Autoreferat - IBBAutoreferat dr Paulina Jackowiak ... uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej....

Załącznik nr 2

do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego

Autoreferat

dr Paulina Jackowiak

Zakład Biologii Molekularnej i Systemowej

Instytut Chemii Bioorganicznej

Polskiej Akademii Nauk

Poznań, listopad, 2018

dr Paulina Jackowiak Załącznik nr 2

2

1. Imię i Nazwisko.

Paulina Jackowiak

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe – z podaniem nazwy, miejsca i roku ich

uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.

stopień doktora nauk chemicznych w zakresie biochemii (z wyróżnieniem),

Instytut Chemii Biooorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu (ICHB

PAN), 2010. Tytuł rozprawy doktorskiej: Identyfikacja czynników kształtujących

strukturę populacji wirusowej w przebiegu przewlekłego zapalenia wątroby typu

C, promotor: prof. dr hab. Marek Figlerowicz;

tytuł magistra biologii, specjalność biologia molekularna, Wydział Biologii

Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, 2004. Tytuł pracy

magisterskiej: Badanie wpływu struktury RNA na zdolność odwrotnej

transkryptazy wirusa HIV do wykonywania niehomologicznych przeskoków

rekombinacyjnych, promotor pracy: doc. dr hab. Marek Figlerowicz (praca

wykonana w Zespole Wirusologii Molekularnej ICHB PAN);

tytuł licencjata biologii, specjalność biologia molekularna, Wydział Biologii

Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu, 2002. Tytuł pracy

licencjackiej: Potranskrypcyjne wyciszanie ekspresji genów, promotor: dr hab.

Artur Jarmołowski, prof. UAM.

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych.

01.01.2011–obecnie: adiunkt w Zakładzie Biologii Molekularnej i Systemowej,

ICHB PAN;

01.10.2014–30.09.2016: adiunkt w Zakładzie Chemii Organicznej, Instytut

Technologii i Inżynierii Chemicznej, Wydział Technologii Chemicznej

Politechniki Poznańskiej;

01.01.2010–31.12.2010: asystent w Zespole Wirusologii Molekularnej,

Pracowni Biologii Molekularnej Roślin, ICHB PAN.


3

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca

2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w

zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.):

a) tytuł osiągnięcia naukowego

Identyfikacja fragmentów RNA w wybranych układach eukariotycznych oraz

charakterystyka zidentyfikowanych cząsteczek w kontekście ich biogenezy i potencjału

funkcjonalnego

b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego (autor/autorzy, rok

wydania, tytuł/tytuły publikacji, nazwa wydawnictwa, recenzenci wydawniczy)

1. P. Jackowiak#, M. Nowacka#, P. M. Strozycki, M. Figlerowicz*, 2011, RNA

degradome - its biogenesis and functions, Nucleic Acids Research 39(17), 7361-7370;

IF 8.026; kwartyl 1 (biochemistry & molecular biology); MNiSW 40; cytowania:

26/22 bez autocytowań;

praca nagrodzona Nagrodą Naukową ICHB PAN w 2012 roku

2. M. Nowacka, P. M. Strozycki, P. Jackowiak, A. Hojka-Osinska, M. Szymanski, M.

Figlerowicz*, 2013, Identification of stable, high copy number, medium-sized RNA

degradation intermediates that accumulate in plants under non-stress conditions, Plant

Molecular Biology 83(3), 191-204;

IF 4.072; kwartyl 1 (plant sciences); MNiSW 40; cytowania: 19/16 bez

autocytowań

3. P. Jackowiak, A. Hojka-Osinska, A. Philips, A. Zmienko, L. Budzko, P. Maillard, A.

Budkowska, M. Figlerowicz*, 2017, Small RNA fragments derived from multiple RNA

classes – the missing element of multi-omics characteristics of the hepatitis C virus cell

culture model, BMC Genomics, 18, 502;

IF 3.730; kwartyl 1 (biotechnology & applied microbiology); MNiSW 40;

cytowania: 1/0 bez autocytowań


4

4. A. Hojka-Osinska, L. Budzko, A. Zmienko, A. Rybarczyk, P. Maillard, A.

Budkowska, M. Figlerowicz, P. Jackowiak*, 2016, RNA-Seq-based analysis of

differential gene expression associated with hepatitis C virus infection in a cell culture,

Acta Biochimica Polonica, 63(4), 789-798;

IF 1.159; kwartyl 4 (biochemistry & molecular biology); MNiSW 15; cytowania:

2/1 bez autocytowań

5. P. Jackowiak*, A. Lis, M. Luczak, I. Stolarek, M. Figlerowicz*, 2018, Functional

characterization of RNA fragments using high-throughput interactome screening,

Journal of Proteomics, https://doi.org/10.1016/j.jprot.2018.10.007;

IF2017 3.722; kwartyl 1 (biochemical research methods); MNiSW 35; cytowania: 0

6. P. Jackowiak*, A. Hojka-Osinska, K. Gasiorek, M. Stelmaszczuk, D. Gudanis, Z.

Gdaniec, M. Figlerowicz*, 2017, Effects of G-quadruplex topology on translational

inhibition by tRNA fragments in mammalian and plant systems in vitro, The

International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 92, 148-154;

IF 3.247; kwartyl 2 (biochemistry & molecular biology); MNiSW 35; cytowania: 0

*autor korespondencyjny

#autorzy równorzędni

łączny IF = 23.956; MNiSW = 205 ; liczba cytowań: 48/39 bez autocytowań

Oświadczenia habilitantki oraz współautorów dotyczące ich wkładu w powstanie

poszczególnych publikacji znajdują się w Załączniku nr 5, natomiast kopie publikacji

stanowiących osiągnięcie naukowe znajdują się w Załączniku nr 6.

https://doi.org/10.1016/j.jprot.2018.10.007


5

c) omówienie celu naukowego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z

omówieniem ich ewentualnego wykorzystania

I. Wprowadzenie

Niekodujący RNA (ang. non-coding RNA, ncRNA) pełni pierwszoplanowe

funkcje we wszystkich typach komórek żywych, zarówno jako ich konstytutywny

element, jak i czynnik regulujący zachodzące w nich procesy [1]. Co więcej, istnieje

wiele przesłanek świadczących o tym, że cząsteczki ncRNA odegrały istotną rolę w

sukcesie ewolucyjnym organizmów eukariotycznych. Stwierdzono między innymi, że

występujący u bakterii system regulacji ekspresji genów jest efektywny tylko w

przypadku niewielkich genomów, gdyż wymaga zaangażowania wielu specyficznych

czynników białkowych. W rezultacie każdemu nowo powstającemu genowi

towarzyszyć muszą aż cztery kolejne, kodujące białka regulujące jego ekspresję [2, 3].

Zaproponowano, że ta zależność jest podstawowym elementem ograniczającym

złożoność genetyczną bakterii. Dopiero zasadnicza zmiana strategii regulacyjnej, która

dokonała się u eukariontów i polegała na wykorzystaniu RNA, otworzyła organizmom

żywym drogę do dalszego dynamicznego rozwoju [1-3].

Pod koniec pierwszej dekady XXI wieku spektrum znanych ncRNA

powiększyło się znacząco wraz z odkryciem, że w komórkach tworzone są i

akumulowane stabilne fragmenty, powstające z cząsteczek reprezentujących różne klasy

RNA (m.in. rRNA, tRNA, snoRNA, mRNA). Odkrycie to nieprzypadkowo zbiegło się

w czasie z powstaniem i upowszechnieniem technik sekwencjonowania nowej generacji

(ang. next generation sequencing, NGS), które umożliwiły identyfikację elementów

transkryptomu na niespotykaną dotąd skalę.

Zagadnienia związane z rolą RNA w procesach biologicznych znalazły się w

centrum moich zainteresowań badawczych już w momencie realizacji pracy

licencjackiej dotyczącej zjawiska potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów.

Dalsze badania, prowadzone w ramach realizacji pracy magisterskiej i doktorskiej,

skupiłam wokół wirusów RNA. W okresie tym zajmowałam się przede wszystkim

poznawaniem mechanizmów warunkujących polimorfizm genetyczny wirusów oraz

analizą jego wpływu na przebieg przewlekłych infekcji i wyniki terapii. Rozpoczynając

w 2010 roku nowy etap kariery zawodowej po uzyskaniu stopnia doktora, swoje

zainteresowania naukowe skoncentrowałam wokół zagadnień dotyczących fragmentów


6

RNA, będących słabo poznaną grupą cząsteczek o potencjalnie dużym znaczeniu dla

przebiegu procesów biologicznych.

II. Krytyczna analiza stanu wiedzy na temat fragmentów RNA

Pierwszym zadaniem jakiego należało się podjąć było usystematyzowanie stanu

wiedzy na temat fragmentów RNA. Poddaliśmy zatem krytycznej analizie dane

literaturowe dotyczące tej tematyki, a wynikające z niej wnioski przedstawiliśmy w

formie publikacji przeglądowej RNA DEGRADOME - ITS BIOGENESIS AND FUNCTIONS

(NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 2011; publikacja nr 1), stanowiącej część osiągnięcia

habilitacyjnego. Została ona uznana za najlepszą pracę przeglądową opublikowaną w

roku 2011 w ICHB PAN. Streszczenie jej głównych wątków przedstawiłam poniżej.

W momencie powstania tego artykułu było już wiadomo, że fragmenty RNA

występują zarówno u przedstawicieli Prokaryota jak i Eukaryota, co wskazywało na

zachowawczość ewolucyjną mechanizmów prowadzących do powstawania i akumulacji

tych cząsteczek oraz sugerowało ich zaangażowanie w przebieg istotnych procesów

komórkowych. Powstawanie fragmentów RNA wiązano w głównej mierze z

warunkami stresowymi. Mimo że zidentyfikowano klasę cząsteczek obejmujących

końce 3’ pre-tRNA, zdecydowana większość poznanych fragmentów nie zawierała

odcinków występujących jedynie w transkryptach pierwotnych. Można było zatem

stwierdzić, że fragmenty powstają przede wszystkim z dojrzałych cząsteczek RNA. Co

więcej, zgromadzone dane wskazywały, iż fragmentacji ulegają cząsteczki funkcjonalne

a nie tylko te, które usuwane są w procesie kontroli jakości. Tylko w nielicznych

przypadkach zidentyfikowano nukleazy zaangażowane w biogenezę fragmentów RNA.

Były to między innymi: kolicyny, angiogenina, Rny1, RNASET2 czy Dicer. Sposób

powstawania większości fragmentów RNA pozostawał jednak nieznany.

Przedstawiliśmy zatem koncepcję, zgodnie z którą fragmenty RNA mogą być

stabilnymi produktami przejściowymi degradacji dojrzałych funkcjonalnych RNA.

Podkreślaliśmy przy tym, że należy wyraźnie odróżnić degradację RNA – ściśle

regulowany i niezwykle efektywny proces zachodzący powszechnie w komórkach

wszystkich organizmów – od przypadkowego rozpadu RNA. Jednocześnie

zaproponowaliśmy odejście od nadawania odrębnych nazw poszczególnym grupom

fragmentów (np. sdRNA, tRFs, tsRNA) na rzecz nazwania ich zbioru degradomem

RNA. Z perspektywy kilku lat można powiedzieć, że kwestia nazewnictwa czy


7

klasyfikacji fragmentów RNA pozostaje nadal otwarta. W miejscu tym warto zaznaczyć

jednak, iż zaproponowana przez nas nomenklatura jest dotąd najbardziej uniwersalna.

Równie szczątkowa jak w przypadku biogenezy fragmentów RNA była wiedza

na temat ich funkcji. Dane literaturowe nie pozostawiały wątpliwości, że pula tych

cząsteczek zawiera ncRNA zaangażowane w regulację szeroko rozumianego procesu

ekspresji genów. Zidentyfikowano między innymi fragmenty RNA stanowiące

cząsteczki przewodnie dla tRNAzy Z, pełniące funkcję miRNA, uczestniczące w

tworzeniu granul stresowych, czy w procesach sygnalizacji u roślin. Z drugiej strony

było jasne, że role przypisane tylko niektórym fragmentom stanowią dopiero wstęp do

poznania rzeczywistego znaczenia tych cząsteczek [publikacja nr 1].

Krytyczna analiza stanu wiedzy na temat fragmentów RNA doprowadziła mnie

do kilku istotnych spostrzeżeń. Po pierwsze, fragmenty RNA powstają w sposób

wtórny, z dojrzałych cząsteczek RNA, które pełnią zdefiniowane role w komórce. Ta

cecha odróżnia je od znanych wcześniej krótkich ncRNA, które generowane są w

wyniku przetwarzania pierwotnych transkryptów. Wskazuje to na istnienie zjawiska

„podwójnego wykorzystania” komórkowych RNA. Po drugie, istnieją przesłanki

świadczące o tym, że biogeneza fragmentów RNA przebiega kilkoma odrębnymi

ścieżkami. Po trzecie, akumulacja tych cząsteczek jest ściśle kontrolowana – tylko

niektóre fragmenty macierzystego RNA są gromadzone, natomiast inne ulegają

całkowitej degradacji. Po czwarte, fragmenty RNA wykazują zróżnicowany potencjał

funkcjonalny. Prawdopodobnie tylko część z nich odgrywa istotną rolę biologiczną,

jednak można sądzić, że spektrum ich funkcji jest stosunkowo szerokie. W kontekście

powyższych spostrzeżeń zrodziło się wiele intrygujących pytań i stało się oczywistym,

że dalsze poszerzanie wiedzy dotyczącej fragmentów RNA jest niezwykle ciekawym,

ale też długofalowym i trudnym zadaniem. Planując moje badania postanowiłam zatem

skupić się w pierwszej kolejności na kilku szczególnie istotnych problemach, które

przedstawiłam poniżej.

Informacje o fragmentach RNA były dotąd zdobywane w głównej mierze

podczas badań poświęconych innym grupom RNA (m.in. miRNA). Rozwiązania

metodyczne z powodzeniem stosowane w tych badaniach były jednak niewystarczające

w przypadku tak szczególnej i heterogennej puli cząsteczek, jaką stanowią fragmenty

RNA. Przykładowo, źródła literaturowe nie zawierały danych dotyczących parametrów

określających jakość prób, w których identyfikowano fragmenty RNA. W przypadku


8

niektórych technik badawczych (qRT-PCR czy mikromacierze) wyznaczono ścisłe

kryteria integralności RNA, które muszą być spełnione, aby uzyskiwane wyniki można

było uznać za wiarygodne. Kryteria te nie odnosiły się jednak do badań fragmentów

RNA. Tymczasem ze względu na nietrwałość RNA, wynikającą zarówno z jego

podatności na nieenzymatyczną hydrolizę jak i cięcie przez nukleazy pozakomórkowe,

jakość badanego materiału ma pierwszorzędne znaczenie. Kolejny problem związany

był z brakiem właściwych podejść analitycznych. Standardowe procedury

sekwencjonowania nowej generacji i analizy uzyskanych wyników w bardzo

ograniczonym stopniu pozwalały na identyfikację indywidualnych fragmentów RNA,

umożliwiając jedynie globalną charakterystykę tej puli cząsteczek i zachodzących w

niej zmian. Koniecznym stało się zatem stworzenie kompleksowych rozwiązań

metodycznych ukierunkowanych na systematyczną analizę fragmentów RNA,

począwszy od przygotowania prób, a skończywszy na bioinformatycznej analizie

wyników sekwencjonowania nowej generacji.

Jak wcześniej wspomniałam, początkowo fragmenty RNA identyfikowano

przede wszystkim w warunkach stresowych, takich jak niedobór substancji

odżywczych, stres oksydacyjny czy zmiany nowotworowe. Gdy rozpoczynałam

niniejsze badania, w literaturze światowej nie istniały żadne doniesienia dotyczące

akumulacji fragmentów RNA podczas stresu, jakim jest infekcja wirusowa.

Zagadnienie to wydało się szczególnie interesujące w kontekście moich wcześniejszych

prac poświęconych wirusom RNA i zdobytej wiedzy na temat oddziaływań między

wirusem a gospodarzem. Było już bowiem wiadomo, że istnieje wyraźny związek

między szlakami degradacji RNA i potranskrypcyjnego wyciszania genów a

przebiegiem niektórych infekcji wirusowych. Stwierdzono nawet, że zaburzenie tych

szlaków przez patogen jest nieodzownym warunkiem rozwoju niektórych infekcji [4].

Zjawisko to dotyczy m.in. modelowego ludzkiego wirusa (+)RNA, jakim jest wirus

zapalenia wątroby typu C (ang. hepatitis C virus, HCV). Podczas infekcji HCV zmienia

się lokalizacja subkomórkowa białek współtworzących tzw. ciałka P i granule stresowe,

struktury rybonukleoproteinowe związane z inhibicją translacji i apoptozą [5]. Ponadto,

komórkowe rybonukleazy, np. RNAza L [6] czy XRN1 [7] hamują rozwój infekcji

katalizując cięcie wirusowych RNA. W szerszej perspektywie, po zakażeniu komórka

staje się obszarem złożonych oddziaływań obejmujących cząsteczki RNA, zarówno

pochodzenia komórkowego jak i wirusowego. Poznanie pełnego spektrum tych


9

cząsteczek uznałam za nieodzowny warunek zrozumienia procesów związanych z

rozwojem i przebiegiem infekcji wirusowych. Jako system badawczy wybrałam układ

modelowy hodowli komórkowej HCV. Stanowi go linia ludzkich komórek raka

wątrobowokomórkowego Huh-7.5, zakażonych cząstkami wirusowymi

reprezentującymi izolat JFH-1 HCV.

W kontekście przedstawionych powyżej rozważań dotyczących warunków

stresowych, rodziło się również pytanie, czy fragmenty RNA są generowane w sposób

powtarzalny także w warunkach fizjologicznych i czy ulegają wówczas znaczącej

akumulacji. Badania dotyczące tego ostatniego zagadnienia były już prowadzone w

Pracowni Biologii Molekularnej Roślin ICHB PAN (obecnie Zakład Biologii

Molekularnej i Systemowej) w momencie, gdy zostałam w niej zatrudniona po

uzyskaniu stopnia doktora. Naszym obiektem badawczym była między innymi roślina

modelowa, Arabidopsis thaliana. Dostępność tego modelu obok wybranego wcześniej,

otwierała możliwość identyfikacji i scharakteryzowania fragmentów RNA w dwóch

zdecydowanie różnych układach eukariotycznych oraz udzielenia odpowiedzi na

pytanie, na ile uniwersalne są mechanizmy powstawania i funkcjonowania tych

cząsteczek.

Za jedno z największych wyzwań dotyczących fragmentów RNA uznałam

określenie ich znaczenia biologicznego. Można było bowiem przypuszczać, że

spektrum ich potencjalnych funkcji jest szerokie i nie ogranicza się tylko do działania w

sposób typowy dla krótkich regulatorowych RNA. Potwierdzały to wspomniane już

doniesienia literaturowe, wskazujące m.in. na udział fragmentów RNA w regulacji

translacji czy sekwestracji białek Ago [8, 9]. Powstało zatem pytanie, w jaki sposób

ocenić potencjał funkcjonalny fragmentów RNA. O ile istniały już metody

wysokoprzepustowej identyfikacji fragmentów RNA, o tyle możliwości równie szeroko

zakrojonej analizy mechanizmów ich działania do tej pory pozostają niedostępne.

Punktem wyjścia do podjęcia prób odpowiedzi na pytanie o potencjał funkcjonalny

fragmentów RNA było przyjęte założenie, że zdolności regulacyjne danej cząsteczki

RNA ujawniają się w większości przypadków dopiero wówczas, gdy wchodzi ona w

skład kompleksu rybonukleoproteinowego, często zawierającego białka o

właściwościach katalitycznych. W momencie rozpoczęcia niniejszych badań,

zidentyfikowanych było tylko kilka białek wiążących fragmenty RNA, takich jak m.in.:

tRNaza Z, Piwi, Ago, eIF4G. Poznanie szerszego spektrum białkowych partnerów


10

fragmentów RNA było zatem koniecznym warunkiem lepszego scharakteryzowania

potencjału funkcjonalnego tej grupy cząsteczek. Z drugiej strony, w kontekście

istniejących doniesień dotyczących wpływu fragmentów RNA na potranskrypcyjną

regulację ekspresji genów i na translację, istotne wydawało się także lepsze poznanie

cech strukturalnych, warunkujących zdolności regulatorowe tych cząsteczek.

III. Cel

Podstawowym celem podjętych prac było stworzenie kompleksowej strategii

badania fragmentów RNA, a następnie zastosowanie jej do identyfikacji tych cząsteczek

w wybranych eukariotycznych układach modelowych oraz poznania uwarunkowań ich

biogenezy i potencjału funkcjonalnego.

Zgodnie z zarysowanymi powyżej kierunkami badawczymi, osiągnięcie tak

postawionego celu wymagało w szczególności:

a) opracowania szeregu rozwiązań metodycznych ukierunkowanych na wszechstronną

analizę fragmentów RNA;

b) identyfikacji fragmentów RNA powstających w Arabidopsis thaliana oraz w

układzie modelowym hodowli komórkowej HCV;

c) identyfikacji czynników mogących warunkować biogenezę fragmentów RNA;

d) identyfikacji białek wiążących wybrane fragmenty RNA;

e) określenia zdolności fragmentów RNA do regulacji wybranego procesu;

f) identyfikacji cech strukturalnych fragmentów RNA, warunkujących ich potencjał

regulatorowy.

IV. Omówienie wyników i ich wykorzystania

Rozpoczynając badania dotyczące fragmentów RNA, włączyłam się w prace

realizowane w naszym zespole już od kilku lat, które koncentrowały się na identyfikacji

i charakterystyce fragmentów RNA powstających w roślinie modelowej Arabidopsis

thaliana. Ich rezultaty przedstawiliśmy w publikacji IDENTIFICATION OF STABLE, HIGH

COPY NUMBER, MEDIUM-SIZED RNA DEGRADATION INTERMEDIATES THAT

ACCUMULATE IN PLANTS UNDER NON-STRESS CONDITIONS (PLANT MOLECULAR

BIOLOGY, 2013; publikacja nr 2). Wykorzystując opracowaną wcześniej metodę


11

elektroforezy dwukierunkowej RNA (opisaną przez nas w pracy niewłączonej do

osiągnięcia naukowego), określiliśmy wzory akumulacji fragmentów RNA w

korzeniach, liściach i kwiatostanach A. thaliana. Wykazaliśmy, że cząsteczki te

występują w roślinie także w warunkach fizjologicznych, w ilościach zbliżonych do

miRNA, a wzory ich akumulacji są wysoce powtarzalne i specyficzne dla

poszczególnych organów. Wskazywało to jednoznacznie, że procesy warunkujące

biogenezę i akumulację fragmentów RNA są ściśle regulowane. Następnie

zidentyfikowaliśmy fragmenty za pomocą klonowania i standardowego

sekwencjonowania metodą Sangera. Stwierdziliśmy, że większość z nich pochodziła z

tRNA i rRNA. W pierwszej grupie dominowały fragmenty obejmujące region 3’ tRNA,

ale były obecne również m.in. połówki 5’. Aby ustalić, czy rybonukleazy typu Dicer są

zaangażowane w powstawanie fragmentów RNA, określiliśmy wzory akumulacji tych

cząsteczek w czterech mutantach A. thaliana, z których każdy pozbawiony był jednego

białka typu Dicer (DCL1, DCL2, DCL3 lub DCL4). Okazało się, że nieobecność

poszczególnych rybonukleaz DCL nie wpływa znacząco na wzór akumulacji

fragmentów RNA, co sugerowało, że powstawanie tych ostatnich jest niezależne od

ścieżki biogenezy krótkich regulatorowych RNA. W kolejnym etapie naszą uwagę

skoncentrowaliśmy na potencjale regulatorowym zidentyfikowanych fragmentów RNA.

Istniały już wówczas pierwsze doniesienia na temat zdolności fragmentów RNA do

hamowania translacji in vitro, zarówno w przypadku fragmentów obecnych w soku

floemowym Cucurbita maxima [8], jak i zidentyfikowanych w komórkach ludzkich

[10]. W tym ostatnim przypadku pokazano in vitro, że w systemie ssaczym (lizat z

retikulocytów królika, ang. rabbit reticulocyte lysate, RRL) efektywnymi inhibitorami

translacji były połówki 5’ tRNA, które: (i) posiadają motyw oligoG na końcu 5’ i

równocześnie (ii) przyjmują strukturę drugorzędową, składającą się z jednoniciowego

motywu oligoG na końcu 5’, poniżej którego występuje spinka, zakończona

jednoniciowym odcinkiem na końcu 3’ [10]. Spośród zidentyfikowanych u A. thaliana

fragmentów tRNA wybraliśmy zatem trzy, które możliwie jak najlepiej spełniały

powyższe warunki, i sprawdziliśmy ich wpływ na przebieg translacji in vitro w

systemie roślinnym (ekstrakt z kiełków pszenicy, ang. wheat germ extract, WGE).

Wszystkie trzy fragmenty obniżały wydajność translacji reporterowego mRNA, przy

czym najwyższą wydajność inhibicji wykazywał fragment At-112A. Nie stwierdziliśmy

istnienia korelacji między liczbą reszt guanozynowych na końcu 5’ fragmentu RNA a


12

jego potencjałem inhibitorowym, co odróżniało układ roślinny od układu ssaczego [10].

Co ciekawe, zastosowany jako cząsteczka kontrolna fragment ludzkiego tRNAAla, który

wydajnie hamował translację w systemie ssaczym [10], nie miał wpływu na przebieg

translacji w systemie roślinnym. Poczynione obserwacje wskazywały z jednej strony na

istnienie pewnych ogólnych podobieństw między procesami hamowania translacji przez

fragmenty tRNA w dwóch układach eukariotycznych. Z drugiej jednak strony

sugerowały, że uwarunkowania strukturalne, które determinują właściwości

regulatorowe fragmentów RNA, są odmienne u roślin i zwierząt.

Dalsze badania poświęcone fragmentom RNA były prowadzone w ramach

kierowanych przeze mnie dwóch projektów badawczych (SONATA, NCN oraz

IUVENTUS PLUS, MNiSW). W pierwszej kolejności staraliśmy się odpowiedzieć na

pytanie, jakie fragmenty RNA powstają w ludzkich komórkach wątrobowych i czy

skład tej puli cząsteczek zmienia się pod wpływem stresu wywołanego infekcją

wirusową. Aby scharakteryzować fragmenty RNA w wybranym układzie modelowym

hodowli komórkowej HCV, nawiązaliśmy współpracę z dr Agatą Budkowską z

Instytutu Pasteura w Paryżu. Dzięki temu uzyskaliśmy możliwość wykorzystania w

naszych badaniach najlepszego dostępnego na świecie systemu hodowli komórkowej

HCV, w którym zachodzą wszystkie etapy infekcji, począwszy od wnikania cząstek

wirusowych do komórek, aż do uwalniania zakaźnych wirionów potomnych. Fragmenty

RNA zidentyfikowaliśmy za pomocą NGS, a wyniki przeprowadzonych badań

przedstawiliśmy w pracy SMALL RNA FRAGMENTS DERIVED FROM MULTIPLE RNA

CLASSES – THE MISSING ELEMENT OF MULTI-OMICS CHARACTERISTICS OF THE

HEPATITIS C VIRUS CELL CULTURE MODEL (BMC GENOMICS, 2017; publikacja nr 3).

Bardzo istotny w tej publikacji jest aspekt metodyczny, opisaliśmy w niej bowiem

opracowane przez nas podejścia ukierunkowane na analizę fragmentów RNA. Po

pierwsze, izolacja RNA obejmowała dwa etapy, w których najpierw otrzymywany był

całkowity RNA, a dopiero później rozdzielany na frakcję wzbogaconą w RNA o

długości poniżej 200 nukleotydów (<200 nt) i frakcję długich RNA (>200 nt). Do

identyfikacji fragmentów RNA wykorzystywane były tylko takie frakcje <200 nt, dla

których współczynnik integralności RNA RIN (ang. RNA integrity number) w

odpowiednich próbkach całkowitego RNA i RNA >200 nt wyniósł co najmniej 9 (gdzie

wartość 10 oznacza maksymalną integralność RNA). Zastosowane kryterium było więc

bardziej rygorystyczne niż proponowane wcześniej w literaturze dla technik


13

mikromacierzowych (RIN ≥8). Po drugie, jakość prób została dodatkowo potwierdzona

za pomocą elektroforezy dwukierunkowej, w której uzyskano wysoce powtarzalne

wzory akumulacji fragmentów RNA. Po trzecie, biblioteki do sekwencjonowania

rozdzielono w żelu poliakryloamidowym, następnie izolowano z niego frakcje

obejmujące cząsteczki krótsze aniżeli większość dojrzałych tRNA i poddano je

sekwencjonowaniu w 100 cyklach. W rezultacie uzyskane odczyty obejmowały pełne

sekwencje analizowanych cząsteczek. Co więcej, odczyty, dla których współczynnik

jakości Phred w przypadku choćby jednego nukleotydu był niższy niż 30 (co oznacza

dokładność przypisania zasady równą 99,9%), nie były brane pod uwagę. Zastosowane

podejście pozwoliło zatem maksymalnie zwiększyć prawdopodobieństwo, że analiza

obejmie jedynie cząsteczki powstałe w komórkach oraz że sekwencje fragmentów RNA

będą odczytane w sposób ciągły, a nie, jak to zwykle ma miejsce, odtworzone

metodami bioinformatycznymi z krótszych odczytów. Ponadto opracowane rozwiązanie

obejmowało: (i) iteracyjne mapowanie odczytów najpierw do sekwencji pochodzących

z baz danych RNA a dopiero później do genomu HCV czy ludzkiego; (ii) analizę

poszczególnych fragmentów w celu ustalenia wzorów cięcia ich cząsteczek

macierzystych; (iii) grupowanie podobnych fragmentów pochodzących z tej samej

cząsteczki macierzystej i wyodrębnienie fragmentów reprezentatywnych dla każdej

grupy (klastra) w celu określenia ich poziomów akumulacji oraz identyfikacji

cząsteczek różnicujących komórki zakażone i niezakażone.

Przeprowadzone analizy pokazały, że najliczniejsze były fragmenty pochodzące

z rRNA, tRNA (wśród nich połówki 5’) i snoRNA, przy czym rozkład długości tych

pierwszych odbiegał od pozostałych i sugerował, że reprezentują one produkty cięcia

rRNA przez procesywne egzonukleazy. Uzyskane dane wskazywały jednoznacznie, że

podobnie jak w przypadku układu roślinnego, także w komórkach ludzkich fragmenty

RNA generowane są w sposób uporządkowany i wysoce powtarzalny. W wyniku

przeprowadzonych analiz szczegółowo scharakteryzowaliśmy fragmenty pochodzące z

konstytutywnych niekodujących RNA: tRNA, snoRNA, Y RNA i snRNA. Analizując

wzory cięcia cząsteczek macierzystych stwierdziliśmy, że nie istnieje uniwersalna

ścieżka biogenezy fragmentów RNA, nawet w obrębie jednej klasy RNA. Ponadto

nasze dane dostarczyły przesłanek wskazujących, że powstawanie przynajmniej

niektórych fragmentów tRNA, Y RNA i snRNA jest procesem dynamicznym,

związanym z rearanżacjami strukturalnymi. Fragmentacja dojrzałych RNA jest zatem


14

mechanizmem generowania cząsteczek o zmienionej strukturze. W ten sposób

zwiększony zostaje repertuar cząsteczek istniejących w komórce. Wykazaliśmy także,

że w wybranym modelu poziomy akumulacji fragmentów RNA i miRNA są zbliżone.

Poziom akumulacji najliczniej występujących fragmentów RNA był podobny w

komórkach zakażonych HCV i niezakażonych (nie wykazywał istotnych statystycznie

zmian), co wskazywało, iż ta grupa cząsteczek jest bardzo znaczącym elementem

transkryptomu układu hodowli komórkowej HCV. Podczas infekcji HCV wzrastał

natomiast poziom akumulacji fragmentów, które w komórkach niezakażonych

występowały w stosunkowo niewielkich ilościach. Nie stwierdziliśmy jednak

powstawania znaczących ilości fragmentów pochodzenia wirusowego. Wykazaliśmy

zatem, że infekcja HCV jest czynnikiem modulującym skład puli fragmentów RNA,

jednak nie powoduje daleko idących globalnych zmian. Szczegółowa charakterystyka

fragmentów snoRNA, snRNA i Y RNA wykazała, że większość z nich zawierała

miejsca wiążące białka. Obserwacja ta miała dwojakie znaczenie. Po pierwsze

pozwoliła sformułować hipotezę, w myśl której białka wiążące RNA (ang. RNA-binding

proteins, RBPs) są ważnymi czynnikami zaangażowanymi w powstawanie i akumulację

fragmentów RNA (białka chronią wiązane regiony cząsteczek macierzystych przed

degradacją do pojedynczych nukleotydów – poszukując czynników uczestniczących w

biogenezie fragmentów RNA należy zatem zwrócić uwagę nie tylko na rybonukleazy,

ale również na białka wiążące macierzyste RNA). Po drugie zaproponowaliśmy, że

fragmenty mogą współzawodniczyć ze swoimi cząsteczkami macierzystymi o wiązanie

z białkami i w ten sposób wywierać wpływ na przebieg procesów komórkowych. Na

podstawie zarówno uzyskanych wyników jak i danych literaturowych wytypowaliśmy

szereg fragmentów RNA jako kandydatów do przyszłych badań funkcjonalnych

(przykładowe zostały opisane w dyskusji, publikacja nr 3). Obejmowały one

potencjalne: biomarkery, niekanoniczne miRNA, cząsteczki przewodnie dla tRNazy Z

czy też regulatory translacji.

Kolejnym zadaniem było określenie potencjału funkcjonalnego

zidentyfikowanych fragmentów RNA. Na tym etapie badań projektowanie testów do

analiz funkcjonalnych pojedynczych fragmentów byłoby jednak naszym zdaniem

przedwczesne i nieefektywne. Oznaczałoby bowiem podążanie wytyczonymi wcześniej

ścieżkami i mogłoby doprowadzić co najwyżej do identyfikacji np. kolejnego

pojedynczego niekanonicznego miRNA bądź cząsteczki przewodniej dla tRNazy Z.


15

Uznaliśmy, że znaczenie takich odkryć jest ograniczone i o wiele bardziej korzystne

będzie opracowanie strategii, która pozwoli analizować znane funkcje fragmentów

RNA w większej skali oraz poszerzy zakres poszukiwań o nowe obszary. Biorąc pod

uwagę powyższe założenie przyjęliśmy, że taka strategia powinna obejmować dwa

zasadnicze elementy: (i) analizę poziomu akumulacji mRNA jako potencjalnych

cząsteczek docelowych dla fragmentów RNA oraz (ii) identyfikację białek

oddziałujących z wybranymi fragmentami RNA.

Pierwszym etapem była zatem charakterystyka profilu ekspresji genów w

układzie modelowym hodowli komórkowej HCV. Dla jej przeprowadzenia

wykorzystane zostały frakcje >200 nt z tych samych izolatów RNA, które wcześniej

posłużyły do identyfikacji fragmentów RNA we frakcjach <200 nt. Wyniki tych badań

przedstawiliśmy w pracy RNA-SEQ-BASED ANALYSIS OF DIFFERENTIAL GENE

EXPRESSION ASSOCIATED WITH HEPATITIS C VIRUS INFECTION IN A CELL CULTURE

(ACTA BIOCHIMICA POLONICA, 2016; publikacja nr 4). Określiliśmy poziom

ekspresji genów kodujących białka, a także zidentyfikowaliśmy te z nich, które ulegają

zmienionej ekspresji po 72 i 96 godzinach od inokulacji. Wykazaliśmy, że infekcja

HCV powoduje wzrost poziomu ekspresji genów zaangażowanych w: (i) sygnalizację

zależną od kinaz aktywowanych mitogenami, (ii) sygnalizację, w której uczestniczą

adipocytokiny, (iii) cykl komórkowy, oraz (iv) metabolizm azotu. Wśród procesów

zmienionych pod wpływem infekcji były m.in.: regulacja cyklu komórkowego,

odpowiedź na stres retikulum endoplazmatycznego, odpowiedź na reaktywne formy

tlenu oraz metabolizm lipidów i aminokwasów. Wyniki zaprezentowane w

publikacjach nr 3 i nr 4 stanowią pierwszy kompleksowy opis transkryptomu układu

modelowego hodowli komórkowej HCV, obejmujący zarówno krótkie RNA (miRNA,

fragmenty RNA), jak i mRNA. Może on zostać wykorzystany przez innych naukowców

w dalszych badaniach procesów zachodzących podczas infekcji HCV w tym

oddziaływań między wirusem a gospodarzem. W naszym zespole wyniki te staną się

podstawą do stworzenia narzędzia bioinformatycznego umożliwiającego wykonanie

szeroko zakrojonych analiz potencjału funkcjonalnego fragmentów RNA in silico. Do

tej pory przeanalizowaliśmy m.in. sekwencje kilkuset fragmentów RNA pod kątem

występowania w nich cech, które mogą predysponować je do pełnienia funkcji miRNA.

Ponadto, za pomocą programów miRanda i PACCMIT przewidziane zostały

transkrypty docelowe dla wybranych fragmentów RNA. Następnie wyznaczyliśmy


16

współczynniki korelacji poziomów akumulacji fragmentów RNA i ich potencjalnych

docelowych mRNA. W najbliższym czasie planujemy stworzyć algorytm

umożliwiający wybranie spośród fragmentów RNA potencjalnych cząsteczek

przewodnich dla tRNAzy Z i wytypowanie mRNA, z którymi mogą one oddziaływać.

Całość zostanie zintegrowana w jedno narzędzie bioinformatyczne, które pozwoli na

bardzo wydajną, jednoczesną analizę tysięcy fragmentów RNA oraz mRNA. Sądzimy,

że zaproponowane podejście doskonale uzupełni opracowaną przez nas strategię

wszechstronnej charakterystyki fragmentów RNA.

Drugim etapem prac zmierzających do określenia potencjału funkcjonalnego

fragmentów RNA była identyfikacja oddziałujących z nimi białek. Ostatnie odkrycia

dokonane za pomocą nowych technik badawczych, takich jak fotozszywanie i

immunoprecypitacja (ang. cross-linking and immunoprecipitation, CLIP) czy

wychwytywanie interaktomu (ang. interactome capture) zmuszają nas do znaczącej

modyfikacji dotychczasowych poglądów na temat sposobów oddziaływania RNA z

białkami oraz roli tych oddziaływań. Po pierwsze ustalono, że w komórkach istnieją

tzw. sieci REM (ang. RNA-enzyme-metabolite), w których aktywność enzymów

metabolicznych jest regulowana przez cząsteczki RNA [11]. Zaobserwowano także

powszechne występowanie białek niekonwencjonalnie oddziałujących z RNA. Białka te

pozbawione są jakichkolwiek znanych domen wiążących RNA, stąd określono je

mianem „enigmRBP” [12]. Stwierdzono, że takie oddziaływania są możliwe dzięki

regionom inherentnie nieuporządkowanym, które występują w o wiele większej puli

białek, aniżeli wcześniej sądzono. Ponadto, tak zwane niespecyficzne oddziaływania

RNA-białko, które kiedyś były uznawane za przypadkowe i małoistotne, zaczęto

uważać za ważny czynnik umożliwiający organizowanie się kompleksów

funkcjonalnych oraz wspomagający tzw. typowe oddziaływania. Zaproponowano

ponadto, że w komórkach mogą powstawać „endogenne aptamery” – cząsteczki, które

dzięki określonej strukturze przestrzennej oddziałują z białkami pozbawionymi

typowych domen wiążących RNA [13, 14]. Postawiliśmy zatem hipotezę, że fragmenty

RNA są ważnymi składnikami komórkowych sieci oddziaływań RNA-białko i

doskonałymi kandydatami do pełnienia wymienionych powyżej ról. Zaproponowaliśmy

nową strategię analizy potencjału funkcjonalnego fragmentów RNA, polegającą na

identyfikacji białek, które bezpośrednio lub pośrednio z nimi oddziałują. Następnie

wybraliśmy siedem fragmentów powstających w hodowli komórkowej HCV


17

(pochodzących z tRNA, snoRNA i snRNA) i zidentyfikowaliśmy oddziałujące z nimi

białka obecne w lizatach komórkowych Huh-7.5, posługując się metodami RNA pull-

down oraz spektrometrii mas. Uzyskane wyniki zaprezentowaliśmy w pracy

FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF RNA FRAGMENTS USING HIGH-THROUGHPUT

INTERACTOME SCREENING (JOURNAL OF PROTEOMICS, 2018; publikacja nr 5).

Dogłębna analiza danych proteomicznych była możliwa dzięki uwzględnieniu

informacji pochodzących z wcześniej opublikowanych źródeł, w tym także danych

stanowiących podstawę do publikacji nr 4. Wykazaliśmy, że fragmenty oddziaływały

zarówno z typowymi RBP, jak i białkami nie posiadającymi znanych domen wiążących

RNA. Co więcej, były to z reguły inne białka aniżeli oddziałujące z cząsteczkami

macierzystymi fragmentów. Oznacza to, że postawiona wcześniej hipoteza dotycząca

udziału fragmentów RNA w regulacji procesów komórkowych poprzez

współzawodnictwo z cząsteczkami z których pochodzą wydaje się obecnie mało

prawdopodobna. Ujawniliśmy istnienie białek preferencyjnie wychwytywanych przez

badane fragmenty. Ponadto dla pięciu fragmentów określiliśmy główne funkcje jakie

pełnią białka tworzące z nimi kompleksy. Wśród tych funkcji było zarówno składanie

mRNA i obróbka tRNA, jak i rekombinacja/replikacja DNA czy metabolizm kwasów

karboksylowych. W dwóch ostatnich przypadkach zidentyfikowane białka nie należały

do typowych RBP. Przeprowadzona analiza pozwoliła zatem wskazać nieznane dotąd

obszary potencjalnego zaangażowania funkcjonalnego badanych fragmentów RNA i

otworzyła pole do dalszych badań. W przyszłości zamierzamy potwierdzić

występowanie odkrytych oddziaływań w układzie komórkowym, a także ustalić, czy

fragmenty RNA bezpośrednio wiążą zidentyfikowane białka, czy też tworzą

rusztowania, na których budowane są bardziej złożone kompleksy

rybonukleoproteinowe. Ponieważ jednak istniejące obecnie „RNA-centryczne” metody

wychwytywania interaktomu umożliwiają jedynie identyfikację białek związanych z

poliadenylowanymi RNA, konieczne będzie zastosowanie technik typu CLIP. W

odróżnieniu od tych pierwszych, podejścia CLIP koncentrują się na poznaniu spektrum

cząsteczek RNA, z którymi wiąże się znane białko. Wyniki naszych badań stanowią

zatem doskonałą podstawę do wytypowania kilku najbardziej interesujących białek,

których oddziaływania z RNA w komórkach zostaną w przyszłości szczegółowo

scharakteryzowane. Wykorzystanie technik typu CLIP wiąże się z koniecznością

optymalizacji istniejącej obecnie metodyki, która obejmuje trawienie preparatów


18

rybonukleazami. Utrudnia to dokonanie oceny, czy dane białko wiąże cząsteczkę

macierzystą, czy powstały z niej fragment RNA. Wyniki wykonanych przez nas analiz

30 zestawów danych uzyskanych przy zastosowaniu technik CLIP wskazują jednak, iż

te ostatnie mogą być z powodzeniem zastosowane do walidacji oddziaływań białek z

fragmentami RNA [publikacja nr 5].

Do tej pory scharakteryzowaliśmy ludzkie białka wiążące fragmenty RNA.

Można jednak postawić hipotezę, że fragmenty RNA oddziałują również z białkami

wirusowymi. Aby ją zweryfikować, planujemy przeprowadzić analogiczne

doświadczenia, korzystając z lizatów komórek zakażonych HCV. W tym celu

nawiązaliśmy współpracę z dr Annette Martin z Instytutu Pasteura w Paryżu. Podczas

stażu naukowo-badawczego w jej laboratorium miałam okazję poznać niezbędne

techniki wirusologiczne, a także przeprowadzić badania będące podstawą do przyszłych

testów funkcjonalnych fragmentów RNA. Z drugiej strony, zamierzamy

scharakteryzować roślinne białka oddziałujące z fragmentami RNA zidentyfikowanymi

u A. thaliana [publikacja nr 1]. Pozwoli to lepiej poznać sieci oddziaływań RNA-

białko u roślin oraz umożliwi ocenę zachowawczości mechanizmów angażujących

fragmenty RNA.

Wśród fragmentów RNA zidentyfikowanych w hodowli komórkowej HCV

[publikacja nr 3] były także fragmenty tRNA posiadające na końcu 5’ motyw oligoG.

Biorąc pod uwagę wyniki naszych badań dotyczących wpływu fragmentów RNA na

translację w układzie roślinnym [publikacja nr 2], postanowiliśmy szczegółowo

scharakteryzować cechy strukturalne tych cząsteczek, warunkujące ich zdolności

regulatorowe. Rezultaty tych prac opisaliśmy w publikacji EFFECTS OF G-

QUADRUPLEX TOPOLOGY ON TRANSLATIONAL INHIBITION BY tRNA FRAGMENTS IN

MAMMALIAN AND PLANT SYSTEMS IN VITRO (THE INTERNATIONAL JOURNAL OF

BIOCHEMISTRY & CELL BIOLOGY, 2017; publikacja nr 6). O ile w przypadku

fragmentów zidentyfikowanych wcześniej u A. thaliana motywy oligoG znajdowały się

w odcinkach jednoniciowych przewidywanej struktury drugorzędowej cząsteczek, o

tyle w przypadku fragmentów powstających w komórkach ludzkich były one

zaangażowane w tworzenie par zasad. Co więcej, jeden z fragmentów nazwany Hs-96K

przyjmował strukturę długiej spinki z trzema pętlami. Przewidywane struktury nie

spełniały zatem kryteriów, które jak wynikało z wcześniejszych badań Ivanova i wsp.

[10], warunkują wydajną inhibicję translacji. Niespodziewanie okazało się jednak, że


19

badane cząsteczki bardzo wydajnie hamowały biosyntezę lucyferazy w systemie

ssaczym. Ta obserwacja doprowadziła nas do wniosku, że uwarunkowania strukturalne

determinujące zdolność fragmentu RNA do inhibicji translacji in vitro są inne niż

wcześniej postulowano. Postawiliśmy hipotezę, że najważniejszym elementem jest

przyjmowanie przez fragmenty RNA struktur kwadrupleksowych. Podczas gdy nasze

badania były w toku, hipoteza ta została wsparta przez wyniki Ivanova i wsp. [15],

którzy zaproponowali, że fragmenty tRNAAla tworzą kwadrupleksy i stanowi to czynnik

determinujący ich potencjał inhibitorowy w RRL i komórkach ssaczych. Do badania

struktury RNA zastosowali oni metodę pomiaru fluorescencji N-metylomezoporfiryny

IX (ang. N-methyl mesoporphyrin IX, NMM) w roztworze oligomeru. NMM jest

barwnikiem specyficznie wiążącym kwadrupleksy. Uznaliśmy jednak, że konieczna jest

dalsza weryfikacja naszej hipotezy, w szczególności potwierdzenie zdolności

fragmentów RNA do przyjmowania struktury kwadrupleksów za pomocą metod, które

dostarczają jednoznacznych dowodów na obecność kwadrupleksu oraz pozwalają

ocenić, czy badane cząsteczki przyjmują jedną, czy też więcej konformacji. W tym celu

posłużyliśmy się spektroskopią magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. nuclear

magnetic resonance, NMR) oraz elektroforezą w żelach poliakryloamidowych, z

zastosowaniem różnicowego barwienia. Ponadto, aby sprawdzić, czy uwarunkowania

strukturalne inhibicji translacji są uniwersalne, przetestowaliśmy wpływ fragmentów

zidentyfikowanych w A. thaliana i w komórkach ludzkich na przebieg translacji w

układzie ssaczym i roślinnym. Pięć spośród sześciu badanych fragmentów bardzo

efektywnie obniżało wydajność produkcji lucyferazy w systemie RRL. Wykazaliśmy,

że wydajne inhibitory posiadały zdolność do przyjmowania struktury kwadrupleksu a

zaburzenie tej struktury (inkubacja w roztworze chlorku litu) w dużym stopniu znosiło

ich działanie hamujące. W systemie WGE wydajność inhibicji była zdecydowanie

niższa i nie korelowała ze zdolnością fragmentu RNA do przyjmowania struktury

kwadrupleksu. Biorąc pod uwagę fakt, iż kwadrupleksy RNA wykazują zróżnicowanie

topologiczne, przetestowaliśmy w jaki sposób na translację w obu systemach wpływają

modelowe krótkie RNA przyjmujące dobrze poznane struktury kwadrupleksów o

różnych topologiach. Stwierdziliśmy, że wpływ modelowych RNA na wydajność

translacji w systemie RRL był uzależniony od topologii tworzonego przez nie

kwadrupleksu. Uzyskane wyniki stały się podstawą do postawienia hipotezy, że koniec

5’ RNA, zaangażowany w tworzenie tetrady guanozynowej, oddziałuje z elementami


20

maszynerii translacyjnej a jego dostępność jest kluczowa dla wywołania efektu

inhibicji. Jednocześnie stwierdziliśmy, że w systemie WGE modelowe kwadrupleksy

nie wpływały na wydajność translacji lub obniżały ją tylko w niewielkim stopniu. Te

obserwacje dowiodły, że uwarunkowania strukturalne hamowania translacji przez

fragmenty RNA w układzie ssaczym i roślinnym są odmienne.

V. Podsumowanie i perspektywy

W ramach przedłożonego osiągnięcia naukowego, opracowana została

kompleksowa strategia badania fragmentów RNA (Rys. 1).

Rys. 1. Strategia badania fragmentów RNA. Opis w tekście.

Jej pierwszym etapem jest identyfikacja indywidualnych fragmentów RNA przy użyciu

sekwencjonowania nowej generacji. Zastosowanie szeregu niestandardowych

rozwiązań, ukierunkowanych na analizę fragmentów RNA (od sposobu przygotowania

prób po analizę bioinformatyczną), umożliwia dokładną charakterystykę tej grupy

cząsteczek. Uwzględnia ona m.in. precyzyjne wyznaczenie miejsc cięcia cząsteczek

dających początek fragmentom, co daje wgląd w biogenezę tych ostatnich. W celu

ustalenia potencjału funkcjonalnego fragmentów RNA stosowane są dwa podejścia:

określenie poziomu akumulacji ich potencjalnych cząsteczek docelowych (mRNA) oraz

identyfikacja ich białkowych partnerów. Kolejnym elementem opracowanej strategii są

wstępne testy funkcjonalne wybranych fragmentów RNA, a także określenie cech

strukturalnych warunkujących zdolności regulatorowe badanych cząsteczek.

Wyniki przedstawione w publikacjach składających się na przedłożone

osiągnięcie naukowe stanowią podstawę do zaproponowania następującego nowego

modelu biogenezy i funkcjonowania fragmentów RNA (Rys. 2).


21

Rys. 2. Model biogenezy i funkcjonowania fragmentów RNA. Opis w tekście.

Dojrzały funkcjonalny RNA wchodzi w skład kompleksu rybonukleoproteinowego, w

którym niektóre jego regiony są związane z białkami, natomiast inne wyeksponowane

na zewnątrz kompleksu. Te ostatnie są cięte przez nukleazy, wśród których mogą być

zarówno specyficzne enzymy, takie jak angiogenina, jak również białka zaangażowane

w degradację RNA i obieg nukleotydów (ang. RNA turnover). RNA może także

podlegać hydrolizie nieenzymatycznej. Region RNA związany z białkiem jest

chroniony przed cięciem, co sprawia, że ten fragment jest stabilny i ulega akumulacji,

podczas gdy pozostałe odcinki RNA są całkowicie degradowane. Oddziaływania RNA-

białko są więc jednym z czynników wpływających na skład puli komórkowych

fragmentów RNA, określają bowiem, dlaczego te a nie inne fragmenty danej cząsteczki

ulegają akumulacji. Następnie może dojść do: (i) uwolnienia fragmentu RNA z

kompleksu rybonukleoproteinowego, rearanżacji jego struktury i związania z innym

białkiem lub kompleksem, bądź (ii) rearanżacji struktury fragmentu RNA wewnątrz

kompleksu rybonukleoproteinowego i powstania zmienionego lub nowego kompleksu.

W rezultacie fragment RNA wiąże się z innymi białkami niż jego cząsteczka

macierzysta i staje się funkcjonalny. Funkcja ta może być spełniana bezpośrednio na

drodze regulacji aktywności białek (tak jak np. podczas regulacji translacji lub

aktywności enzymów metabolicznych), bądź też pośrednio, gdy fragment RNA stanowi

rusztowanie, współuczestnicząc w budowaniu bardziej złożonych kompleksów.


22

Zgodnie z tym modelem, cięcie dojrzałych funkcjonalnych RNA byłoby mechanizmem

indukującym zmiany struktury, a przez to i funkcji RNA, pozwalającym zwiększyć

spektrum cząsteczek regulatorowych. Innymi słowy, w wyniku cięcia istniejący w

obrębie cząsteczki macierzystej odcinek RNA, uwalniany jest z dotychczasowego

kontekstu strukturalno-funkcjonalnego, przez co z cząsteczki pełniącej określoną rolę w

komórce wyzwalany jest fragment o odmiennej strukturze/funkcji. Rearanżacje

strukturalne mogą być daleko idące i obejmować tworzenie oddziaływań między takimi

samymi lub różnymi cząsteczkami RNA, w tym przyjmowanie struktury

kwadrupleksów.

W dalszych badaniach fragmentów RNA planuję zweryfikować przedstawiony

powyżej model oraz zidentyfikować mechanizmy regulujące powstawanie i akumulację

tych cząsteczek. Jednym z wyzwań z tym związanych, a niewymienionych w

poprzednim podrozdziale, będzie ustalenie lokalizacji subkomórkowej fragmentów

RNA. Na obecnym etapie naszych badań, jak również w kontekście aktualnego stanu

wiedzy, nie sposób stwierdzić, jak duża frakcja cząsteczek powstałych podczas

fragmentacji RNA jest funkcjonalna. Do uzyskania odpowiedzi na to pytanie mogłaby

przyczynić się m.in. analiza zachowawczości filogenetycznej poszczególnych

fragmentów. Przeprowadzenie takich badań może wkrótce stać się możliwe dzięki stale

zwiększającej się dostępności danych charakteryzujących fragmenty RNA w różnych

układach badawczych. Jeżeli nawet przyjąć negatywny scenariusz zakładający, że

cząsteczki posiadające ściśle określoną, specyficzną funkcję stanowią jedynie niewielki

procent puli fragmentów RNA, należy uznać, że ze względu na wysoki poziom

akumulacji tych cząsteczek ich obecność nie może być obojętna dla środowiska

wewnątrzkomórkowego. Rodzi to pytanie o mechanizmy, które zapobiegają

przypadkowemu włączaniu fragmentów RNA do szlaków regulacji ekspresji genów i

gwarantują utrzymanie homeostazy komórkowej.

VI. Najważniejsze osiągnięcia

1. Opracowanie kompleksowej strategii identyfikacji fragmentów RNA oraz

określania ich potencjału funkcjonalnego.

2. Scharakteryzowanie fragmentów RNA powstających w układzie modelowym

hodowli komórkowej HCV. Jest to pierwszy opis fragmentów RNA dla tego

układu i jednocześnie jeden z nielicznych dostępnych obecnie w literaturze


23

opisów podejmujących zagadnienie powstawania tych cząsteczek podczas

infekcji wirusowych.

3. Wykazanie, że fragmenty RNA powstają i ulegają akumulacji nie tylko w

warunkach stresowych, ale także w warunkach fizjologicznych (w roślinie

modelowej) oraz pod nieobecność infekcji wirusowej (w ludzkiej linii

komórkowej). Co więcej, fragmenty RNA występują w ilościach podobnych do

miRNA, mogą zatem stanowić ważny element transkryptomu.

4. Wykazanie, że biogeneza fragmentów RNA w roślinie modelowej i ludzkiej linii

komórkowej jest procesem uporządkowanym, podlegającym regulacji w

odpowiedzi na bodźce endogenne (w różnych organach A. thaliana) lub

egzogenne (zakażenie komórek HCV).

5. Identyfikacja ludzkich białek bezpośrednio lub pośrednio oddziałujących z

fragmentami wywodzącymi się z różnych klas RNA (tRNA, snoRNA i snRNA)

i wskazanie nowych potencjalnych obszarów zaangażowania funkcjonalnego

fragmentów RNA: (i) rekombinacji/replikacji DNA w przypadku fragmentu

snoRNA oraz (ii) metabolizmu kwasów karboksylowych w przypadku

fragmentu tRNA.

6. Wykazanie, że fragmenty RNA wchodzą w skład innych kompleksów

rybonukleoproteinowych aniżeli ich cząsteczki macierzyste.

7. Wykazanie, że zarówno w komórkach roślinnych jak i ludzkich powstają

fragmenty RNA zdolne do inhibicji translacji.

8. Wykazanie, że zdolność fragmentów RNA do przyjmowania struktury

kwadrupleksu determinuje ich zdolność do hamowania translacji w układzie

ssaczym.

9. Wykazanie, że uwarunkowania strukturalne inhibicji translacji przez fragmenty

RNA są odmienne w układzie ssaczym i roślinnym.

10. Wykazanie, że topologia kwadrupleksu tworzonego przez modelowe krótkie

RNA wpływa na ich zdolność do hamowania translacji w systemie ssaczym.

VII. Literatura uzupełniająca

[1] Mattick JS, Makunin IV. Non-coding RNA. Hum Mol Genet. 2006;15 Spec No

1:R17-29.

[2] Gagen MJ, Mattick JS. Inherent size constraints on prokaryote gene networks due to

"accelerating" growth. Theory Biosci. 2005;123:381-411.


24

[3] Mattick JS, Gagen MJ. Mathematics/computation. Accelerating networks. Science.

2005;307:856-8.

[4] Dickson AM, Wilusz J. Strategies for viral RNA stability: live long and prosper.

Trends Genet. 2011;27:286-93.

[5] Ariumi Y, Kuroki M, Kushima Y, Osugi K, Hijikata M, Maki M, et al. Hepatitis C

virus hijacks P-body and stress granule components around lipid droplets. J Virol.

2011;85:6882-92.

[6] Liang SL, Quirk D, Zhou A. RNase L: its biological roles and regulation. IUBMB

Life. 2006;58:508-14.

[7] Jones DM, Domingues P, Targett-Adams P, McLauchlan J. Comparison of U2OS

and Huh-7 cells for identifying host factors that affect hepatitis C virus RNA

replication. J Gen Virol. 2010;91:2238-48.

[8] Zhang S, Sun L, Kragler F. The phloem-delivered RNA pool contains small

noncoding RNAs and interferes with translation. Plant Physiol. 2009;150:378-87.

[9] Haussecker D, Huang Y, Lau A, Parameswaran P, Fire AZ, Kay MA. Human

tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA.

2010;16:673-95.

[10] Ivanov P, Emara MM, Villen J, Gygi SP, Anderson P. Angiogenin-induced tRNA

fragments inhibit translation initiation. Mol Cell. 2011;43:613-23.

[11] Hentze MW, Preiss T. The REM phase of gene regulation. Trends Biochem Sci.

2010;35:423-6.

[12] Beckmann BM, Horos R, Fischer B, Castello A, Eichelbaum K, Alleaume AM, et

al. The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs. Nat

Commun. 2015;6:10127.

[13] Castello A, Fischer B, Eichelbaum K, Horos R, Beckmann BM, Strein C, et al.

Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell.

2012;149:1393-406.

[14] Beckmann BM, Castello A, Medenbach J. The expanding universe of

ribonucleoproteins: of novel RNA-binding proteins and unconventional interactions.

Pflugers Arch. 2016;468:1029-40.

[15] Ivanov P, O'Day E, Emara MM, Wagner G, Lieberman J, Anderson P. G-

quadruplex structures contribute to the neuroprotective effects of angiogenin-induced

tRNA fragments. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:18201-6.

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych.

W skład mojego pozostałego dorobku naukowego wchodzi 13 publikacji w

czasopismach z listy JCR oraz 9 prac w czasopismach spoza tej listy, a także jeden

patent krajowy i jeden patent europejski. Szczegółowy wykaz tych prac wraz z opisem

mojego wkładu w ich powstanie został umieszczony w Załączniku nr 4.

Badania prowadzone przeze mnie w ramach tematyki związanej z analizą

fragmentów RNA obejmowały także dodatkowe aspekty, które nie zostały włączone do

przedstawionego powyżej osiągnięcia naukowego. Pierwszym z nich było opracowanie

metody analizy porównawczej frakcji cząsteczek RNA o długości 10-90 nukleotydów.

Prace nad tą metodą rozpoczęły się w Pracowni Biologii Molekularnej Roślin (obecnie


25

Zakład Biologii Molekularnej i Systemowej) zanim jeszcze szeroko dostępne stały się

metody sekwencjonowania nowej generacji. Rezultaty przeprowadzonych badań

opublikowaliśmy w pracy 2D-PAGE AS AN EFFECTIVE METHOD OF RNA DEGRADOME

ANALYSIS, MOLECULAR BIOLOGY REPORTS, 2012. Wykazaliśmy, że dwukierunkowa

elektroforeza w żelach poliakryloamidowych w warunkach częściowo denaturujących

umożliwia szybką i efektywną analizę porównawczą tzw. wysokokopijnych RNA.

Zastosowanie tej metody pozwoliło udowodnić, że wzór akumulacji fragmentów RNA

jest specyficzny dla poszczególnych ludzkich linii komórkowych czy organów

roślinnych oraz że podlega zmianom w odpowiedzi na infekcję bakterii

symbiotycznych. Rozwój metod sekwencjonowania nowej generacji umożliwił dalsze

poszerzenie warsztatu służącego badaniom cząsteczek RNA. Aspekty techniczne oraz

możliwe zastosowania masowego sekwencjonowania transkryptomów opisaliśmy w

pracy TRANSCRIPTOME SEQUENCING: NEXT GENERATION APPROACH TO RNA

FUNCTIONAL ANALYSIS, BIOTECHNOLOGIA, 2011. Kolejny aspekt badań fragmentów

RNA dotyczył zastosowania metod bioinformatycznych do modelowania

nieenzymatycznego rozpadu cząsteczek RNA. Efektem prac prowadzonych we

współpracy z zespołem prof. dr hab. Jacka Błażewicza z Politechniki Poznańskiej było

stworzenie algorytmu umożliwiającego przewidywanie miejsc spontanicznej hydrolizy

cząsteczek RNA – miejsc, które w kontekście struktury pierwszo- i drugorzędowej

RNA oraz jego dynamizmu konformacyjnego są najbardziej wrażliwe na

nieenzymatyczną hydrolizę. Uzyskane wyniki przedstawiliśmy w pracy

COMPUTATIONAL PREDICTION OF NONENZYMATIC RNA DEGRADATION PATTERNS, ACTA

BIOCHIMICA POLONICA, 2016.

Pozostałe prace naukowo-badawcze, w które byłam zaangażowana zarówno

przed, jak i po uzyskaniu stopnia doktora, koncentrowały się wokół dwóch głównych

nurtów, scharakteryzowanych poniżej.

I. Polimorfizm genetyczny jako czynnik warunkujący przebieg infekcji

wirusowych

Podstawową przyczyną niepowodzeń w profilaktyce i terapii zakażeń

wywoływanych przez wirusy RNA jest ogromna zmienność genetyczna tych

patogenów. Dzięki niej w szybkim tempie powstają warianty wirusowe oporne na

działanie układu immunologicznego i stosowane leki. U podłoża tej zmienności leży


26

wysoce wydajne, ale nieprecyzyjne kopiowanie genomu wirusowego przez enzymy

pozbawione aktywności korekcyjnej: odwrotne transkryptazy bądź polimerazy RNA

zależne od RNA. Badania nad tym zagadnieniem rozpoczęłam w ramach realizacji

pracy magisterskiej, której tematyka koncentrowała się wokół uwarunkowań

strukturalnych rekombinacji niehomologicznej ludzkiego wirusa upośledzenia

odporności (ang. human immunodeficiency virus, HIV-1). Ich wyniki

zaprezentowaliśmy w pracy CONSTRUCTION OF A UNIVERSAL SYSTEM FOR IN VITRO

STUDIES OF HIV-1 REVERSE TRANSCRIPTASE-MEDIATED RNA RECOMBINATION, ANNALS

OF THE POLISH CHEMICAL SOCIETY, 2003. Dodatkowo przegląd literatury dotyczącej tej

tematyki przedstawiliśmy w opracowaniu HIV – POCHODZENIE, CYKL REPLIKACYJNY,

LECZENIE, NA POGRANICZU CHEMII I BIOLOGII, 2004. Szczególnym przejawem

zmienności wirusów RNA jest ich występowanie w organizmie pacjenta w formie

zbioru spokrewnionych, lecz zróżnicowanych genetycznie wariantów, tworzących

populację nazwaną quasi-gatunkiem. Moje dalsze badania, prowadzone w ramach

realizacji pracy doktorskiej, koncentrowały się właśnie wokół zagadnienia wpływu

struktury populacji wirusowej na wynik terapii. Były one wykonywane we współpracy

z prof. dr hab. Magdaleną Figlerowicz i prof. dr hab. Arletą Kowalą-Piaskowską z

Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu oraz z zespołem prof. dr hab. Jacka Błażewicza

z Politechniki Poznańskiej. Przed 2010 rokiem leczenie przewlekłego zapalenia

wątroby typu C, wywoływanego przez HCV, polegało na podawaniu interferonu alfa

(lub jego modyfikowanej pochodnej) oraz rybawiryny. Trwałą eliminację wirusa

obserwowano zaledwie u ok. 40% pacjentów zakażonych HCV należącym do

najbardziej rozpowszechnionego w Europie genotypu 1. Nie stwierdzono jednak, by

istniała jednoznaczna korelacja między cechami charakteryzującymi pacjenta a

rezultatem terapii przeciwwirusowej – nie było też wiadomo, dlaczego chorzy

charakteryzujący się podobnymi parametrami reagują w różny sposób na zastosowane

leczenie. Postawiliśmy zatem hipotezę, że to specyficzne cechy wirusa mogą

decydować o wynikach leczenia. Aby sprawdzić jej słuszność, postanowiliśmy określić

strukturę populacji HCV u dzieci przed rozpoczęciem terapii interferonem i rybawiryną

oraz po dwóch tygodniach jej trwania. Powyższa problematyka została opisana w

opracowaniu ZNACZENIE KLINICZNE ZMIAN W POPULACJI HCV W PIERWSZYCH

TYGODNIACH LECZENIA PRZEWLEKŁEGO ZAPALENIA WĄTROBY TYPU C INTERFERONEM I

RYBAWIRYNĄ, PRZEGLĄD EPIDEMIOLOGICZNY, 2005. Pierwszy etap podjętych działań


27

obejmował opracowanie bioinformatycznych metod analizy polimorfizmu

genetycznego quasi-gatunków HCV. Rezultaty przeprowadzonych badań zostały

opublikowane w pracy COMPUTATIONAL METHODS IN DIAGNOSTICS OF CHRONIC

HEPATITIS C, BULLETIN OF THE POLISH ACADEMY OF SCIENCES: TECHNICAL SCIENCES,

2005. Zastosowanie opracowanej metody pozwoliło na przeprowadzenie analiz

populacji HCV u dzieci. Wyniki badań zostały przedstawione w trzech pracach: (i)

ANALIZA ZMIENNOŚCI WIRUSOWEGO BIAŁKA NS5A U DZIECI Z PRZEWLEKŁYM

ZAPALENIEM WĄTROBY TYPU C – POSZUKIWANIE KORELACJI POMIĘDZY POLIMORFIZMEM

GENETYCZNYM WIRUSA A ODPOWIEDZIĄ NA LECZENIE. BADANIA WSTĘPNE, PEDIATRIA

POLSKA, 2008; (ii) HEPATITIS C VIRUS QUASISPECIES IN CHRONICALLY INFECTED

CHILDREN SUBJECTED TO INTERFERON-RIBAVIRIN THERAPY, ARCHIVES OF VIROLOGY,

2010 oraz (iii) EVOLUTION OF HEPATITIS C VIRUS HYPERVARIABLE REGION 1 IN

CHRONICALLY INFECTED CHILDREN, VIRUS RESEARCH, 2012. Zaprezentowane wyniki

były pierwszym opisem struktury quasi-gatunków HCV-1a u ponad 20 dzieci

poddanych terapii skojarzonej interferonem i rybawiryną, bądź pegylowanym

interferonem i rybawiryną. Analizując strukturę populacji przed leczeniem,

stwierdziliśmy istnienie dwóch typów quasi-gatunku HCV. Pierwszy z nich

charakteryzował się występowaniem wyraźnego dominanta, otoczonego ograniczoną

liczbą wariantów towarzyszących. Poziom zróżnicowania takiej populacji był niewielki,

a warianty łączyły ścisłe relacje filogenetyczne. Ten typ quasi-gatunku zdecydowanie

przeważał u pacjentów, którzy nie odpowiedzieli na leczenie. Drugi typ populacji HCV

charakteryzował się obecnością większej liczby zróżnicowanych wariantów o

odleglejszych związkach filogenetycznych. Występował on głównie u dzieci z

pozytywną odpowiedzią na terapię. Otrzymane wyniki wskazywały, że istnieje związek

między strukturą quasi-gatunku HCV u dzieci a rezultatem terapii. Ponadto

stwierdziliśmy, że bardzo podobne lub identyczne (na poziomie sekwencji

aminokwasowych, lecz nie nukleotydowych) warianty tzw. rejonu HVR1 glikoproteiny

wirusowej mogą występować w kilku niezależnych epidemiologicznie quasi-gatunkach

HCV, obecnych u pacjentów, którzy nie odpowiedzieli na leczenie. Świadczyło to, że

istnieją zachowawcze warianty HVR1 zapewniające wysoki poziom przystosowania,

które nie ulegają zmianom w czasie i umożliwiają przetrwanie wirusa u różnych

gospodarzy. Dodatkowym aspektem badań realizowanych w ramach powyższego nurtu

było zastosowanie metod obliczeniowych do przewidywania wyników leczenia oraz do


28

modelowania przebiegu infekcji HCV (TOWARDS PREDICTION OF HCV THERAPY

EFFICIENCY, COMPUTATIONAL AND MATHEMATICAL METHODS IN MEDICINE, 2010 oraz

MULTI-AGENT MODEL OF HEPATITIS C VIRUS INFECTION, ARTIFICIAL INTELLIGENCE IN

MEDICINE, 2014). Prowadzone przez nas prace zaowocowały także powstaniem trzech

publikacji przeglądowych, napisanych na zaproszenie wydawców: (i) HUMAN- AND

VIRUS-ENCODED MICRORNAS AS POTENTIAL TARGETS OF ANTIVIRAL THERAPY, MINI-

REVIEWS IN MEDICINAL CHEMISTRY, 2009; (ii) MECHANISMS INVOLVED IN THE

DEVELOPMENT OF CHRONIC HEPATITIS C AS POTENTIAL TARGETS OF ANTIVIRAL THERAPY,

CURRENT PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY, 2011 oraz (iii) PHYLOGENY AND

MOLECULAR EVOLUTION OF THE HEPATITIS C VIRUS, INFECTION, GENETICS AND

EVOLUTION, 2014.

Przełom w terapii przewlekłego zapalenia wątroby typu C przyniosło

opracowanie leków o bezpośrednim działaniu przeciwwirusowym, które stały się

dostępne w 2010 roku (początkowo jedynie w Stanach Zjednoczonych). Ich stosowanie

prowadziło do całkowitego wyeliminowania HCV u ponad 80% pacjentów. Krótko

przedtem opisano także obecność w ludzkim genomie polimorfizmu pojedynczego

nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism, SNP) w pobliżu genu IL28B, i

zidentyfikowano warianty polimorficzne, które są skorelowane z lepszą odpowiedzią na

leczenie interferonem i rybawiryną. W kontekście tych doniesień, postanowiliśmy

przeanalizować polimorfizm ludzkich genów kodujących białka zaangażowane w

oddziaływania z białkami lub RNA HCV. Naszą uwagę skupiliśmy na polimorfizmie

obejmującym zmiany liczby kopii odcinków genomu o długości powyżej tysiąca par

zasad (ang. copy number variation, CNV). W wyniku przeprowadzonych analiz 106

prób DNA od osób reprezentujących populację europejską, azjatycką i afrykańską

zidentyfikowaliśmy 4 geny (IGLL1, MLLT4, PDPK1, PPP1R13L), dla których

polimorfizm liczby kopii wynosił od 1 do 6. Są one obiecującymi kandydatami do

dalszych szerzej zakrojonych badań wpływu polimorfizmu genetycznego gospodarza na

przebieg zapalenia wątroby typu C. Wyniki tych badań zostały opisane w pracy COPY

NUMBER VARIATION OF GENES INVOLVED IN THE HEPATITIS C VIRUS-HUMAN

INTERACTOME, SCIENTIFIC REPORTS, 2016.

Wśród wirusów RNA występują także patogeny roślin mających duże znaczenie

gospodarcze. Należy do nich m.in. wirus mozaiki pepino (ang. pepino mosaic virus,

PepMV), jeden z najgroźniejszych wirusów infekujących pomidora. W ramach


29

współpracy z zespołem prof. dr hab. Henryka Pospiesznego z Instytutu Ochrony Roślin

– Państwowego Instytutu Badawczego uczestniczyłam w badaniach mających na celu

ocenę wybranych polskich izolatów PepMV. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy

opracowane w naszym zespole metody analizy populacji wirusowych. Najważniejszymi

efektami tych prac było wykazanie, że PepMV (izolat CH2) występuje jako quasi-

gatunek a także zidentyfikowanie pojedynczej mutacji powodującej zmianę łagodnego

patotypu PepMV w patotyp nekrotyczny. Uzyskane wyniki opisaliśmy w trzech

publikacjach: (i) PEPINO MOSAIC VIRUS – A PATHOGEN OF TOMATO CROPS IN POLAND:

BIOLOGY, EVOLUTION AND DIAGNOSTICS, JOURNAL OF PLANT PROTECTION RESEARCH,

2010; (ii) QUASISPECIES NATURE OF PEPINO MOSAIC VIRUS AND ITS EVOLUTIONARY

DYNAMICS, VIRUS GENES, 2010 oraz (iii) SINGLE MUTATION CONVERTS MILD PATHOTYPE

OF THE PEPINO MOSAIC VIRUS INTO NECROTIC ONE, VIRUS RESEARCH, 2011.

II. Mechanizmy molekularne leżące u podłoża aktywności ludzkiej deaminazy

cytydyny indukowanej aktywacją limfocytów B (ang. activation-induced cytidine

deaminase, AID)

Deaminaza cytydyny indukowana aktywacją limfocytów B (ang. activation-

induced cytidine deaminase, AID) warunkuje różnicowanie przeciwciał, deaminując

deoksycytydynę (C) w genach immunoglobulin. Enzym ten znalazł się w obszarze

moich zainteresowań badawczych, ponieważ zaburzenia ekspresji genu AID wywołane

infekcją HCV były wskazywane jako jeden z patomechanizmów przewlekłego

zapalenia wątroby typu C. Co ciekawe, biorąc pod uwagę zdolność AID do deaminacji

5-metylodeoksycytydyny (5mC), sugerowano też udział tego enzymu w aktywnej

demetylacji DNA. Informacje na ten temat zebraliśmy w pracy przeglądowej

ACTIVATION-INDUCED CYTIDINE DEAMINASE (AID): SINGLE ACTIVITY – PLEIOTROPIC

EFFECT, BIOTECHNOLOGIA, 2013. W momencie gdy rozpoczynaliśmy realizację tego

nurtu badawczego, w literaturze istniało wiele niespójnych doniesień na temat

funkcjonowania AID, co było powodem powstania licznych kontrowersji dotyczących

fizjologicznej roli tego enzymu. W szczególności, uwarunkowania strukturalne

aktywności AID wobec różnych substratów nie zostały w pełni poznane. Ich określenie

stało się zatem celem naszych badań.

Pierwszym problemem, który należało rozwiązać, było opracowanie metody

otrzymywania aktywnej ludzkiej AID (hAID), ponieważ enzym ten nie był dostępny


30

handlowo. Wybraliśmy do tego celu układ bakteryjny jako najbardziej wydajny z

dostępnych systemów ekspresyjnych. Podejmowane wcześniej przez inne zespoły

badaczy próby otrzymywania AID w układzie prokariotycznym kończyły się

niepowodzeniem, gdyż uzyskane białko nie posiadało aktywności enzymatycznej, bądź

preparaty były zanieczyszczone bakteryjną deaminazą cytydyny. Opracowana przez nas

metoda okazała się bardzo efektywna i pozwoliła na otrzymanie aktywnej hAID, która z

powodzeniem mogła zostać wykorzystana do dalszych badań biochemicznych. Prace te

zaowocowały przyznaniem patentu krajowego nr 225333 (2017) oraz europejskiego

EP2870241 (2018) (publikacja PRODUCTION OF AN ACTIVE HUMAN AID ENZYME IN A

BACTERIAL SYSTEM, BIOTECHNOLOGIA, 2016). Przeprowadzenie procedury patentowej

było możliwe m.in. dzięki pozyskaniu przez nas finansowania w ramach poddziałania

1.3.2 Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka na lata 2007-2013. Preparat

hAID uzyskany przy zastosowaniu zaproponowanej przez nas procedury został

wdrożony do sprzedaży, stając się pierwszym dostępnym komercyjnie w skali

światowej. Osiągnięcie to zostało wyróżnione w 2015 nominacją do Nagrody Marszałka

Województwa Wielkopolskiego „i-Wielkopolska - Innowacyjni dla Wielkopolski” dla

Genesius Sp. z o. o. wraz z ICHB PAN.

Dalsze działania realizowane w ramach tego nurtu badawczego skupiły się na

określeniu wpływu wybranych mutacji w hAID na jej zdolność do deaminacji C, 5mC i

5-hydroksymetylodeoksycytydyny (5hmC) w obrębie jednoniciowego DNA (ssDNA) in

vitro. Otrzymaliśmy hAID typu dzikiego (wt hAID) oraz trzy zmutowane formy tego

enzymu (R50A, N51A i R190X). Zbadaliśmy ich aktywność wobec substratów

zawierających pojedynczy docelowy motyw sekwencyjny (AGCT, AG5mCT lub

AG5hmCT). Następnie przetestowaliśmy aktywność wt hAID oraz N51A wobec

ssDNA zawierających wszystkie możliwe motywy NNCN. Wykorzystując

modelowanie homologiczne i symulacje dynamiki molekularnej, scharakteryzowaliśmy

oddziaływanie wt hAID oraz N51A z metylowanym i niemetylowanym substratem.

Wykazaliśmy, że żaden z testowanych wariantów hAID nie deaminował 5hmC.

Ponadto stwierdziliśmy, że aktywność deaminazowa wariantów hAID wobec C nie

korelowała z ich aktywnością wobec 5mC. Szczególnie interesujący był przypadek

mutanta N51A, który był pozbawiony aktywności wobec C i jednocześnie zdolny do

deaminacji 5mC. Zidentyfikowaliśmy następujące trzy kluczowe elementy warunkujące

deaminację C lub 5mC: (i) sieć oddziaływań między kieszenią katalityczną enzymu a

Autoreferat - IBBAutoreferat dr Paulina Jackowiak ... uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej....

Documents

Transcript of Autoreferat - IBBAutoreferat dr Paulina Jackowiak ... uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej....