Aspek Laboratorium Extended-Spectrum Beta-LactamaseDanny Luhulima / IGAA Putri Sri Rejeki Bagian Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

Pada awal tahun 1980 cephalosporin generasi ketiga banyak digunakan untuk melawan bakteri yang menghasilkan -lactamase karena bakteri jenis ini sudah banyak yang resisten terhadap antibiotik1. -lactamase adalah enzim yang dihasilkan oleh beberapa bakteri yang fungsinya untuk melawan antibiotik golongan lactam (misalnya penicillin). lactam adalah antibiotik yang berasal dari penicillin dan cephalosporin 2. Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) adalah enzim yang mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis antibiotika golongan penicillin, cephalosporin generasi satu, dua, dan tiga, serta golongan aztreonam (namun bukan cephamycin dan carbapenem)1. ESBL paling banyak dihasilkan oleh Enterobacteriaceae, terutama Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae3. Sejak ditemukan pada tahun 1983 (di Jerman) hingga sekarang, angka kejadian infeksi oleh bakteri penghasil ESBL semakin meningkat di seluruh dunia. ESBL sering dijumpai di berbagai rumah sakit di dunia dan sulit diatasi, bahkan di negara dengan penanganan bagus sekalipun. Di Singapura prevalensi ESBL dapat mencapai 40 %, sedangkan di RSAI Harapan Kita adalah 16% 4. Penggunaan atau paparan sebelumnya dengan generasi ketiga cephalosporin dituding sebagai salah satu penyebab terjadinya ESBL. Selain itu juga ada faktor risiko lain misalnya lama menginap di ICU, prosedur invasif, dan keparahan penyakit4. Ada banyak tipe dari lactamase, tapi ada dua tipe yang sulit ditangani yaitu ESBL dan AmpC. Keduanya menghidrolisis cephalosporin generasi ketiga. Berbeda dengan ESBL, AmpC lactamase bisa mengnonaktifkan cephamycin dan tidak dihambat oleh inhibitor b-lactamase seperti clavulanic acid. Belum tuntas penanganan masalah ESBL di rumah sakit, kini dunia medis juga tengah dihadang oleh ESBL yang muncul di komunitas. Di komunitas begitu banyak dijumpai organisme penyebab diare, terutama Salmonella dan E.coli yang ternyata juga menyebabkan1

ESBL ataupun plasmid-mediated AmpC beta lactamase. Temuan ESBL komunitas ini bisa memberi implikasi klinis yang kurang baik terhadap pasien4,5. Pada tinjauan pustaka ini yang dimaksud ESBL adalah grup 2be dan 2d berdasarkan kriteria -Lactamase Bush-Jacoby-Medeiros1,6.

Beta-lactamase (-lactamase)Sebelum kita membahas ESBL, kita harus mengerti tentang -lactamase, baik definisi maupun pembagiannya, sehingga kita dapat memahami ESBL secara tepat. -lactamase adalah enzim yang dihasilkan oleh beberapa bakteri yang berfungsi untuk melawan / mempertahankan diri terhadap serangan antibiotik -lactam seperti penicillin, cephamycin dan carbapenem (entapenem), dan cephalosprorin. Antibiotik golongan ini memiliki unsur yang sama dalam struktur molekul mereka yaitu 4 cincin atom dan disebut sebagai -lactam. Enzim -Lactamase bekerja merusak cincin ini dan nonaktifkan molekul ini7. -lactamase pertama kali ditemukan pada tahun 1940 oleh Abraham dan Chain8. Enzi m ini berhasil ditemukan dari isolat S. aureus dan disebut sebagai penicillinase9. Sejak saat itu semakin banyak pelaporan penemuan -lactamase yang baru, antara lain : 1963 ditemukan TEM-1 (dari isolat E. coli), 1974 ditemukan SHV-1 (dari isolat E. coli)9. Antibiotik beta-lactam dapat digunakan untuk melawan bakteri Gram positif dan Gram negatif. -Lactamase diproduksi oleh bakteri Gram negatif. Ternyata enzim -lactamase terdiri dari berbagai golongan sehingga sulit untuk mengidentifikasinya. Untuk itu para ahli berusaha untuk mengklasifikasikan enzim ini.

Klasifikasi -lactamaseSaat ini sudah ditemukan lebih dari 700 jenis -Lactamase sehingga perlu dibuat suatu klasifikasi agar mempermudah identifikasi enzim ini8. Ada banyak cara yang digunakan untuk mengklasifikasi -Lactamase, namun yang sering digunakan adalah klasifikasi menurut Ambler molecular dan Bush-Jakoby-Medieros functional classification. Ambler membagi -Lactamase ke dalam empat kelompok utama (A sampai D). Dasar pembagian ini terletak pada homologi protein (kesamaan dalam asam amino), bukan karakteristik phenotype. Serine -Lactamase adalah dasar klasifikasi -Lactamase kelas A, C, dan D, sebaliknya enzim kelas B adalah2

Metallo--Lactamase.

Klasifikasi

Bush-Jacoby-Medeiros

membagi

grup

-Lactamase

berdasarkan kesamaan fungsi (substrat dan profil inhibitor). Ada empat grup utama dan beberapa subgrup dalam sistem ini. Klasifikasi ini lebih relevan untuk praktisi medis atau mikrobiologi di laboratorium karena berdasarkan -Lactamase inhibitor dan -Lactamase substrate1,7,8,9,10.

Klasifikasi menurut Bush-Jacoby-MedeirosKlasifikasi ini membagi -Lactamase menjadi 4 kelas dan beberapa subkelas1,7,8,9,10 :

Grup 1 Cephalosporinase, (Molecular class C) (tidak dihambat oleh clavulanic acid)Grup 1 merupakan grup cephalosporinases dan tidak dihambat oleh clavulanic acid , grup golongan ini identik dengan pembagian molecular class C.

Grup 2Yang termasuk dalam grup 2 adalah penicillinases, cephalosporinases, atau keduanya yang dihambat oleh clavulanic acid. Grup ini sesuai dengan pembagian molecular class A dan D yang mencerminkan gen TEM dan SHV. Namun, karena meningkatnya jumlah TEM- dan SHVderived -lactamase, maka grup 2 dibagi lagi menjadi 2 subgrup yaitu 2a dan 2b.

Grup 2a Penicilinase (molecular class A)Subgrup 2a hanya untuk golongan penicillinase.

Grup 2b Broad-spectrum (molecular class A)Tidak seperti grup 2a, grup 2b merupakan board spectrum lactamases, artinya lactamase golongan ini mampu menonaktifkan penicillin dan cephalosporin. Grup 2b dibagi lagi menjadi tingkat grup baru yaitu 2be dan 2br :

3

Grup 2be Extended-spectrum (molecular class A)Grup 2be, dengan huruf e untuk extended spectrum artinya memiliki spektrum yang lebih luas sehingga sering disebut sebagai ESBL, karena mampu menonaktifkan cephalosporin generasi ketiga ( ceftazidime, cefotaxime, dan cefpodoxime) serta serta monobactam (aztreonam).

Grup 2br Inhibitor-resistant (molecular class A) (diminished inhibition by clavulanic acid)Enzim 2br, huruf r menunjukkan penurunan pengikatan terhadap clavulanic acid dan sulbactam, dan disebut sebagai inhibitor-resistant TEM-derivative enzymes, namun golongan ini umumnya masih sensitif terhadap tazobactam.

Grup 2c Carbenicillinase (molecular class A)Grup 2c selanjutnya dipisahkan dari kelompok 2 karena enzim pada grup ini ternyata menonaktifkan carbenicillin lebih baik dari benzylpenicillin, dan juga ditemukan beberapa efek pada cloxacillin.

Grup 2d Cloxacilanase (molecular class D atau A)Enzim grup 2d dapat menonaktifkan cloxacillin lebih baik dibandingkan benzilpenisilin, dengan beberapa aktivitas yang dapat melawan carbenicillin. Clavulanic acid kurang mampu menginhibisi enzim ini. Beberapa dari enzim golongan ini juga termasuk dalam ESBL. Enzim golongan ini juga dikenal dengan nama Oxacillinase. Enzim ini juga mampu menonaktifkan oxazolylpenicillin seperti oxacilli, dicloxacillin, cloxacillin.

4

Grup 2e Cephalosporinase (molecular class A)Grup 2e adalah Enzim golongan cephalosporinase. Enzim golongan ini juga dapat menghidrolisis monobactam. Golongan ini dihambat oleh clavulanic acid.

Grup 2f Carbapenamase (molecular class A)Grup ini ditambahkan karena carbapenemase. Hal ini merupakan golongan serine berdasarkan serine-based untuk membedakan dengan Zinc-based dilakukan

carbapenamase yang ada dalam grup 3.

Grup 3 Metalloenzyme (molecular class B) (tidak dihambat oleh clavulanic acid)Grup 3 merupakan enzim yang berbasis zinc atau Metallo -lactamase. Golongan ini merupakan enzim yang hanya bereaksi karena adanya ion metal zinc. Metallo -lactamase mampu menghidrolisis penicillin, cephalosporin, dan carbapenem. Dengan demikian, carbapenem dapat dihambat oleh 2 kelompok, yaitu grup 2f (serine-based) dan grup 3 (zinc-based).

Grup 4 Penisilinase, No class molecular (tidak dihambat oleh clavulanic acid)Grup 4 adalah penicillinase yang tidak dihambat oleh clavulanic acid. Grup ini belum ada dalam pembagian grup menurut Ambler molecular.

5

Tabel 1

Klasifikasi The bush-Jacoby-Medeiros

(Indian journal of microbiology)

Extended-spectrum beta lactamase (ESBL)Pada tinjauan pustaka ini yang dimaksud ESBL adalah grup 2be dan 2d berdasarkan kriteria -Lactamase Bush-Jacoby-Medeiros1,7. Banyak ESBL termasuk dalam grup 2d dan 2be. Masuknya grup -lactamase miliki 2be sebagai ESBL karena enzim ini yang berasal dari grup 2b -Lactamase (misalnya,TEM-1, TEM-2, dan SHV-1). Huruf e dari 2be menandakan bahwa spektrum yang luas. Grup 2d juga banyak menghasilkan ESBL karena sebagian besar grup ini memiliki sifat yang mirip dengan grup 2be1,7. Sampai saat ini belum ada konsensus terhadap definisi ESBL. Definisi yang sering digunakan adalah : enzim yang

mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis antibiotika golongan penicillin, cephalosporin generasi satu, dua, dan tiga, serta golongan aztreonam (namun bukan cephamycin dan carbapenem)1. ESBL paling banyak dihasilkan oleh Enterobacteriaceae (terutama Escherichia coli) dan Klebsiella pneumoniae3,11. Gen pengkode ESBL pada bakteri paling banyak berada di plasmid. Dalam suatu review article yang diterbitkan oleh Indian Journal microciology : ESBL merupakan plasmid mediated dan termasuk dalam golongan TEM dan SVH. Canadian External Quality Assesment Advisory6

Group for Antibiotic menyatakan bahwa gen yang mengontrol produksi -lactamase terletak di dalam plasmid atau kromosom12,13. Hal ini mempermudah kemampuan gen ESBL pindah dari satu organisme ke organisme yang lain, sehingga penyebaran resistensi sangat mudah terjadi antar strain bahkan antar spesies1. Plasmid juga bertanggung jawab atas gen pengkode yang membawa gen resistensi untuk golongan obat yang lain (misalnya, aminoglycoside). Keadaan ini membuat pilihan antibiotik untuk melawan organisme yang memproduksi ESBL sangat terbatas1,5,6. Umumnya ESBL berasal dari gen TEM-1, TEM-2, atau SHV-1 yang mengalami mutasi dan mengubah konfigurasi asam amino di sekitar lokasi aktif dari -lactamase. Keadaan ini membuat spektrum antibiotik -lactam rentan terhadap hidrolisis oleh enzim ini. Banyak penelitian yang meneliti tentang faktor resiko ESBL, dan mereka sepakat bahwa faktor resiko ESBL disebabkan keadaan sebagai berikut14 :1. 2. 3. 4.

Keparahan penyakit, Lama rawat inap di rumah sakit, Peralatan medis yang invasif (kateter urine, endotracheal tubes, central venous lines), Antibiotik.

Saat ini angka kejadian infeksi oleh bakteri penghasil ESBL semakin meningkat di seluruh dunia. Karena banyaknya bakteri yang mampu menghasilkan ESBL, maka diperlukan suatu klasifikasi agar kita dengan mudah mengidentifikasikan jenis ESBL apa yang menginfeksi seseorang.

Klasifikasi Extended-spectrum beta lactamase (ESBL)Anggota famili Enterobacteriaceae sering mengekspresikan plasmid-encoded -lactamase (misalnya, TEM-1, TEM-2, dan SHV-1) yang resisten terhadap pencillin namun tidak terhadap cephalosporin. Namun akhir akhir ini sudah banyak ditemukan bakteri penghasil -lactamase yang resisten terhadap golongan antibiotik cephalosporin1,3,5,6,11,12. Jenis ESBL yang sering ditemukan adalah sebagai berikut1,8,9 : SHV -lactamases (class A),

7

-

TEM -lactamases (class A), CTX-M -lactamases (class A), OXA -lactamases (class D), PER-type ESBL, Other ESBL.

1. SHV lactamases (class A)ESBL SHV adalah tipe yang sering ditemukan di isolat klinis dibandingkan jenis lainnya. SHV mengacu pada variabel sulfhydril (sulfhydril variable) dan termasuk dalam grup 2be. Ada lebih dari 100 jenis variasi dari tipe SHV8. SHV-1 dan TEM-1 memiliki struktur yang mirip, 68 % asam amino yang ada di SHV-1 juga terdapat di TEM-1. SHV-1 sering ditemukan dalam K. pneumoniae. Sekitar 20% plasmidmediated ampicillin resistance disebabkan oleh organisme ini7,9. Pada tahun 1983, di Jerman, suatu -lactamase berhasil diidentifikasi dari isolat Klebsiella ozaenae. Enzim ini mampu menghidrolisis cefotaxime dan ceftazidime. Ternyata jenis -lactamase ini berbeda dengan SHV-1. Posisi glycine diganti oleh serine pada posisi 238. Mutasi ini menunjukkan extended-spectrum -lactamase. Enzim ini diklasifikasikan sebagai SVH-2. Saat ini telah ditemukan ESBL golongan SHV pada Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa dan Acinetobacter spp1.

2. TEM lactamase (class A)ESBL golongan ini merupakan turunan dari TEM-1 dan TEM-21. Klasifikasi TEM berdasarkan perbedaan perubahan kombinasi asam amino7. TEM-1 pertama kali dilaporkan pada tahun 1965. TEM-1 dihasilkan oleh bakteri Gram negatif dan umumnya resisten terhadap ampicillin1,9. TEM-1 ini berasal dari isolat E. coli di Athena, Yunani dan disebut Temoneira sehingga sejak itu digunakan istilah TEM. TEM-1 memiliki daya hidrolisis yang sangat kuat terhadap ampicillin, namun lemah terhadap carbenicilin, oxasilin, cephalotin, atau

cephalosporin. Kemampuan hidrolisis enzim ini dihambat oleh clavulanic acid. TEM-1 sering

8

dijumpai pada bakteri Gram negatif seperti E coli, H influenza, N gonorrhoeae dan K pneumonia1. TEM-2 memiliki profil hidrolitik yang sama seperti TEM-1. Letak perbedaan kedua TEM ini yaitu pada TEM-1 memiliki kemampuan alamiah yang lebih aktif dan berbeda dalam titik isoelektrik (pH TEM-1 = 5,6, TEM-2 = 5,4). TEM-13 juga memiliki profil hidrolitik mirip dengan TEM-1 dan TEM-2. TEM-1, TEM-2, dan TEM-13 bukan merupakan ESBL1. Pada tahun 1987, sebuah isolat Klebsiella pneumoniae terdeteksi di Perancis, bakteri ini memiliki kesamaan seperti yang ditemukan tahun 1984 yaitu mengandung plasmid-mediated laktamase yang dibentuk oleh CTX-1. Awalnya enzim ini diberi nama CTX-1 karena terjadi peningkatan aktivitas melawan cefotaxime, namun kini disebut sebagai TEM-3. Berbeda

dengan TEM-2, pada TEM-3 ditemukan dua substitusi asam amino. Ternyata TEM-3 bukanlah bentuk ESBL pertama di Klebsiella karena pada tahun 1982, di Liverpool, Inggris telah ditemukan Klebsiella oxytoca yang mengandung plasmid dan membawa gene encoding ceftazidime resistance. Enzim lactamase ini disebut sebagai TEM-12. Menariknya, ada pelaporan tentang Klebsiella oxytoca yang diisolasi dari unit neonatal, ternyata dapat memproduksi TEM-11. Saat ini telah dilaporkan lebih dari 100 TEM-type -Lactamase dengan titik isoelektrik berkisar 5,2 6,5. Sebagian besar dari enzim ini adalah ESBL1. ESBL TEM juga telah ditemukan pada Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Morganella morganii dan Salmonella species, P.aeruginosa1,9. Khusus P.aeruginosa, organisme ini memproduksi TEM-429.

3. CTX-M -lactamases (class A)Enzim ini diberi nama karena tingginya kemampuan aktivitas hidrofilik melawan cefotaxime dibandingkan terhadap substrat oxyimino-beta-lactam lainnya, seperti ceftazidime, ceftriaxone atau cefepime. Mutasi enzim ini memiliki hubungan erat dengan gen plasmid -lactamase yang ditemukan pada spesies Kluyvera (grup organisme komensal), misalnya kromosom yang mengkode -lactamases Kluyvera georgiana juga mengkode ESBL KLUG-1, ternyata jenis ESBL ini memiliki 99% kesamaan asam amino dengan CTX-M-81,7. Organisme penghasil CTX-M-type -lactamases biasanya memiliki resisten MIC (minimum inhibitory

concentration) cefotaxime > 64 ug/ml, sedangkan MIC ceftazidime 2-8 ug/ml, namun CTX-M9

yang membentuk ESBL dapat menghidrolisis ceftazidime dan resisten terhadap cephalosporin (MIC 256 ug/ml)1. Enzim ini banyak ditemukan di Salmonella enterica serovar typhimurium dan E. coli, juga dapat ditemukan di spesies lain golongan Enterobacteriaceae. Tipe ini banyak ditemukan di Amerika selatan7. CTX-M-type -lactamases memiliki kesamaan dengan ESBL TEM dan SVH, namun kesamaan ini biasanya < 40 %. Saat ini ESBL jenis ini memiliki banyak tipe dan sudah terditeksi hampir di seluruh belahan dunia. CTX-M tipe 9,43,253,254,263,313,324 ditemukan di selatan Amerika dan Eropa. Jepang menemukan enzim yang strukturnya mirip dengan CTX-M-type -lactamases dan disebut Toho-1 dan Toho-2. Istilah Toho diambil dari nama fakultas kedokteran universitas Toho, Tokyo, Jepang. Mereka berhasil menemukan -lactamase producing E. coli yang ditemukan dari seorang anak yang dirawat di RS Amori, Jepang. Enzim ini kemudian disebut sebagai Toho-1. Toho-1 dan Toho-2 juga menghidrolisis cefotaxime dan ceftazidime1.

4. OXA lactamases (class D)Diberi nama OXA lactamases karena golongan ini mampu menghidrolisis antibiotik golongan oxacillin. Enzim lactamases ini termasuk grup 2d dan class D karena struktur molekul dan fungsinya berbeda jika dibandingkan dengan golongan TEM dan SHV. OXA-1 adalah jenis yang sering ditemukan. OXA sering ditemukan Pseudomonas aeruginosa, namun telah dilaporkan bahwa ESBL golongan ini juga terdeteksi di bakteri Gram negatif lainnya1,7. Saat ini telah dilaporkan bahwa sekitar 10 % dari E. coli dapat menghasilkan ESBL

golongan ini. ESBL OXA awalnya ditemukan dari isolat Pseudomonas aeruginosa sakit di Ankara, Turki. Di Perancis, di suatu rumah

juga dilaporkan telah menemukan OXA dari isolat

Pseudomonas aeruginosa yang merupakan turunan dari OXA-10 dan disebut sebagai OXA-28. Sayangnya data epidemiologi ESBL golongan ini masih sedikit sehingga belum diketahui dengan pasti data penyebaran ESBL golongan ini. Kebanyakan OXA lactamases tidak menghidrolisis antibiotik golongan cephalosporin, sehingga sering tidak dianggap sebagai ESBL, namun kini telah dilaporkan bahwa Oxa-1010

ternyata mampu menghidrolisis cefotaxime, ceftriaxone, dan aztreonam, walaupun kemampuan hidrolisisnya lemah1. OXA lainnya seperti : Oxa-11, -14, -16, -17, -19, -15, -18, -28, -31, -32, -35, dan -45 juga dilaporkan sebagai jenis yang dapat menghidrolisis antibiotik cefotaxime, namun kemampuan hidrolisis terhadap ceftazidime dan aztreonam masih lemah1.

5. PER-type ESBLPER-type ESBL adalah ESBL yang memiliki kesamaan dengan TEM dan SHV sebanyak 25 27 %. PER-1 -Lactamase mampu menghidrolisis penicillin dan cephalosporin, namun sensitif terhadap inhibisi clavulanic acid. PER-1 pertama kali terditeksi dari isolat Pseudomonas aeruginosa, namun kini telah ditemukan di isolat Salmonella enterica serovar Typhimurium dan Acinetobacter. Di Turki, sebanyak 46 % PER-1 ditemukan dari isolat Acinobacter spp dan 11 % ditemukan dari isolat Pseudomonas aeruginosa. Saat ini PER-1 baru dilaporkan di Turki,

Prancis, Itali, Belgia dan Korea (khusus Korea, PER-1 berasal dari isolat Acinetobacter). PER-2 memiliki 86 % kesamaan dengan PER-1 dan ditemukan di S. enteric serovar Typhimurium,

E. coli, Klebsiella pneumonia, Proteus mirabilis dan Vibrio cholera. PER-2 hanya ditemukan di Amerika bagian selatan1.

6. Tipe Tambahan ESBLBaru - baru ini ditemukan variasi dari lactamases yang lain yaitu plasmid-mediated atau integron-associated class A enzyme. Para ahli mengalami kesulitan dalam menggolongkan ESBL tipe ini karena mutasinya sulit dikenali, dan ditemukan di berbagai tempat yang berbeda geografisnya. Yang termasuk ESBL tipe ini antara lain VEB-1, BES-1. VEB-1 memiliki

kesamaan dengan PER-1 dan PER-2 sebesar 38 %. Hal ini mengakibatkan resistensi yang tinggi terhadap ceftazidime, cefotaxime, dan aztreonam. Gen pengkode VEB-1 telah ditemukan dan merupakan plasmid-mediated; gen ini memiliki resistensi terhadap antibiotik yang bukan berasal dari golongan -lactam. ESBL tipe ini telah ditemukan di Prancis, Thailand, Kuwait dan Cina. GES (76, 118, 320, 327, 410, 413, 416, 418), BES (45), TLA (8, 369), SFO (240), dan IBC (133, 138, 191, 208, 241, 410-412) adalah11

contoh lain dari ESBL non-TEM, non-SHV dan telah ditemukan di banyak Negara. BES-1, IBC-1 SFO-1 dan TLA-1 dapat ditemukan dari isolat Enterobacteriaceae1,9.

AmpC-type beta-lactamase (class C)AmpC- type -lactamase umumnya diisolasi dari bakteri Gram negatif yang Extendedspectrum cephalosporin-resistant. AmpC -lactamase (disebut juga sebagai Class C atau grup 1) biasanya dikodekan oleh kromosom bakteri Gram negatif seperti : Citrobacter, Serratia, dan Enterobacter. AmpC type -lactamase juga ditemukan di plasmid. Berbeda dengan ESBL, AmpC -lactamase dapat menghidrolisis cephalosporin, tetapi tidak dihambat oleh -lactamase inhibitor seperti clavulanic acid7,13. AmpC dan ESBL dapat ditemukan dalam mikroorganisme yang sama, namun mekanisme ketahanan terhadap antibiotiknya berbeda, sehingga pencegahan dan pengendalian infeksi terhadap keduanya harus spesifik2.

Struktur dan mekanisme kerja -LactamaseSemua ESBL memiliki serine yang terletak di active sites kecuali sebagian kecil class B grup Metallo -lactamase. Kelompok ini memiliki banyak kesamaan asam amino dengan penicillin binding proteins (PBPs)11. -lactamase akan menyerang ikatan amida di cincin -lactam penicillin, dan

cephalosporin serta menghasilkan penicillinoic acid dan cephalosporic acid sehingga senyawa anti bakteri menjadi tidak aktif11. Plasmid yang memiliki ukuran 80 Kb dan bertanggung jawab terhadap pembawa gen ESBL. Pada organisme penghasil ESBL juga sering resisten terhadap antibiotik golongan aminoglycoside, trimethoprim. ESBL jarang terjadi di Proteus mirabilis, diduga penyebabnya karena spesies ini memiliki kandungan plasmid yang rendah11. Hal ini memperkuat teori bahwa transmisi ESBL antara satu organisme ke organisme yang lain biasanya terjadi di plasmid.12

fluoroquinolon,

tetracycline,

chloramphenicol

dan

sulfamethoxazole-

Pada ESBL terjadi substitusi asam amino dan mengakibatkan perubahan konfigurasi enzim. Perubahan ini akan merubah fungsi enzim tersebut. Terbukanya substrat -lactam biasanya juga dapat meningkatkan kemampuan enzim lactamase, contoh : substitusi asam amino tunggal pada posisi 104, 164, 238, dan 240 menghasilkan ESBL. Biasanya ESBL dengan spektrum luas memiliki lebih dari satu substitusi asam amino7.

Hal Yang Harus Diperhatikan Dalam Menditeksi ESBLJika hasil pertumbuhan bakteri menunjukkan hasil Gram negatif, maka kita harus berhatihati dalam menginterpretasi hasil tes kepekaan antibiotik(TKA) karena dikhawatirkan bakteri ini dapat memproduksi ESBL. Untuk itu sebaiknya kita harus mengetahui hal-hal yang penting dalam menditeksi ESBL, yaitu12 : 1. Semua isolat E. coli atau K. pneumoniae harus diuji terhadap antibiotik -lactam. Jika hasil isolat menunjukkan terjadinya penurunan sensitif terhadap satu atau lebih dari ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone, cefpodoxime atau aztreonam tetapi sensitif terhadap cefoxitin atau cefotetan harus dianggap sebagai potensial ESBL. 2. Isolat E. coli atau K. pneumoniae menunjukkan penurunan sensitif atau resisten terhadap extended spectrum cephalosporin dan cefoxitin atau cefotetan harus dianggap sebagai potensial AmpC resistance. 3. Uji sensitivitas dengan menggunakan kriteria yang ada masih mungkin gagal untuk mendeteksi ESBL. 4. Pengujian selektif untuk ESBL harus dipertimbangkan untuk enteric bacilli Gram negatif yang diisolasi dari bagian tubuh yang steril atau jika dicurigai terjadinya infeksi nasokomial. 5. Pengujian tes tambahan harus dipertimbangkan untuk enteric bacilli Gram negatif jika terjadi kegagalan terapeutik ketika hasil dari isolat bakteri yang sama menunjukkan hasil yang sensitif terhadap extended spectrum cephalosporin. 6. Perlu diketahui bahwa metode yang digunakan untuk menditeksi ESBL E.coli belum tentu dapat digunakan untuk enterobacteriaceae yang lain.

13

Metode Pemeriksaan Untuk Bakteri Penghasil ESBLSampai akhir tahun 1998 belum ada panduan konsensus internasional tentang cara

mendeteksi ESBL. The Canadian guideline labolatories, mengusulkan beberapa metode untuk menditeksi enterobacteriaceae penghasil ESBL, yaitu12 : 1. 2. 3. 4. Disk Diffusion Testing, MIC Method, Disk Approximation / Double Disk Method, Molecular Testing.

Pada tahun 2004, Indian Journal of Medical Microbiology mempublikasikan sebuah artikel tentang ESBL, dan merekomendasikan beberapa metode untuk menditeksi ESBL, yaitu11 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Double Disc Synergy Test, Three Dimensional Test, Inhibitor Potentiated Disc Diffusion Test, Disk Approximation Test, MIC Reduction Test, Vitek ESBL Test, E Test.

National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) yang kemudian berganti nama menjadi Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) merekomendasikan metode penyaring ESBL adalah1,114,15: 1. 2. Disk Diffusion Methods, Screening by Dilution Antimicrobal Susceptibility Test.

Tes konfirmasi ESBL, CLSI merekomendasikan : 1. 2. Cephalosporin / Clavulanate Combination Disk, Broth Microdilution. yang

Saat ini sudah banyak metode komersial untuk menditeksi bakteri penghasil ESBL terdapat di pasaran, antara lain1,8,9,16,17: 1. E Test,

14

2. 3. 4.

Vitek ESBL Cards, MicroScan Panels, BD Phoenix Automated Microbiology System.

Metode lain yang juga dapat digunakan untuk menditeksi bakteri penghasil ESBL antara lain 1 : 1. 2. 3. 4. 5. Cephalosporin / Clavulanate Combination Disk on Iso-Sensitest Agar, Double-Disk Diffusion Test, Agar Supplement with Clavulanate, Disk Replacement Methods, Three-Dimensional Test.

The Canadian External Quality Assessment Advisory Group for Antibiotic Resistance menggunakan beberapa metode untuk menditeksi bakteri penghasil ESBL. Metode diteksi ini terbagi dalam dua kelompok utama : dengan menggunakan screening (penyaring) untuk

menditeksi ESBL dan yang menggunakan pengamatan penurunan sensitivitas antibiotik untuk mengkonfirmasi suatu ESBL. Metode Penyaring mencakup pengujian Disk Diffusion Methods dan metode MIC. Phenotypic confirmatory testing bertumpu pada menunjukkan peningkatan ukuran dari zona hambatan disekitar disk yang berisi expanded spectrum cephalosporin, atau penurunan MIC ketika sebuah inhibitor -lactamase (clavulanic acid) ditambahkan ke disk atau metode MIC . Jika terjadi selisih diameter (A) 5 mm atau penurunan MIC cephalosporin lebih dari 3 kali pengenceran (untuk bakteri yang diuji secara tunggal) dibandingkan uji MIC yang pada saat diuji digunakan kombinasi dengan clavulanic acid, menunjukkan kemungkinan adanya ESBL12.

Disk Diffusion TestingCLSI menetapkan Disk Diffusion Testing dapat digunakan sebagai tes penyaring untuk bakteri penghasil ESBL seperti Klebsiella, E. coli, dan Proteus mirabilis. Disk Diffusion Testing adalah uji TKA, kecurigaan ESBL ditentukan berdasarkan perubahan zona diameter tertentu. Digunakan cefpodoxime, ceftazidime, aztreonam, cefotaxime, atau ceftriaxone. Jika salah satu diameter zona menunjukkan kecurigaan adanya produksi ESBL, maka harus dilakukan phenotypic confirmatory test.

15

Pada tahun 1995, Thomson mencatat bahwa kepekaan disk diffusion cefpodoxime dapat diandalkan untuk membedakan antara penghasil ESBL dan bukan penghasil ESBL dari K. pneumonia dan E. coli. CLSI merekomendasikan zona diameter 22 mm untuk 10 ug disk cefpodoxime sebagai tes penyaring yang cocok untuk bakteri penghasil ESBL. Namun tes ini kurang spesifik bila digunakan untuk E.coli, oleh karena itu kini CLSI merekomendasikan batas penyaring cefpodoxime adalah 17 mm. Uji disk cefpodoxime memiliki sensitivitas hampir 100% 1. Metode ini dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2 Antibiotic MIC and Inhibition Zone Criteria for the Detection of ESBLs in K. pneumoniae and E.coli* Zone diameter for Zone diameter susceptible strains for possible ESBLproducing strains 22 mm 27 mm MIC for susceptible strains MIC for possible ESBL-producing strains

Aztreonam 30g Cefotaxime 23 mm 27 mm 30g Cefpodoxime 21 mm 22 mm 10g Ceftazidime 18 mm 22 mm 30g Ceftriaxone 21 mm 25 mm 30g *adapted from NCCLS document M100-S88

8 mg/L 8 mg/L 8 mg/L 8 mg/L 8 mg/L

2 mg/L 2 mg/L 2 mg/L 2 mg/L 2 mg/L

Tabel ini menggambarkan adanya "Grey Area" pada zona diameter dan nilai MIC yang harus dipertimbangkan ketika hasil isolasi mengarah ke bakteri penghasil ESBL. Baru-baru ini diperkenalkan penggunaan disk ceftazidime dengan kandungan 5 g. Jika diduga bahwa K. pneumoniae yang diisolat dapat menghasilkan ESBL maka zona yang terbentuk 17 mm dan untuk E.coli 21 mm. Pedoman dari NCCLS (1999) merekomendasikan phenotypic confirmatory test dengan menggunakan ceftazidime (30g) dibandingkan ceftazidime/clavulanic acid (30/10g) dan cefotaxime (30g) dibandingkan cefotaxime/clavulanic acid (30/10g). Hasil zona yang terbentuk dibandingkan dengan zona diameter yang terdapat pada table 2, jika hasilnya16

A 5 mm untuk hasil kombinasi dengan disk clavulanic acid dibandingkan zona yang bukan kombinasi antibiotik, maka hasil ini menunjukkan bahwa bakteri yang diuji memproduksi ESBL.

Metode MIC untuk uji penyaring ESBLCLSI merekomendasikan dilution method untuk uji penyaring bakteri penghasil ESBL seperti E. coli dan klebsiella. Digunakan ceftazidime, aztreonam, cefotaxime, atau ceftriaxone dengan konsentrasi 1 ug/ml. Pertumbuhan bakteri pada konsentrasi ini {MIC cephalosporin (ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone, azteronam ) 2 ug/ml dan cefpodoxime 8 ug/ml} dapat dianggap sebagai penghasil ESBL. Metode ini direkomendasikan untuk K. pnemoniae, K oxytoca dan E. coli. Jika bakteri yang uji diduga mengandung ESBL maka harus dilanjutkan dengan uji konfirmasi ( phenotypic conformation test )1,8.

Disk Approximation / Double Disk Method / Double Disc Synergy TestDisk Approximation method adalah metode dengan menggunakan bermacam target disk yang saling berdekatan atau hanya menggunakan disk cefpodoxime secara tunggal, dan disk clavulanic. Penempatan disk ini harus mengikuti metode yang telah divalidasi/standar. The Canadian External Quality Assessment Advisory Group for Antibiotic Resistance, The Indian Journal of Medical Microbiology, The British Society for Antimicrobial Chemotherapy dan NCCLS (CLSI) merekomendasikan metode ini sebagai screening test ESBL1,6,10. Pada agar Mueller-Hinton diinokulasi dari suspensi kultur blood agar dengan cara dan metodenya sama seperti yang direkomendasikan untuk uji TKA. Disk yang berisi 30 ug ceftazidime, atau ceftriaxone, atau aztreonam, atau 10 ug cefpodoxime ditempatkan dengan jarak masing disk adalah 15 mm (ujung ke ujung) {referensi lain 25 -30 mm (pusat ke pusat disk)} dari disk amoxcillin-clavulanic acid (10 ug). Setelah inkubasi selama 16-20 jam pada suhu 35 - 37 o C, setiap peningkatan zona inhibisi antara disk dari -lactam dan yang mengandung -lactamase inhibitor merupakan indikasi adanya suatu ESBL atau dikatakan sinergi jika ditemukan zona yang jernih di tepi disk cefotaxime dan melebar hingga disk yang mengandung clavulanate. Keadaan sinergi ini diinterpretasikan sebagai ESBL. Perlu diingat

17

bahwa metode ini digunakan untuk E. coli dan K pneumoniae12. Sensitivitas metode ini berkisar 79 - 97% dan spesifisitas 94% - 100%. Hasil negatif palsu terjadi pada SHV-2, SHV-3, dan TEM-12. Untuk mengatasi strain ini, kita dapat mengubah jarak dari disk ke disk menjadi 20 mm atau 40 mm. Hasil positif palsu dapat terjadi karena aztreonam bukan substrat untuk maltophilia1. L2 metalloenzymes atau karena clavunamic acid menghambat -lactamase lain seperti yang dihasilkan oleh Stenotrophomonas

Gambar 1

Suspected bakteri penghasil ESBL dengan Double Disk Method (semiloka

mikrobiologi Patologi Klinik FK UNAIR 2010)

Gambar 2 Contoh lain suspected ESBL pada Double Disc method (www.medwelljournals.com/fulltext/?doi=javaa.2010.2030.2034)

Molecular TestingLebih dari 800 jenis -lactamase telah ditemukan, sehingga para ahli mulai merancang dan mengimplementasikan protokol molekuler untuk mendeteksi gen -lactamase. Saat ini tes PCR telah tersedia dan dapat digunakan untuk menditeksi bakteri penghasil ESBL5,18.

18

Three Dimensional TestMetode ini dikembangkan oleh Thomson dan Sanders1,9. Bakteri diinokulasikan sesuai dengan metode standar TKA ( densitas optik koloni setara dengan 0,5 McFarland), kemudian dibuat suatu potongan melingkar sebesar 4 mm pada agar. Setelah itu pada lobang yang telah dibuat di inokulasikan bakteri dengan kandungan 109 sampai 1010 CFU/mL. Disk -lactam diletakkan pada permukaan agar dengan jarak 3 mm dari tepi lobang tadi. -LactamaseInduced akan menginaktivasi tiap uji antibiotik. Cara menditeksinya adalah dengan memeriksa tepi dari zona hambatan di sekitar persimpangan lobang (circular three-dimensional dapat dinilai inoculation). Kehadiran -lactamase / ESBL yang menginaktivasi antibiotik

dengan cara terlihatnya suatu distorsi atau diskontinuitas di zona hambatan yang biasanya berbentuk melingkar atau menghasilkan koloni yang berbeda di sekitar celah inokulasi1,9,11.

Inhibitor Potentiated Disc Diffusion TestDisk cephalosporin ditempatkan pada tempat yang mengandung clavulanate selanjutnya diletakkan pada agar Mueller-Hinton tanpa disertai clavulanic acid lagi. ESBL ditetapkan jika ditemukan >10 mm peningkatan zona hambatan pada area yang berisi clavulanate dibandingkan disk cephalosporin murni11.

Cephalosporin / Clavulanate Combination DiskThe Canadian External Quality Assessment Advisory Group for Antibiotic Resistance, The Indian Journal of Medical Microbiology, The British Society for Antimicrobial Chemotherapy dan NCCLS (CLSI) merekomendasikan tes konfirmasi ESBL adalah phenotypic conformation test dengan menggunaan disk cefotaxime (30 ug) atau ceftazidime (30 ug) dengan atau tanpa clavulanate (10 ug) pada bakteri Klebsiellae dan E. coli. Cara membuat disk ini yaitu larutan clavulanic acid ditambahkan pada disk cephalosporin, kemudian diinkubasi selama 1 jam, setelah itu baru dapat digunakan. Saat ini kombinasi disk itu sudah dikomersilkan oleh Becton Dickinson, Oxoid, dan MAST . Tes ini dilakukan pada agar Mueller- Hinton. Dikatakan phenotypic conformation ESBL positif jika terjadi perbedaan diameter 5 mm antara disk cephalosporin (tanpa clavulanate) dengan disk cephalosporin /clavulanate1,6,12,14.

19

Steward dkk

menemukan 117 dari 139 (84%) dari isolat K. pneumonia memenuhi

kriteria positif untuk phenotypic conformation test terhadap ESBL. Dari 117 isolat, 104 (89%) memenuhi kriteria untuk phenotypic conformation test dengan menggunakan ceftazidime dan cefotaxime, 11 (9%) hanya ceftazidime dan 2 (2%) jika hanya menggunakan cefotaxime

saja. Hal ini membuktikan pentingnya penggunakan cefotaxime dan ceftazidime dengan dan tanpa clavulanate dalam melakukan phenotypic conformation test. Salah satu alasannya adalah bahwa penggunaan ceftazidime secara tunggal tidak mampu mendeteksi organisme penghasil CTX-M1.

Broth Microdilution untuk phenotypic conformation testPhenotypic conformation test juga dapat dilakukan dengan microdilution assay. Digunakan ceftazidime dan ceftriaxone dengan atau tanpa 2 mg/L clavulanic acid, (rekomendasi NCCLS = 4 mg/L clavulanic acid)12. Ceftazidime (0,25 s/d 128 ug/ml), ceftazidime yang

ditambahkan clavulanic acid (0,25/4 s/d 128/4 ug/ml), cefotaxime (0,25 s/d 64 ug/ml), dan cefotaxime yang ditambahkan clavulanic acid (0,25/4 s/d 64/4 ug/ml). Untuk meningkatkan sensitivitas metode ini ceftazidime dan cefotaxime harus digunakan. Cara pengerjaan Broth microdilution sesuai metode standar TKA. Dikatakan phenotypic conformation ESBL positif jika 3-twofold-serial dilution decrease in MIC (penurunan 3 kali lipat serial MIC) pada MIC cephalosporin yang mengandung clavulanic acid dibandingkan yang tidak mengandung clavulanic acid. Metode ini dapat bekerja dengan baik untuk K. pneumonia dan E. coli yang memproduksi ESBL tapi tidak pada isolat Enterobacter atau Morganella9,12. Steward dkk mengusulkan suatu algoritma untuk phenotypic method dalam menentukan ESBL. Mereka menyarankan untuk menggunakan cefoxitin pada isolat yang sudah positif pada uji penyaring tetapi dari hasil uji konfirmasi memberikan hasil negatif. Hasil resisten dari Cefoxitin mungkin disebabkan oleh isolat yang memproduksi enzim AmpC atau terjadi karena perubahan porin. Sebagai catatan bahwa bakteri penghasil AmpC dan ESBL dapat hidup secara berdampingan1.

E TestAB Biodisk (Solna, swedia) memproduksi plastic drug-imprenagted strips (strip plastik yang telah diletakkan antibiotik). Salah satu ujung strip berisi ceftazidime (kadar MIC antara20

0,5-32 ug/ml) dan sisi yang lain ditanam ceftazidime dan clavulanate (4 ug/ml). Saat ini strip yang mengandung cefotaxime dan cefotaxime / clavulanate. E Test dapat berguna sebagai uji penyaring maupun phenotypic confirmation E Test adalah 87 - 100% , spesifisitas terhadap bakteri penghasil ESBL. Sensitivitas

95 - 100% (untuk phenotypic confirmation test).

Sensitivitas dan spesifisitas metode tergantung pada rasio perbandingan MIC cephalosporin dan cephalosporin/Clavulanate. Rekomendasi dari pabrik pembuat E Test dalam menentukan ESBL adalah terjadi rasio MIC cephalosporin : cephalosporin/clavulanate 8.

Kadang kita sulit membaca strip yang berisi MIC cephalosporin saja akibat distorsi dari zona hambatan yang dibentuk oleh clavulanic acid. Dalam kasus ini, beberapa pengguna lebih suka mengukur MIC cephalosporin secara konvensional yaitu dengan menggunakan strip ceftazidime atau cefotaxime murni yang diletakkan secara terpisah dari clavulanate. E Test mampu menditeksi ESBL grup CTX-M-Type. Tipe ini mampu menghidrolisis cefotaxime1,6,16.

Gambar 3 E Test (http://www.scielo.br/img/revistas/bjid/v12n6/a14fig01.jpg) (perhatikan MIC ceftazidime (32ug/mL) : ceftazidime/clavulanate (0.125ug/mL) = 256 ( 8 ). Hasil ini merupakan ESBL.

21

Vitek ESBL CardsConvetional Vitek card kurang sensitif untuk organisme penghasil ESBL dengan kadar MIC cephalosporin 8 ug/ml. Untuk itu FDA (Food and Drug Administration) telah

menyetujui sebuah kartu khusus yang ditujukan untuk menditeksi bakteri penghasil ESBL. The Vitek ESBL test (bioMerieux Vitek, Hazelton, Missouri) menggunakan cefotaxime dan

ceftazidime (0,5 ug/ml) secara tunggal, serta kombinasi cefotaxime dengan clavulanic acid (4 ug /ml) dan ceftazidime dengan clavulanic acid (4 ug /ml). Cara inokulasi kartu ini sama dengan cara yang dilakukan untuk kartu Vitek biasa. Analisis seluruh sumur dilakukan secara otomatis setelah pertumbuhan bakteri telah mencapai ambang batas yang telah ditetapkan (setelah inkubasi 4 15 jam). Hasil positif ditetapkan jika terjadi penurunan dalam pertumbuhan bakteri di sumur yang berisi cefotaxime atau ceftazidime yang mengandung clavulanic acid,

dibandingkan dengan pertumbuhan sumur yang mengandung cephalosporin saja. Sensitivitas dan spesifisitas metode ini dapat melebihi 90 %. Sanders dkk melaporkan sensitivitas metode ini dapat mencapai 99 %, namun sebaliknya Tzelepi dkk melaporkan bahwa metode ini dapat gagal menditeksi ESBL yang dihasilkan oleh Enterobacter spesies9. Keunggulan Vitek ESBL Cards adalah dapat digunakan / diintegrasikan ke dalam alur kerja laboratorium yang sudah menggunakan sistem Vitek1,17.

MicroScan PanelsAlat ini diproduksi oleh Dade Behring Microscan (Sacramento, California) yaitu suatu dehydrated panel untuk uji kepekaan antibiotik secara microdilution. Metode ini dapat

digunakan untuk menditeksi bakteri penghasil ESBL yang resisten terhadap ceftazidime tetapi kurang baik untuk menditeksi resistensi cefotaxime atau ceftriaxone. Saat ini Microscan panel yang berisi kombinasi ceftazidime atau cefotaxime yang ditambah dengan inhibitor -lactamase telah disetujui FDA karena dalam beberapa penelitian telah terbukti dapat menditeksi bakteri penghasil ESBL1.

BD Phoenix Automated Microbiology SystemBecton Dickinson Biosciences (Sparks, Md) memperkenalkan sistem waktu inkubasi yang pendek untuk mengidentifikasi bakteri dan TKA. Sistem ini dikenal sebagai BD Phoenix. Untuk mendeteksi bakteri penghasil ESBL, Phoenix ESBL test menggunakan respon22

pertumbuhan bakteri terhadap cefpodoxime, ceftazidime, ceftriaxone dan cefotaxime, dengan atau tanpa clavulanic acid. Algoritma uji ini telah dibuat oleh Sanguinetti dkk

(gambar 4). Biasanya hasil dapat dilihat dalam 6 jam. Metode BD Phoenix dapat menditeksi 90 % strains genotypically bakteri penghasil ESBL. Metode ini dapat menditeksi dengan baik terhadap bakteri penghasil ESBL dari Enterobacter, Proteus, dan Citrobacter spp., klebsiellae dan Escherichia coli1,18.

Gambar 4 Algoritme BD Phoenix (http://jcm.asm.org/cgi/reprint/41/4/1463)

Cephalosporin / Clavulanate Combination Disk on Iso-Sensitest Agar.The British Society for Antimicrobial Chemotherapy merekomendasikan : untuk

mengkonfirmasi bakteri penghasil ESBL digunakan metode kombinasi disk cephalosporin/ clavulanate dan cefotaxime/clavulanate pada Iso-Sensitest Agar. M'Zali dkk membandingkan diameter zona dari setiap kombinasi disk antibiotik dengan disk cephalosporin saja, kemudian dihitung rasionya ( zona cephalosporin/ clavulanate dibagi zona cephalosporin). Dikatakan ESBL jika jika rasio > 1,5. Sensitivitas metode ini adalah 86% (menggunakan disk ceftazidime) dan 65,5% untuk disk yang berisi cefotaxime, namun jika dikombinasikan maka sensitivitasnya

23

meningkat menjadi 93%. Metode ini memiliki kelemahan yaitu tidak dapat mendeteksi ESBL yang dihasilkan oleh strain yang memproduksi SHV-6. Carter dkk mengevaluasi kombinasi disk cefpodoxime / clavulanate dan cefpodoxime saja. Dari 180 bakteri yang memproduksi ESBL didapatkan hasil : disk kombinasi memberikan hasil zona yang lebih besar, minimal 5 mm dari disk cefpodoxime saja (selisih rerata sebesar 11,6 mm), sedangkan dari 50 kontrol (bukan ESBL) hanya menghasilkan selisih zona berkisar 1 mm1.

Agar Supplemented with Clavulanate.Ho dkk mengusulkan sebuah metode yaitu pada agar Mueller-Hinton diberi 4 ug/ml clavulanate, kemudian ditanam disk ceftazidime (30 ug), cefotaxime (30 ug), ceftriaxone (30 ug), dan aztreonam (30 ug). Antibiotik tersebut juga ditanam di agar Mueller-Hinton yang tidak mengandung clavulanate. Jika terjadi perbedaan lebar zona antara disk di kedua agar 10 mm maka dapat dianggap sebagai ESBL. Sensitivitas Perbedaan ukuran zona ceftazidime adalah 93 96%, spesifisitas 100%. Kelemahan metode ini adalah sifat aktif clavulanate akan menurun setelah 72 jam1.

Disk Replacement MethodsPada Mediterranean Congress of Chemotherapy di Barcelona, Spanyol ( 20 -25 Mei 1990), Callas dan Pringler mengemukakan suatu metode untuk menditeksi ESBL. Tiga disk amoxcicillin/clavulanate ditempatkan pada agar Mueller-Hinton yang telah berisi bakteri yang akan diuji. Lakukan inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar, kemudian ketiga disk antibiotik (clavulanate) dilepas dan pada tempat yang sama diganti dengan disk yang mengandung cefotaxime, ceftazidime dan aztreonam. Disk kontrol (cefotaxime, ceftazidime dan aztreonam murni) diletakkan dengan jarak 30 mm dari ke tiga disk antibiotik tersebut. Hasil positif ESBL bila ditemukan kenaikan zona 5 mm untuk ketiga disk ini (cefotaxime, ceftazidime dan aztreonam) dibandingkan disk kontrol1.

24

The 10-disk Test for Phenotypic DetectionMetode ini dilakukan jika dijumpai keadaan seperti yang tercantum dibawah ini19 : 1. Jika terjadi perbedaan hasil ESBL(E.coli atau Klebsiella) antara uji phenotype dengan uji konfirmasi (misal : ceftazidime -Intermediate (I) atau Resistant (R) tetapi uji konfirmasi ESBL negatif). 2. Khusus Enterobactericeae, jika hasil uji TKA memberikan hasil : salah satu cephalosporin generasi ketiga memberikan hasil I atau R dan hasil uji konfirmasi negatif. 3. Khusus Enterobactericeae, Jika hasil menunjukkan atypical atau multi-drug resistant. 4. Khusus Enterobactericeae, jika terjadi resistensi terhadap semua antibiotik, kecuali imipenem. Ada 10 jenis antibiotik yang digunakan (tabel 3). Cara melakukan metode ini : Lakukan inokulasi pada agar MH seperti metode standar TKA. Tempatkan 10 disk seperti yang tercantum pada tabel 3. Tempatkan disk kombinasi dengan clavulanate berdekatan dengan disk cephalosporin. Inkubasi agar MH dalam inkubator selama 1 malam pada suhu 35oC dan dalam kondisi non-CO2. Hasil : dikatakan ESBL bila terlihat keyhole formation / keyhole phenomen atau selisih diameter kombinasi disk dengan disk cephalosporin 5 mm. Lihat pada gambar 5 8.

Tabel 3 The 10-disk Test for Phenotypic Detection of beta-Lactamase Resistance

( http://www.medical. siemens.com)

25

Gambar 5 Combination disk (Cephalosporin /Clavulanate) (http://www.medical. siemens.com)

Gambar 6 Double disk potentiation method/ Disk Approximation /Double Disc Synergy Test. (http://www.medical. siemens.com)

Gambar 7 AmpC pada Double disk potentiation method. (http://www.medical. siemens.com)

26

Gambar 8 Kombinasi ESBL dan AmpC (http://www.medical. siemens.com)

K1 -LactamaseKlebsiella oxytoca yang mengalami mutasi dapat memproduksi suatu chromosomal betalactamase (K1 enzyme). Sebagian besar enzim ini adalah penicillinase dan dapat menghidrolisis aztreonam, cefuroxime, ceftriaxone, sedangkan efek hirolisis terhadap cefotaxime atau ceftazidime relatif lemah. Jika produksi K1 berlebih (hyperproducer K1) akan memberikan gambaran yang khas pada enzim ini yaitu daya hidrolisis terhadap ceftriaxone lebih kuat

dibandingkan cefotaxime demikian juga daya hidrolisis terhadap aztreonam lebih besar dibandingkan ceftazidime. Gambaran ini dapat dilihat pada gambar 9. Alat otomatis sering rancu dalam menditeksi K1 -lactamase karena pada alat ini K1 lactamase diinterpretasikan sebagai ESBL (positif palsu ESBL), oleh karena itu kita harus berhati-hati dalam menginterpretasikan kuman Klebsiella oxytoca19.

27

Gambar 9 Gambaran K1 -Lactamase pada K.oxytoca. Perhatikan : ceftriaxone= R, cefotaxime= S (daya hidrolisis terhadap ceftriaxone lebih kuat dibandingkan cefotaxime). Aztreonam=R, ceftazidime=S (daya hidrolisis terhadap aztreonam (http://www.medical. siemens.com) lebih kuat dibandingkan ceftazidime).

Terapi terhadap infeksi akibat bakteri penghasil ESBLStochastic modeling mengusulkan penggunaan cefepime 2 g setiap 12 jam karena berdasarkan pengalaman klinis mungkin dosis ini mungkin dapatt mencapai target farmakokinetik/farmakodinamik. Namun pada suatu randomized trial terhadap organisme

penghasil ESBL akibat infeksi pneumonia nasokomial dilakukan perbandingan antara cefepime dengan imipenem. Dari 10 dari 10 (100%) penderita yang diterapi dengan imipenem sembuh, sedangkan dengan cefepime hanya 69% (9 dari 13) yang sembuh. Mungkin Cefepime telah resisten terhadap strain yang memproduksi CTX-M. Cefepime tidak boleh digunakan sebagai lini pertama terapi terhadap organism penghasil ESBL, jika digunakan harus dengan dosis tinggi (minimal 2 g tiap 12 jam). Carbapenem adalah antibiotik pilihan untuk terapi infeksi serius akibat organisme yang memproduksi ESBL, namun penggunaan carbapenem harus digunakan secara efisien karena baru-baru ini juga telah dilaporkan adanya carbapenem-resistant isolate1. Daftar obat yang direkomendasikan untuk terapi infeksi akibat bakteri penghasil ESBL dapat dilihat pada tabel 41.

28

Tabel 4 Daftar Antibiotik yang direkomendsikan untuk menangani bakteri penghasil ESBL

(http: //www.bsac.org.uk)

Screening ESBL diLaboratorium Patologi Klinik RSU Dr Soetomo Surabaya1. Double disk diffusion test. Metode ini telah dijelaskan sebelumnya. 2. Disk diffusion method Media : Mueller-Hinton Agar, lama inkubasi : 16 18 jam pada suhu 35 370 C, antimikroba : K. pneumonia, K. oxytoca, E coli : Cefpodoxime 10 ug atau Ceftazidime 30 ug atau Aztreonam 30 ug atau Cefotaxime 30 ug atau Ceftriaxone 30 ug. P. mirabilis :

Cefpodoxime 10 ug atau Ceftazidime 30 ug atau Cefotaxime 30 ug Catatan : semakin banyak antimikroba yang digunakan maka sensitivitas semakin baik. Hasil zona (clear area) yang terbentuk : K. pneumonia, K. oxytoca, E coli : Cefpodoxime 10 ug 17 mm29

Ceftazidime 30 ug Aztreonam 30 ug Cefotaxime 30 ug Ceftriaxone 30 ug P. mirabilis :

22 mm 27 mm 27 mm 25 mm

Cefpodoxime 10 ug Ceftazidime 30 ug Cefotaxime 30 ug

22 mm 22 mm 27 mm

Jika zona yang terjadi dibawah batas yang ditetapkan mengindikasikan bakteri penghasil ESBL.

30

RingkasanPada awal tahun 1980 cephalosporin generasi ketiga banyak digunakan untuk melawan bakteri yang menghasilkan -lactamase karena bakteri jenis ini sudah banyak yang resisten terhadap antibiotik. -lactamase adalah enzim yang dihasilkan oleh beberapa bakteri yang fungsinya untuk melawan antibiotik lactam, sedangkan lactam adalah antibiotik yang berasal dari penicillin dan cephalosporin. Carbapenem bukan merupakan lactam. Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) adalah enzim yang mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis antibiotika golongan penicillin, cephalosporin generasi satu, dua, dan tiga, serta golongan aztreonam (namun bukan cephamycin dan carbapenem). ESBL paling banyak dihasilkan oleh Enterobacteriaceae, terutama Escherichia coli dan Klebsiella pneumoniae. Carbapenem adalah antibiotik pilihan untuk terapi infeksi serius akibat organisme yang memproduksi ESBL, namun baru-baru ini juga telah dilaporkan adanya carbapenem-resistant isolate. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) yang kemudian berganti nama menjadi Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) merekomendasikan metode penyaring ESBL adalah : Disk Diffusion Methods, dan Screening by Dilution

Antimicrobal Susceptibility Test, sedangkan untuk konfirmasi ESBL, CLSI merekomendasikan : Cephalosporin / Clavulanate Combination Disk dan Broth Microdilution. Metode lain yang juga dapat digunakan untuk menditeksi bakteri penghasil ESBL antara lain : Cephalosporin/

Clavulanate Combination Disk on Iso-Sensitest Agar, Double-Disk Diffusion Test, Agar Supplement with Clavulanate, Disk Replacement Methods, Three-Dimensional Test, Molecular test, The 10-disk Test for Phenotypic Detection. Saat ini sudah banyak metode komersial untuk menditeksi bakteri penghasil ESBL yang terdapat di pasaran, antara lain : E Test, Vitek ESBL Cards, MicroScan Panels, dan BD Phoenix Automated Microbiology System.

31

Pustaka1. Paterson D L; Extended-Spectrum -Lactamases: a Clinical Update; downloaded at http://www. ncbi.nlm. nih.gov/pmc/articles/PMC1265908/pdf/0016-05.pdf;10 -12 - 2010. 2. Capital Health; Infection control Manual Policy and procedure; downloaded at

http://policy.cdha.nshealth.ca/defaultnc.aspx?page=DocumentRender&class17.Id=1103; 11 -12-2010. 3. Colodner R; Extended-Spectrum Beta-Lactamases: The End of Cephalosporins?; downloaded at http://www.ima.org.il/imaj/ar05may-13.pdf; 9-12-2-10. 4. Majalah Farmacia Edisi Juni 2007 , Halaman: 46; Infeksi Nosokomial: Menggantung Harapan Pada Antibiotik Anyar; downloaded at http://www.majalah-farmacia.com/rubrik /one_ news. asp?IDNews=508; 10-12-2010. 5. Tumbarello M; Bloodstream Infections Caused by Extended-Spectrum-beta-LactamaseProducing Klebsiella pneumoniae: Risk Factors, Molecular Epidemiology, and Clinical Outcome; downloaded at http://aac.asm.org/cgi/reprint/50/2/498 10-12-2010. 6. British Society for Antimicrobial Chemotherapy; Detection of Extended-Spectrum Beta Lactamases(ESBL) in E. coli and Klebsiella Species; downloaded at

http://www.bsac.org.uk/OneStopCMS/Core/CrawlerResourceServer.aspx?resource=79B 12740-4793-400D-A6FF-078792164D74&mode=link&guid ccdac 24bd6e068; 11-12-2-10. 7. Beta Lactamases; downloaded at http://en.wikipedia.org/wiki/Beta-lactamase; 09-122010. 8. Dakh F; Mutation frequency of non-ESBL phenotype SENTRY(Asia-Pasific) Isolates of Klebsiella pneumonia Conversion to ESBL Positive Phenotype; Queensland University of Technology School of Life Science; QUT December 2008; downloaded at http://eprints.qut.edu.au/28413/1/Farshid_Dakh's_Thesis.pdf; 05.01-2010. 9. Rao,MR; Detection of ESBL Producing Enterobacteriaceae Isolated from Pus Sample; Jagadguru Sri Shivara Threeshwara Medical College; Bangalore; Karnataka; September 2006;downloaded at http://119.82.96.197/gsdl/collect/disserta/index/ assoc/HASH46b3. dir/ doc.pdf; 01-05-2011. =3718a364383a41 e7ba

32

10. Konemans; Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology; sith edition volume 2; Lippincott Williams & Wilkins;Chicago; p 958 1004. 11. Chaudhary U; Review Article : Extended Spectrum beta lactamases an Emerging Threat to Clinical Therapeutics; downloaded at http://www.ijmm. org/article.asp

?issn=0255-0857;year=2004;volume=22;issue=2;spage=75;epage=80;aulast=Chaudhary: 12-12-2010. 12. Canadian External Quality Assessment Advisory Group for Antibiotic Resistance ; Guidelines on Susceptibility Testing of Antibiotic Resistant Enterobacteriaceae due to extended Spectrum Beta-Lactamases; dowaloaded at http://www.phac-aspc.gc.ca/ publicat/ ceqa-pceeq/esbl98-eng.php; 9-12-2010. 13. Sudarmono P; Genetika dan Resistensi in Mikrobiologi Kedokteran; Edisi revisi; Binarupa Aksara; Jakarta; 1994; 34-35. 14. ClinMicro.orgBlog; Extended Spectrum Beta Lactamases: A Review; downloaded at http://www.clinmicro.org/blog/?p=21; 2-1-2011. 15. Mitchell J; Utility of NCCLS Guidelines for Identifying Extended-Spectrum betaLactamases in Non-Escherichia coli and Non-Klebsiella spp.of Enterobacteriaceae; downloaded at http://jcm.asm.org/cgi/reprint/42/1/294.pdf; 28-12-2010. 16. Biomerieux-Diagnostic; Etest Procedure; Downloaded at http://biomeriux-diagnostic. com; 2-1-2011. 17. Biomerieux-Diagnostic ; New VITEK 2 Cards Expanding and Improving Testing Capabilities; downloaded at http://www.biomerieux-usa.com; 2-1-2010. 18. Maurizio S; Characterization of Clinical Isolates of Enterobacteriaceae from Italy by the BD Phoenix Extended-Spectrum beta-Lactamase Detection Method; downloaded at http://jcm.asm.org/cgi/reprint/41/4/1463.pdf; 3-12-2011. 19. C.Paul; The 10-disk test for phenotypic detection of beta-lactamase resistance in Gramnegative bacilli : testing and interpretation guide; downloaded at http://www.medical. siemens.com/siemens/en_GLOBAL/gg_diag_FBAs/files/education/microbiology/MicroF ocus_Journal_Issue_Fall_2009.pdf; 4-01-2011.

33

34