Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych · 2017. 6. 8. · “Molecular...

Załącznik 2

Autoreferat

przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych

dr Robert Lenartowski

Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Wydział Biologii i Ochrony Środowiska

Pracownia Izotopowa i Analizy Instrumentalnej

Spis treści

1. Dane biograficzne

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych

4. Wskazanie osiągnięcia naukowego

5. Komentarz autorski do publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe

5.1 Wprowadzenie

5.2 Cel badań

5.3 Model badawczy

5.4 Główne tezy osiągnięcia naukowego

5.5 Podsumowanie

5.6 Literatura

6. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych

1. Dane biograficzne

Robert Lenartowski

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe

1995 dyplom magistra biologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi (BiNoZ), Uniwersytet

Mikołaja Kopernika w Toruniu (UMK w Toruniu)

1995 dyplom ukończenia Międzywydziałowego Studium Pedagogicznego, UMK w

Toruniu

2001 dyplom doktora nauk biologicznych, Wydział BiNoZ, UMK w Toruniu

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych

2001-2005 asystent, Pracownia Genetyki, Wydział BiNoZ UMK w Toruniu

2003-2005 associate researcher, prof. Karen O’Malley Laboratory, Washington

University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

2006-2012 adiunkt, Zakład Genetyki, Wydział BiNoZ UMK w Toruniu

od 2011 kierownik Pracowni Izotopowej i Analizy Instrumentalnej (PIiAI),

Wydział BiNoZ, UMK w Toruniu

od 2013 adiunkt, PIiAI, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska (BiOŚ, dawny

Wydział BiNoZ), UMK w Toruniu

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o

stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki

(Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):

Tytuł osiągnięcia naukowego:

Ekspresja i funkcja kalretikuliny podczas kluczowych wydarzeń procesu rozmnażania

generatywnego Petunia hybrida

Osiągnięciem naukowym zgłoszonym do postępowania habilitacyjnego jest spójny

tematycznie cykl publikacji, złożony z czterech oryginalnych prac badawczych i jednej pracy

przeglądowej, opublikowanych w latach 2009-2017. Prace eksperymentalne zawierają wyniki

badań nad rolą kalretikuliny (CRT, ang. calreticulin) w procesie rozmnażania generatywnego

roślin okrytozalążkowych na przykładzie Petunia hybrida (Ph), prowadzonych przeze mnie w

kilkuosobowym zespole naukowym. Polskojęzyczna publikacja przeglądowa, stanowiąca

wstęp teoretyczny do prezentowanych prac doświadczalnych, opisuje budowę i lokalizację

komórkową CRT oraz funkcje tego białka w komórkach eukariotycznych. Syntetyczny opis

najważniejszych wyników badań przedstawia komentarz autorski. Łączny wskaźnik

oddziaływania (IF, ang. impact factor) czterech oryginalnych prac badawczych będących

podstawą osiągnięcia naukowego wynosi 12,942 (zgodnie z rokiem opublikowania),

natomiast sumaryczna liczba punktów wszystkich pięciu publikacji wg listy MNiSW wynosi

154 pkt. (zgodnie z rokiem opublikowania). Dla pracy opublikowanej w 2017 r. przyjęto

wartość IF oraz punktację MNiSW z 2016 r.

Wykaz prac stanowiących osiągniecie naukowe:

1. Lenartowska M, Walczewski J, Lenartowski R (2009) „Kalretikulina – budowa,

lokalizacja komórkowa oraz proponowane funkcje u zwierząt i roślin”. Post Bioch 55:406-

15. 4 pkt. MNiSW

Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu jej koncepcji oraz wiodącej roli w

przygotowaniu i korekcie manuskryptu.

Swój udział procentowy w powstaniu pracy szacuję na 70%.

2. Lenartowski R, Suwińska A, Prusińska J, Gumowski K, Lenartowska M (2014)

“Molecular cloning and transcriptional activity of a new Petunia calreticulin gene involved

in pistil transmitting tract maturation, progamic phase, and double fertilization”. Planta

239:437-454. IF: 3,376; 40 pkt. MNiSW

Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i

koordynacji przebiegu wszystkich zadań badawczych oraz przeprowadzeniu większości

doświadczeń. Wykonałem analizy in silico, sklonowałem i scharakteryzowałem pełnej

długości sekwencję PhCRT cDNA, na jej podstawie wygenerowałem sondę molekularną

specyficzną dla PhCRT mRNA, wykonałem hybrydyzację northern, analizę Western blot

oraz badania ilościowe i statystyczne oraz uczestniczyłem eksperymentach z

wykorzystaniem FISH. Miałem wiodący udział w interpretacji uzyskanych wyników badań,

przygotowaniu manuskryptu i ostatecznej korekcie wydawniczej jako autor

korespondujący.


3. Lenartowski R, Suwińska A, Lenartowska M (2015) “Calreticulin expression in relation

to exchangeable Ca2+

level that changes dynamically during anthesis, progamic phase, and

double fertilization in Petunia”. Planta 241:209-227. IF: 3,239; 40 pkt. MNiSW

Mój wkład w powstanie pracy polegał na opracowaniu koncepcji badań, zaplanowaniu i

koordynacji przebiegu wszystkich zadań badawczych oraz przeprowadzeniu większości

doświadczeń. Wykonałem analizę Western blot, badania ilościowe, statystyczne i

immunocytochemiczne oraz uczestniczyłem w analizach cytochemicznych. Miałem wiodący

udział w interpretacji uzyskanych wyników badań, przygotowaniu manuskryptu i

ostatecznej korekcie wydawniczej jako autor korespondujący.


4. Suwińska A, Lenartowski R, Smoliński DJ, Lenartowska M (2015) “Molecular

evidence that rough endoplasmic reticulum is the site of calreticulin translation in Petunia

pollen tubes growing in vitro”. Plant Cell Rep 34:1189-99. IF: 3,088; 35 pkt. MNiSW wskazani autorzy mają równy udział w publikacji

Mój wkład w powstanie pracy polegał na współudziale w opracowaniu koncepcji badań

oraz ich realizacji. Przygotowałem sondy molekularne specyficzne dla PhCRT mRNA i

Ph18S rRNA. Miałem wiodący udział w koordynacji przebiegu zaplanowanych zadań

badawczych, interpretacji uzyskanych wyników i przygotowaniu manuskryptu.


5. Suwińska A, Wasąg P, Zakrzewski P, Lenartowska M, Lenartowski R (2017)

“Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in

Petunia”. Planta doi:10.1007/s00425-017-2649-0. IF: 3,239; 35 pkt. MNiSW

Mój wkład w powstanie pracy polegał na współudziale w opracowaniu koncepcji badań

oraz wiodącej roli w zaplanowaniu i koordynacji przebiegu wszystkich zadań badawczych

oraz udziale w ich realizacji. Wykonałem analizy in silico, zaprojektowałem i

zweryfikowałem doświadczalnie sekwencje siRNA degradujące wybiórczo PhCRT mRNA i

wygenerowałem sondę molekularną specyficzną dla PhCRT mRNA. Uczestniczyłem w

przeprowadzeniu większości eksperymentów, w tym badań ilościowych i analiz

statystycznych. Miałem wiodący udział w interpretacji uzyskanych wyników badań,

przygotowaniu manuskryptu i ostatecznej korekcie wydawniczej jako autor

korespondujący.


5. Komentarz autorski do publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe

Cytowania prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego zostały wyróżnione

Wykaz najczęściej stosowanych skrótów:

AF filamenty aktynowe

Ca2+

wapń/jony wapnia

Ca2+c stężenie Ca

2+ w cytozolu

CRT/CRT gen/białko kalretikuliny/a

ER siateczka śródplazmatyczna

FISH fluorescencyjna in situ hybrydyzacja

Ph Petunia hybrida

PTGS potransrypcyjne wyciszenie ekspresji genu

rER cysterny siateczki śródplazmatycznej ziarnistej

sER rurki gładkiej siateczki śródplazmatycznej

siRNA krótki (mały) interferujący RNA

5.1 Wprowadzenie

Przedmiotem badań stanowiących podstawę osiągnięcia naukowego są kluczowe

elementy molekularne mechanizmów komórkowych gwarantujących sukces reprodukcyjny

rośliny okrytonasiennej. Wieloetapowy proces rozmnażania generatywnego roślin obejmuje

kilka faz: wytworzenie gametofitu męskiego w pylniku (dojrzałe ziarno pyłkowe) i żeńskiego

w słupku (woreczek zalążkowy), otwarcie kwiatu (anteza), fazę progamiczną (zapylenie,

kiełkowanie pyłku, wzrost łagiewki pyłkowej, depozycja komórek plemnikowych w

docelowej synergidzie), podwójne zapłodnienie oraz embriogenezę i rozwój bielma.

Efektywny przebieg kolejnych zdarzeń reprodukcyjnych jest konsekwencją zgodnego

zapylenia i zależy od interakcji kiełkującego ziarna pyłkowego i rosnącej łagiewki z

komórkami szlaku transmisyjnego słupka, komunikacji obu gametofitów poprzedzającej fuzję

gamet oraz powstania zarodka i tkanki odżywczej w postaci bielma. Uważa się, że większość

zdarzeń reprodukcyjnych (jeśli nie wszystkie) wymaga precyzyjnej regulacji poziomu jonów

wapniowych (Ca2+

) w komunikujących się komórkach, w których Ca2+

pełnią funkcję

fizjologiczną, sygnałową i regulatorową (Ge i in. 2007; Dresselhaus i Franklin-Tong 2013;

Steinhorst i Kudla 2013). Ca2+

występuje w komórkach roślinnych w trzech podstawowych

postaciach: trwale związanej (nierozpuszczalny Ca2+

pełniący funkcję strukturalną); jonowej

(jako wtórny przekaźnik informacji w procesie transdukcji sygnału); oraz luźno-związanej

(tzw. wymienny Ca2+

, buforowany m. in. przez białka wiążące Ca2+

). Wymienna pula Ca2+

stanowi mobilny magazyn tych jonów uruchamiany w chwili zapotrzebowania na wyższe

stężenie Ca2+

w cytozolu (Ca2+c). Utrzymanie stanu dynamicznej równowagi między

jonowym i wymiennym Ca2+

jest krytyczne dla funkcjonowania komórek i wymaga ścisłej

kontroli podczas skomplikowanych interakcji komórkowych związanych z rozmnażaniem

płciowym roślin. Istotne zmiany w poziomie Ca2+

są obserwowane podczas kiełkowania

pyłku na znamieniu słupka, ukierunkowanego wzrostu łagiewki pyłkowej, podwójnego

zapłodnienia, aktywacji genomu zygotycznego oraz embriogenezy (Ge i in. 2007;

Dresselhaus i Franklin-Tong 2013; Steinhorst i Kudla 2013). Większość autorów wskazuje, że

głównym magazynem Ca2+

podczas tych procesów jest ściana komórkowa. Niemniej, równie

istotne wydają się być struktury wewnątrzkomórkowe, takie jak siateczka śródplazmatyczna

(ER) czy diktiosomy, które dzięki akumulacji białek wiążących Ca2+

mogą stanowić

niezwykle efektywne, mobilne magazyny tych jonów w cytoplazmie. Jak dotąd,

wewnątrzkomórkowe źródła Ca2+

i mechanizmy ich mobilizacji podczas kluczowych

wydarzeń reprodukcyjnych u roślin okrytozalążkowych nie zostały w pełni

zdefiniowane.

Jednym z podstawowych procesów umożliwiających podwójne zapłodnienie jest

wzrost łagiewki pyłkowej w słupku transportującej pozbawione zdolności ruchu komórki

plemnikowe do woreczka zalążkowego, w którym dochodzi do fuzji gamet (Boavida i in.

2005; Takeuchi i Higashiyama 2011). Łagiewka pyłkowa jest najszybciej rosnącą komórką

roślinną, charakteryzującą się szczytowym wzrostem oraz strefową organizacją cytoplazmy i

procesów komórkowych. W wydłużonej łagiewce wyróżnia się trzy podstawowe strefy

organizacji protoplastu (Qin i Yang 2011; Onelli i Moscatelli 2013; Cai i in. 2015): (i) strefa

apikalna (jasna, ang. clear zone), bogata w pęcherzyki egzo/endocytarne; (ii) strefa

podwierzchołkowa (subapikalna, ang. subapical zone), w której gromadzą się aktywne

metabolicznie organelle komórkowe, takie jak ER, mitochondria i diktiosomy; oraz (iii) strefa

trzonowa (nazywana także strefą dużych organelli, ang. shank), w której występują głównie

amyloplasty i wakuole. Polarny wzrost łagiewki pyłkowej odbywa się dzięki egzocytozie

elementów błonowych i prekursorów ściany komórkowej na jej wierzchołku. Natomiast w

regionie podwierzchołkowym i trzonowym obserwowany jest dwukierunkowy przepływ

cytoplazmy wg modelu odwrotnej fontanny (ang. reverse fountain cytoplasmic streaming),

który odpowiada za transport metabolicznie aktywnych organelli i pęcherzyków do strefy

wzrostu łagiewki pyłkowej. Akumulacja małych organelli w regionie podwierzchołkowym

oraz pęcherzyków wydzielniczych w strefie jasnej rosnącej łagiewki umożliwia szczytowy

wzrost komórki. W strefie subapikalnej dochodzi do nagromadzenia rurek gładkiej siateczki

śródplazmatycznej (sER, ang. smooth endoplasmic reticulum), podczas gdy cysterny siateczki

ziarnistej/szorstkiej (rER, ang. rough endoplasmic reticulum) występują w cytoplazmie całej

łagiewki, poza apikalnym wierzchołkiem (Cheung i Wu 2007). W literaturze wyodrębnia się

dodatkową strefę jądrową, ze względu na lokalizację męskiej jednostki rozrodczej (MGU,

ang. male germ unit) na granicy strefy trzonowej i subapikalnej (Cheung i Wu 2007; Qin i

Yang 2011; Onelli i Moscatelli 2013). W proksymalnym regionie trzonowym łagiewki małe

wakuole zlewają się tworząc jedną centralną, która wspomaga utrzymanie turgoru

ekstremalnie wydłużonej komórki. Liczne badania dowodzą, że przepływ cytoplazmy w

rosnącej łagiewce jest generowany przy udziale cytoszkieletu, głównie filamentów

aktynowych i współdziałających z nimi białek wiążących aktynę (ABP, ang. actin binding

proteins), w tym białek motorycznych z rodziny miozyn (Ren i Xiang 2007; Cai i Cresti

2009; Staiger i in. 2010; Guan i in. 2013; Hepler i in. 2013; Cai i in. 2015). W wydłużonych

łagiewkach pyłkowych różnych gatunków roślin okrytozalążkowych wykazano odmienną

organizację aktyny w zdefiniowanych strefach cytoplazmy. W strefie trzonowej występują

długie włókna aktynowe zbudowane z równolegle ułożonych mikrofilamentów, które tworzą

główne szlaki transportu dla organelli i pęcherzyków. Znacznie krótsze filamenty aktynowe

(AF, ang. actin filaments) strefy subapikalnej formują charakterystyczną strukturę opisywaną

w literaturze jako obrączka (ang. ring, Kost i in. 1998), kołnierz (ang. collar, Gibbon i in.

1999), sieć subapikalna (ang. subapical mesh, Geitmann i in. 2000), lejek (ang. funnel, Vidali

i in. 2001), kosz (ang. basket, Snowman i in. 2002; Hörmanseder i in. 2005) lub grzywka

(ang. fringe, Lovy-Wheeler i in. 2005; Vidali i in. 2009; Dong i in. 2012). Uważa się, że AF

strefy subapikalnej umożliwiają zmianę kierunku przepływu cytoplazmy, transport

pęcherzyków wydzielniczych do rosnącego wierzchołka, utrzymanie odrębności strukturalnej

strefy jasnej oraz ruch pęcherzyków endocytarnych. W strefie jasnej funkcjonuje

najprawdopodobniej dynamiczna populacja AF, określanych jako krótkie wiązki aktynowe

(SAB, ang. short actin bundles). Przypisuje się im udział w egzocytozie pęcherzyków do

błony apikalnej łagiewki. Dlatego AF strefy podwierzchołkowej wraz z dynamiczną siecią

SAB strefy jasnej są uważane za podstawowy element strukturalno-funkcjonalny

odpowiedzialny elongację łagiewki pyłkowej.

Ukierunkowany wzrost łagiewki w słupku wymaga koordynacji szeregu procesów

komórkowych związanych z utrzymaniem strefowej organizacji cytoplazmy, sprawnym

funkcjonowaniem wewnątrzkomórkowego transportu, syntezą ściany komórkowej oraz

wymianą informacji podczas interakcji gametofitu męskiego z komórkami słupka. Zgodnie z

obecną wiedzą, prawidłowy przebieg tych procesów moduluje optymalne Ca2+c w

zdefiniowanych strefach rosnącej łagiewki (Ge i in. 2007). W łagiewkach pyłkowych roślin

okrytozalążkowych powstaje gradient Ca2+

(ang. tip-focused Ca2+

gradient), w wyniku

napływu tych jonów ze środowiska zewnątrzkomórkowego do cytoplazmy łagiewki przez

aktywne na jej wierzchołku kanały Ca2+

oraz redukcji [Ca2+

]c w strefie podwierzchołkowej

(Hepler i in. 2013; Steinhorst i Kudla 2013). Stabilizacja gradientu Ca2+

w rosnącej łagiewce

wymaga więc istnienia niezwykle efektywnego mechanizmu usuwania nadmiaru Ca2+

z

cytozolu strefy subapikalnej na teren ściany komórkowej lub gromadzenia tych jonów w

przedziałach wewnątrzkomórkowych uważanych za mobilne magazyny Ca2+

(Vandecaetsbeek i in. 2011). Wciąż jednak brak jednoznacznej odpowiedzi na pytanie,

które elementy komórkowe i w jaki sposób uczestniczą w regulacji mobilnej puli Ca2+

w

rosnącej łagiewce pyłkowej.

Dostępne dane literaturowe oraz wyniki wcześniejszych badań naszego zespołu stały

się podstawą do sformułowania hipotezy, zgodnie z którą CRT jest istotnym elementem

molekularnym wewnątrzkomórkowego mechanizmu kontrolującego homeostazę Ca2+

w

komunikujących się komórkach podczas kluczowych zdarzeń reprodukcyjnych u roślin

okrytozalążkowych. CRT jest zachowywanym w toku ewolucji białkiem opiekuńczym

wiążącym/buforującym Ca2+

w ER komórek eukariotycznych. Jej udział w utrzymaniu

homeostazy Ca2+

i kontroli jakości białek dojrzewających w ER determinuje prawidłowy

przebieg wielu procesów komórkowych (Jia i in. 2009; przegl. Lenartowska i in. 2009;

Michalak i in. 2009). Obie funkcje CRT wydają się być równie istotne podczas kolejnych

etapów rozmnażania generatywnego roślin, kiedy wymagane jest wysokie tempo syntezy

białek oraz mobilizacja Ca2+

związana z transdukcją sygnałów i modulowaniem metabolizmu

komórek w sposób zależny od Ca2+

(przegl. Lenartowska i in. 2009). U zwierząt

zidentyfikowano jak dotąd dwa geny CRT – CRT1, który podlega ekspresji w różnych

tkankach oraz CRT2, który jest aktywny wyłącznie w jądrach samców (Persson i in. 2002).

Funkcjonalna specjalizacja roślinnych genów CRT o zróżnicowanej ekspresji w różnych

organach i tkankach, jest wynikiem ewolucji molekularnej sekwencji kodującej i pojawieniem

się genów paralogów (CRT1 i CRT2) i ortologów (CRT3) u różnych gatunków roślin (Persson

i in. 2003; Jia i in. 2009; przegl. Lenartowska i in. 2009; Del Bem 2011; Thelin i in. 2011).

Podobnym do siebie białkom roślinnym grupy CRT1/2 przypisuje się podstawowe i

niekwestionowane funkcje związane z utrzymaniem homeostazy Ca2+

i kontrolą jakości

polipeptydów dojrzewających w ER, podczas gdy CRT3 charakteryzuje się najwyższym

stopniem homologii międzygatunkowej i podlega wzmożonej ekspresji w odpowiedzi na stres

abiotyczny lub biotyczny (Li i in. 2009, Christensen i in. 2010).

Wyniki badań prowadzonych w kilku ośrodkach naukowych dokumentują aktywność

genów CRT w organach generatywnych roślin, ziarnach i łagiewkach pyłkowych, zalążkach,

zarodkach i dojrzewających nasionach (przegl. Lenartowska i in. 2009). U Arabidopsis

podwyższoną ekspresję CRT stwierdzono w pylnikach i górnej części słupka, przy czym

aktywność CRT1 i CRT2 (odpowiednio AtCRT1a i AtCRT1b) obserwowano zarówno w

znamieniu/szyjce słupka jak i w dojrzałym pyłku (Christensen i in. 2010). Ostatnie

doniesienia jednej grupy badawczej wskazują, że mutacje genów CRT u Arabidopsis skutkują

większą wrażliwością tych mutantów na stres wodny (Kim i in. 2013) lecz nie wpływają w

istotny sposób na ich wzrost i rozwój (Vu i in. 2017). Jednak autorzy wnioskują, że

współdziałanie dwóch białek opiekuńczych ER (CRT i kalneksyny) jest bezwzględnie

wymagane dla utrzymania funkcji wegetatywnych i rozwoju męskiego gametofitu/wzrostu

łagiewek pyłkowych u tego gatunku (Vu i in. 2017). Krytyczną rolę CRT w rozwoju

embrionalnym potwierdzają badania z użyciem zwierzęcych modeli, które dowodzą, że

mutacja w genie CRT(-/-)

u myszy jest letalna (Mesaeli i in. 1999; Rauch i in. 2000, Michalak i

in. 2009). Wnioski z toczącej się dyskusji wskazują, że rozmnażanie generatywne

organizmów eukariotycznych wymaga aktywności CRT. Wciąż jednak nie wiadomo, które

izoformy tego białka i w jaki sposób uczestniczą w kolejnych fazach procesu reprodukcji

u roślin okrytozalążkowych. Dlatego określenie wzorca ekspresji genów CRT oraz czasowo-

przestrzennej dystrybucji ich produktów w komunikujących się komórkach podczas

kluczowych wydarzeń reprodukcyjnych jest podstawą dla zrozumienia biologicznej funkcji

CRT w procesie rozmnażania płciowego roślin okrytonasiennych.

5.2 Cel badań

Wyniki prowadzonych przeze mnie badań w ramach wcześniejszej współpracy

naukowej z zespołem prof. dr hab. Elżbiety Bednarskiej (Lenartowska i in. 2001, 2002, 2009)

potwierdziły obecność CRT i kodujących ją transkryptów w kiełkującym pyłku i rosnących

łagiewkach pyłkowych dwóch gatunków roślin okrytonasiennych, należących do kladu

jednoliściennych (Haemanthus albiflos) i kladu dwuliściennych (Petunia hybrida). Były to

pierwsze doniesienia na świecie dokumentujące ekspresję CRT zarówno w łagiewkach

pyłkowych rosnących w warunkach in vitro jak i w słupku. Otrzymane wyniki badań

doprowadziły nas do wniosku, że wzorzec dystrybucji CRT mRNA oraz białka CRT jest

uniwersalny w badanych komórkach, co może wskazywać na istotną funkcję CRT w

interakcjach pyłek-słupek. Niestety, nie uzyskaliśmy wówczas wystarczających dowodów na

poparcie tej hipotezy. Jej weryfikacja była możliwa dopiero dzięki wykorzystaniu

zaawansowanych technik biologii molekularnej, szerokiego spektrum metod biologii

komórki, analiz biochemicznych, bioinformatycznych i ilościowych/statystycznych w

badaniach, które stanowią podstawę prezentowanego osiągnięcia naukowego.

Głównym celem badań było określenie biologicznej roli CRT w interakcjach

komórkowych podczas kluczowych wydarzeń reprodukcyjnych u modelowej rośliny

dwuliściennej Petunia hybrida (Ph). Badania realizowano w kilku etapach, zmierzając do

osiągnięcia następujących celów szczegółowych: (i) sklonowania i molekularnej

charakterystyki swoistej gatunkowo sekwencji PhCRT cDNA oraz przypuszczalnej sekwencji

aminokwasowej PhCRT (Lenartowski i in. 2014); (ii) określenia poziomu i wzorca ekspresji

PhCRT podczas dojrzewania słupka, antezy, fazy progamicznej, podwójnego zapłodnienia i

wczesnej embriogenezy (Lenartowski i in. 2014, 2015); (iii) ustalenia korelacji pomiędzy

ekspresją PhCRT a dynamiką zmian w poziomie wymiennego Ca2+

podczas interakcji pyłek-

słupek w kolejnych etapach procesu reprodukcji (Lenartowski i in. 2015); (iv) wskazania

miejsc translacji PhCRT w kiełkujących ziarnach i rosnących łagiewkach pyłkowych

(Suwińska i in. 2015); (v) ujawnienia efektu utraty funkcji genu PhCRT podczas

szczytowego wzrostu łagiewki pyłkowej (Suwińska i in. 2017).

W zależności od przyjętej strategii badawczej, eksperymenty prowadzono w

warunkach in vitro lub in vivo wykorzystując metody biochemiczne (izolacja i oczyszczanie

białek i kwasów nukleinowych, analiza Western blot), cytochemiczne (podstawowe barwienia

cytologiczne, bioobrazowanie filamentów aktynowych, piroantymonianowa technika

lokalizacji wymiennego Ca2+

, fluorescencyjna metoda wizualizacji jonowego Ca

2+, badania

ultrastrukturalne z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii elektronowej),

immunocytochemiczne (metoda immunofluorescencyjna i immunozłotowa), techniki biologii

molekularnej (RT-PCR, szybka amplifikacja końców cDNA-RACE, hybrydyzacja northern,

hybrydyzacja in situ, interferencja RNA) oraz analizy bioinformatyczne (analiza baz

sekwencji nukleotydowych, analiza filogenetyczna i poszukiwanie motywów strukturalnych).

Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej (test ANOVA lub Mann-Whitney), a

ich wiarygodność była weryfikowana w kolejnych powtórzeniach eksperymentów oraz w

reakcjach kontrolnych.

5.3 Model badawczy

Materiałem badawczym były izolowane z kwiatów słupki oraz dojrzały pyłek Petunia

(odmiana o białych płatkach korony i jasnym zabarwieniu organów generatywnych, z których

łatwo pozyskuje się kwasy nukleinowe i białka). Uprawa tych roślin jest możliwa przez cały

rok w komorach hodowlanych, w optymalnych warunkach temperatury, wilgotności i światła.

Istotną zaletą Petunia jest możliwość uzyskiwania dużej liczby pojedynczych kwiatów w

relatywnie krótkim czasie, których zapylenie krzyżowe może być ściśle kontrolowane. Słupek

Petunia ma długą szyjkę typu zamkniętego wypełnioną tkanką transmisyjną o charakterze

sekrecyjnym, mokre znamię pokryte lepką wydzieliną w stadium receptywnym i

dwukomorową zalążnię zawierającą liczne zalążki na środkowym łożysku, do których

łagiewki pyłkowe dorastają niemal w tym samym czasie od zapylenia. Taka budowa

anatomiczna słupka umożliwia utrwalenie jego określonych fragmentów bez utraty ziaren

pyłkowych kiełkujących na powierzchni znamion lub łagiewek pyłkowych rosnących w

szlaku transmisyjnym, a także analizę poziomu ekspresji wybranych genów w odpowiedzi na

kolejne zdarzenia reprodukcyjne odbywające się w tzw. słupku górnym (fragment znamię-

szyjka) lub dolnym (zalążnia). Dojrzały pyłek Petunia, pozyskiwany z otwartych pylników w

dniu antezy, kiełkuje efektywnie na podłożach hodowlanych stałych i płynnych, a łagiewki

pyłkowe rosnące w warunkach in vitro zachowują polarny typ wzrostu charakteryzujący się

strefową organizacją cytoplazmy. Dlatego też Petunia, podobnie jak Arabidopsis czy Lilium,

jest gatunkiem modelowym w badaniach z zakresu embriologii roślin (Dowd i in. 2006;

Wang i Kumar 2007; Trivellini i in. 2015). Ponadto, w bioinformatycznych bazach danych

zostały zdeponowane sekwencje EST Petunia (ang. expressed sequence tag), na podstawie

których możliwa jest przynajmniej częściowa rekonstrukcja cząsteczek cDNA określonych

genów. Dzięki temu sklonowano pełnej długości sekwencję PhCRT cDNA oraz wewnętrzną

część sekwencji Ph18S rRNA, co pozwoliło na wygenerowanie swoistych gatunkowo sond

molekularnych oraz sekwencji siRNA (ang. short/small interfering RNA) selektywnie

degradujących PhCRT mRNA.

W trakcie prowadzonych badań poziom i wzorzec ekspresji PhCRT w słupku Petunia

analizowano w kilku następujących po sobie etapach procesu reprodukcji, które uznano za

szczególnie istotne: (i) dojrzewający słupek przed i po antezie; (ii) słupek zapylony zgodnym

pyłkiem, izolowany z kwiatów w trzech etapach fazy progamicznej (wczesna, zaawansowana

i późna) oraz (iii) słupek w okresie okołozapłodnieniowym i podczas wczesnej embriogenezy.

Doświadczenia z użyciem kiełkujących ziaren pyłkowych i rosnących łagiewek Petunia

prowadzono również w kulturach in vitro.

5.4 Główne tezy osiągnięcia naukowego

Zidentyfikowany w słupku Petunia gen PhCRT należy do grupy homologów CRT1/2

Roślinne warianty CRT wykazują różnice w budowie sekwencji aminokwasowej.

Obserwowane zmiany poziomu poszczególnych polipeptydów w trakcie wzrostu, rozwoju i

odpowiedzi organizmu roślinnego na czynniki środowiskowe (biotyczne i abiotyczne)

sugerują ich funkcjonalną dywergencję (Jin i in. 2009; Li i in. 2009; przegl. Lenartowska i

in. 2009; Saijo i in. 2009; Christensen i in. 2010; Thelin i in. 2011). Warianty CRT1/2

charakteryzuje zdolność wiązania znacznych ilości Ca2+

w domenach P-C. Są one uznawane

za podstawowe białka zaangażowane w utrzymanie wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca2+

oraz kontrolę jakości fałdowania polipeptydów w ER. Ekspresja genu CRT3 wiążę się

natomiast z odpowiedzią rośliny na stres, a kodowane przez tę sekwencję białko ma

ograniczoną pojemność wiązania Ca2+

w domenie C-końcowej ze względu na jej odmienną

strukturę (Qiu i in. 2012). Szereg wcześniej opublikowanych prac wskazuje na wzmożoną

aktywność genów CRT w trakcie rozmnażania płciowego roślin okrytozalążkowych (przegl.

Lenartowska i in. 2009). W kwiatach podwyższony poziom ekspresji dotyczył głównie

genów CRT1/2 (Nelson i in. 1997; Persson i in. 2003; Christensen i in. 2010). Doniesienia na

ten temat są jednak fragmentaryczne i nie odnoszą się do określonych etapów rozwoju

organów generatywnych lub faz procesu płciowego.

Aby zweryfikować potencjalny udział CRT1/2 w przebiegu kluczowych etapów

procesu reprodukcji w słupku Petunia, podjąłem próbę pozyskania swoistej gatunkowo

sekwencji PhCRT cDNA (Lenartowski i in. 2014). W pierwszym etapie badań dokonałem

identyfikacji in silico sekwencji EST Petunia (CV296977.1, CV296202.1, and DC240877.1)

wykazujących wysoki stopień identyczności z CRT1 cDNA Arabidopsis thaliana

(NM_001036122), zamieszczonej w internetowej bazie sekwencji GenBank. Odszukane EST

posłużyły do zaprojektowania specyficznych starterów wykorzystanych do przeprowadzenia

reakcji RT-PCR oraz szybkiej amplifikacji końców 5’ i 3’ PhCRT cDNA (RACE).

Namnożoną wewnętrzną części sekwencji PhCRT oraz oba jej końce poddano

zsekwencjonowaniu, co umożliwiło sklonowanie pełnej długości PhCRT cDNA w obecności

specyficznych starterów. Otrzymana sekwencja o długości 1550 pz składała się z 5’ UTR,

1254 pz potencjalnej otwartej ramki odczytu, dwóch przypuszczalnych sygnałów

poliadenylacji oraz regionu 3’ UTR zakończonego sekwencją poliA. Analiza

bioinformatyczna przypuszczalnej sekwencji aminokwasowej kodowanej przez PhCRT

wykazała, że polipeptyd składa się z 417 reszt aminokwasowych (aa) i jest niewielkim,

kwaśnym białkiem o teoretycznej masie ~48 kDa, która odpowiada białkom CRT

zidentyfikowanym u różnych gatunków roślin (przegl. Lenartowska i in. 2009). W

sekwencji aminokwasowej PhCRT wyznaczono granice trzech charakterystycznych domen

(N, P i C) oraz zmapowano motywy uważane za typowe dla CRT, tj. sekwencję sygnałową

kierującą do ER, charakterystyczne regiony Calreticulin1 i Calreticulin2, dwa ciągi

trzykrotnych powtórzeń M1 (PXXIXDPXXKKPEXWDE) i M2 (GXWXAXXIXNPXYK), a

także sekwencję retencyjną HDEL. Obecność dużej liczby ujemnie naładowanych aa w

domenie C-końcowej oraz lokalizacja miejsca glikozylacji w domenie N-końcowej pomiędzy

59. a 62. aa (jedno z najsilniej konserwowanych miejsc glikozylacji w roślinnych wariantach

CRT; Jia i in. 2009) świadczy o przynależności sklonowanej sekwencji PhCRT do grupy

genów CRT1/2. Natomiast przeprowadzona analiza filogenetyczna pozwala przypuszczać, że

PhCRT jest izoformą CRT1, która wykazuje najwyższą zgodność sekwencji aminokwasowej

z CRT Nicotiana tabacum, gatunkiem należącym do tej samej rodziny co Petunia

(Solanaceae). Oba polipeptydy rozpoczynają się sześcioma jednakowymi aa MATQRR i

kończą motywem HDEL (Lenartowski i in. 2014). Zatem zidentyfikowany w słupku

Petunia gen PhCRT jest zachowywany w toku ewolucji i koduje białko należące do

grupy izoform CRT1/2.

Gen PhCRT podlega wzmożonej ekspresji podczas zdarzeń reprodukcyjnych w słupku

Petunia wiążących się z dynamiką zmian w poziomie wymiennego Ca2+

Sklonowana sekwencja PhCRT cDNA stanowiła matrycę dla syntezy gatunkowo

specyficznej antysensownej sondy RNA. Jej wykorzystanie podczas hybrydyzacji northern i

fluorescencyjnej in situ hybrydyzacji (FISH) umożliwiło określenie aktywności

transkrypcyjnej PhCRT w kluczowych etapach procesu reprodukcji w słupku Petunia

(Lenartowski i in. 2014). Przeprowadzone badania wykazały najwyższy poziom

transkryptów PhCRT w górnej części słupka (fragment znamię-szyjka) przed antezą oraz w

trakcie wczesnej fazy progamicznej, kiedy z pyłku na powierzchni znamienia kiełkują

łagiewki pyłkowe. W zalążniach odnotowałem postępujący wzrost poziomu PhCRT mRNA

od momentu zapylenia do późnego etapu fazy progamicznej, kiedy komórki plemnikowe są

deponowane na terenie woreczka zalążkowego. Bioobrazowanie miejsc lokalizacji PhCRT

mRNA za pomocą FISH potwierdziło nagromadzenie transkryptów PhCRT w: (i) komórkach

wydzielniczych znamion izolowanych z pąków kwiatowych i dojrzałych kwiatów w dniu

antezy; (ii) kiełkujących ziarnach pyłkowych i łagiewkach penetrujących szlak transmisyjny

słupka; (iii) komórkach regionu mikropylarnego zalążka podczas późnej fazy progamicznej,

fuzji gamet i wczesnej embriogenezy (Lenartowski i in. 2014). Szczególne nagromadzenie

badanych transkryptów występowało w docelowej synergidzie zawierającej komórki

plemnikowe oraz w zygocie i rozwijającym się bielmie.

Następnie wykonałem analizę porównawczą poziomu i lokalizacji białka CRT w

analogicznych stadiach rozwojowych/regionach/komórkach słupka Petunia za pomocą

metody Western blot oraz immunozłotowej techniki lokalizacji antygenu na ultracienkich

skrawkach z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej (Lenartowski i in. 2015). W

badaniach wykorzystałem poliklonalne przeciwciało pierwotne anty-CRT z kukurydzy

(Napier i in. 1995), którego specyficzność została potwierdzona dla PhCRT (Lenartowski i

in. 2015). Analiza Western blot wykazała najwyższy poziom badanego białka podczas

wczesnej fazy progamicznej w górnej części słupka oraz w stadium okołozapłodnieniowym

(późna faza progamiczna - fuzja gamet - wczesna embriogeneza) w zalążni (Lenartowski i

in. 2015). Jednocześnie badania immunocytochemiczne zapylonych znamion oraz zalążków,

do których wrastały łagiewki pyłkowe, potwierdziły lokalizację PhCRT w: (i) wydzielniczych

komórkach znamienia; (ii) aktywnej aperturze kiełkujących ziaren pyłkowych; (iii) strefie

subapikalnej rosnących łagiewek pyłkowych, (iv) komórkach aparatu jajowego (głównie w

docelowej synergidzie) oraz w zygocie i rozwijającym się bielmie. Szczególne

nagromadzenie badanego białka w tych komórkach obserwowałem w ER i diktiosomach, a

także na terenie aparatu fibrylarnego synergid (Lenartowski i in. 2015). Zasadniczo we

wszystkich powyżej wymienionych miejscach lokalizacji PhCRT występowały dynamiczne

zmiany w poziomie wymiennego Ca2+

, głównie w cysternach ER i diktiosomach

komunikujących się komórek podczas interakcji pyłek-słupek (Lenartowski i in. 2015).

Podobnie jak w przypadku PhCRT, szczególne gromadzenie Ca2+

obserwowałem przede

wszystkim w aktywnej aperturze kiełkujących ziaren pyłkowych, strefie subapikalnej

rosnących łagiewek pyłkowych, komórkach aparatu jajowego (głównie w docelowej

synergidzie), zygocie i rozwijającym się bielmie.

Otrzymane wyniki badań stały się podstawą do wyciągnięcia wniosku, że gen PhCRT

podlega wzmożonej ekspresji w słupku Petunia w odpowiedzi na: (i) dojrzewanie słupka

poprzedzające antezę; (ii) kiełkowanie pyłku i wzrost łagiewek pyłkowych; (iii) depozycję

komórek plemnikowych w docelowej synergidzie; oraz (iv) podwójne zapłodnienie i wczesną

embriogenezę. Zdecydowana większość wymienionych zdarzeń reprodukcyjnych wymaga

wysokiego tempa biosyntezy białek, kiedy aktywność CRT w roli białka opiekuńczego może

być szczególnie istotna dla funkcji wydzielniczej komórek szlaku transmisyjnego słupka,

szczytowego wzrostu łagiewek pyłkowych związanego z egzocytozą oraz procesu

formowania zarodka i tkanki odżywczej w postaci bielma. Na podwyższoną ekspresję genów

CRT (w większości przypadków bez wskazania określonych ortologów/paralogów) w

tkankach sekrecyjnych/odżywczych pylników i rozwijających się nasion, w rosnących in vitro

łagiewkach pyłkowych, a także w odpowiedzi na zapłodnienie i/lub rozwój zarodka

wskazywały również wyniki innych grup badawczych (przegl. Lenartowska i in. 2009). W

organach generatywnych Arabidopsis potwierdzono wysoki poziom ekspresji wszystkich

trzech genów CRT, z wyjątkiem CRT3 w dojrzałych pylnikach (Christensen i in. 2010).

Autorzy tych doniesień skłaniali się ku hipotezie, zgodnie z którą rozmnażanie generatywne

roślin wymaga bezwzględnie wysokiej aktywności białek opiekuńczych, wśród których CRT

może pełnić nadrzędną rolę. Otrzymane przeze mnie wyniki badań nie kwestionują tej tezy

lecz wskazują, że równie istotny w omawianym procesie może być udział CRT w regulacji

mobilnej puli Ca2+

podczas zdarzeń reprodukcyjnych w słupku. Świadczą o tym

następujące fakty:

produktem zidentyfikowanego w słupku Petunia genu PhCRT jest białko należące do

grupy izoform CRT1/2 (Lenartowski i in. 2014), które wiążą znaczne ilości Ca2+

w

domenach P-C (Qiu i in. 2012);

podwyższona ekspresja PhCRT w słupku Petunia koreluje z dynamiką zmian w poziomie

wymiennego Ca2+

w wyspecjalizowanych komórkach uczestniczących w interakcji pyłek-

słupek (Lenartowski i in. 2014, 2015). Precyzyjna regulacja Ca2+c

jest wymagana

podczas kluczowych etapów procesu reprodukcji, takich jak kiełkowanie pyłku, wzrost

łagiewki pyłkowej, uwolnienie komórek plemnikowych w docelowej synergidzie, blok

polispermii, fuzja gamet, aktywacja genomu zygotycznego oraz rozwój zarodka i bielma

(Ge i in. 2007; Dresselhaus i Franklin-Tong 2013; Steinhorst i Kudla 2013);

PhCRT i wymienny Ca2+

współwystępują w komunikujących się komórkach, głównie w

ER i diktiosomach (Lenartowski i in. 2015), stanowiących niekwestionowane miejsca

występowania CRT u roślin (przegl. Lenartowska i in. 2009) oraz efektywne magazyny

Ca2+

w komórkach eukariotycznych (Vandecaetsbeek i in. 2011).

W świetle powyższych faktów, CRT pretenduje do roli istotnego elementu

wewnątrzkomórkowego mechanizmu gromadzenia i mobilizacji Ca2+

podczas

kluczowych zdarzeń reprodukcyjnych w słupku Petunia.

W kiełkujących ziarnach pyłkowych i rosnących łagiewkach Petunia translacja CRT

odbywa się na rybosomach związanych z ER

Ukierunkowany wzrost łagiewki pyłkowej w słupku jest jednym z podstawowych

procesów gwarantujących sukces reprodukcyjny rośliny okrytonasiennej. Łagiewki różnych

gatunków roślin rosną także w kulturach in vitro, gdzie z oczywistych powodów nie

funkcjonują mechanizmy odpowiedzialne za orientację ich wierzchołków do mikropyle

zalążków. Możliwość elongacji łagiewek pyłkowych na podłożach hodowlanych dowodzi, że

ich szczytowy wzrost jest procesem niezależnym od specyficznych „sygnałów słupkowych”.

Z tego powodu rosnące in vitro łagiewki pyłkowe stanowią dogodny model w badaniach nad

ekspresją/funkcją określonych genów/białek w procesie wierzchołkowego wzrostu

wyspecjalizowanych komórek roślinnych. Na tej podstawie, w kolejnych etapach badań

wykorzystano kultury in vitro łagiewek Petunia w celu: (i) określenia miejsc syntezy CRT w

rosnącej łagiewce pyłkowej oraz (ii) zdefiniowania roli CRT w procesie szczytowego wzrostu

tej komórki.

Powszechnie akceptowany model zakłada, że w komórkach eukariotycznych

biosynteza białek cytozolowych i białek jądrowych odbywa się na polisomach wolnych,

natomiast białka wydzielnicze, białka rozpuszczalne organelli komórkowych oraz integralne

białka błonowe powstają na rybosomach zasocjowanych z ER (Cui i Pallazo 2014). O

translacji na powierzchni ER decyduje sekwencja sygnałowa na N-końcu syntetyzowanego

polipeptydu wiązana przez znajdującą się w cytozolu cząstkę rozpoznającą sygnał (SRP, ang.

signal recognition particle), która kieruje rybosom do ER. W błonie ER znajduje się receptor

SRP odpowiedzialny za powstanie kompleksu umożliwiającego wznowienie syntezy białka

na rER i przemieszczenie nowo syntetyzowanego polipeptydu do wnętrza organelli. Białka

rezydujące w ER mają także C-końcową sekwencję retencyjną (zwykle KDEL u zwierząt i

HDEL u roślin), która uniemożliwia ich eksport do innych przedziałów komórkowych lub

sekrecję poza komórkę. CRT, jako rozpuszczalne białko wnętrza ER, posiada sekwencję

sygnałową i retencyjną (Jia i in. 2009; Michalak i in. 2009). Wyniki moich badań wykazały,

że PhCRT mRNA koduje polipeptyd zawierający obie sekwencje, w tym typowy dla roślinnej

CRT sygnał retencyjny HDEL (Lenartowski i in. 2014). Ponadto, obecność PhCRT,

transkryptów PhCRT mRNA, cząsteczek Ph18S rRNA i cystern rER została potwierdzona w

aktywnych aperturach kiełkujących ziaren pyłkowych oraz w strefie subapikalnej i dystalnym

trzonie rosnących łagiewek (Suwińska i in. 2015). Podobną dystrybucję CRT i jej

transkryptów obserwowano również w łagiewkach pyłkowych penetrujących tkankę

transmisyjną słupka Petunia (Lenartowski i in. 2014, 2015) oraz w kiełkujących ziarnach

pyłkowych i/lub wydłużonych łagiewkach innych gatunków roślin okrytozalążkowych (Nardi

i in. 2006; Lenartowska i in. 2009). Akumulacja CRT występowała w regionach cytoplazmy

bogatych w struktury rER/sER. Dlatego wyniki badań dokumentujące współwystępowanie

PhCRT, kodujących ją transkryptów, Ph18S rRNA oraz rER dowodzą w sposób pośredni, że

w ściśle określonych regionach cytoplazmy kiełkujących ziaren pyłkowych i rosnących

łagiewek Petunia translacja CRT odbywa się na rybosomach związanych z błonami ER.

Powyższy wniosek wymaga pewnego uzupełnienia. Wydaje się, że niektóre

transkrypty mogą wiązać się z ER bez udziału sekwencji sygnałowej rozpoznawanej przez

SRP (Pyhtila i in. 2008; Chen i in. 2011), za pomocą swoistych białek bezpośrednio

promujących kotwiczenie określonych rodzajów mRNA na powierzchni ER (Cui i Pallazo

2014). Wydaje się, że ten alternatywny mechanizm mógłby funkcjonować także w przypadku

translacji CRT w rosnących łagiewkach pyłkowych. W komórkach z obniżonym poziomem

lub brakiem białek SRP, transkrypty CRT są akumulowane w pobliżu ER (Pyhtila in. 2008).

Ich asocjacja z błoną ER wymaga prawdopodobnie obecności innych, hipotetycznych

receptorów błonowych (Cui i in. 2012). Jednym z nich może być białko p180, w którego

sekwencji zidentyfikowano region wiążący się bezpośrednio z RNA (Cui i in. 2012). Ponadto,

niektóre mRNA kodujące białka rezydujące w ER są zdecydowanie mocniej wiązane z

powierzchnią tej organelli niż inne, co sugeruje istnienie odmiennych mechanizmów

kotwiczenia ich transkryptów na powierzchni ER (Chen i in. 2011; Cui i in. 2012). W świetle

przedstawionych wyników badań wydaje się, że w kiełkujących ziarnach pyłkowych i

rosnących łagiewkach Petunia synteza CRT na rybosomach związanych z ER może odbywać

się w sposób zależny lub niezależny od SRP. Niewykluczone, że w określonych przypadkach

mogą funkcjonować obie alternatywne drogi kierujące mRNA PhCRT do translacji na rER.

Jednak weryfikacja tej hipotezy wymaga dalszych badań.

CRT uczestniczy w utrzymaniu homeostazy Ca2+

w rosnącej łagiewce pyłkowej Petunia,

co umożliwia jej prawidłowy wzrost

W ostatnim etapie badań zaplanowałem szereg eksperymentów w warunkach in vitro z

wykorzystaniem sekwencji siRNA komplementarnych do PhCRT cDNA. Celem tych

doświadczeń było ujawnienie potencjalnych zaburzeń w procesie wzrostu łagiewek

pyłkowych Petunia, będących skutkiem niedoboru CRT. Badania te są szczególnie istotne z

uwagi na fakt, że po raz pierwszy na świecie otrzymano wyniki dokumentujące efekt

wyciszenia ekspresji CRT na poziomie transkryptu w rosnących łagiewkach pyłkowych.

Mechanizm potranskrypcyjnego wyciszenia ekspresji genu (PTGS, ang. post-transcriptional

gene silencing) w komórkach roślinnych jest naturalnym procesem degradacji/regulacji

poziomu mRNA z udziałem aktywnego kompleksu RISC (ang. RNA-induced silencing

complex), indukowanym obecnością efektora, jakim jest dwuniciowy siRNA (Vaucheret et al.

2001). Adaptacja mechanizmu PTGS do celów eksperymentalnych polega na dostarczeniu do

komórek egzogennych, komplementarnych do określonego mRNA dupleksów siRNA.

Oczekiwanym efektem jest wybiórcza degradacja transkryptów danego genu umożliwiająca

poznanie funkcji jego produktu (białka) podczas analizy potencjalnych zmian fenotypowych

w badanym układzie biologicznym (komórka-tkanka-organizm).

W oparciu o sklonowaną sekwencję PhCRT cDNA (Lenartowski i in. 2014),

zaprojektowałem szereg gatunkowo swoistych sekwencji siRNA komplementarnych do

PhCRT mRNA (Suwińska i in. 2017). Proces wyboru i syntezy dupleksów poprzedziłem

wieloetapową analizą bioinformatyczną, która umożliwiła wykluczenie siRNA

homologicznych do mRNA innych genów lub podobnych do endogennych, małych

niekodujących RNA Petunia. Szczególną uwagę zwróciłem na zachowanie

komplementarności tzw. „regionu seed” projektowanych sekwencji siRNA z docelowym

transkryptem. Każdy dupleks zawierał wymagany procent par A/T i G/C oraz miał

zmodyfikowane końce 3’ w celu zapewnienia stabilności cząsteczki. W trakcie badań

wstępnych, z trzech zsyntetyzowanych siPhCRT został wybrany najbardziej efektywny

(si1PhCRT), wywołujący efekt potranskrypcyjnego wyciszenia ekspresji PhCRT w rosnących

in vitro łagiewkach Petunia na wymaganym poziomie przy najniższym stężeniu roboczym w

pożywce hodowlanej. Wykonane eksperymenty, reakcje kontrolne i analizy statystyczne

potwierdziły wybiórczą degradację transkryptów PhCRT oraz wykluczyły potencjalną

cytotoksyczność dupleksów siRNA. Badania z wykorzystaniem specyficznych sekwencji

si1PhCRT obejmowały szereg analiz porównawczych dotyczących morfologii, parametrów

wzrostu, ultrastruktury, organizacji cytoszkieletu aktynowego oraz poziomu Ca2+

w

wydłużonych łagiewkach pyłkowych Petunia z wyciszoną ekspresją PhCRT (łagiewki

si1PhCRT) oraz w łagiewkach kontrolnych (Suwińska i in. 2017).

Badania ilościowe poziomu PhCRT mRNA (pomiar sygnału FISH) oraz PhCRT

(pomiar sygnału immunofluorescencji) wykazały istotny spadek poziomu badanego

transkryptu i białka w łagiewkach pyłkowych si1PhCRT w stosunku do łagiewek kontrolnych

(odpowiednio o 85 i 79%). Dodatkowo, analiza Western blot potwierdziła wyniki otrzymane

dzięki pomiarom sygnału immunofluorescencji oraz wykluczyła potencjalny wpływ

interferencji si1PhCRT na poziom białek referencyjnych, takich jak aktyna i tubulina. Kolejne

obserwacje prowadzone w mikroskopie optycznym i elektronowym ujawniły, że skutkiem

niedoboru CRT w rosnących łagiewkach Petunia są poważne anomalie morfologiczne i

ultrastrukturalne. Łagiewki si1PhCRT wykazywały nieprawidłowe parametry wzrostu,

deformacje kształtu i zaburzenia w strefowej organizacji cytoplazmy. Podczas gdy w strefie

jasnej łagiewek kontrolnych obserwowałem głównie pęcherzyki, w cytoplazmie

wierzchołkowej łagiewek si1PhCRT występowały liczne mitochondria, krótkie cysterny ER,

ciała lipidowe i małe wakuole. W strefie subapikalnej i dystalnym trzonie stwierdziłem

zaburzoną lokalizację diktiosomów i zredukowanych struktur ER oraz postępującą

wakuolizację cytoplazmy. Ponadto, w łagiewkach pyłkowych z wyciszoną ekspresją PhCRT

następowała dezorganizacja wszystkich typowych dla łagiewek roślin okrytonasiennych

konfiguracji mikrofilamentów, w tym długich wiązek F-aktyny w strefie trzonowej, obrączki

krótkich AF w strefie subapikalnej i sieci SAB w strefie wierzchołkowej. Procesowi

dekompozycji struktur aktynowych towarzyszyła destabilizacja gradientu Ca2+

, a efektem

kumulacji wszystkich obserwowanych zaburzeń było zahamowanie wzrostu i pękanie

zdecydowanej większości łagiewek si1PhCRT (Suwińska i in. 2017).

Unikalna organizacja cytoszkieletu aktynowego w łagiewce pyłkowej warunkuje

strefową organizację cytoplazmy, wewnątrzkomórkowy transport metabolicznie aktywnych

organelli i pęcherzyków do rosnącego wierzchołka oraz egzo- i endocytozę, co umożliwia

szczytowy wzrost komórki (Cai i Cresti 2009; Onelli i Moscatelli 2013; Cai i in. 2015).

Dynamikę aktyny i funkcjonowanie szlaków transportu opartych na systemie akto-

miozynowym regulują liczne białka ABP, których aktywność moduluje optymalne Ca2+c w

zdefiniowanych strefach rosnącej łagiewki pyłkowej (Ren i Xiang 2007; Fu 2010; Staiger i in.

2010; Hepler i Winship 2015; Qu i in. 2015). W świetle tych faktów, otrzymane wyniki badań

wskazują, że CRT jest ważnym elementem wewnątrzkomórkowego mechanizmu, który

stabilizując gradient Ca2+

wpływa na współdziałanie podstawowych procesów i struktur

warunkujących szczytowy wzrost łagiewki pyłkowej Petunia. Równie istotna w tym

procesie może być niekwestionowana funkcja CRT w kontroli jakości polipeptydów

dojrzewających w ER, ze względu na wymagane wysokie tempo syntezy białek podczas

elongacji łagiewki – najszybciej rosnącej komórki roślinnej.

Ujawnione miejsca lokalizacji CRT w słupku i rosnących łagiewkach pyłkowych Petunia

potwierdzają aktywność tego białka także poza ER

Wszystkie opisane dotychczas roślinne warianty CRT zawierają peptyd sygnałowy i

sekwencję retencyjną HDEL, które determinują ich lokalizację w ER (Jia i in. 2009; przegl.

Lenartowska i in. 2009). Pomimo takiej budowy, potwierdzono obecność CRT poza

wspomnianym przedziałem komórkowym (również w komórkach zwierzęcych), głównie w

diktiosomach i różnego typu pęcherzykach, a także na terenie cytozolu, jądra komórkowego,

wrzeciona podziałowego, w ciałach białkowych, błonie komórkowej, plazmodesmach, na

powierzchni komórki i w ścianie komórkowej (przegl. Lenartowska i in. 2009).

Dokumentowana przez kolejne doniesienia naukowe identyfikacja CRT poza ER podlega

ciągłej dyskusji (Christensen i in. 2010; Lenartowski i in. 2015; Luczak i in. 2015;

Niedojadło i in. 2015). Jak dotąd brak jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób

CRT może opuszczać wnętrze ER. Formułowane hipotezy uwzględniają możliwość

powstawania wariantów splicingowych białka kierowanych do różnych lokalizacji w

komórce, a także potranslacyjne modyfikacje CRT skutkujące utratą sekwencji retencyjnej

HDEL (Johnson i in. 2001; Michalak i in. 2009). Jedna z najnowszych publikacji zespołu

naukowego prof. dr hab. Przemysława Wojtaszka bezsprzecznie dowodzi, że CRT (podobnie

jak kilka innych białek) jest wiązana w ścianach komórkowych kukurydzy, Lupinus i

Arabidopsis (Luczak i in. 2015).

W trakcie badań stanowiących podstawę osiągnięcia naukowego ujawniłem

lokalizację PhCRT zarówno w przedziałach komórkowych uznawanych dla tego białka za

typowe (ER i diktiosomy) jak i poza nimi (Lenartowski i in. 2015), co potwierdza

wcześniejsze obserwacje naszego zespołu i innych grup badawczych. Badania

immunocytochemiczne prowadzone na poziomie mikroskopu elektronowego wykazały, że

głównym miejscem występowania CRT w szlaku transmisyjnym słupka Petunia, komórkach

gametofitu żeńskiego, rosnących w słupku łagiewkach pyłkowych oraz w zygocie i

rozwijającym się bielmie jest ER i diktiosomy (Lenartowski i in. 2015). Ponadto, obecność

badanego białka potwierdziłem w jądrach komórkowych, ciałach jądrowych i jąderkach oraz

na terenie aparatu fibrylarnego synergid. Wykazałem także akumulację PhCRT mRNA w

jądrach tych komórek oraz w jądrze wegetatywnym kiełkującego ziarna pyłkowego i

wyrastającej łagiewki, jak i komórkach plemnikowych deponowanych na terenie docelowej

synergidy (Lenartowski i in. 2014). Rozważania teoretyczne dotyczące lokalizacji PhCRT w

subdomenach jądrowych oraz w aparacie fibrylarnym synergid podczas kluczowych zdarzeń

reprodukcyjnych w słupku zostały obszernie przedyskutowane w odniesieniu do hipotetycznej

roli tego białka w procesie regulacji aktywności transkrypcyjnej, organizacji przestrzennej

chromatyny, eksportu białek na teren cytoplazmy, składania/dojrzewania transkryptów i

biogenezy rybosomów oraz funkcji mobilnego magazynu Ca2+

i roli białka opiekuńczego

(Lenartowski i in. 2014, 2015). Niemniej, kwestia biologicznej roli CRT poza ER wymaga

dalszych, szczegółowych badań.

5.5 Podsumowanie

Wyniki badań stanowiących podstawę prezentowanego osiągnięcia naukowego

umożliwiły sformułowanie następujących wniosków końcowych:

zidentyfikowany w słupku Petunia gen PhCRT jest zachowywany w toku ewolucji i

koduje transkrypt, na matrycy którego powstaje polipeptyd z grupy izoform CRT1/2

opisywane jako białka o podstawowym znaczeniu w utrzymaniu homeostazy Ca2+

oraz

kontroli jakości polipeptydów dojrzewających w ER;

gen PhCRT podlega wzmożonej ekspresji podczas kluczowych etapów procesu

reprodukcji w słupku Petunia, takich jak dojrzewanie szlaku transmisyjnego słupka

poprzedzające antezę, kiełkowanie pyłku i wzrost łagiewek pyłkowych, depozycja

komórek plemnikowych w docelowej synergidzie, podwójne zapłodnienie oraz wczesna

embriogeneza;

podwyższona ekspresja PhCRT w słupku Petunia koreluje z dynamiką zmian w poziomie

wymiennego Ca2+

w komórkach uczestniczących w interakcji pyłek-słupek, w których

precyzyjna regulacja Ca2+c

jest krytyczna podczas kolejnych zdarzeń reprodukcyjnych;

w komunikujących się komórkach, PhCRT i wymienny Ca2+

współwystępują w ER i

diktiosomach, stanowiących niekwestionowane miejsca występowania CRT u roślin oraz

mobilne magazyny Ca2+

w komórkach eukariotycznych;

w kiełkujących ziarnach pyłkowych i rosnących łagiewkach Petunia translacja PhCRT

odbywa się na rybosomach związanych z ER w ściśle określonych regionach cytoplazmy,

jakimi są aktywna apertura kiełkującego ziarna pyłkowego oraz strefa podwierzchołkowa i

dystalny trzon rosnącej łagiewki pyłkowej;

PhCRT uczestniczy w utrzymaniu homeostazy Ca2+

w rosnącej łagiewce pyłkowej

Petunia, co umożliwia przebieg podstawowych procesów i współdziałanie struktur

warunkujących szczytowy wzrost komórki;

ujawnione miejsca lokalizacji PhCRT w jądrach komórek szlaku transmisyjnego słupka

Petunia, gametofitu żeńskiego, zygoty i rozwijającego się bielma oraz na obszarze aparatu

fibrylarnego synergid potwierdzają aktywność tego białka także poza ER.

Podsumowując, uzyskane wyniki badań wskazują, że CRT jest istotnym elementem

wewnątrzkomórkowego mechanizmu gromadzenia i mobilizacji Ca2+

podczas

kluczowych etapów rozmnażania generatywnego Petunia, takich jak dojrzewanie szlaku

transmisyjnego słupka, kiełkowanie pyłku i ukierunkowany wzrost łagiewki pyłkowej,

uwolnienie komórek plemnikowych w docelowej synergidzie, blok polispermii, fuzja gamet,

aktywacja genomu zygotycznego oraz rozwój zarodka i bielma. Równie ważne w tym

wieloetapowym procesie może być zaangażowanie CRT w kontrolę jakości polipeptydów

dojrzewających w ER. Ta niekwestionowana funkcja CRT może gwarantować utrzymanie

wysokiego tempa syntezy białek podczas aktywności wydzielniczej komórek szlaku

transmisyjnego słupka, szczytowy wzrost łagiewki pyłkowej związany z egzocytozą na jej

wierzchołku oraz proces formowania zarodka i tkanki odżywczej w postaci bielma.

5.6 Literatura

Boavida L, Becker, J Fejio J (2005) The making of gametes in higher plants. Int J Dev Biol

49:595–614

Cai G, Cresti M (2009) Organelle motility in the pollen tube: a tale of 20 years. J Exp Bot

60:495–508

Cai G, Parrotta L, Cresti M (2015) Organelle trafficking, the cytoskeleton, and pollen tube

growth. J Integr Plant Biol 57:63–78

Chen Q, Jagannathan S, Reid DW, Zheng T, Nicchita CV (2011) Hierarchical regulation of

mRNA partitioning between the cytoplasm and the endoplasmic reticulum of mammalian

cells. Mol Biol Cell 22:2646–2658

Cheung AY, Wu HM (2007) Structural and functional compartmentalization in pollen tubes. J

Exp Bot 58:75–82

Christensen A, Svensson K, Thelin L, Wenjing Z, Tintor N, Prins D, Funke N, Michalak M,

Schulze-Lefert P, Saijo Y, Sommarin M, Widell S, Persson S (2010) Higher plant

calreticulins have acquired specialized functions in Arabidopsis. PLoS ONE 5:e11342

Cui XA, Palazzo AF (2014) Localization of mRNAs to the endoplasmic reticulum. Wiley

Interdiscip Rev RNA 5:481–492

Cui XA, Zhang H, Palazzo AF (2012) p180 promotes the ribosome-independent localization

of a subset of mRNA to the endoplasmic reticulum. PLoS Biol 10:e1001336

Del Bem LE (2011) The evolutionary history of calreticulin and calnexin genes in green

plants. Genetica 139:255–259

Dong H, Pei W, Ren H (2012) Actin fringe is correlated with tip growth velocity of pollen

tubes. Mol Plant 5:1160–1162

Dowd PE, Coursol S, Skirpan AL, Kao TH, Gilroy S (2006) Petunia phospholipase c1 is

involved in pollen tube growth. Plant Cell 18:1438–1453

Dresselhaus T, Franklin-Tong N (2013) Male-female crosstalk during pollen germination,

tube growth and guidance, and double fertilization. Mol Plant 6:1018-1036

Fu Y (2010) The actin cytoskeleton and signaling network during pollen tube tip growth. J

Integr Plant Biol 52:131–137

Ge LL, Tian HQ, Russell SD (2007) Calcium function and distribution during fertilization in

angiosperms. Am J Bot 94:1046-1060

Geitmann A, Snowman BN, Emons AM, Franklin-Tong VE (2000) Alterations in the actin

cytoskeleton of pollen tubes are induced by the self-incompatibility reaction in Papaver

rhoeas. Plant Cell 12:1239–1251

Gibbon BC, Kovar DR, Staiger CJ (1999) Latrunculin B has different effects on pollen

germination and tube growth. Plant Cell 11:2349–2363

Guan Y, Guo J, Li H, Yang Z (2013) Signaling in pollen tube growth: crosstalk, feedback,

and missing links. Mol Plant 6:1053–1064

Hepler PK, Rounds CM, Winship LJ (2013) Control of cell wall extensibility during pollen

tube growth. Mol Plant 6:998–1017

Hepler PK, Winship LJ (2015) The pollen tube clear zone: clues to the mechanism of

polarized growth. J Integr Plant Biol 57:79–92

Hörmanseder K, Obermeyer G, Foissner I (2005) Disturbance of endomembrane trafficking

by brefeldin A and calyculin A reorganizes the actin cytoskeleton of Lilium longiflorum

pollen tubes. Protoplasma 227:25–36

Jia XY, He LH, Jing RL, Li RZ (2009) Calreticulin: conserved protein and diverse functions

in plants. Physiol Plant 136:127–138

Jin H, Hong Z, Su W, Li J (2009) A plant-specific calreticulin is a key retention factor for a

defective brassinosteroid receptor in the endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci USA

106:13612–13617

Johnson S, Michalak M, Opas M, Eggleton P (2001) The ins and outs of calreticulin: from the

ER lumen to the extracellular space. Trends Cell Biol 11:122–129

Kim JH, Nguyen NH, Nguyen NT, Hong SW, Lee H (2013) Loss of all three calreticulins,

CRT1, CRT2 and CRT3, causes enhanced sensitivity to water stress in Arabidopsis. Plant

Cell Rep 32:1843-1853

Kost B, Spielhofer P, Chua NH (1998) A GFP-mouse talin fusion protein labels plant actin

filaments in vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes. Plant J

16:393–401

Lenartowska M, Karaś K, Marshall J, Napier R, Bednarska E (2002) Immunocytochemical

evidence of calreticulin-like protein in pollen tubes and styles of Petunia hybrida Hort.

Protoplasma 219:23–30

Lenartowska M, Lenartowski R, Bednarska E (2001) Localization of the calreticulin gene

mRNA in unpollinated and pollinated styles of Petunia hybrida Hort. J Appl Genet 42:15–

20

Lenartowska M, Lenartowski R, Smoliński DJ, Wróbel B, Niedojadło J, Jaworski K,

Bednarska E (2009) Calreticulin expression and localization in plant cells during pollen-

pistil interactions. Planta 231:67–77

Lenartowska M, Walczewski J, Lenartowski R (2009) Kalretikulina – budowa,

lokalizacja komórkowa oraz proponowane funkcje u zwierząt i roślin. Post Bioch

55:406-15

Lenartowski R, Suwińska A, Lenartowska M (2015) Calreticulin expression in relation

to exchangeable Ca2+

level that changes dynamically during anthesis, progamic phase,

and double fertilization in Petunia. Planta 241:209-227

Lenartowski R, Suwińska A, Prusińska J, Gumowski K, Lenartowska M (2014)

Molecular cloning and transcriptional activity of a new Petunia calreticulin gene

involved in pistil transmitting tract maturation, progamic phase, and double

fertilization. Planta 239:437-454

Li J, Zhao-Hui C, Batoux M, Nekrasov V, Roux M, Chinchilla D, Zipfel C, Jones JD (2009)

Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune

receptor EFR. Proc Natl Acad Sci USA 106:15973–15978

Lovy-Wheeler A, Wilsen KL, Baskin TI, Hepler PK (2005) Enhanced fixation reveals the

apical cortical fringe of actin filaments as a consistent feature of the pollen tube. Planta

221:95–104

Luczak M, Krzeszowiec-Jeleń W, Konopka-Postupolska D, Wojtaszek P (2015) Collagenase

as a useful tool for the analysis of plant cellular peripheries. Phytochemistry 112:195-209

Mesaeli N, Nakamura K, Zvaritch E, Dickie P, Dziak E, Krause KH, Opas M, MacLennan

DH, Michalak M (1999) Calreticulin is essential for cardiac development. J Cell Biol.

144:857-868.

Michalak M, Groenendyk J, Szabo E, Gold LI, Opas M (2009) Calreticulin, a multiprocess

calcium-buffering chaperone of the endoplasmic reticulum. Biochem J 417:651– 666

Napier RM, Trueman S, Henderson J, Boyce JM, Hawes C, Fricker MD, Venis MA (1995)

Purification, sequencing and functions of calreticulin from maize. J Exp Bot 46:1603–1613

Nardi MC, Feron R, Navazio L, Mariani P, Pierson E, Wolters-Arts M, Knuiman B, Mariani

C, Derksen J (2006) Expression and localization of calreticulin in tobacco anthers and

pollen tubes. Planta 223:1263–1271

Nelson DE, Glaunsinger B, Bohnert HJ (1997) Abundant accumulation of the calciumbinding

molecular chaperone calreticulin in specific floral tissues of Arabidopsis thaliana. Plant

Physiol 114:29–37

Niedojadło K, Lenartowski R, Lenartowska M, Bednarska-Kozakiewicz E

(2015) Late

progamic phase and fertilization affect calreticulin expression in the Hyacinthus orientalis

female gametophyte. Plant Cell Rep 34:2201-15

Onelli E, Moscatelli A (2013) Endocytic pathways and recycling in growing pollen tubes.

Plants 2:211–229

Persson S, Rosenquist M, Sommarin M (2002) Identification of a novel calreticulin isoform

(Crt2) in human and mouse. Gene 4:151–158

Persson S, Rosenquist M, Svensson K, Galvao R, Boss WF, Sommarin M (2003)

Phylogenetic analyses and expression studies reveal two distinct groups of calreticulin

isoforms in higher plants. Plant Physiol 133:1385–1396

Pyhtila B, Zheng T, Lager PJ, Keene JD, Reedy MC, Nicchitta CV (2008) Signal sequence-

and translation-independent mRNA localization to the endoplasmic reticulum. RNA

14:445–453

Qin Y, Yang Z (2011) Rapid tip growth: insights from pollen tubes. Sem Cell Dev Biol

22:816–824

Qiu Y, Xi J, Du L, Roje S, Poovaiah BW (2012) A dual regulatory role of Arabidopsis

calreticulin-2 in plant innate immunity. Plant J 69:489-500

Qu X, Jiang Y, Chang M, Liu X, Zhang R, Huang S (2015) Organization and regulation of the

actin cytoskeleton in the pollen tube. Front Plant Sci 5:1-13

Rauch F, Prud'homme J, Arabian A, Dedhar S, St-Arnaud R (2000) Heart, brain, and body

wall defects in mice lacking calreticulin. Exp Cell Res. 256:105-111

Ren H, Xiang Y (2007) The function of actin-binding proteins in pollen tube growth.

Protoplasma 230:171–182

Saijo Y, Tintor N, Lu X, Rauf P, Pajerowska-Mukhtar K, Häweker H, Dong X, Robatzek S,

Schulze-Lefert P (2009) Receptor quality control in the endoplasmic reticulum for plant

innate immunity. EMBO J 28:3439–3449

Snowman BN, Kovar DR, Shevchenko G, Franklin-Tong VE, Staiger CJ (2002) Signal

mediated depolymerization of actin in pollen during the self-incompatibility response.

Plant Cell 14:2613–2626

Staiger CJ, Poulter NS, Henty JL, Franklin-Tong VE, Blanchoin L (2010) Regulation of actin

dynamics by actin-binding proteins in pollen. J Exp Bot 61:1969–1986

Steinhorst L, Kudla J (2013) Calcium – a central regulator of pollen germination and tube

growth. Biochim Biophys Acta 1833:1573-1581

Suwińska A, Lenartowski R, Smoliński DJ, Lenartowska M (2015) Molecular evidence

that rough endoplasmic reticulum is the site of calreticulin translation in Petunia

pollen tubes growing in vitro. Plant Cell Rep 34:1189-99

Suwińska A, Wasąg P, Zakrzewski P, Lenartowska M, Lenartowski R

(2017)

Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in

Petunia. Planta doi:10.1007/s00425-017-2649-0

Takeuchi H, Higashiyama T (2011) Attraction of tip-growing pollen tubes by the female

gametophyte. Curr Opin Plant Biol 14:614–621

Thelin L, Mutwil M, Sommarin M, Persson S (2011) Diverging functions among calreticulin

isoforms in higher plants. Plant Signal Behav 6:905–910

Trivellini A, Cocetta G, Vernieri P, Mensuali-Sodi A, Ferrante A (2015) Effect of cytokinins

on delaying Petunia flower senescence: a transcriptome study approach. Plant Mol Biol

87:169–180

Vandecaetsbeek I, Vangheluwe P, Raeymaekers L, Wuytack F, Vanoevelen J (2011) The

Ca2+

pumps of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus. Cold Spring Harb Perspect

Biol 3:a004184

Vaucheret H, Béclin C, Fagard M (2001) Post-transcriptional gene silencing in plants. J Cell

Sci 114:3083-3091

Vidali L, McKenna ST, Hepler PK (2001) Actin polymerization is essential for pollen tube

growth. Mol Biol Cell 12:2534–2545

Vidali L, Rounds CM, Hepler PK, Bezanilla M (2009) Lifeact–mEGFP reveals a dynamic

apical F-actin network in tip growing plant cells. PLoS One 4:e5744

Vu KV, Nguyen NT, Jeong CY, Lee YH, Lee H, Hong SW (2017) Systematic deletion of the

ER lectin chaperone genes reveals their roles in vegetative growth and male gametophyte

development in Arabidopsis. Plant J doi:10.1111/tpj.13435 Wang Y, Kumar PP (2007) Characterization of two ethylene receptors PhERS1 and PhETR2

from petunia: PhETR2 regulates timing of anther dehiscence. J Exp Bot 58: 533–544

6. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych

Pozostały dorobek publikacyjny, nie wchodzący w skład osiągnięcia naukowego, to:

6 oryginalnych prac eksperymentalnych i 8 publikacji przeglądowych, w tym 8

opublikowanych w czasopismach znajdujących się w bazie JCR (ang. Journal Citation

Reports) o łącznej wartości IF=15,471 (zgodnie z rokiem opublikowania) oraz 6

nieposiadających współczynnika wpływu IF; sumaryczna liczba punktów dla publikacji

nie wchodzących w skład osiągnięcia naukowego wynosi 192 wg listy MNiSW (zgodnie z

rokiem opublikowania);

35 doniesień konferencyjnych prezentowanych na międzynarodowych i krajowych

konferencjach naukowych.

Powyższe publikacje i doniesienia konferencyjne są efektem badań prowadzonych przeze

mnie podczas realizacji pracy doktorskiej oraz po osiągnięciu stopnia doktora nauk

biologicznych. Pozycje te są także wynikiem mojej współpracy naukowej z różnymi grupami

badawczymi. Tematyka prowadzonych badań dotyczy głównie swoistej tkankowo

ekspresji genu hydroksylazy tyrozynowej (TH) u ssaków oraz aktywności genów CRT w

organach generatywnych różnych gatunków roślin okrytonasiennych, a także topologii DNA,

dystrybucji małych niekodujących RNA w wyspecjalizowanych komórkach roślinnych czy

funkcjonowania miozyny VI (MVI) w komórkach zwierzęcych. Natomiast prace

przeglądowe opisują zagadnienia związane z regulacją ekspresji określonych jednostek

transkrypcyjnych i roli ich produktów w wybranych procesach komórkowych oraz

strukturalno-funkcjonalnej aranżacji architektury jądra komórkowego w komórkach

zwierzęcych. Zamieszczony poniżej komentarz stanowi syntetyczny opis najważniejszych

wyników badań nie wchodzących w skład osiągnięcia habilitacyjnego.

Wykaz najczęściej stosowanych skrótów:

Ca2+

wapń/jony wapnia

CRT/CRT gen/białko kalretikuliny/a

MVI miozyna VI

NM macierz jądrowa

NMP białka macierzy jądrowej

SAR/MAR sekwencje DNA wiązane przez białka macierzy jądrowej

TH/TH gen/enzym hydroksylazy tyrozynowej

TH-/TH

+ tkanki z nieaktywnym i aktywnym genem TH

Rozwój naukowy przed uzyskaniem stopnia doktora nauk biologicznych

Identyfikacja elementów cis i trans włączonych w swoistą tkankowo ekspresję genu TH

W 1995 roku ukończyłem studia magisterskie w dziedzinie biologii (specjalność

biologia molekularna) na Wydziale BiNoZ UMK (obecnie Wydział Biologii i Ochrony

Środowiska, BiOŚ) i obroniłem pracę magisterską, wykonaną w Pracowni Genetyki pod

kierunkiem dr Anny Goc pt. „Lokalizacja miejsc przyczepu wołowego genu hydroksylazy

tyrozynowej do matriks jądrowej izolowanej metodą LIS”. Celem pracy dyplomowej było

uzyskanie preparatów matriks jądrowej (NM, ang. nuclear matrix) i wykorzystanie ich w

badaniach dotyczących tkankowo swoistej ekspresji genu TH, który warunkuje poprawne

działanie układu dopaminergicznego u zwierząt. Przyjęta strategia badawcza była oparta na

powiązaniu wzorca przestrzennej organizacji chromatyny z aktywnością transkrypcyjną TH w

tkankach bydlęcych, w których ten gen jest aktywny (rdzeń nadnercza, TH+) lub wyciszony

(wątroba, TH-). W trakcie badań porównawczych z wykorzystaniem preparatów NM

izolowanych z obu tkanek wykonałem hybrydyzację metodą Southerna z użyciem

specyficznych sond molekularnych pokrywających proksymalną część promotora i fragment

sekwencji kodującej TH. Działanie to miało doprowadzić do zmapowania sekwencji DNA

określanych jako MAR (ang. matrix associated region) bądź SAR (ang. scaffold attachment

region), znajdujących się w podstawach pętli chromatynowych, które wchodzą w interakcje z

białkami NM (NMP). Powszechnie uważa się, że oddziaływania S/MAR z NMP odpowiadają

za przestrzenną organizację chromatyny i decydują o aktywności transkrypcyjnej genów w

komórkach eukariotycznych. Niestety, pomimo pozyskania preparatów NM odpowiedniej

jakości, nie udało się wówczas precyzyjnie zidentyfikować obszarów sekwencji TH

kotwiczonych przez białka NM do szkieletu jądrowego.

Badania dotyczące przestrzennej organizacji chromatyny genu TH kontynuowałem w

trakcie czteroletnich studiów doktoranckich na Wydziale BiNoZ UMK w Toruniu, po których

zostałem zatrudniony na stanowisku asystenta w Pracowni Genetyki (UMK w Toruniu).

Zastosowanie w procesie mapowania techniki PCR oraz wykonanie reakcji wiązania in vitro

egzogennych sond pokrywających obszar -9kpz/+7kpz bydlęcego i -2,3kpz/+2,3kpz

ludzkiego genu TH doprowadziło do ujawnienia sekwencji S/MAR w badanych jednostkach

transkrypcyjnych. Było to pierwsze doniesienie na świecie dokumentujące stałe miejsce

przyczepu w pierwszym intronie TH Bos taurus do NM izolowanej z bydlęcych tkanek TH- i

TH+ (niezależnie od statusu transkrypcyjnego) oraz tkankowo swoiste wiązanie w układzie

heterologicznym pierwszego intronu TH Homo sapiens przez czynniki trans NM izolowanej z

bydlęcej tkanki TH+. Analiza proksymalnej części sekwencji promotora TH u obu badanych

gatunków wykazała korelację pomiędzy statusem transkrypcyjnym TH a obecnością miejsc

S/MAR. Wykazałem, że badany fragment promotora ludzkiego i bydlęcego genu TH jest

kotwiczony przez NMP tylko w tkance TH+. Otrzymane wyniki badań pozwoliły na

sformułowanie wniosku, że swoiste tkankowo białka/kompleksy białkowe wiążą sekwencję

promotora genu TH Bos taurus i Homo sapiens, podczas gdy intronowe S/MAR wchodzą w

interakcje z NMP w sposób swoisty gatunkowo. Nie można jednak wykluczyć, że wśród

białek NM wiążących się w obszarze intronu występują także polipeptydy swoiste tkankowo.

Podsumowując, wyniki analizy porównawczej rozkładu sekwencji S/MAR w genach TH

Homo sapiens i Bos taurus wskazują na gatunkowo specyficzną organizację chromatyny

obu badanych jednostek transkrypcyjnych.

Badania prowadzone w ramach realizacji pracy doktorskiej były finansowane z dotacji

statutowej na utrzymanie potencjału badawczego Pracowni Genetyki oraz grantów UMK, w

których pełniłem funkcję głównego wykonawcy. Otrzymane przeze mnie wyniki zostały

zawarte w dysertacji doktorskiej pt. „Badanie miejsc przyczepu do macierzy jądrowych genu

hydroksylazy tyrozynowej – ich specyficzność tkankowa i gatunkowa", którą obroniłem w

2001 roku. Promotorem w przewodzie doktorskim była prof. dr hab. Barbara Chwirot

(Pracownia Biologii Molekularnej Nowotworów, UMK w Toruniu), a funkcję bezpośredniego

opiekuna naukowego pełniła dr Anna Goc (Pracownia Genetyki, UMK w Toruniu). Wyniki

zawarte w pracy doktorskiej były prezentowane w formie doniesień konferencyjnych

(Załącznik nr 4).

Identyfikacja transkryptów genu/ów CRT w rosnących łagiewkach pyłkowych

Podczas realizacji pracy doktorskiej wyspecjalizowałem się w dziedzinie

biologii/genetyki molekularnej, wykorzystując wybrane metody/techniki badawcze w pracy

eksperymentalnej, której celem była analiza poziomu/regulacji ekspresji genów w komórkach

eukariotycznych. Zdobyta wiedza i umiejętności praktyczne umożliwiły mi nawiązanie

współpracy naukowej z Pracownią Biologii Rozwoju (PBR, UMK w Toruniu), kierowaną w

tym czasie przez prof. dr hab. Elżbietę Bednarską. Projekty realizowane w tej grupie

badawczej dotyczyły głównie udziału Ca2+

, pektyn i białek wiążących Ca

2+, takich jak

kalmodulina i kalretikulina (CRT) w rozmnażaniu generatywnym roślin okrytozalążkowych.

Hipoteza robocza jednego z nich zakładała potencjalny udział CRT w procesie

ukierunkowanego wzrostu łagiewki pyłkowej w słupku. Moim zadaniem w tym projekcie

było wygenerowanie antysensownej sondy molekularnej na podstawie sekwencji CRT cDNA

Zea mays i wykorzystanie jej w celu odnalezienia transkryptów CRT w cytoplazmie łagiewek

pyłkowych rosnących w tkance transmisyjnej słupka Petunia. Badania z wykorzystaniem

hybrydyzacji in situ na poziomie mikroskopu elektronowego potwierdziły ekspresję

homologa genu/ów CRT zarówno w komórkach transmisyjnych jak i łagiewkach pyłkowych.

Były to pierwsze obserwacje na świecie dokumentujące obecność transkryptów CRT w

tych komórkach. Otrzymane wyniki badań były prezentowane na konferencji naukowej

(Załącznik nr 4) i zostały opublikowane:

Lenartowska M, Lenartowski R, Bednarska E (2001) „Localization of the calreticulin

gene mRNA in unpollinated and pollinated styles of Petunia hybrida Hort”. J Appl Genet

42:15-20.

Rozwój naukowy po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych

Mechanizmy regulacji ekspresji genów neuronalnych

Po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych opublikowałem dwie oryginalne

prace badawcze przedstawiające wyniki badań zawarte w dysertacji:

Lenartowski R, Goc A (2002) "Tissue-specific association of the human tyrosine

hydroxylase gene with the nuclear matrix”. Neurosci Lett 330:151-154

Lenartowski R, Grzybowski T, Miścicka-Śliwka D, Wojciechowski W, Goc A (2003)

"The bovine tyrosine hydroxylase gene associates with the nuclear matrix by its first intron

sequence”. Acta Bioch Pol 3:865-873

oraz trzy polskojęzyczne prace przeglądowe podejmujące problem regulacji aktywności

hydroksylazy tyrozynowej i budowy oraz funkcji NM:

Lenartowski R, Goc A (2002) „Wielopoziomowa regulacja hydroksylazy tyrozynowej. I:

regulacja potranskrypcyjna”. Post Hig i Med Dosw 56:555-565,

Lenartowski R, Goc A (2002) „Wielopoziomowa regulacja hydroksylazy tyrozynowej. II:

Transkrypcyjna regulacja”. Post Hig i Med Dosw 56:671-686,

Lenartowski R, Goc A (2002) „Rola macierzy jądrowej w przestrzennej organizacji

procesów jądrowych”. Post Biochem 48:252-261.

Moja wiedza i umiejętności w dziedzinie biologii molekularnej, w tym metod inżynierii

genetycznej, umożliwiła mi odbycie dwuletniego stażu podoktorskiego (w latach 2003-

2005) w laboratorium prof. Karen O'Malley (Department of Anatomy and Neurobiology –

obecnie Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine in Saint

Louis, Missouri), który jest jednym z wiodących ośrodków naukowych w USA. Projekt w

dziedzinie neurobiologii, który realizowałem w zespole naukowym prof. Karen O'Malley,

wymagał ode mnie zmiany dotychczas wykorzystywanych modeli badawczych i poszerzenia

warsztatu metodycznego o techniki inżynierii genetycznej stosowane w rekombinacji

sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC, ang. bacterial artificial chromosome).

Głównym celem projektu pt. „Transcriptional Control of Neuroendocrine Genes” (nr

MH45330) było przygotowanie zwierzęcego modelu choroby Parkinsona z możliwością

czasowo-przestrzennej kontroli ekspresji wybranych genów w kontrolowanych warunkach

eksperymentalnych. Ekspresja zmutowanych kopii genów lub indukcja cytotoksyczności,

wywołana nadekspresją danej jednostki transkrypcyjnej w żądanej subpopulacji neuronów,

miała umożliwić identyfikację mechanizmów odpowiedzialnych za proces neurodegeneracji.

W tym celu zrekombinowałem obecny na BAC locus mysiego genu TH sekwencją

aktywatora transkrypcyjnego rtTA2S-M2, stanowiącą część systemu binarnego TETon w

bakteriach niosących system λRED. Przygotowany konstrukt posłużył do otrzymania

organizmów założycielskich i wyprowadzenia linii transgenicznych myszy, u których

możliwa była indukcja ekspresji transgenu w zdefiniowanej populacji komórek nerwowych -

neuronach dopaminergicznych. Dysfunkcja tego niezwykle rzadkiego typu komórek wiąże się

z zaburzeniami działania układu dopaminergicznego, które skutkują wywołaniem procesu

chorobowego u człowieka. Wykreowana linia modyfikowanych genetycznie myszy została

wstępnie przebadana i zdeponowana w Mouse Genetics Core (Washington University in Saint

Louis, WUSTL). W tym czasie byliśmy szóstym laboratorium na świecie, w którym z

powodzeniem zastosowano opisaną technikę rekombinacji DNA in vivo (ang.

recombineering). Potwierdzenie odbycia stażu naukowego stanowi Załącznik 4a.

Po powrocie do Polski kontynuowałem badania rozpoczęte w USA (przygotowując

kolejne konstrukty BAC) w oparciu o umowę finansową zawartą pomiędzy UMK w Toruniu i

WUSTL (potwierdzenie współpracy naukowej stanowi Załącznik 4b), a następnie dzięki

zdobyciu dwóch grantów badawczych finansowanych z puli środków Unii Europejskiej w

ramach konkursów pn. „Konkurs dla świata nauki” oraz „Wspieranie nauki”, ogłoszonych

przez Marszałka Województwa Kujawsko-Pomorskiego jako instytucji pośredniczącej (oba

granty uzyskały finansowanie w 2007 r.). Byłem autorem wniosków konkursowych oraz

kierownikiem i wykonawcą obu projektów badawczych. Niestety, pomimo mojego

zaangażowania w realizację wszystkich zaplanowanych zadań, nie udało się opublikować

uzyskanych wyników badań. Powodem była nagła choroba i śmierć prof. Richarda Todda w

2008 r., dyrektora Division of Child and Adolescent Psychiatry WUSTL, który był

faktycznym pomysłodawcą i koordynatorem realizowanego przeze mnie projektu w USA. W

tym samym roku laboratorium prof. Karen O'Malley zawiesiło obustronną współpracę

naukową, a wyprowadzony przez mnie organizm modelowy oraz pozyskane konstrukty BAC,

zgodnie z moją wiedzą, nigdy nie zostały wykorzystane w badaniach. Zaistniałe okoliczności

miały decydujący wpływ na przebieg mojej dalszej kariery naukowej.

Zdecydowałem się na publikację pracy przeglądowej:

Lenartowski R, Gumowski K, Goc A (2008) „Wielofunkcyjność białka CHIP w systemie

kontroli jakości białek”. Post Hig Med Dosw 62:297-308,

podsumowującej wiedzę na temat genu CHIP (ang. carboxyl terminus of Hsp70-interacting

protein), którego nadekspresję planowaliśmy zaindukować u transgenicznych myszy z

aktywatorem transkrypcyjnym rtTA2S-M2. Równolegle kontynuowałem badania dotyczące

wpływu przestrzennej organizacji chromatyny genu TH na jego status transkrypcyjny u bydła

i człowieka, których głównym celem była identyfikacja i molekularna charakterystyka

czynników trans oraz docelowych elementów cis włączonych w proces jego swoistej

tkankowo ekspresji. Zostałem powołany na promotora pomocniczego w dwóch

przewodach doktorskich: mgr Piotra Wasąga (w 2012 r.) oraz mgr Joanny Jabłońskiej (w

2015 r.), realizujących studia doktoranckie w Zakładzie Genetyki (UMK w Toruniu) pod

opieką dr hab. Anny Goc. Miałem wiodący udział w opracowaniu planu badań dla obu

doktorantów, nadzorowałem merytorycznie ich przebieg i finansowałem zdecydowaną

większość zadań badawczych wynikających z harmonogramu w ramach dotacji statutowej na

utrzymanie potencjału badawczego Pracowni Izotopowej i Analizy Instrumentalnej (PIiAI),

którą kieruję od 2011 r. Mgr Piotr Wasąg uzyskał stopień doktorski w 2015 r. Wyniki

prowadzonych przez niego badań doprowadziły do zmapowania minimalnego obszaru

odpowiadającego za wiązanie pierwszego intronu genu TH do NM bydlęcych tkanek TH+ i

TH-. Wykorzystując technikę Southwestern, wytypował szereg białek NM w obu badanych

bydlęcych tkankach oraz ludzkich liniach komórkowych TH+ (SH-SY5Y) i TH

- (HepG2),

oddziałujących z obszarem +766/+1193 pz genu TH. Analiza molekularnych mas tych

polipeptydów umożliwiła wskazanie białek NM o charakterze gatunkowo, tkankowo i

komórkowo swoistym. Test opóźnienia migracji w żelu (EMSA) wykazał, że w wykrywanych

interakcjach TH DNA-NM mogą uczestniczyć także złożone kompleksy białkowe.

Otrzymane wyniki badań były prezentowane w formie doniesień konferencyjnych (Załącznik

nr 4). Wspólnie opublikowaliśmy również pracę przeglądową:

Wasąg P, Lenartowski R (2016) „Macierz jądrowa struktura funkcja i patogeneza”. Post.

Hig. i Med. Dośw. 70:1206-1219.

Wśród wyników badań otrzymanych w trakcie realizacji pracy doktorskiej przez mgr

Joannę Jabłońską (obecnie Joanna Guenter) należy wymienić przede wszystkim zmapowanie

w 30 kpz fragmencie położonym w locus TH miejsc wchodzących w swoiste tkankowo

interakcje z NM, izolowaną z bydlęcych tkanek oraz ludzkich linii komórkowych TH+ i TH

-.

Ponadto, przeprowadzone doświadczenia z wykorzystaniem techniki EMSA wykazały, że

pierwszy intron ludzkiego genu TH jest wiązany przez polipeptydy/kompleksy białkowe

charakterystyczne dla linii komórkowych TH+, TH

- lub obecne w obu badanych liniach

komórkowych. Otrzymane wyniki badań były prezentowane w formie doniesień

konferencyjnych i stanowią część doświadczalną dysertacji doktorskiej przygotowywanej

przez mgr Joannę Jabłońską (Guenter). Wspólnie opublikowaliśmy również pracę

przeglądową:

Guenter J, Lenartowski R (2016) „Molekularna charakterystyka oraz fizjologiczne

znaczenie DOPA-dekarboksylazy”. Post Hig Med Dosw. 70 1424-1440.

W omawianym okresie aktywności naukowej byłem również współautorem anglojęzycznej

pracy przeglądowej dotyczącej mechanizmów regulacji ekspresji genu TH:

Lenartowski R, Goc A (2011) “Epigenetic, transcriptional and posttranscriptional

regulation of the tyrosine hydroxylase gene”. Int J Dev Neurosci 2:873–883.

CRT w interakcjach pyłek-słupek podczas rozmnażania generatywnego roślin

Po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych kontynuowałem współpracę

naukową z zespołem badawczym prof. dr hab. Elżbiety Bednarskiej-Kozakiewicz będąc

głównym wykonawcą projektu pt. „Rola apoplastu w interakcjach komórkowych u roślin

okrytonasiennych” (grant KBN 3 P04C 05123, 2002-2003). Wyniki naszych badań były

prezentowane w formie doniesień konferencyjnych (Załącznik nr 4) i nagrodzone w

kategorii najlepsze doniesienie plakatowe pt. „Expression of the calreticulin (CRT) gene in

pollen tubes growing in vitro: analysis by fluorescent in situ hybridization (FISH)” podczas 1st

Conference of the Polish Society for Plant Experimental Biology w Olsztynie (PSPEB, 2003).

Po powrocie ze stażu naukowego w USA zintensyfikowałem współpracę naukową w

zakresie identyfikacji molekularnych elementów funkcjonujących w procesach komórkowych

podczas rozmnażania generatywnego roślin okrytonasiennych z prof. dr hab. Elżbietą

Bednarską (Zakład Biologii Komórki, UMK w Toruniu), oraz dr Martą Lenartowską

(Pracownia Biologii Rozwoju, UMK w Toruniu). Zostałem głównym wykonawcą w dwóch

projektach badawczych: grant MNiSW N303 023 32/1034 pt. „Rola Ca2+

i cytoszkieletu

aktynowego w ukierunkowanym wzroście łagiewki pyłkowej” (2007-2010) i grant MNiSW N

N303 290434 pt. „Dynamika transkrypcji i dystrybucja elementów systemu splicingowego

podczas płciowego rozmnażania roślin kwiatowych” (2008-2011) oraz wykonawcą w

trzecim projekcie pt. „Analiza ekspresji i dystrybucji mikro RNA w komórkach męskiego i

żeńskiego gametofitu przed i po zapłodnieniu u roślin okrytozalążkowych” (grant NCN

2011/03/D/NZ3/00603, 2011-2016).

W ramach realizacji pierwszego projektu skoncentrowałem się na poszukiwaniu

dowodów świadczących o udziale CRT w interakcjach komórkowych podczas elongacji

łagiewki pyłkowej w słupku, prowadząc badania u dwóch gatunków roślin okrytonasiennych

różniących się budową anatomiczną słupka (jednoliścienna Haemanthus i dwuliścienna

Petunia). Badania prowadzone przeze mnie w kilkuosobowym zespole potwierdziły obecność

CRT w kiełkujących ziarnach pyłkowych, rosnących łagiewkach i komórkach szlaku

transmisyjnego słupka obu gatunków roślin. Były to pierwsze doniesienia dokumentujące

ekspresję CRT w łagiewkach pyłkowych rosnących zarówno w warunkach in vitro jak i w

słupku. Wyniki naszych badań były prezentowane na konferencjach naukowych (Załącznik nr

4), a uzyskane dla Haemanthus zostały opublikowane:

Lenartowska M, Lenartowski R, Smoliński DJ, Wróbel B, Niedojadło J, Jaworski K,

Bednarska E (2009) “Calreticulin expression and localization in plant cells during pollen-

pistil interactions”. Planta 231:67-77.

Dokonane obserwacje doprowadziły nas do wniosku, że wzorzec dystrybucji CRT i jej

transkryptów jest uniwersalny podczas interakcji pyłek-słupek, co może świadczyć o

istotnej funkcji CRT w procesie rozmnażania generatywnego roślin okrytonasiennych. Jednak

postawiona hipoteza wymagała weryfikacji w oparciu o szerokie spektrum metod

badawczych, w tym narzędzi i technik biologii molekularnej, które potrafiłem wykorzystać w

pracy eksperymentalnej.

Udział w tym projekcie badawczym był punktem zwrotnym w mojej karierze

naukowej. Jako współautor pracy przeglądowej:

Lenartowska M, Walczewski J, Lenartowski R (2009) „Kalretikulina – budowa,

lokalizacja komórkowa oraz proponowane funkcje u zwierząt i roślin”. Post Biochem

55:406-415,

zapoznałem się dogłębnie z literaturą przedmiotu i podjąłem decyzję o kontynuacji

rozpoczętych badań u Petunia. Pracując w kilkuosobowym zespole naukowym, uzyskałem

wyniki stanowiące podstawę prezentowanego osiągnięcia habilitacyjnego, które zostały

opublikowane i były wielokrotnie prezentowane na konferencjach naukowych (Załącznik nr

4). Dwa z nich zostały wyróżnione w kategorii najlepsze doniesienie plakatowe:

„Calreticulin and its transcripts synthesis during pollen germination and pollen tube

elongation in Petunia hybrida - fluorescent in situ hybridization and immunocytochemical

studies” (5th

Conference of the PSPEB we Wrocławiu, 2011) oraz “Transcriptional activity of

Petunia calreticulin gene (PhCRT) involved in pistil transmitting tract maturation, progamic

phase and double fertilization” (6th

Conference of the PSPEB w Łodzi, 2013). Badania

prowadziłem dzięki dotacji statutowej na utrzymanie potencjału badawczego kierowanej

przeze mnie jednostki (PIiAI, UMK w Toruniu) oraz we współpracy naukowej z Pracownią

Biologii Rozwoju (PBR, UMK w Toruniu). W ramach tej współpracy, trwającej do chwili

obecnej, zostałem powołany na promotora pomocniczego w przewodzie doktorskim mgr

Anny Suwińskiej (w 2009 r.), która uzyskała stopień doktora nauk biologicznych w 2015

roku. Wymiernym efektem naszych wspólnych badań w ostatnim czasie jest oryginalna praca

doświadczalna pt. „Calreticulin localizes to plant cellular peripheries of highly specialized

cells involved in pollen-pistil interactions” (Piotr Wasąg, Anna Suwińska, Przemysław

Zakrzewski, Jakub Walczewski, Robert Lenartowski, Marta Lenartowska), która jest w

trakcie recenzji w czasopiśmie Protoplasma.

Udział w dwóch kolejnych projektach badawczych zaowocował dotychczas moim

współautorstwem w trzech doniesieniach konferencyjnych (Załącznik nr 4) oraz w jednej

oryginalnej pracy badawczej:

Niedojadło K, Lenartowski R, Lenartowska M, Bednarska-Kozakiewicz E (2015) “Late

progamic phase and fertilization affect calreticulin expression in the Hyacinthus orientalis

female gametophyte”. Plant Cell Rep 34:2201-221.

Wyniki naszych badań ujawniły zróżnicowany poziom ekspresji CRT w komórkach woreczka

zalążkowego Hyacinthus orientalis przed i po zapyleniu. Stosując fluorescencyjną

hybbrydyzację in situ oraz immunocytochemiczne techniki lokalizacji antygenów,

ujawniliśmy istotny wzrost poziomu CRT mRNA i białka CRT w docelowej synergidzie

podczas późnej fazy progamicznej oraz po zapłodnieniu, w zygocie i rozwijającym się

bielmie. Podobnie jak w przypadku innych badanych przez nas gatunków roślin, głównym

miejscem występowania CRT była siateczka śródplazmatyczna i diktiosomy (typowe miejsca

lokalizacji tego białka w komórkach eukariotycznych), ale także teren aparatu fibrylarnego

synergid (co wykazałem wcześniej u Petunia). Otrzymane wyniki są kolejnym dowodem

potwierdzającym uniwersalny wzorzec dystrybucji CRT i jej transkryptów w gametoficie

żeńskim roślin okrytonasiennych, co potwierdza funkcję tego białka podczas podwójnego

zapłodnienia i wczesnej embriogenezy.

Natomiast mój udział w badaniach dotyczących biogenezy małych, niekodujących

RNA podczas rozmnażania generatywnego roślin okrytonasiennych zaowocował dotychczas

współautorstwem w dwóch doniesieniach konferencyjnych (Załącznik nr 4). Ujawniliśmy

czasowo-przestrzenną dystrybucję komponentów białkowych biorących udział w procesie

wyciszania ekspresji genów z udziałem miRNA (AGO1 i HYL1) oraz siRNA (AGO4) w

komórkach gametofitu męskiego Hyacinthus orientalis. Analizy immunocytochemiczne

potwierdziły zróżnicowany wzorzec lokalizacji badanych białek w dojrzałych,

dwukomórkowych ziarnach pyłkowych i rosnących in vitro łagiewkach, w tym w jądrze

wegetatywnym i generatywnym oraz w komórkach plemnikowych. Uzyskane wyniki

wskazują, że regulacja ekspresji genów podczas rozwoju gametofitu męskiego u roślin

odbywa się z udziałem regulatorowych RNA. Manuskrypt oryginalnej pracy badawczej jest

przygotowywany do publikacji.

Inne tematy badawcze realizowane w ramach współpracy naukowo-badawczej

Od powrotu ze stażu naukowego w USA współpracuję również z zespołem naukowym

kierowanym przez prof. dr hab. Aleksandra Baltera (Zakład Biofizyki i Fizyki Medycznej,

Wydział Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej UMK w Toruniu) oraz grupą badawczą

prof. dr hab. Marii Jolanty Rędowicz (Pracownia Molekularnych podstaw Ruchów

Komórkowych, Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie).

Współpraca z prof. Aleksandrem Balterem podejmuje problem mechaniki DNA,

determinującej biologiczne właściwości tej makrocząteczki. Przeprowadziliśmy badania

mechaniki pojedynczych cząsteczek DNA w zakresie bardzo dużych sił deformujących,

wykorzystując dwie komplementarne techniki badawcze, tj. spektroskopię pojedynczych

molekuł przy wykorzystaniu mikroskopu sił atomowych (AFM, ang. atomic force

microscope) oraz symulację sterowanej dynamiki molekularnej (SMD, ang. steered molecular

dynamics). Wykonane pomiary umożliwiły uzyskanie krzywych siłowych w zaplanowanym

zakresie wartości sił oraz dokonanie pionierskich obserwacji nowego przejścia

mechanicznego. Uchwyciliśmy nieopisywane dotąd plateau obecne na wykresie zależności

siły rozciągającej od stopnia odkształcenia cząsteczki DNA. Wykonaliśmy także pomiary

krzywych siłowych dla cząsteczek DNA różnej długości, w celu określenia zależności między

długością łańcucha polinukleotydowego a długością plateau. Symulacje SMD dla modeli

pełno-atomowych, skonfrontowane z danymi eksperymentalnymi, stały się podstawą do

wysunięcia hipotezy, że obserwowane zjawisko powstaje w wyniku wymuszonego

rozciąganiem zaciskania struktury podwójnej helisy i przejścia cząsteczki DNA do nowej

konformacji (z parami zasad przemieszczonymi na zewnątrz). Zgodnie z tą hipotezą,

cząsteczka DNA poddana wysokiemu naprężeniu zachowuje integralność nawet dla sił

uznawanych za znacznie przekraczające granice jego wytrzymałości. Otrzymane przez nas

wyniki badań uzupełniają wiedzę w zakresie mechaniki DNA, a w szerszej perspektywie

mogą być przydatne w zrozumieniu mechanizmów jądrowych/komórkowych, w tym procesu

nowotworzenia związanego z pękaniem chromosomów. Rzucają także nowe światło na

makrocząsteczkę DNA w kontekście jej potencjalnego wykorzystania do wytwarzania

nanostruktur. Wymiernym efektem naszych badań jest doniesienie konferencyjne (Załącznik

nr 4) oraz opublikowana praca doświadczalna:

Strzelecki J, Peplowski L, Lenartowski R, Nowak W, Balter A (2014) “Mechanical

transition in a highly stretched and torsionally constrained DNA”. Phys Rev E 89:020701.

W ramach trójstronnej współpracy pomiędzy PIiAI, PBR i zespołem naukowym prof.

Marii Jolanty Rędowicz prowadzimy także badania dotyczące ekspresji miozyny VI (MVI)

u zwierząt, ze szczególnym uwzględnieniem dojrzewających spermatyd myszy oraz ludzkich

komórek neuronalnych w kulturach in vitro. MVI jest unikalnym białkiem motorycznym

cytoszkieletu aktynowego, które jako jedyne wśród dotąd poznanych miozyn porusza się w

kierunku końca „minus” mikrofilamentu. Ta unikalna cecha decyduje prawdopodobnie o

wyjątkowych funkcjach MVI w różnych typach komórek i procesach komórkowych u

zwierząt. Wiadomo, że białko to pełni kluczową rolę w późnej fazie spermatogenezy u

Drosophila, natomiast mutacja genu MVI u myszy wywołuje poważne zaburzenia w

strukturze narządu Cortiego (powodujące utratę słuchu), ale także obniżoną płodność

mutantów. Prowadzone przez nas badania są ważne z uwagi na potencjalny udział MVI w

procesie spermatogenezy, który u ssaków nie był dotąd badany. Wyniki naszych badań

dowodzą, że w jądrach myszy funkcjonują dwa spośród czterech możliwych wariantów

splicingowych tego białka – z tzw. małą wstawką oraz bez żadnej wstawki w C-końcowym

odcinku ogonka MVI. Badania immunocytochemiczne prowadzone w oparciu o szczegółowe

analizy ultrastrukturalne z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej wskazują, że podobnie

jak u Drosophila, MVI może być zaangażowana w prawidłowy przebieg procesu

spermiogenezy u myszy na wszystkich jego etapach.

Natomiast eksperymenty prowadzone z wykorzystaniem ludzkich linii komórkowych

zmierzają do ustalenia biologicznej roli MVI w jądrze komórkowym. Wiadomo, że spośród

wszystkich miozyn występujących w komórkach zwierzęcych, w jądrach komórkowych

potwierdzono obecność tylko kilku z nich, w tym MVI. Niestety, ich funkcja w tym

przedziale komórkowym pozostaje w sferze spekulacji. Prowadzone przez nas badania

potwierdziły obecność MVI na terenie jąder neuronalnych komórek PC12, w tym w

jąderkach, gdzie białko to współwystępuje z nukleoliną, fibrylaryną, polimerazą RNA I oraz

białkiem B23. Zaobserwowaliśmy również, że wyciszenie ekspresji MVI w badanych

komórkach powoduje zmiany w lokalizacji markerów jąderkowych oraz w organizacji

jąderka i rybosomów. Natomiast zahamowanie transkrypcji rybosomalnego DNA wywołuje

istotne zmiany w lokalizacji MVI, w tym brak jej kolokalizacji z fibrylaryną. Uzyskane

wyniki badań sugerują potencjalny udział MVI w utrzymaniu prawidłowej struktury/funkcji

jąderka związanej z biogenezą rybosomów, jednak ta hipoteza wymaga dalszych,

szczegółowych analiz. W ramach współpracy z zespołem naukowym prof. Marii Jolanty

Rędowicz, w 2015 roku zostałem powołany na promotora pomocniczego w przewodzie

doktorskim mgr Jolanty Nowak (Pracownia Molekularnych podstaw Ruchów Komórkowych,

Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego w Warszawie). Dotychczas

uzyskane przez nas wyniki badań nad rolą MVI w wyspecjalizowanych komórkach

zwierzęcych zostały zaprezentowane w formie czterech doniesień konferencyjnych

(Załącznik nr 4). Przygotowaliśmy także manuskrypt oryginalnej pracy doświadczalnej pt.

„Expression and localization of myosin VI in developing mouse spermatids” (Przemysław

Zakrzewski, Robert Lenartowski, Maria J. Rędowicz, Kathryn G. Miller, Marta Lenartowska),

która jest w trakcie recenzji w czasopiśmie Histochemistry and Cell Biology.

Po uzyskaniu stopnia doktora nauk biologicznych współpracowałem również z dr

Markiem Jankowskim (Pracownia Diagnostyki Obrazowej i Farmakologii Skóry, Katedra

Dermatologii, Wydział Lekarski Collegium Medicum UMK w Toruniu/Bydgoszczy) w

projekcie dotyczącym immunoterapii niedrobnokomórkowego raka płuc przy użyciu

metod terapii genowej. Wspólnie badania wiązały się z koniecznością skonstruowania

wektorów plazmidowych kodujących chimeryczne białko złożone z humanizowanego

fragmentu flagelliny Salmonella typhimurium oraz domeny transbłonowej ludzkiego

receptora płytkowego czynnika wzrostu. Jednocześnie sekwencje wektorów poddawano

modyfikacjom zwiększającym ich stabilność i efektywność. Polegały one głównie na dodaniu

syntetycznych, aktywowanych w komórkach nowotworu sekwencji promotorów, sekwencji

umożliwiających episomalne utrzymywanie się plazmidu w komórce, czy retrowirusowych

elementów typu P2A, umożliwiających jednoczesną ekspresję kilku sekwencji cDNA.

Wynikiem tej współpracy są trzy doniesienia konferencyjne (Załącznik nr 4).

Za osiągnięcia w działalności naukowo-badawczej po uzyskaniu stopnia doktora nauk

biologicznych otrzymywałem czterokrotnie nagrody/wyróżnienia JM Rektora UMK w

Toruniu: Nagrodę zespołową III stopnia (za osiągnięcia w roku akademickim 2002/2003),

Indywidualne wyróżnienie (za osiągnięcia w 2014 r.) oraz Wyróżnienie zespołowe i Nagrodę

Indywidualną III stopnia (za osiągnięcia w 2015 r.).

Kompletny wykaz wszystkich osiągnięć naukowo-badawczych, w tym publikacji

naukowych i innych wskaźników dokonań naukowych oraz dorobek dydaktyczny,

organizacyjny i popularyzatorski zawiera Załącznik nr 4.

Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych · 2017. 6. 8. · “Molecular...

Documents

Transcript of Autoreferat przedstawiający opis dorobku i osiągnięć naukowych · 2017. 6. 8. · “Molecular...