BIOLUMINESCENCJAwiato ycia

Targi Akademia, Gdask, 19 marca 2012Dr hab. Karol Krzymiski

Bioluminescencja czyli o zwierztach ktre wiec

Bioluminescencja i chemiluminescencjaLucyferaza Utleniona lucyferyna w stanie wzbudzonym

BLLucyferyna w stanie podstawowym

BIOLUMINESCENCJA

Utleniona lucyferyna w stanie podstawowym

Energia z procesu utleniania

Utlenione czsteczki w stanie wzbudzonym

CHEMILUMINESCENCJA

Czsteczki w stanie podstawowym

CLUtlenione czsteczki w stanie podstawowym

BL: schemat procesulucyferyna + O2 lucyferaza oksylucyferyna + h

Etapy BL: Biako lucyferaza katalizuje utlenianie lucyferyny tlenem z powietrza. wyniku reakcji powstaje nieaktywna forma lucyferyny oksylucyferyna i wytwarzane jest wiato.W

BL: Fotoproteiny

Ca2+ Ca2+

oxylucyferyn lucyferyna a + O2apoproteina fotoproteina

+

h

Ca2+

Fotoproteiny: specyficzny ukad chemiczny tworzcy w obecnoci tlenu kompleks lucyferyny i katalizujcego biaka. Kompleks uwalnia lucyferyn w rezultacie wizania jonw wapnia dostpnych w ukadzie.

BL morska i ldowa

Okoo 2/3 organizmw w grnych 2000 metrach wd oceanicznych luminezuje

Poziom morza Bioluminescencja / nm

nie jest zbyt rozpowszechniona w ekosystemach ldowych.BL organizmw ldowychGboko czerwony ty

zielony BL organizmw morskich

Przyczyna ? niebieski

Organizmy oceaniczneA B C DA. Bakterie morskie z rodziny Vibrio B. Radiolarie przybrzene C. Meduza Aequorea victoria D. Syfonofory Erenna sp.

E

F

G

E. Wieloszczet Tomopteris F. Larwa planktonu Ptychodera flava G. Meduza Aequorea coerulescens H. Kaamarnica Vampyroteuthis I. Paka wodna Caecosagitta macrocephala J. ebropaw Beroe forskalii K. Kaamarnica Abraliopsis sp. L. Beroe forskalii, emisja wiata M. Kryl Thysanoessa sp.

J I K H N L

M

N. Ryba-wdkarz Chaenophryne longiceps O. Ostryga Conchoecia sp P. Ryba-topr Q. Kopepod Gaussia princeps R. Ryba-lampa Myctophid S. Ryba Tactostoma sp. w biaym wietle

O

P

T. Ryba Tactostoma sp. z widocznymi fotoforami

Q

R

S

T

Zdjcia: S. Haddock

BakterieBioluminezujce bakterie morskie to organizmy symbiotyczne (np. Vibrio)

KaamarniceBioluminezujca kaamarnica gbinowa. Wyposaona jest w spektakularne fotofory (tkanki emitujce wiato), ktre mog wyrzuca na zewntrz luminezujce chmury.

Vampyroteuthis swj odstraszajcy wygld zawdzicza organom emitujcym promieniowanie znajdujcym si na ramionach.

Teuthowenia pellucida Kaamarnica szklana

OmiorniceRzadkie gatunki bioluminezujce

Fotofory: organy, w ktrych generowane jest wiato wyewoluowane z wypustek pokrywajcych kade rami. Wykorzystanie: wabienie ofiary, imitacja wiecenia innych organizmw

Bardzo spektakularna!

Stauroteuthis Syrtensis

Ryby gbinowe

MyctophidRyby-lampy z posiadaj charakterystyczne dla rnych gatunkw fotofory. Myctophids s popularne na rednich gebokociach i migruj w nocy w kierunku powierzchni.

Angler fish

Chaenophryne longiceps, ryba-wdkarz wykorzystuje symbioz z bakteriami w celu wytwarzania wiata

Organizmy ldowe Chrzszcze

(robaczki witojaskie) Robaki i ddownice (np. robak kolejowy)

Organizmy ldoweBL ldowa obejmuje szeroki zakres kolorw, w przeciwiestwie do BL morskiej. Inne-

Grzyby/Fungigrzyb Panellus stipticus Opieka miodowa

- Bakterie

Geografia BL Tak zwana "fosforescencja" wody jest obserwowana we wszystkich oceanach szczeglnie czsto w zatokach i wrd raf koralowych.

Zatoka Bioluminescencji (Bioluminescent Bay): widowiskowa luminescencjadinoflagellatw (> 200 ty glonw / 1 litr wody!)

Okolice wyspy Vigues (Puerto Rico sfotografowane przez satelit

Funkcje biologiczne BLWabienie (przyciganie ) ofiary Przynta wiato zewntrzne

ATAK

Oguszenie lub zmylenie ofiary

Owietlenie ofiary

Ryba-wdkarz prezentuje wiecc przynt, aby zwabi ofiar. Inne drapieniki mog wabi ofiar imitujc sygnay charakterystyczne dla ofiary. LEGENDA:

WABIENIE

Rozpoznanie/ Przyciganie osobnika przeciwnej pci

Bysk

arzenie Zdobycz Drapienik 1 Drapienik 2

Fotofor dwubarwny u Aristostomias

- Wykorzystuje wiato czerwone, Czarna ryba-smok (Aristostomias) Aristostomias

a nie typowe

niebiesko zielone. Jedna szczeglnych rodzin ryb gbinowych wyposaona we wasny "noktowizor" dajcy moliwo widzenia nocnego.

- Zastosowanie: Widzenie w ciemnoci bez uwidaczniania si ofierze / drapienikowi.

Fotofor dwubarwny u Aristostomias Pigment fluorescencyjny w fotoforze absorbuje promieniowanie z zakresu zieleni i reemituuje je jako wiato to- czerwone (okoo 600 nm). Przed wydobyciem si do morza, wiato jest jeszcze dodatkowo filtrowane, osigajc dugoci fal okoo 700 nm.

Filtr

fotocyty

reflektor

Obraz fluorescencyjny oka i fotofora u Aristostomias Dugofalowe pasmo emisyjne u Aristostomias

Funkcje biologiczne BLZaskoczenie przeciwnika Owietlenie kamuflujce Tworzenie zasony dymnej Odwracanie uwagi Podnoszenie alarmu Kamufla u innego drapienika

OBRONA

Niektre krewetki wyrzucaj luminezujc chmur, aby zmyli napastnika i zamaskowa ucieczk

Zmienne zabarwienie ochronne(zniechcanie nowych osadnikw

LEGENDA:

Bysk

arzenie Zdobycz Drapienik 1 Drapienik 2

Lucyferyna alg morskich Lucyferyna wystpujca w glonachmorskich prawdopodobnie pochodzi od chlorofilu, gdy ma do niego podobn struktur.

- Dinoflagellaty to organizmy jednokomrkowe (algi) - Maj ksztat wrzecionowatej wieccej komrki

wieci zalenie od pH:

Lucyferyn a glonw morskichChlorofil

- pH 8: lucyferyna przyczona do biaka brak moliwoci wiecenia - pH 6: wolna lucyferyna moe uczestniczy w wytwarzaniu wiata

Lucyferyna alg morskichR1 NH O HN HO2C H N O2 HN HN H2O R2 O O O O H HO2C H O O HN R1

R2

hv

Procesowi jej utleniania tlenem czsteczkowym (katalizator lucyferaza) towarzyszy powstawanie diketonu i emisja wiata z zakresu niebiesko-zielonego (okoo 470 nm).

Lucyferyna bakteryjnabakterie, kaamarnice, niektre ryby

Lucyferyna bakteryjnajest zredukowanym fosforanem ryboflawiny (FMNH2).

Najlepiej poznane gatunki: - Photobacterium phosphoreum - Photobacterium luciferum - Vibrio fischeri - Vibrio harveyi

Lucyferyna bakteryjnaOH HO O P HO N H N O O2 , O NH N H O HO R O O O C H R2 R1 NH HN O O C R H RCO2H O R3 N N O H2O R2 R1 NH N O R3 N N O

hv

FMNH2

FMN

Zredukowany mononukleotyd flawiny (FMNH2) przeksztaca si w obecnoci czsteczkowego tlenu w pochodn peroksy. Peroksyflawina reaguje z dugoacuchowym aldehydem, co daje fosforan ryboflawiny (FMN) wod oraz odpowiedni kwas tuszczowy. Reakcji towarzyszy emisja niebiesko-zielonego wiata (ok. 490 nm).

KoelenterazynaRadiolarie, ctenofory, kaamarnice, widonogi, krewetki Decapod, strzaki wodne (Chaetognatha), meduzy

Koelenterazyna naley do najbardziej "popularnych i poznanychlucyferyn morskich (bratki morza Renilla, meduzy Aequorea). nazwie akworyna.

Czsteczka tego typu jest emiterem promieniowania fotoproteiny o

KoelenterazynaO N N H HO N O2 OH R1 N R2 OH O N O O NH CO2 R1 O N N NH

R2

OH

+ hv

Piercie imidazolopirazynowy jako centralny ukadbicykliczny.

Utlenianie piercienia imidazolopirazyny jest zwizane zemisj wiata niebieskiego (460480 nm).

Cykl przemian podobny do utleniania lucyferyny wietlika.

Lucyferyna chrzszczyRobaczki witojaskie (Lampyridae)

Lucyferyna robaczkw witojaskich wymaga oprcz

enzymu lucyferazy, obecnoci ATP jako katalizatora reakcji luminogennej.

Jest najlepiej zbadan lucyferyn, stosowana jakobiowskanik obecnoci ATP.

Lucyferyna chrzszczyLF: enzym lucyferaza

2

OL: oksylucyferyna

+LFH2: zredukowana1

lucyferyna

PP: pirofosforan

OL*: wzbudzona oksylucyferyna

Mechanizm BL: lucyferyna wietlikaLF + LFH2 + ATP LFH2 AMPLF + PPNH2HO

Mg2+

B

S N LH2 LFH2

HO NS

C-4H CO2H

S ATP-Mg2+ NA

HO N

C

S N O

O P

N O SO

H C

NO O O P O O

NH2 N

N

NN

S

NH

OH LH2-AMP LFH2-AMPO +

H HO

O

O

NH H OH

N

HH H OHPPi PP OH

P O O P O O O

OH

B. Od atomu wgla C-4 koniugatu LFH2AMPLF odrywany jest proton z udziaem acucha bocznego reszty aminokwasowej lucyferazy.

A.

Tworzenie kompleksu LFH2 AMPLF

Mechanizm BL: lucyferyna wietlikaO2 C

O2 D

HO

O

S N

N S

O O

OO O

O CH O H

NH2 N N N + AMP

SC N

N

O P O OHS H OH

OH OH

N

C. Okrelone reszty aminokwasowe lucyferazy promuj addycj D. Dioksetanon wysokoenergetyczne indywiduum porednie czsteczki tlenu do zoonego anionu. - dostarcza ok. 250 kJ mol1 energii

C O C O

C O C O

C O C O

C O*

Mechanizm BL: lucyferyna wietlikaLuc LH2AMP + O2 Luc LO* + AMP + CO2 Luc LO* Luc LO + hv ( ~ 1)O S N N S O* H

pH ~ 6,0 forma ketonowa

O S N Modulacja koloru emisji

*OH

E - CO2

nastpuje poprzez zmian delokalizacji adunku w N S stanie wzbudzonym. McCapra:

H Oksylucyferyna (KETO)

mechanizm TICT(ENOL) Oksylucyferyna pH ~ 8,0 forma enolanowa

O

S N

N S

*OH H

Emisja w zakresie to-zielonym *O (ok. 560 nm) zwizana jest z S N enolanow form wzbudzonego O + dianionuN oksylucyferyny. S

Lucyferazy

Enzymy reakcji BL - lucyferazy s wrd wieccych gatunkw s bardzo zrnicowane.Lucyferaza wietlika (Luc) Thr Schemat wstgowy struktury Luc (ok. 550 a-k). Domena Nkocowa (nieb.-fiol) jest poczona z mniejsz domen Ckocow (ty) poprzez krtki peptyd zawiasowy [1].

Lys

Oddziaywania pomidzy lucyferaz i substratami: lucyferyn (zielony), ATP ( fioletowy) i Mg2+. Interakcje w granicach ok. 24 oznaczono jako

BL w analityce: oznaczanie ATP Okrelanie poziomu ATP jest wykorzystywane jako wskanik ilociywych komrek w ukadzie biologicznym. lucyferaza.

Stosuje si pomiar natenia emisji wiata ukadu lucyferynaRapid Hygiene Tester (Biothema) (< 1 pg ATP)

BL w analityce: BRET Technologia BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)opiera si na moliwoci skierowania energii pochodzcej z reakcji BL (lucyferaza-lucyferyna) do wzbudzenia biaka fluorescencyjnego, znajdujcego si w bliskoci przestrzennej enzymu lucyferazy.

RLuc

eYFP

proteina 1 proteina 2

BRET

Brak oddziaywa

Oddziaywania

BL w analityce: oznaczenia kaspazMonitorowanie aktywnoci kaspaz enzymw z grupy kwasowych proteaz cysteinowo-asparaginowych jest podstawow metod w badaniach procesu apoptozy, czyli programowanej mierci komrki.

Oznaczenia oparte s o specyficzne substraty peptydowe w stosunku do kaspazy 3, 7, metody oznaczenia kaspaz to zastosowanie zwizkw apoptozy. Tradycyjne 8 i 9, pojawiajcych si w ssiedztwie komrek w stanie fluoryzujcych (np. pochodnychs oparte olub fluoresceiny) lub barwnych Najczulsze oznaczenia kaspaz kumaryny analiz luminescencji ukadu (pomiary absorpcji). lucyferyna-lucyferaza.

BL w analityce: oznaczenia kaspazAminolucyferyna (luc) vs rodamina 110 (rho 110) vs Aminokumaryna (AMC)RLU / RFU

Limity detekcji (S/T > 3)

Stenie kaspazy (mU)Z-DEVD H N S N N S COO usuwanie peptydu H2 N S N N S COO H2 N S N N S O + hv

lucyferaza

BL: inspiracje artystyczne

Galeria wiata wczone Galeria wiata wyczone

Dlaczego wiec?

Wprowadzenie obcego fragmentu genu strukturalnego luxCDABE do bakterii umoliwia ekspresj kompleksu enzymatycznego reduktazy kwasu tuszczowego oraz lucyferazy i wywouje emisj promieniowania u organizmu.

BL: inspiracje artystyczne Rnorodno emisjijest zwizana ze wzbudzeniem rnych form fluoryzujcych protein wprowadzonych do zmutowanych genetycznie bakterii.

Obrazek play w SanDiego wykonany za pomoc ywych bakterii emitujcych 8 rnych kolorw BL.

PODSUMOWANIE: pytania, ktre pozostaj Jaka jest historia ewolucyjna wydajnej bioluminescencji?

Jaka jest fizykochemia procesu BL na poziomie

molekularnym w wyniku ktrego efektywnie wytwarzane jest promieniowanie?

Jakie mechanizmy biochemiczne kontroluj synchronicznebyski wiata?

Jak korzy z bioluminescencji czerpi ddownice? W jaki sposb rodowisko wpywa na energi stanuwzbudzonego i przesunicie zakresu emisji? biakami antenowymi?

Jak dochodzi do sprzenia w stanie wzbudzonym z

Materiay rdowe:Conti, Franks and Brick, Structure 4 (1996) 287298. S. Angers, A. Salahpour, E. Joly, S. Hilairet, D. Chelsky, M. Dennis, M. Bouvier, Proc. Nat. Acad. Sci. 97 (2000) 36843689. M. W. Griffiths, J. Dairy Sci 76 (1993) 31183125. J. Perroy, S. Pontier, P.G. Charest, M. Aubry, M. Bouvier, Nature 1 (2004) 203208. A. Roda, P. Pasini, M. Mirasoli, E. Michelini, M. Guardigli, Trends Biotechnol. 22 (2004) 295303. S. Girotti, E.N. Ferri, L. Bolelli, G. Sermasi, F. Fini, Applications of Bioluminescence in Analytical chemistry, w: S.G. Schulman, J. Schulman, Y. Rakiciolu. In: Chemiluminescence in Analytical Chemistry, p. 6781, A.M. Garcia Campaa, W.R.G. Bayenes eds, Marcel Dekker, New York-Basel 2001. http://www.lifesci.ucsb.edu/~biolum/ http://www.lifesci.ucsb.edu/~biolum/chem/ http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm http://www.3rd1000.com/labs/lumine.htm http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/7/3684. http://las.perkinelmer.com/Content/RelatedMaterials/Posters/PSH_BRET2NovelAssayTechnology.pdf http://jds.fass.org/cgi/reprint/76/10/3118.pdf http://www.mapageweb.umontreal.ca/bouvier/bret/index.html Bouviers Lab, Using BRET to study Protein-Protein interactions. Montana State University, Bioglyphs, http://www.erc.montana.edu/Bioglyphs/default.htm S. Hosseinkhani. Bioluminescnece (2007): http://www.modares.ac.ir/sci/saman_h/Pages/Bioluminescence%20.htm

Strony internetowe odwiedzono w okresie 12/2010 04/2011.

Dinoflagellaty, Trynidad