Bez tytułu slajdu...bez zmiany apertury obiektywu prowadzi to tylko do rozciągnięcia obrazu bez...

Mikroskopia

optyczna

Mikroskopia optyczna

Mikroskop to instrument optyczny do

oglądania w powiększeniu małych

przedmiotów.

Mikroskop optyczny wynalazł Holender

Zacharias Janssen w 1595r. Z pomocą ojca

Hansa.

Przyrząd ten udoskonalił Leeuwenhoek,

urzędnik z Delft w 1673r., który biologią

zajmował się tylko amatorsko.

Szlifował on niezwykle precyzyjnie szklane

soczewki w taki sposób, że jego mikroskop

powiększał aż 300 razy. Przy takim

powiększeniu można już było obserwować

mikroorganizmy.

Antony van Leeuwenhoek (1632-1723)


W 1683r. Antony van

Leeuwenhoek opublikował

pierwsze rysunki bakterii i

pierwotniaków.

Pierwsze komórki pod

mikroskopem zaobserwował w

1655r. angielski uczony Robert

Hooke.

A potem już się potoczyło…

http://campus.udayton.edu/~hume/Microscope

/microscope.htm

Robert Hooke (1635-1703)

R. Hooke Micrographia, Royal Society, London, 1665.


Normy dotyczące mikroskopii optycznej:PN-84/N-53050 Przyrządy optyczne wizualne -- Podstawowe wymagania optyczne i metody badań

PN-88/N-53049 Olejek immersyjny do mikroskopów -- Wymagania podstawowe

PN-89/N-53041 Mikroskopy optyczne -- Obiektywy -- Podstawowe wymagania

PN-90/N-53048 Szkiełka do preparatów mikroskopowych

PN-91/N-53053 Mikroskopy optyczne -- Okulary -- Podstawowe wymagania

PN-ISO 8036-1:1996 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Olejek immersyjny ogólnego

stosowania w mikroskopii optycznej

PN-ISO 8037-1:1996 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Szkiełka podstawowe -- Wymiary,

właściwości optyczne i znakowanie

PN-ISO 8038-1:2000 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Gwinty obiektywów i ich opraw --

Gwint typu RMS (4/5 in x 1/36 in)

PN-ISO 8039:2000 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Powiększenie

PN-ISO 8255-1:1996 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Szkiełka nakrywkowe -- Odchyłki

wymiarów, grubość i właściwości optyczne

PN-ISO 8578:1999 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Znakowanie obiektywów i okularów

PN-ISO 9345-1:1999 Optyka i przyrządy optyczne -- Mikroskopy -- Związek odległości obrazowych z

mechanicznymi płaszczyznami odniesienia -- Długość tubusa 160 mm

PN-N-53041:1989 Mikroskopy optyczne -- Obiektywy -- Podstawowe wymagania

PN-N-53048:1990 Szkiełka do preparatów mikroskopowych

PN-N-53049:1988 Olejek immersyjny do mikroskopów -- Wymagania podstawowe

PN-N-53053:1991 Mikroskopy optyczne -- Okulary -- Podstawowe wymagania

http://www.narzedziownie.pl/?t=k&i=620&n=23909

















Konwencjonalna mikroskopia optyczna (ang. far-field

microscopy) wykorzystuje zjawiska związane z płaskimi

falami świetlnymi rozchodzącymi się podłużnie.

NA = nsin Warunek Abbe’go

NA – szczelina (apertura) numeryczna X = Y2/Y1 = n sin u1 / n sin u2

n – współczynnik załamania u1+ u2

Schemat układu optycznego mikroskopu

Źródło

światła

Kondensor wytwarza

równoległą wiązkę

promieni o dużej

intensywności

Soczewki

pomocnicze

przysłona

aperturowa

zmniejsza ilość

światła ale

zwiększa głębie

ostrości

przysłona

pola widzenia

przepuszcza środkową

część wiązki odcinając

promienie zewnętrzne

które wywołują wady

optyczne

okular

Obraz

pośredni

(rzeczywiy)

płytka

półprzeźroczysta

obiektywobiektyw

próbka

Całkowite powiększenie

mikroskopu Pc

Pc = Pob x Pok

Gdzie:

Pob =t/fob oraz Pok =d/fok

Gdzie:

t – długość optyczna tubusu mikroskopu, w mm (odległość pomiędzy ogniskiem obrazowym obiektywu a ogniskiem przedmiotowym okularu)

d – odległość najlepszego widzenia (250 mm)

fob – ogniskowa obiektywu

fok – ogniskowa okularu

Mikroskopia optyczna – ograniczenia

warunek dyfrakcyjny Abbe’go

Mikroskopia optyczna – ograniczeniaZjawisko dyfrakcji Fraunhofera

1. Światło jest rozchodzącą się falą podlegającą ugięciu na szczelinie.

2. Obraz obiektu punktowego może być opisany funkcją

rozproszenia Airy’ego.

sin = k/2d

k – numer prążka


3. Kryterium Rayleigh’a

Najmniejsza rozróżnialna odległość (lmin) określona jest przez odległość

dwóch różnych obiektów punktowych, które mogą być widziane jeśli

maksimum funkcji Airy’ego jednego obiektu pokrywa się z minimum funkcji

Airy’ego drugiego obiektu.

lmin = 0,61 /nsin

/2

lmin 0,4

min 4000 Å

czyli lmin 1600 Å,

więc powiększenie Xmaks 7000, jeśli obraz ma mieć około 1mm.

Mikroskopia optyczna – ograniczeniazdolność rozdzielcza mikroskopu

d =λ/2NAobgdzie:

d – najmniejsza odległość pomiędzy dwoma obiektami przedmiotu, które w obrazie

mikroskopowym mogą być jeszcze rozróżniane jako oddzielne

d

NAob – apertura obiektywu, charakteryzuje możliwość efektywnego wykorzystania obiektywu

dla uzyskania obrazu o możliwie największej ilości szczegółów

α

NAob = nsin

gdzie:

n – współczynnik załamania światła (np. dla powietrza n = 1, dla olejku

immersyjnego n =1,5)

α – kąt pomiędzy główną osią optyczną obiektywu a najbardziej

skrajnym promieniem wpadającym do obiektywu po ugięciu na

preparacie i biorącym jeszcze udział w tworzeniu obrazu

Mikroskopia optyczna – ograniczeniazdolność rozdzielcza mikroskopu

1/d =λ/2n·sinα

Przykład obliczeń:

Stosując do oświetlenia preparatu w mikroskopie wiązkę światła

monochromatycznego o długości fali 0,55 μm (550 nm), przy

obiektywie o aperturze 0,65 zdolność rozdzielcza mikroskopu

wyniesie 0,42 μm (420 nm). Dla porównania - rozmiar bakterii waha

się w granicach 0,2 μm do kilkunastu μm.

Graniczna zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego mikroskopu

wynosi 0,15 μm (150 nm) przy założeniu, że α = 90°, n = 1,52

(obserwacje z immersją), λ=0,45 μm (450 nm, niebieskie).


zdolność rozdzielcza mikroskopu

Mikroskopia optyczna – ograniczeniapowiększenie użyteczne mikroskopu

Powiększenie „puste” jest związane z ograniczoną zdolnością

rozdzielczą oka. Zwiększenie Pok bez zmiany apertury

obiektywu prowadzi to tylko do rozciągnięcia obrazu bez

ujawnienia nowych szczegółów.

Puż = lo/d

lo – zdolność rozdzielcza oka około (0,15 – 0,3) mm

d – zdolność rozdzielcza mikroskopu

Przyjmując średnią długość fali dla światła białego λ=0,55·10-3 mm

można wykazać, że:

Puż ~ (500÷1000)· NAob

Mikroskopia optyczna – ograniczeniaprzykład doboru okularu do obiektywu

Do obserwacji zostanie użyty obiektyw o powiększeniu 63 i aperturzeNAob=0,65 (na obiektywie 0,65/63). Jaki należy dobrać okular?

Puż ~ (500÷1000)· NAob=325-650Zakładamy, że Puż=Pc, więc

Pok=(Puż/Pob)=(325/63)÷(650/63)= 5,1÷10,3

Przy okularach o większym powiększeniu wystąpi tzw. powiększeniepuste, a przy okularach o mniejszym powiększeniu nie wszystkieszczegóły obrazu obiektywowego zostaną dostatecznie powiększone irozróżnione przez oko ludzkie w obrazie mikroskopowym.

Budowa mikroskopu

Pierwszy mikroskop składał się z jednej soczewki.

Wady soczewek:

• aberracje, np. chromatyczna),

• astygmatyzm,

• koma.

Aż do współczesnych układów wieloelementowych.

Budowa mikroskopuhistoria i współczesność

1. Jones, Thomas E.1995. http://www.utmem.edu/~thjones/hist/hist_mic.htm

2. Bradbury S. 1967. The Evolution of the Microscope.Pergamon PressLtd, Oxford,

London.

3. Samuel H. Cohen. 1994. Seeing the Invisible: The New Microscope. Collier’s Year

Book.

4. Bradbury S. 1968. The Microscope: Past And Present. Pergamon PressLtd, Oxford,

London.

5. Ford, Brian J. 2001. http://www.sciences.demon.co.uk/whistmic.htm

6. Doane, Nathaniel . 1995.

http://www.otal.umd.edu/~vg/amst205.F97/vj06/project6.html

7. 1998 A-Z Microscope Corporation. http://www.az-

microscope.on.ca/history/history.html

http://www.ucmp.berkeley.edu/history/hooke.html

http://www.utmem.edu/~thjones/hist/hist_mic.htm

http://www.sciences.demon.co.uk/whistmic.htm

http://www.otal.umd.edu/~vg/amst205.F97/vj06/project6.html

http://www.az-microscope.on.ca/history/history.html

http://www.ucmp.berkeley.edu/history/hooke.html

Mikroskopia optycznametody badań mikroskopowych

Maksymalna ilość informacji przy obserwacjach mikroskopowych

zależy nie tylko od zdolności rozdzielczej mikroskopu, ale również

od dostatecznie dużego kontrastu pomiędzy interesującymi

szczegółami preparatu.

Zwiększenia kontrastu można dokonać na drodze optycznej.

Mikroskopia optycznametody badań mikroskopowych

Techniki:

w jasnym polu

w ciemnym polu

w świetle spolaryzowanym

z kontrastem fazowym i interferencyjnym

Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym polu

Preparat oświetlony jest wiązką prostopadłą do jego powierzchni (oświetlacz Becka – półprzeźroczysta płytka szklana ustawiona pod kątem 45° do osi optycznej obiektywu). Obraz jest płaski z

ostrymi i wąskimi konturami szczegółów.

Zalety:

• Pełne wykorzystanie apertury obiektywu i tym samym

zdolności rozdzielczej.

Wady:

• Duże straty światła na płytce półprzezroczystej zmniejszają

jasność i kontrast.

• Konieczność używania silnych źródeł światła np. lampy

rtęciowej lub ksenonowej.

Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym polu

Preparat oświetlony jest wiązką skośną do jego powierzchni (oświetlacz Nacheta – zamiast płytki szklanej pryzmat).

Obraz jest bardziej plastyczny i kontrastowy.

Zalety:

• Znacznie jaśniejszy obraz niż przy oświetlaczu

Becka.

Wady:

• Pogorszenie zdolności rozdzielczej mikroskopu

ponieważ jest wykorzystana tylko połowa apertury

obiektywu.

Mikroskopia optycznaobserwacje w ciemnym polu

Preparat oświetlony jest wiązką skośną do jego powierzchni (oświetlaczwykonany z pierścienia szklanego ustawiony pod kątem 45° do osioptycznej obiektywu). Uzyskuje się efekt czarnego tła obrazu, naktórym pojawiają się jasne kontury nierówności, którychpowierzchnia nie jest prostopadła do głównej osi optycznejobiektywu.

Zaletą tego sposobu obserwacji jest

maksymalne wykorzystanie apertury

obiektywu, co zapewnia wykorzystanie

pełnej zdolności rozdzielczej.

Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym i w ciemnym polu - przykłady

Badanie krwi w ciemnym polu widzenia jest ściśle związane

z osobą niemieckiego profesora Günthera Enderleina (1872-

1968), który stworzył podstawy teoretyczne tego badania.

Do badania używa się świeżej krwi włośniczkowej pobranej z

opuszka palca. Bezpośrednio po pobraniu krew umieszcza

się na szkiełku podstawowym, przykrywa szkiełkiem

nakrywkowym i ogląda pod mikroskopem z ciemnym polem

widzenia.

Ciemne pole ma przewagę nad jasnym pod względem

obserwacji mikroorganizmów, szczególnie bakterii, bez

potrzeby ich utrwalania i wybarwiania, gdyż wyraźnie świecą

one na ciemnym polu obserwacji.

Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym i w ciemnym polu - przykłady

Bieg promieni w mikroskopie

a) z ciemnym polem widzenia, b) z jasnym polem widzenia

Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym i w ciemnym polu – przykłady

Obraz krwi w mikroskopie

a) z ciemnym polem widzenia, b) z jasnym polem widzenia

Mikroskopia optycznaobserwacje w ciemnym polu – przykłady

Obraz Treponema pallidum w

mikroskopie z ciemnym polem

widzenia Krętek blady (Treponema

pallidum) pod mikroskopem

elektronowym

Mikroskopia optycznaobserwacje w ciemnym polu – przykłady

Skrzydło motyla w mikroskopie z

ciemnym polem widzenia

(powiększenie 50x)

Mikroskopia optycznaobserwacje w jasnym i w ciemnym polu – literatura

W.Z. Traczyk: Fizjologia człowieka w zarysie, PZWL

2000.

A. Litwin: Podstawy technik mikroskopowych,

Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków

1999.

Ratajczak J., Wysocki M., Hayek F., Janowska-Wieczorek

A., Ratajczak M.Z.: Membrane-devided microvesicles:

important and underappreciated mediators of cell-to-cell

communication. Leukamia 20, 1487-1495, (2006).

Mikroskopia optycznaobserwacje w świetle spolaryzowanym

• Mikroskop polaryzacyjny to mikroskop, który przystosowany jest do obserwacji preparatów w świetle spolaryzowanym liniowo. Wykorzystywany jest on głównie do badania anizotropowości obiektów.

• Oprócz klasycznych elementów mikroskopu, w polaryzacyjnym występuje jeszcze dodatkowo polaryzator, analizator oraz soczewka Bertranda. Polaryzator jak sama nazwa wskazuje, służy do polaryzacji światła, analizator - do sprawdzenia polaryzacji światła. Soczewka Bertranda jest to soczewka, której użycie powoduje powstanie jedynie obrazu źrenicy obiektywu, a w okularze nie obserwujemy obrazu preparatu. Gdy nie ma preparatu na stoliku, to skrzyżowanie polaryzatora i analizatora spowoduje powstanie w źrenicy obiektywu obrazu przedstawiającego czarny krzyż tzw. konoskopowy.

• Gdy natomiast umieścimy na stoliku preparat, to krzyż ten zostanie zmodyfikowany i utworzy się figura charakterystyczna dla danego typu anizotropowości jaka występuje w preparacie.


• W przypadku gdy obserwujemy pod mikroskopem jedno-lub dwuosiowy kryształ, to powstały obraz (oprócz krzyża) może także przedstawiać barwne prążki, a także pewne figury interferencyjne, które są określane mianem obrazów konoskopowych. Do analizy takich obrazów wykorzystuje się zazwyczaj płytki opóźniające, jak np. ćwierćfalówka lub też dwójłomne kompensatory.

• Pierwszy mikoskop polaryzacyjny został skonstruowany w 1834 roku, przez Tabolta i Brewstera i był wówczas wykorzystany do badania minerałów. Obecnie mikroskopy polaryzacyjne wykorzystywane są w biologii i medycynie, gdzie bada się nimi strukturę komórek i tkanek, a także w metalografii, czy przemyśle szklarskim i włókienniczym.


Płaszczyzna drgań wektora Ē

Polaryzator Płaszczyzna polaryzacji światła

kierunek polaryzacji polaryzatora

kierunek biegu wiązki światła

Płaszczyzna drgań wektora Ē

Polaryzator Płaszczyzna polaryzacji światła

kierunek polaryzacji polaryzatora

kierunek biegu wiązki światła

Polaryzator Analizator

Źródło

światła

Ē B


Celem badań w świetle spolaryzowanym jest wykrywanie

anizotropii szczegółów obserwowanego obiektu

Polaryzator umieszczany jest zwykle przed kondensorem.

Po odbiciu od powierzchni wiązka promieni świetlnych dostaje się

do analizatora.

Analizator ustawiony „równolegle” przepuszcza wiązkę, a

„skrzyżowany” wygasza światło spolaryzowane.

Izotropowa powierzchnia nie zmienia stanu polaryzacji wiązki

światła (płasko spolaryzowana wiązka pozostaje taka sama i może

być wygaszona przez właściwy obrót analizatora).


Oprócz obserwacji przy jednoczesnym zastosowaniu polaryzatora i

analizatora można prowadzić obserwację przy wprowadzeniu w bieg

promieni samego analizatora. Otrzymuje się wtedy interesujące dane

o właściwościach optycznych (zmiana świecenia, charakterystyczne

zabarwienie) składników strukturalnych preparatu wykazujących

silną anizotropię.

Okresowo powtarzające się wygaszanie i rozjaśnianie obrazu

podczas obracania stolika mikroskopu przy skrzyżowanych nikolach

oznacza, że dany szczegół wykazuje zjawisko anizotropii optycznej.

Jeżeli mimo obrotu obraz szczegółu pozostaje jednakowo jasny,

wtedy jest on izotropowy.

A. Litwin: Podstawy technik mikroskopowych, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego,

Kraków 1999.

Mikroskopia optycznaobserwacje w świetle spolaryzowanym - przykłady

Z. Róg, J.E. Badurski : Ocena form i stopnia mineralizacji chrząstki stawowej metodą

mikroskopii optycznej w świetle spolaryzowanym. Postępy Osteoartrologii 6, 48, 1994.

Włókna jedwabiu Ludzki włos

Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego

Przy prowadzeniu obserwacji w jasnym polu, kontrast w obrazie

powstaje w wyniku różnic natężenia (amplitudy) i barwy światła

odbitego od powierzchni. Jeżeli jednak szczegóły powierzchni nie

zmieniają amplitudy oraz długości fali, a powodują jedynie

przesunięcie w fazie fal świetlnych odbitych od nich (względem

fal odbitych od powierzchni), wtedy nie dają one zmiany

kontrastu w obrazie.

Metoda kontrastu fazowego

została opracowana przez

holenderskiego fizyka Fritsa

Zernike (1888-1966), za co w

roku 1953 otrzymał Nagrodę

Nobla.


Długość wektorów odpowiada

amplitudzie fal świetlnych, a kierunek

ich fazie. OP jest wektorem światła

odbitego od punktu powierzchni, a

wektor OQ od szczegółu znajdującego

się blisko powierzchni, ale leżącego w

zagłębieniu o takiej samej zdolności

odbijania światła jak powierzchnia.

Na skutek różnicy dróg optycznych światła odbitego od powierzchni i od zagłębienia pojawia się

opóźnienie fazowe φ wektora OQ względem wektora OP. Zgodnie z teorią Abbego obraz powstaje w

wyniku interferencji światła ugiętego na przedmiocie z światłem nieugiętym. W wyniku tej interferencji

widać, że wektor OQ jest sumą wektorów OP i PQ. Kąt ψ jest bliski 90o jeżeli kąt opóźnienia fazowego φ

jest mały. OP odpowiada wektorowi światła nieugiętego PQ natomiast reprezentuje wektor światła ugiętego

na preparacie. Ponieważ wektor OP ma taką samą długość (amplitudę) jak wektor OQ natężenie światła w

obszarze zajmowanym przez obraz szczegółu przedmiotu jest takie samo jak w pozostałej części pola

widzenia. Szczegół ten jest więc w obrazie niewidoczny. Jeżeli jednak w płaszczyźnie ogniskowej

obrazowej obiektywu umieści się płytkę fazową, która zmieni fazę światła ugiętego PQ o + 90o lub -90o

(odpowiada to obrotowi wektora PQ do pozycji PQ’ lub PQ’’), wtedy w wyniku interferencji tego światła ze

światłem nieugiętym OP w obrazie pojawi się kontrast od niewidocznego poprzednio szczegółu.

O P O

Qφ

O P O

Qφψ

P

O P O P

Q

Q’ Q’’P

Schemat mikroskopu do badań z kontrastem fazowym

Źródło

światła

kondensor

Przysłona

pierścieniowa

przysłona

aperturowa

przysłona

pola widzenia

okular

płytka

fazowa

płytka

półprzeźroczysta

obiektywobiektyw

próbka


Mikroskopia optycznaobserwacje przy zastosowaniu kontrastu fazowego - przykłady

Hodowla komórek – obserwacja w kontraście fazowym


Pasożyt Taenia pisiformis (tasiemiec) –

obserwacja w kontraście fazowym.

Osiąga długość do 2m. Dojrzałe człony osiągają

szerokość większą niż długość (porównaj

zdjęcie).

Najczęściej spotykany u psów. Jego żywiciele

pośredni to zające, króliki, drobne gryzonie.


Orzęsek Paramecium bursaria – obserwacja w

kontraście fazowym.

Organizm jednokomórkowy, częsty obiekt

badań biologów.


Zalety metody obserwacji z kontrastem fazowym:

1. Bardzo duża czułość – można wykrywać szczegóły struktury o różnicach

wysokości powyżej 5 nm.

2. Umożliwia obserwację przezroczystych struktur komórkowych, które zmieniają

fazę światła i/lub nieznacznie je uginają, nie powodując jednocześnie spadku

jego amplitudy promieniowania. Może być stosowana również do preparatów

żywych.

3. Eliminuje konieczność uprzedniego czasochłonnego barwienia preparatu.

4. W mikroskopach kontrastowo-fazowych bardzo dobrze widać znacznie więcej

organelli komórkowych, również drobnych, które nie są dostrzegalne w

mikroskopie jasnego pola.

5. Wyraźnie widać również niektóre procesy życiowe komórki, jak ruch

cytoplazmy lub endocytozę.

Mikroskopia optycznaobserwacje z kontrastem interferencyjnym - zjawisko interferencji

przesłona z dwiema szczelinami

przesłona z jedną szczeliną

ekran

źródło

światła

n = dsin

Mikroskopia optycznaobserwacje z kontrastem interferencyjnym – przykłady

Ze zjawiska interferencji światła korzysta również mikroskopia

interferencyjna. Działa ona na tej samej zasadzie, co kontrast faz, tzn.

zamienia różnicę w fazie wiązek świetlnych na jedną wiązkę świetlną

o nowej amplitudzie.

Dokonuje tego jednak w zupełnie inny sposób, a mianowicie

rozszczepiając wiązkę światła na dwie oddzielne, jeszcze zanim

dotrze do stolika z obserwowanym obiektem. Jedna z wiązek po

przejściu przez preparat może ulec na strukturach komórkowych

przesunięciu w fazie, po czym w obiektywie znów zbiega się z drugą

wiązką, której bieg jest tak ustawiony, aby pominąć preparat.

Podobnie, jak wcześniej dochodzi do interferencji i wzmocnienia, lub

osłabienia amplitudy światła.


Mikroskopia interferencyjna pozwala na

wyznaczenie suchej masy komórek z dużą

dokładnością lub określenie grubości preparatu.

Istnieje też możliwość rozszczepienia wiązki

świetlnej na poszczególne składowe widma światła

białego, dzięki czemu można w nieszkodliwy dla

komórek sposób pozornie wybarwić je światłem, a

nie odczynnikami chemicznymi.


Badanie włókien

kolagenowych

nicień


Komórki HeLa – obserwacja

w kontraście fazowym (a) i w kontraście interferencyjnym (b)

Dawczynią komórek HeLa była Henrietta Lacks, która w wieku lat 31 zgłosiła się

do John Hopkins University z zaawansowanym stadium nowotworu.

Dziś linia komórkowa HeLa służy naukowcom do badań.

a b


Pasożyt Echinococcus granulosus (Tasiemiec bąblowcowy, bąblowiec)

w kontraście fazowym (a) i w kontraście interferencyjnym (b)

Gatunek tasiemca, w postaci dojrzałej bytujący w jelicie cienkim

psowatych, przypadkowo występujący u człowieka, który jest wtedy

żywicielem pośrednim.

a b

Badania komórek i tkanek

Histopatologia (histologia patologiczna) jest działem

patomorfologii (dawniej nazywanej anatomią patologiczną),

która bada i rozpoznaje zjawiska mikroskopowe zachodzące

w komórkach oraz tkankach organizmu przy różnego

rodzaju schorzeniach.

Badanie histopatologiczne materiału tkankowego ma duże

znaczenie w rozpoznawaniu chorób nowotworowych, wielu

schorzeń zapalnych i zwyrodnieniowych, monitorowaniu

postępu leczenia, a także przy stwierdzeniu przyczyny

zgonu i istniejących zmian chorobowych u osób zmarłych,

u których wykonano sekcję.


Zakres wykorzystania diagnostycznego i znaczenie histopatologii w codziennej praktyce klinicznej stale się zwiększa. Przedmiotem badania histopatologicznego są usunięte chirurgicznie narządy lub części narządów oraz

specjalnie pobrane wycinki tkankowe w trakcie zabiegów chirurgicznych nazywanych biopsją. Badanie histopatologiczne w odróżnieniu od badania

cytopatologicznego umożliwia ocenę przestrzenną zmian chorobowych w tkance, stąd rozpoznania

histopatologiczne są na ogół wiarygodniejsze i dokładniejsze niż cytologiczne.


Cytopatologia to metoda diagnostyczna w medycynie,

polegająca na badaniu pod mikroskopem świetlnym

komórek pobranych przyżyciowo.

Ocena mikroskopowa polega na analizie składu

komórkowego preparatu, szczegółów

cytologicznych, poszczególnych komórek, sposobu

grupowania się komórek (płaty, gniazda, komórki

rozproszone etc.) oraz tzw. "tła" preparatu (bakterie,

składniki nieupostaciowane, wydzielina białkowa).


Zaletami badań cytopatologicznych (w porównaniu z

badaniami histopatologicznymi są:

• mała inwazyjność badania i możliwość ich powtarzania,

• niewielkie koszty materiałowe,

• szybkość badania,

• prostota procedur laboratoryjnych (zwłaszcza pominięcie

etapu bloczka parafinowego, podczas którego niszczone są

niektóre substancje zawarte w komórkach np. tłuszcze,

glikogen, niektóre białka, co czyni możliwe je do

uwidocznienia drogą specjalnych barwień),

• dobre uwidocznienie szczegółów komórkowych.


Wadami badań cytopatologicznych (w porównaniu z histopatologicznymi) są:

• niemożność oceny topografii tkankowej (wzajemnego położenia komórek, włókien, naczyń, etc.),

• trudności w ocenie ilościowej obrazu mikroskopowego,

• czasochłonność przy ocenie preparatów cytopatologicznych, wymagająca dużej skrupulatności, wnikliwości i spostrzegawczości od oceniającego (powoduje mniejszą wydajność oceniających wynikającą m.in. ze znużenia i zmęczenia wzroku),

• mała liczba specjalistów umiejących wiarygodnie oceniać niektóre typy preparatów (konieczność posiadania dużego doświadczenia przez cytopatologa przy ocenie niektórych materiałów),

• mniejsza objętość próbki (nie zawsze).


Badanie cytopatologiczne jest wykorzystywane zwłaszcza w

diagnostyce wczesnych postaci chorób nowotworowych, a

także w ocenie zaburzeń hormonalnych monitorowaniu

postępu leczenia i innych.

W przypadkach wątpliwych, ocena cytopatologiczna

powinna być potwierdzona badaniem histopatologicznym,

które umożliwia ocenę większej liczby szczegółów obrazu

mikroskopowego.

Badania materiałów cytologicznychMateriał cytologiczny może pochodzić z:

1. biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej (zabieg z użyciem typowej igły iniekcyjnej i

strzykawki; nakłucie badanej tkanki oraz wytworzenie podciśnienia poprzez

wsteczny ruch tłoka powoduje niewielką, miejscową traumatyzację, wystarczającą

do uwolnienia niewielkich grup komórek aspirowanych do światła igły; z pobranych

komórek sporządza się preparaty cytologiczne),

2. cytologii złuszczeniowej:

• wydzieliny ciała (fizjologiczne i patologiczne),

• płyny z jam ciała i aspiraty (przy większej objętości płynu, w którym znajduje

się złuszczony materiał komórkowy, jest on zagęszczany przez delikatne

wirowanie lub sedymentację),

• rozmaz, szczotkowanie (materiał uzyskany z powierzchni zmiany lub błony

śluzowej, który jest bezpośrednio nanoszony na szkiełko mikroskopowe),

3. preparatów miażdżonych (niewielkie strzępki tkankowe są rozcierane lub

rozdrabniane bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym),

4. preparatów odbitkowych (komórki są pozyskiwane poprzez przesuwane szkiełka

podstawowego po świeżo wykonanym przekroju badanej tkanki, np. przekroju guza,

węzła chłonnego).

Badania materiałów cytologicznych

Cytologia to nauka o strukturze żywych komórek, ich funkcji

(cytofizjologia), rozwoju i rozmnażaniu (cytokineza); dział histologii

botanicznej i zoologicznej (także medycznej). Cytologia pojawiła się w

XIX wieku wraz z udoskonaleniem mikroskopii optycznej, co pozwoliło

zaobserwować podstawowe elementy składowe komórki (np. jądro

komórkowe i cytoplazmę). Dzięki rozwojowi nowych metod w XX

wieku (m.in. mikroskopii elektronowej) poznano ultrastrukturę i funkcje

drobniejszych struktur komórkowych (organelli, cytoszkieletu czy

kompartmentacji cytoplazmy).

Po pozyskaniu materiał cytologiczny umieszcza się na szkiełku

mikroskopowym, poddaje barwieniu i utrwaleniu.

Badania materiałów cytologicznychpozyskanie materiału

Materiał do badania cytologicznego w ramach programu profilaktycznego szyjki macicy jest pobierany z tarczy części pochwowej i kanału szyjki specjalną szczoteczką, która pozwala na pobranie komórek nie tylko komórek nabłonka

zgodnie z kryteriami prawidłowej oceny cytologicznej.

Materiał cytologiczny zwykle pobierany jest bezpośrednio na szkiełka mikroskopowe i

natychmiast utrwalany.


Proces utrwalania umożliwia zachowanie obrazu komórkowego po natychmiastowym przerwaniu

wszystkich życiowych funkcji komórki. Aby ten cel osiągnąć należy bezpośrednio po pobraniu rozmazu,

utrwalić go za pomocą utrwalacza.

Przedłużenie czasu jaki upłynął od pobrania materiału do jego utrwalenia powoduje wysychanie materiału, jego

obkurczanie się bądź procesy rozpadu uniemożliwiające prawidłowe zabarwienie się i interpretację uzyskanych obrazów. Jako utrwalacz w diagnostyce cytologicznej

stosowano początkowo 96% alkohol, a obecnie częściej aerozolowe preparaty do utrwalania rozmazów

biologicznych. Przed ich późniejszą oceną wykonuje się barwienie przygotowanych preparatów.


W wyniku skomplikowanej procedury komórki warstw powierzchniowych barwią się na kolor różowo-

czerwony, a komórki warstw pośrednich zielono-niebiesko. Jądra komórkowe barwią się hematoksyliną na kolor fioletowo-niebieski. Erytrocyty są czerwone, leukocyty mają ciemno barwiące się hematoksyliną

jądra i zielonkawą cytoplazmę. O komórkach barwiących się czerwono mówimy, że są

eozynochłonne, a o przyjmujących barwę zielono-niebieską cyjanochłonne. Barwienie umożliwia

rozpoznanie komórek nieprawidłowych.


Obecnie stosuje się wzór opisu według systemu Bethesda, który nie tylko informuje o obecności komórek nowotworowych, ale także o procesach

zapalnych i zmianach charakterystycznych dla konkretnych wirusów, bakterii czy grzybów. Wynik badania zawsze zawiera:

1. Oświadczenie na temat przydatności pobranego materiału do oceny cytologicznej.

2. Ocenę ogólną prawidłowości nabłonka szyjki macicy.

3. Część opisową obejmującą:

– zakażenia,

– zmiany odczynowe,

– zmiany nowotworowe w komórkach nabłonkowych,

– inne zmiany nowotworowe,

– ocenę cytohormonalną.

www.zdrowiekobiety.org

Badania preparatów

barwienie

Metoda Grama barwienia bakterii została opracowana w 1884

roku przez Duńczyka, Hansa Christiana Grama (1853–1938).

Pozwala ona doświadczalnie zróżnicować te organizmy na dwie

duże grupy (Gram-dodatnie i Gram-ujemne) ze względu na

różnice w budowie ściany komórkowej oraz, co za tym idzie,

także pewne różnice w fizjologii i podatności na leki.

Badania preparatów

mechanizm barwienia

• Wszystkie komórki bakteryjne, zarówno Gram-dodatnie, jak i Gram-ujemne,

zabarwiają się fioletem krystalicznym.

• Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego

tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu. Na tym etapie

obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe.

• Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje

zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych,

mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. W rezultacie

kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w

przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol

świetnie wypłukuje barwnik.

• Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-

ujemne – bezbarwne.

• Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) niezbyt mocno dobarwia komórki

Gram-ujemne, nie zmieniając barwy komórek Gram-dodatnich.

Badania preparatów

barwienie i utrwalanie

Barwienie metodą Ziehla-Nielsena to rodzaj techniki

diagnostycznej służącej do odróżniania bakterii

kwasoopornych i niekwasoopornych (diagnostyka gruźlicy).

Kwasooporność np. prątków jest zależna od budowy

fizykochemicznej i obecności kwasu mikolowego.

Metodą tą można też barwić zarodniki grzybów i przetrwalniki

bakterii.

Badania preparatów

barwienie i utrwalanie

• Na utrwalony rozmaz bakterii na odtłuszczonym szkiełku podstawowym

nanosi się barwnik podstawowy (stężona fuksyna) na 15 min. W trakcie

barwienia preparat podgrzewany jest palnikiem,

• Barwnik zlewa się i spłukuje wodą destylowaną,

• Preparat odbarwia się w 3% roztworze HCl w etanolu (tzw. kwaśny alkohol) i

spłukuje wodą destylowaną,

• Następnie nanosi się barwnik kontrastowy, np. błękit metylenowy na 10 min., a

następnie spłukuje wodą destylowaną i suszy.

• W wyniku takiego postępowania bakterie kwasooporne przybierają kolor

czerwony pochodzący od fuksyny (nie odbarwiają się one bowiem w kwaśnym

alkoholu). Natomiast bakterie niekwasooporne są wrażliwe na działanie

kwaśnego alkoholu, odbarwiają się w nim z fuksyny i mają kolor niebieski

pochodzący od błękitu metylenowego.

Badania preparatów

literatura

1. K. Florczak, G. Głąb: Cytodiagnostyka w ambulatoryjnej opiece

ginekologicznej - atlas multimedialny, DMITF, Gdańsk 2006.

2. E.U. Kurczyńska, D. Borowska-Wykręt: Mikroskopia świetlna w

badaniach komórki roślinnej. Ćwiczenia. Wydawnictwo Naukowe

PWN, Warszawa 2007.

Wszystko o mikroskopii i mikroskopach:

definicje i podstawowe pojęcia

bardzo ciekawe filmy i prezentacje

http://micro.magnet.fsu.edu

Mikroskopia optycznaliteratura

Mikroskopia optycznaliteratura

Fizyczne metody badań w biologii, medycynie i ochronie

środowiska, pod red. A.Z. Hrynkiewicza i E. Rokity,

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1999.

Podstawy technik mikroskopowych, Jan A. Litwin,

Wydawnictwo Collegium Medicum UJ, Kraków 1995.

Mikroskopia elektronowa, pod red. Andrzeja Barbackiego,

Wydawnictwo Politechniki Poznańskiej, Poznań 2003.

Bez tytułu slajdu...bez zmiany apertury obiektywu prowadzi to tylko do rozciągnięcia obrazu bez...

Documents

Transcript of Bez tytułu slajdu...bez zmiany apertury obiektywu prowadzi to tylko do rozciągnięcia obrazu bez...