesto un rol comoefector asociado a ras p21 basándose en lossiguientes hechos:

- Ras p21 se une a GAPde un modo GTP-dependiente(Vogel et al, 1988).

—GAPinteractúa con el dominio de Ras p21 que secree sería el encargado de unirse con el efector (Schlichting etal, 1990).

—Mutantes de Ras incapaces de transformar no seunen a GAP

- Mutantes de Ras trasformantes pueden unir GAP(Cales et al, 1988).

—GAP interactúa con todos las p21 conocidas (McCormick, F., 1989).

NORMAL TRANSFORMADO

SEÑALMITOGENICA

' inactivo c,pr

lia! GDP IiiGrasa GTPGAP-depend. 2‘ membranaP csrnáuco

p‘

«¡Hondón

cúosol CELULAR

membfqnaplusmatnca

RESPUESTACELULAR

INTRODUCCION - 54

Análogos de GAPen Saccharomyces eerevisiae estan codificados porlos genes IRAl e IRAZ. Las proteínas que resultan de su traducción tienen 2938 y 3079 aa respectivamente (Tanaka et al, 1989 y1990), y sus dominios cataliticos guardan 45%de homologia con lazona carboxi-terminal de GAPbovino, la cual es suficiente paraestimular la actividad GTP-ásioa de Ras p21 (Marshall et al,1989). Esto sumado al hecho de que GAP bovino es capas desuprimir fenotipos ira- y de que la proteina Ira recombinantemuestra actividad GAP(Ballester et al, 1989 y Tanaka et al,1991) confirma la suposición de que IRAl y 2 son a RAS delevaduras lo que GAPes a Ras p21 de mamíferos.WWVarias proteínas que unen GTP están involucradas en labiosíntesis de proteinas: El factor de iniciación 2 (IF-2) y losfactores de elongación Tu y G (EF-Tu y EF-G) de procariotes, asicomo sus homólogos de eucariotes eIF-Z, EF-la y EF-Z. En Escherichia coli existen dos puntos en el ciclo de elongación de lacadena polipeptídica dependientes de GTP.

(Met (Met Arg

P sim A su,

AmunoacyI-IRNAdelivery by EF-Tu

GTP GDP.+

ch 3 p ch —

{Met fMet

Release of I

unchargod(RNAx Arg

Translocaliondriven by EF-G *

GDP GTP+p' GCU

INTRODUCCION — 55

El primero de ellos es la unión del complejo aminoacil-tRNA alribosoma, promovido por EF-Tu. proteína de 43 kDa. EF-Tu-GTP esla forma activa que se une al aa-tRNA primero y al ribosomadespués. Es necesario que el GTPsea hidrolizado para que el factor se libere y quede en condiciones de reiniciar el ciclo. Unmecanismo análogo permite que EF-G-GTPpueda interactuar con elcomplejo y promover la reacción de traslocación.

Durante el proceso de sintesis de proteinas estos factores sealternan en la interacción con el ribosoma y es necesario quecada uno de ellos se haya despegado para que pueda pegarse elotro. Dadoque el "despegue" es depend

Caracterización de proteínas G en Trypanosoma cruzi · Caracterización de proteínas G en...

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