Analiza zanieczyszczeń preparatów zawierających ibuprofen z … · 2014-03-27 · cyjne w...

37

1 WPROWADZENIE

Ibuprofen (kwas 2-(4-izobutylofenylo)propiono-wy) należy do szerokiej i zróżnicowanej grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Za-kres wskazań, tj. bóle, stany zapalne, gorączka, reumatyzm, zgodny jest z jego właściwościami: przeciwgorączkowymi, przeciwbólowymi, prze-ciwzapalnymi i antyagregacyjnymi. W porówna-niu do pozostałych nieselektywnych inhibitorów cyklooksygenazy ibuprofen jest lepiej tolerowa-ny przez przewód pokarmowy, a przez to jego stosowaniu towarzyszy mniej działań niepożą-danych. Z powyższych względów ibuprofen jest jednym z częściej stosowanych leków z kategorii OTC. Podawany jest w różnych dawkach i pod różnymi postaciami [4].

Zgodnie z definicją sformułowaną przez FDA zanieczyszczeniem produktu leczniczego jest każda występująca w nim substancja, nie-będąca substancją aktywną ani środkiem po-mocniczym [6].

Termin „profilowanie zanieczyszczeń” uzna-wany jest za ogólną nazwę grupy czynności analitycznych mających na celu wykrycie, iden-tyfikację, określenie struktury oraz oznaczenie ilościowe zanieczyszczeń organicznych (w tym pozostałości rozpuszczalników) i nieorganicz-nych w substancjach aktywnych oraz gotowych postaciach leku [3]. Otrzymany profil (swoisty odcisk palca) uzależniony jest od wielu czynni-ków, w związku z czym na jego podstawie możliwe jest określenie podobieństw wystę-pujących między różnymi preparatami farma-ceutycznymi. Niezwykle użytecznymi do tego celu okazują się metody chemometryczne.

Chemometria powstała w odpowiedzi na potrzebę analizy coraz większej ilości danych dostarczanych przez nowoczesne techniki po-miarowe. Dysponuje szeregiem metod m.in.: grupowania, regresji oraz eksploracji, przy czym podział na wymienione grupy nie jest ścisły. Szeroki wachlarz stosowanych procedur oraz ich specyfika umożliwiają poznanie zależności mię-dzy badanymi przypadkami (w tym wypadku profilami zanieczyszczeń) scharakteryzowanymi przez szereg zmiennych.

Inne zastosowanie metod chemometrycznych opiera się na wykorzystaniu ich algorytmów do predykcji. Można tym samym, opracowując odpowiednio zwalidowany model, zastąpić dro-gie i/lub czasochłonne badania innymi, które z różnych powodów mogą być korzystniejsze. Wobec tego oznaczanie zawartości zanieczysz-czeń – proces niezwykle istotny dla przemysłu farmaceutycznego, zapewniający bezpieczeń-stwo farmakoterapii – może być przeprowa-dzone metodami spektroskopowymi, znacznie szybszymi i mniej kosztochłonnymi od wysoko-sprawnej chromatografii cieczowej.

2 CELE PRACY

Preparaty farmaceutyczne, zawierające ibupro-fen jako substancję czynną, posłużyły za ma-teriał do badań, których celem było: opracowanie i optymalizacja jakościowej

chromatograficznej (HPLC) metody rozdzie-lania zanieczyszczeń tych preparatów;

otrzymanie profili zanieczyszczeń (w postaci chromatogramów oraz absorpcyjnych widm

ANALIZA ZANIECZYSZCZEŃ PREPARATÓW ZAWIERAJĄCYCH IBUPROFEN

Z WYKORZYSTANIEM HPLC, SPEKTROSKOPII IR I METOD

CHEMOMETRYCZNYCH

Natalia Piekuś Katedra i Zakład Biofarmacji, Collegium Medicum Uniwersytetu Mikołaja Kopernika, Bydgoszcz

Analiza zanieczyszczeń preparatów zawierających ibuprofen...

www.statsoft.pl/czytelnia.html Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska 2012 38

oscylacyjno-rotacyjnych w zakresie podczer-wieni) badanych leków;

określenie podobieństw między uzyskanymi profilami zanieczyszczeń z wykorzystaniem chemometrycznych metod uczenia bez nad-zoru (analiza skupień, analiza głównych skła-dowych);

zbudowanie modeli kalibracyjnych, z wyko-rzystaniem metody cząstkowych najmniej-szych kwadratów (PLS), pozwalających na predykcję zawartości zanieczyszczeń w środ-kach leczniczych zawierających ibuprofen jako substancję czynną.

Dbałość o wysoką jakość produktów leczni-czych realizowana jest głównie poprzez kontrolę zanieczyszczeń w nich zawartych. Techniką naj-częściej stosowaną w tym celu jest wysoko-sprawna chromatografia cieczowa (HPLC) [8, 2]. Opracowanie odpowiednich parametrów metody chromatograficznej, umożliwiających precyzyjne rozdzielenie wszystkich zanieczysz-czeń zwartych w produkcie, pozwala otrzymać tzw. profile zanieczyszczeń.

Inną metodą analityczną, dającą możliwość kontrolowania jakości środków leczniczych, jest spektroskopia w zakresie podczerwieni z trans-formacją Fouriera. Niewątpliwymi jej zaletami są: łatwość przygotowania próbki do analizy (możliwość badania substancji w postaci stałej), brak konieczności stosowania rozpuszczal-ników, krótki czas wykonywania pomiaru i wiele innych. W przypadku widm w zakresie podczerwieni trudno jednak mówić o typowych profilach zanieczyszczeń. W ich obrazie nie można wskazać miejsc, w których rejestrowana absorbancja jest wynikiem obecności kon-kretnego zanieczyszczenia - jak ma to miejsce w przypadku chromatogramów.

Poddanie analizie chemometrycznej wyników uzyskanych metodami HPLC oraz FT-IR pozwoli zidentyfikować podobieństwa wystę-pujące między badanymi preparatami ibupro-fenu. W tym celu zostaną wykorzystane analiza skupień oraz analiza składowych głównych. Me-tody te umożliwiają pogrupowanie badanych obiektów na podstawie wielu cech je opisu-jących, a tym samym na wydobycie całości cen-nych informacji, dostarczonych w wyniku prze-prowadzonego badania. Są to również techniki uwożliwiające identyfikację obiektów odstają-cych, które mogą powodować złe dopasowanie

modeli kalibracyjnych zbudowanych w oparciu o otrzymany zbiór danych.

Wysoki stopień korelacji wyników otrzy-manych metodami uczenia bez nadzoru - CA, PCA (dla macierzy danych utworzonych na podstawie dwóch różnych metod pomiarowych - HPLC i FT-IR) - pozwoli na podjęcie próby konstrukcji modeli kalibracyjnych typu PLS. Modelowanie metodą częściowych najmniej-szych kwadratów (PLS) jest najczęściej sto-sowaną techniką opracowywania algorytmów predykcyjnych w chemii analitycznej. Dobra ja-kość skonstruowanych modeli umożliwi prze-widywanie zawartości zanieczyszczeń w prepa-ratach farmaceutycznych na podstawie ich widm. W świetle przytoczonych zalet metod spektroskopowych będzie to niewątpliwym sukcesem.

W toku przeprowadzonych badań zostanie również poddana ocenie zasadność przygotowy-wania pastylek do rejestracji tła (FT-IR) z mie-szaniny bromku potasu oraz przygotowanych matryc badanych preparatów farmaceutycznych.

3 METODYKA BADAŃ

Badaniem objęto dostępne na polskim rynku, proste preparaty ibuprofenu, występujące w pos-taci stałej: Aprofen Forte (Polfarmex), Ibuprofen (AFLOFARM), Ibuprofen-Pabi (Polfa Pabia-nice), Ibuprom Max (US Pharmacia), Ibupar Forte (Polfa Pabianice), Ibalgin Maxi (ZEN-TIVA), Ibuprom Duo (US Pharmacia), MIG (Berlin-Chemie).

Próbki do analizy chromatograficznej (chro-matograf cieczowy LC-20AD z detektorem PDA SPD-M20A, firmy Shimadzu) przygoto-wano poprzez roztarcie tabletek badanych środków leczniczych i odważanie porcji zawie-rających 40 mg substancji aktywnej (w oparciu o średnią masę tabletki i deklarowaną przez producenta zawartość ibuprofenu), a następnie ekstrakcję acetonitrylem (J.T. Baker). Filtraty otrzymane po sączeniu (sączek membranowy, średnica porów 2 µm) rozcieńczono fazą ruchomą w stosunku 1:1 i nastrzykiwano.

Elucję prowadzono w odwróconym układzie faz (RP). Fazę ruchomą stanowiła mieszanina: acetonitryl (J.T. Baker): woda (POCH): kwas ortofosforowy (POCH) w stosunku objętoś-ciowym 600:400:2. Jako fazę stałą użyto kolumny wypełnionej żelem krzemionkowym,


Zastosowania metod statystycznych w badaniach naukowych IV StatSoft Polska 2012 www.statsoft.pl/czytelnia.html 39

modyfikowanym grupami oktadecylowymi (kolumna 3 μm C18 110A; 150 x 4,60 mm, firmy Gemini). Przepływ fazy ruchomej wynosił 0,8 ml/min. Czas trwania analizy wynosił 60 minut. Detekcja odbywała się przy długości fali 214 nm. Dla każdego z badanych preparatów przygotowano 3 roztwory - każdy poddano analizie chromatograficznej 2-krotnie.

W badaniach spektroskopowych (spektrofo-tometr IR z transformacją Fouriera FT-IR 8400S, firmy Shimadzu) stosowano transmisyj-ną technikę pomiarową. Wykorzystano metodę pastylki z KBr. Rejestrowano widma absorp-cyjne w zakresie liczb falowych 4000–400 cm

-1,

z rozdzielczością 2 cm-1

. Tradycyjnie przy wykonywaniu widm

w zakresie IR metodą pastylki z KBr jako tło stosuje się czysty bromek potasu. W celu uzys-kania jak najlepszej korelacji między profilami zanieczyszczeń otrzymanymi metodą HPLC i widmami absorpcyjnymi otrzymanymi metodą spektroskopii FT-IR jako tło do pomiaru w zakresie podczerwieni zastosowano miesza-ninę KBr ze specjalnie przygotowaną matrycą.

Ekstrakcję substancji czynnej z masy tablet-kowej przeprowadzono podobnie jak w przypad-ku przygotowania próby do HPLC. Otrzymany roztwór przesączono przez sączek filtracyjny. Następnie osad na sączku wysuszono w temp. 40ºC. Składał się on z substancji nierozpuszczal-nych w acetonitrylu, które były eliminowane podczas przygotowywania próby do analizy chromatograficznej na etapie sączenia przez sączek membranowy. W kolejnym etapie odwa-żono odpowiednią ilość wysuszonego osadu (tak by zawartość substancji pomocniczych w pas-tylce do pomiaru tła odpowiadała ilości obecnej w pastylce przygotowanej z masy tabletkowej) oraz bromku potasu (również pozbawionego wilgoci). Przy użyciu moździerza agatowego dokładnie roztarto i wymieszano oba związki. Uzyskaną mieszaninę poddano działaniu ciśnie-nia w prasie hydraulicznej (firmy Specac). Otrzymane w ten sposób pastylki umieszczono w spektrofotometrze IR z transformacją Fouriera i wykorzystano do pomiaru tła.

Właściwe próbki - pastylki przygotowano przez sprasowanie homogennej mieszaniny bromku potasu i sproszkowanych tabletek w sto-sunku 100:1. Dla każdego z preparatów przygo-towano po 3 pastylki, każdą poddano 2-krot-nemu pomiarowi.

Zgromadzone dane spektroskopowe oraz chromatograficzne, informujące o profilu zanie-czyszczeń badanych produktów leczniczych, poddano analizie chemometrycznej z wykorzys-taniem wielowymiarowych technik eksploracji danych. Obliczenia wykonano w programie STATISTICA.

4 WYNIKI

4.1 Profile zanieczyszczeń otrzymane z zastosowaniem chromatografii cieczowej (HPLC)

W efekcie przeprowadzonych analiz otrzymano po sześć chromatogramów dla każdego z bada-nych preparatów. Rys. 1 przedstawia przykła-dowy chromatogram z zaznaczonymi dziewię-cioma pikami. Osiem z nich (oznaczonych lite-rami A-H) jest skutkiem obecności zanieczysz-czeń w badanej próbce, dziewiąty pochodzi od ibuprofenu.

Rys. 1. Chromatogram z zaznaczonymi zanieczyszczeniami (A-H), na podstawie których utworzono macierz danych wykorzystaną do analizy chemometrycznej (na przykładzie Ibuparu Forte.

4.2 Widma absorpcyjne otrzymane z zastosowaniem metody FT-IR

Rezultatem przeprowadzonych badań są widma w podczerwieni – średnio 6 dla każdego preparatu (rys. 2).

Dla wszystkich wykonanych widm przepro-wadzono korektę linii bazowej metodą wielo-punktową (Multipoint Baseline Correlation) przy użyciu programu IR Solutions 1.30. Ponadto w celu redukcji wpływu użycia różnych ilości badanej substancji otrzymane widma poddano normalizacji. Uzyskuje się ją poprzez określenie granicy sygnału (w tym przypadku wartości absorbancji w przedziale 0-1).



Rys. 2. Widmo w zakresie podczerwieni dla próbki preparatu Aprofen Forte.

5 ANALIZA CHEMOMETRYCZNA

5.1 Analiza profili zanieczyszczeń uzyskanych metodą HPLC

Efektem przeprowadzonej analizy chromatogra-ficznej były wartości pól powierzchni pików stanowiących zanieczyszczenia badanych prepa-ratów ibuprofenu. Wyniki te zostały przeliczone na taką samą zawartość substancji czynnej – 100 mg. Zbiór tych danych stanowił macierz, na podstawie której przeprowadzono analizę che-mometryczną. Braki danych zastąpiono wartościami średnimi. Obliczenia wykonano w programie STATISTICA.

5.1.1 Analiza skupień

Jedną z metod podziału otrzymanych profili zanieczyszczeń na grupy łączące w swoim obrębie najbardziej podobne do siebie próbki jest analiza skupień. Jest to metoda bardzo wrażliwa na występowanie przypadków odsta-jących. Zasadnym jest więc wykonanie jej na wstępnym etapie analizy chemometrycznej. Pozwala to na jeszcze dokładniejsze zweryfiko-wanie zebranego zbioru danych. Dendrogram umieszczony na rys. 3 przedstawia 8 klastrów (liczba zgodna z liczbą badanych preparatów ibuprofenu), których wewnętrzna struktura jest całkowicie jednorodna. Potwierdza to prawi-dłowe przygotowanie danych do analizy (data pre-processing).

Uwzględniając „punkt odcięcia” odczytany z wykresu przebiegu aglomeracji (liniowy wy-kres przedstawiający zależność między etapami procesu wiązania, a odległością wiązań), inter-pretowany dendrogram prezentuje się w sposób przedstawiony na rys. 4.

Widoczny jest wyraźny podział na 4 skupiska: skupisko I zawierające preparaty: Ibuprofen

Aflofarm, Ibuprom Max, Ibuprofen Pabi;

skupisko II zawierające preparaty: Ibalgin Maxi, Ibuprom Duo, Ibupar Forte;

skupisko III stanowi preparat MIG; skupisko IV stanowi preparat Aprofen Forte.

Rys. 3. Analiza skupień; metoda aglomeracji: średnich połą-czeń, miara odległości: odległość Manhattan.

Rys. 4. Analiza skupień z uwzględnieniem „punktu odcięcia”; metoda aglomeracji: średnich połączeń, miara odległości: odległość Manhattan.

Funkcją wykorzystaną w przeprowadzonej analizie była odległość Manhattan, techniką łączenia zaś metoda średnich połączeń. Stosując jako sposób łączenia metodę średnich połączeń ważonych, otrzymamy skupiska o takim samym składzie. Nieco inaczej prezentuje się wew-nętrzna struktura oraz liczba grup, gdy zasto-sujemy metodę pełnego wiązania (rys. 5).

W tym przypadku preparat MIG, stanowiący w poprzedniej analizie osobny klaster, został zaklasyfikowany do skupiska II. Złożone jest ono z preparatów: Ibalgin Maxi, Ibuprom Duo, Ibupar Forte oraz MIG.

Analizę skupień przeprowadzono również, stosując inne miary odległości (odległość



euklidesową, kwadrat odległości euklidesowej). Podobnie jak w przypadku zastosowania algo-rytmu Manhattan otrzymano dendrogramy, na których widoczny jest podział na cztery lub trzy grupy, w zależności od tego, czy preparat MIG tworzy odrębne skupisko czy łączy się w jeden klaster z preparatami: Ibalgin Maxi, Ibuprom Duo, Ibupar Forte.

Lek Aprofen Forte niezależnie od użytej metody aglomeracji stanowi zawsze odrębne skupisko, podobnie jak grupa preparatów oznaczona jako skupisko I (Ibuprofen Aflofarm, Ibuprom Max, Ibuprofen Pabi). Jako metodę identyfikacji „punktu odcięcia” stosowano wykresy przebiegu aglomeracji.

Rys. 5. Analiza skupień; metoda aglomeracji: pełne wiązanie, miara odległości: odległość Manhattan

Celem potwierdzenia otrzymanego podziału na skupienia posłużono się inną, tym razem niehierarchiczną, metodą grupowania – grupo-waniem metodą k-średnich (k–means). Zastoso-wano moduł dostępny w pakiecie STATISTICA Data Miner. Wykonano V-krotny sprawdzian krzyżowy, co umożliwiło iteracyjne wyznacze-nie optymalnej liczby segmentów. Jako wstępne centra skupień przyjęto losowy wybór k-ob-serwacji.

Analiza wykresu sekwencji kosztów wskazu-je, iż istotny spadek błędu precyzji podziału notowany jest przy wyborze czterech segmen-tów. Dalsze zwiększanie liczby skupisk nie powoduje wyraźnego zmniejszenia tzw. „kosz-tu”. Analiza skupień przeprowadzona uogól-nioną metodą k-średnich jednoznacznie wska-zuje więc na rozdzielenie badanych przypadków do czterech grup.

Otrzymany podział pokrywa się z tym otrzy-manym przy użyciu metody aglomeracyjnej – tabela 1.

Tabela 1. Zestawienie rezultatów analizy skupień przepro-wadzonej metodą hierarchiczną oraz grupowania k-średnich.

Skupienie uzyskane metodą

k-średnich Skład

Skupienie uzyskane metodą

aglomeracyjną

1 MIG III

2 Aprofen Forte IV

3 Ibuprofen Aflofarm,

Ibuprom Max, Ibuprofen Pabi

I

4 Ibalgin Maxi, Ibuprom Duo, Ibupar Forte

II

5.1.2 Analiza składowych głównych

PCA polega na przekształceniu zgromadzonych zmiennych (między którymi występują większe lub mniejsze korelacje) na zbiór ortogonalnych czynników głównych. Uzyskuje się więc reduk-cję liczby danych, która umożliwia lepsze dos-trzeżenie prawidłowości i powiązań występu-jących między badanymi próbkami.

Istnieje kilka reguł dotyczących wyboru liczby istotnych czynników głównych. Jedną z nich jest kryterium Kaisera - według niego znaczące są te czynniki, których wartość własna jest większa od 1. Stosując kryterium Kaisera, za istotne należy uznać trzy pierwsze składowe, których skumulowana wartość własna wynosi 6,43. Wyjaśniają one ponad 80% ogółu zmienności.

Redukcja liczby danych opisujących badane próbki (z 8 będących polami powierzchni pików na chromatogramie do 3 będących istotnymi składowymi głównymi) pozwala na wizualizację ich zmienności na wykresach rozrzutu.

Wykres rozrzutu przypadków na płaszczyznę utworzoną przez dwie pierwsze składowe główne przedstawia rys. 6.

Widoczny jest wyraźny podział analizo-wanych przypadków na cztery grupy. Dwie z nich składają się z próbek trzech preparatów każda. Próbki pozostałych dwóch badanych środków leczniczych rozdzieliły się na dwie kolejne grupy - zgodnie z ich pochodzeniem.



Rys. 6. PCA; wykres rozrzutu 1:2.

Analiza skupień przeprowadzona zarówno metodą aglomeracyjną, jak i k-średnich klasyfi-kowała badane przypadki na cztery skupienia. Porównanie podziałów uzyskanych z zastosowa-niem PCA oraz CA przedstawia rys. 7.

Rys. 7. PCA; wykres rozrzutu 1:2 z uwzględnionym podziałem uzyskanym metodą analizy skupień.

Jak widać, obie zastosowane metody chemo-metryczne podzieliły badany zbiór w ten sam sposób.

5.2 Analiza widm absorpcyjnych uzyskanych metodą FT-IR

Efektem przeprowadzonych badań spektrosko-powych były widma w podczerwieni w zakresie liczb falowych 400-4000 cm

-1. Przygotowanie

danych polegało na korekcji linii bazowej, normalizacji oraz eliminacji przypadków odsta-jących. Macierz danych, na której opierała się

analiza chemometryczna, została utworzona z co ósmej wartości absorbancji. Analizę wykonano przy użyciu programu STATISTICA.

5.2.1 Analiza skupień

Tak jak w przypadku profili zanieczyszczeń uzyskanych za pomocą HPLC pierwszą wyko-naną procedurą była analiza skupień. W zależ-ności od zastosowanej metody wiązania uzys-kano podział na cztery, trzy lub dwa skupiska. Za algorytm odległości przyjęto funkcję Manhattan.

Pomimo otrzymania tak różnej liczby skupisk widoczne są pewne prawidłowości. Niezależnie od przyjętej metody wiązania pięć leków: Aprofen Forte, Ibalgin Maxi, Ibupar Forte, Ibuprom Duo oraz MIG tworzy zawsze jedną grupę preparatów. Zmienność ogólnej liczby skupisk wynika z faktu, iż pozostałe trzy środki lecznicze: Ibuprofen Aflofarm, Ibuprofen Pabi oraz Ibuprom Max łączą się ze sobą w większe grupy, bądź pozostają odseparowane.

Weryfikację otrzymanego podziału przepro-wadzono, stosując grupowanie metodą k-śred-nich. Przyjmując jako wstępne centra skupień losowy wybór k-obserwacji, wykonując V-krot-ny test krzyżowy, grupę badanych przypadków zaklasyfikowano do dwóch skupisk. Można więc przyjąć, że analiza skupień (przeprowa-dzona zarówno metodą hierarchiczną, jak i k-średnich) dzieli badany zbiór obiektów na dwie grupy (tabela 2).

Tabela 2. Zestawienie rezultatów analizy skupień przeprowa-dzonej metodą hierarchiczną oraz grupowania k-średnich.

Skupienie uzyskane metodą k-średnich

Skład Skupienie uzyskane

metodą aglomeracyjną

1

Ibalgin Maxi, MIG, Ibuprom Duo, Aprofen Forte, Ibuprom Duo Ibupar Forte

I

2 Ibuprofen Aflofarm,

Ibuprom Max, Ibuprofen Pabi

II

Skupisko 1 składa się z próbek pięciu bada-nych preparatów. Jest ono wewnętrznie jedno-rodne - niezależnie od rodzaju przeprowadzonej analizy oraz stosowanej metody wiązania jego skład jest stały.



Skupisko 2 składa się z próbek pozostałych trzech środków leczniczych i cechuje się więk-szą heterogennością. Zgromadzone w jego obrębie preparaty wykazują większe zróżnico-wanie, przy czym środek leczniczy – Ibuprom Max wyraźniej różni się od dwóch pozostałych.

5.2.2 Analiza głównych składowych

Jako pierwszą wykonano analizę składowych głównych dla całego zbioru zmiennych. Uzyska-no w ten sposób zespół ortogonalnych czynni-ków głównych.

Stosując kryterium Kaisera, za istotne należałoby uznać aż siedemnaście pierwszych czynników głównych (wartość własna powyżej 1). W związku z tak dużą liczbą istotnych składowych głównych wskazanych przez to kryterium celowym wydaje się skorzystanie z wykresu osypiska, który wskazuje, iż znaczący przyrost informacji notowany jest do trzeciej głównej składowej.

Uzyskany obraz – wykres rozrzutu przypad-ków na płaszczyznę utworzoną przez dwie pierwsze składowe główne w żaden sposób nie odzwierciedla podziału zbioru badanych próbek otrzymanego w wyniku przeprowadzonej ana-lizy skupień. Projekcje na płaszczyzny utwo-rzone z czynników 1 i 3 oraz 2 i 3 również nie przyniosły zadowalających rezultatów.

Ponieważ widma w podczerwieni charaktery-zują się obszarami mało specyficznymi, tzn. po-dobnymi dla całych grup związków o określonej budowie chemicznej, kolejną analizę składowych głównych przeprowadzono dla zawężonej grupy zmiennych – analizowano wartości absorbancji dla liczb falowych z zakresu 400-1600 cm

-1.

Podobnie jak w przypadku poprzedniej ana-lizy do wyboru liczby istotnych czynników głównych posłużono się wykresem Cattella (kryterium Kaisera spełniło aż dziesięć pierw-szych głównych składowych). Jako aktywne wybrano trzy pierwsze składowe główne, których skumulowany procent ogółu wariancji wynosi ponad 80%.

Wykres rozrzutu przypadków na płaszczyznę utworzoną przez czynnik 2 i 3 przedstawia podział analogiczny do uzyskanego metodą analizy skupień, gdzie jako metodę aglomeracji zastosowano pojedyncze wiązanie, a miarą odległości była odległość Manhattan (rys. 8).

Oznaczenia skupisk odpowiadają: A=I, B=III, C=IV, D=II.

Rys. 8. PCA dla zmiennych - wartości absorbancji dla liczb falowych 400-1600 cm-1; wykres rozrzutu 1:2 (a); CA- metoda aglomeracji: pojedyncze wiązanie, miara odległości: odległość Manhattan (b).

Wykorzystanie czynnika 1 do zobrazowania zmienności preparatów przyniosło gorsze rezul-taty – punkty na wykresach nie tworzą wyraź-nych skupisk. Oznacza to, iż dane, na podstawie których została utworzona pierwsza składowa główna nie odpowiadają za ogólną zmienność próbek.

Projekcja zmiennych na płaszczyznę czynni-ków pozwala na ocenę, które zmienne mają największy i najmniejszy wkład w tworzeniu składowych głównych.

Rys. 9. PCA dla zmiennych - wartości absorbancji dla liczb falowych 900-1200 cm

-1; wykres rozrzutu 1:2 (a); CA- metoda

aglomeracji: metoda Warda, miara odległości: odległość Manhattan (b).

Rezultatem analizy powyższego wykresu oraz tabeli składającej się z ładunków czynnikowych było przeprowadzenie kolejnych analiz, dla



jeszcze węższego zakresu zmiennych. Wyelimi-nowano te mające najmniejszy wykład w two-rzeniu czynników 2 i 3. Rys. 9 przedstawia rezultaty PCA dla wartości absorbancji mierzo-nych w zakresie liczb falowych 900-1200 cm

-1.

Przedstawiony wykres rozrzutu na płasz-czyznę utworzoną przez dwie pierwsze składo-we główne, uwidacznia podział analizowanych przypadków na trzy grupy. Jest to klasyfikacja odpowiadająca uzyskanej metodą analizy sku-pień, gdzie jako metodę aglomeracji zastoso-wano metodę Warda, a miarą odległości była odległość Manhattan.

Ocena chemometryczna danych uzyskanych za pomocą spektroskopii w podczerwieni, reali-zowana metodami CA oraz PCA, nie przyniosła tak wyrazistego podziału badanych preparatów ibuprofenu jak ta przeprowadzona na podstawie danych uzyskanych metodą HPLC. Nie można jednoznacznie stwierdzić, do ilu grup należy zaklasyfikować badane próbki. Z całą pewnością jedną, wewnętrznie homogenną grupę prepa-ratów tworzy pięć środków farmaceutycznych: Aprofen Forte, Ibalgin Maxi, Ibupar Forte, Ibuprom Duo oraz MIG. Większego problemu przysparza pogrupowanie próbek pozostałych trzech leków (Ibuprofen Aflofarm, Ibuprom Max, Ibuprofen Pabi). Można zaklasyfikować je do jednej grupy - jako preparaty wyraźnie różniące się od pięciu pozostałych. Taki rezultat przyniosła analiza skupień przeprowadzona metodą grupowania k-średnich. Zastosowanie różnych algorytmów podczas przeprowadzo-nych analiz uwidoczniło jednak, iż preparat Ibuprom Max znacząco różni się od podobnych do siebie Ibuprofenu Aflofarm oraz Ibuprofenu Pabi (PCA dla zmiennych z zakresu liczb falowych 900-1200 cm

-1, CA miara odległości -

Manhattan, metoda aglomeracji: Warda). Z kolei analiza składowych głównych dla zmiennych z zakresu liczb falowych 400-1600 cm

-1 wyraź-

nie klasyfikuje próbki tych trzech preparatów do trzech odrębnych skupisk.

5.3 Porównanie wyników analiz chemometrycz-nych dla danych uzyskanych metodą wyso-kosprawnej chromatografii cieczowej oraz spektroskopii w zakresie podczerwieni

Zestawienie rezultatów przeprowadzonych ana-liz chemometrycznych (tabela 3) pozwala na dostrzeżenie występujących analogii.

Grupa preparatów oznaczona jako I (na podstawie danych FT-IR) jest połączeniem grup 1, 2 i 3 (wyznaczonych na podstawie danych HPLC). Odwrotna sytuacja ma miejsce przy analizie pozostałych trzech preparatów. Analiza chemometryczna przeprowadzona na podstawie macierzy danych uzyskanych przy pomocy HPLC zaklasyfikowała je do jednej grupy – 4, podczas gdy segregacja na podstawie danych - widm w podczerwieni wskazuje na pewne zróż-nicowanie tych preparatów (a,b,c). Przedsta-wione niezgodności mogą wynikać z faktu, iż wybór ośmiu pól powierzchni pików zanie-czyszczeń jako zmiennych ograniczył w pewien sposób zakres informacji, jakie niósł ze sobą cały profil zanieczyszczeń.

Istotne jest jednak, iż analiza przeprowadzona na podstawie danych uzyskanych za pomocą różnych metod profilowania zanieczyszczeń prowadzi do wyodrębnienia grup wzajemnie zazębiających się.

Profil zanieczyszczeń zależy m.in. od drogi syntezy substancji aktywnej, technologii nada-wania postaci leku oraz zachodzących procesów degradacji.

Preparaty: Ibuprom Duo oraz Ibuprom Max produkowane są przez tę samą firmę – US Pharmacia. Podobna sytuacja ma miejsce w kon-tekście preparatów: Ibuprofen Pabi oraz Ibupar Forte. Są one produkowane przez firmę Polfa Pabianice. Co ważne, produkty jednego wyt-wórcy w obu przypadkach klasyfikują się do różnych grup. Wytłumaczeniem tego zjawiska może być fakt, iż substancja czynna wyko-rzystywana w wyżej wymienionych zakładach nie pochodzi od jednego producenta. Każda z firm zaopatruje się przynajmniej u dwóch wytwórców API, a badane serie produktów za-wierają ibuprofen z różnych źródeł. Potwierdza to hipotezę, iż profil zanieczyszczeń środka leczniczego zależy od drogi syntezy substancji aktywnej.

Warto zaznaczyć, iż najbardziej ogólny po-dział (czyli na grupy po pięć i trzy preparaty) jest zgodny z klasyfikacją wynikającą z postaci leku. Grupa preparatów: Aprofen Forte, Ibalgin Maxi, Ibupar Forte, Ibuprom Duo oraz MIG (I lub 1-3) to zbiór składający się wyłącznie z tabletek powlekanych. Ibuprofen Aflofarm, Ibuprom Max oraz Ibuprofen Pabi (a,b,c lub 4) to preparaty ibuprofenu, którym nadana jest postać drażetki. Procedury powlekania oraz drażowania znacząco różnią się od siebie.



Substancja aktywna poddawana jest działaniu odmiennych czynników fizycznych oraz może wchodzić w interakcję z innymi związkami che-micznymi (charakterystycznymi dla danego

procesu technologicznego). Skutkuje to różnymi profilami zanieczyszczeń, które były podstawą przeprowadzonej analizy chemometrycznej.

Tabela 3. Zestawienie rezultatów analiz chemometrycznych przeprowadzonych na podstawie macierzy danych otrzymanych przy użyciu HPLC oraz FT-IR.

HPLC Nazwa preparatu FT-IR Nazwa preparatu

1

Ibalgin Maxi

I

Ibalgin Maxi

Ibupar Forte Ibupar Forte

Ibuprom Duo Ibuprom Duo

2 Aprofen Forte Aprofen Forte

3 MIG MIG

4

Ibuprofen Pabi

II A

a Ibuprofen Pabi

Ibuprofen Aflofarm b Ibuprofen Aflofarm

Ibuprom Max B c Ibuprom Max

6 MODELOWANIE METODĄ PLS

Modelowanie ma na celu przewidywanie zmien-nej lub zmiennych zależnych na podstawie dostępnych zmiennych objaśniających. W che-mii metody kalibracyjne są często wykorzys-tywane do przewidywania stężenia jednego lub wielu składników na podstawie badań, które są tańsze i/lub szybsze niż te użyte do opracowania i walidacji modelu. Do najczęściej stosowanych, obok regresji wielorakiej - MLS, regresji czyn-ników głównych – PCR, należy regresja częś-ciowych najmniejszych kwadratów – PLS.

Jeżeli dysponujemy dużą liczbą skorelowa-nych zmiennych (jak ma to miejsce w przypad-ku widm) najodpowiedniejsze techniki modelo-wania to te, których konstrukcja opiera się na kilku zmiennych ukrytych (PCR, PLS). Zaletą regresji częściowych najmniejszych kwadratów jest uwzględnianie, w fazie konstrukcji ukrytych zmiennych, korelacji pomiędzy predyktorami a zmiennymi przewidywanymi.

Spektroskopia w podczerwieni jest metodą cechującą się szeregiem zalet. Do najważniej-szych można zaliczyć: łatwość przygotowania próby - mogącej występować w postaci proszku, pasty lub płynu, możliwość analizy jakościowej i/lub ilościowej jednego lub kilku składników jednocześnie, bardzo krótki czas niezbędny do uzyskania wyników (umożliwia to regularne monitorowanie procesów technologicznych oraz niemal natychmiastową reakcję na ewentualne nieprawidłowości).

Powyższe atuty powodują, iż kombinacja metod spektroskopowych i chemometrycznych

staje się cenną alternatywą dla wysokosprawnej chromatografii cieczowej – techniki czaso- i kosztochłonnej (długi czas analizy, skompliko-wane przygotowanie próby, duża ilość wyko-rzystywanych odczynników) – miedzy innymi w przypadku oznaczania ilości zanieczyszczeń [1, 5, 7].

Do budowy modeli wykorzystano dane przy-gotowane na podstawie wcześniejszej analizy chemometrycznej. Zbiór przypadków podzielo-no na trzy grupy: zbiór uczący (na podstawie którego tworzono model), zbiór walidacyjny (służący do oceny krzyżowej), zbiór testowy (wykorzystywany do oszacowania dokładności opracowanego modelu).

6.1 Modele dla wszystkich preparatów

Prace rozpoczęto od budowy modeli opartych na wszystkich badanych przypadkach oraz na trzech różnych zakresach zmiennych objaśnia-jących – wartości absorbancji dla liczb falo-wych, analogicznie do zastosowanych przy analizie składowych głównych. Każdorazowo tworzono modele PLS-1 dla każdego zanie-czyszczenia i sumy zanieczyszczeń oraz jeden model PLS-2.

Właściwości predykcyjne powyższych modeli okazały się być dobre jedynie w przypadku sumy analizowanych składników (średni błąd 2-3%). Uzyskane modele nie pozwalają na-tomiast poprawnie oszacować zawartości poje-dynczych zanieczyszczeń. W skrajnych przy-padkach wartości błędów sięgają rzędu kilkuset procent.



Zła jakość modeli wynika najprawdopodob-niej z faktu, iż - jak wykazała analiza chemo-metryczna - badane preparaty ibuprofenu dzielą się na dwie grupy wyraźnie różniące się od siebie zawartością poszczególnych zanieczysz-czeń, a podział ten ma związek z postacią leku, w jakiej występuje środek leczniczy. W związku z powyższym następnym krokiem było opra-cowanie osobnych modeli dla preparatów - drażetek oraz tabletek powlekanych.

Ponieważ wśród badanych ośmiu środków leczniczych tylko trzy były preparatami drażo-wanymi, istniało ryzyko, iż modele dla tej właśnie postaci leku będą charakteryzowały się niesatysfakcjonującymi parametrami określają-cymi dopasowanie oraz niewielką mocą predyk-cyjną. Przeprowadzone analizy nie potwierdziły jednak tej obawy.

6.2 Modele dla drażetek

Budowę modeli dla preparatów drażowanych, analogicznie jak w przypadku konstrukcji mode-li uniwersalnych (niezależnych od postaci leku), przeprowadzono w oparciu o trzy zakresy zmiennych. Najlepsze rezultaty przyniosły ana-lizy PLS wykorzystujące jako zmienne objaś-niające wartości absorbancji dla liczb falowych z zakresu 900-1200 cm

-1. Tak jak w przypadku

modeli uniwersalnych opracowano oba typy modeli: PLS-1 oraz PLS-2.

Pierwszy etap każdej analizy polegał na wyz-naczeniu odpowiedniej liczby składowych na podstawie wartości parametru PRESS (Pre-dicted Residual Sum of Squares). Wiarygodność każdego modelu została zweryfikowana na podstawie oceny krzyżowej oraz z wykorzys-taniem zbioru testowego.

Prace rozpoczęto od budowy modelu kalibra-cyjnego dla sumy zanieczyszczeń. Na podstawie minimalnej wartości współczynnika PRESS wyznaczono liczbę istotnych składowych, która wynosiła 9. Na ich podstawie utworzono model kalibracyjny.

Komparacja odchyleń wartości przewidy-wanych od rzeczywistych dla zbioru uczącego, walidacyjnego i testowego została przedsta-wiona na rys. 10.

Bardzo niskie wartości odchyleń od wartości rzeczywistych potwierdzają dobrą jakość otrzy-manego modelu.

W analogiczny do opisanego sposób zbu-dowano modele kalibracyjne dla każdego z 8 zanieczyszczeń (PLS-1).

Model typu PLS-2 wyjaśnia wszystkie prog-nozowane zmienne jednocześnie. Wyraźne ko-rzyści z jego zastosowania są widoczne, jeżeli pomiędzy przewidywanymi zmiennymi wystę-pują silne korelacje.

Analiza skonstruowanego modelu PLS-2 zos-tała ograniczona do porównania jego mocy pre-dykcyjnej z wyżej omówionymi modelami PLS-1 (tabela 4).

Tabela 4. Średnie odchylenia od wartości rzeczywistej w % dla modeli PLS-1 (a) oraz PLS-2 (b) dla grup testowych.

SUMA A B C D E F G H

a 0,05 0,17 0,62 0,80 0,60 2,72 0,76 0,80 2,37

b 0,05 0,18 0,68 0,68 0,51 1,66 0,77 0,78 0,25

Jakość przewidywań przeprowadzonych z wykorzystaniem modelu PLS-2 nie odbiega od tych przeprowadzonych przy użyciu wielu modeli typu PLS-1. W przypadku niektórych zanieczyszczeń (np. C, D, E, H) moc predyk-cyjna modelu wypadkowego (PLS-2) jest nawet większa. Potwierdza to występowania silnych zależności między zawartościami zanieczysz-czeń w badanych preparatach ibuprofenu o pos-taci drażetek.

6.3 Modele dla tabletek powlekanych

Wykonano modele kalibracyjne dla zanieczysz-czeń tabletek powlekanych zawierających ibu-profen w trzech zakresach widm. Otrzymane przy ich użyciu predykcje cechowały się stosun-kowo wysokimi wartościami błędów. Ich przy-czyna leżała w tzw. obiektach odległych, które stanowiły próbki Aprofenu Forte.

Obiekty odległe mogą mieć pozytywny lub negatywny wpływ na model, a jego oceny moż-na dokonać jedynie doświadczalnie. Korzystny wpływ polega na poszerzeniu zakresu kalibra-cyjnego oraz stabilizacji modelu. Negatywny zaś na zmianie dopasowania do danych i pogor-szeniu zdolności predykcyjnych. Wykonanie modeli na grupie przypadków zawierających próbki Aprofenu Forte oraz bez nich jedno-znacznie wskazuje, iż są one złymi obiektami odległymi.

Przedstawione w dalszej części modele zbu-dowane są na zmiennych objaśniających



odpowiadających wartościom absorbancji dla liczb falowych z zakresu 900-1200 cm

-1. Obiek-

ty odstające zostały wyeliminowane (próbki Aprofenu Forte). Liczba istotnych zmiennych ukrytych została określona na podstawie war-tości współczynnika PRESS.

Opracowane modele kalibracyjne cechuje duża moc predykcyjna, czego dowodem są nie-wielkie wartości odchyleń od wartości rzeczy-

wistych oraz rozkład liniowy punktów na wykonanych wykresach rozrzutu.

Wyjątek stanowi model dla zanieczyszczenia C, a dokładniej jakość predykcji dla preparatu MIG. Błąd przywidywania wynosi niecałe 40%. Wynika to z faktu, iż produkt ten znacząco różni się, pod względem zawartości tego zanieczysz-czenia, od wszystkich ośmiu badanych prepara-

tów, co wykazała przeprowadzona analiza chemometryczna.

Wysoka jakość przewidywań, uzyskanych na podstawie modelu typu PLS-2 dla drażetek dowiodła wysokiej korelacji pomiędzy zawar-tościami zanieczyszczeń w badanych środkach leczniczych. Pozwoliło to przypuszczać, iż uogólniony model dla tabletek powlekanych również będzie charakteryzował się wysoką mocą predykcyjną. Założenie to okazało się słuszne, czego dowodem jest tabela 5.

Tabela 5. Średnie odchylenia od wartości rzeczywistej w % dla modeli PLS-1 (a) oraz PLS-2 (b) dla grup testowych.

SUMA A B C D E F G H

a 0,17 0,46 1,30 18,82 4,72 0,53 3,01 6,05 7,02

b 0,16 1,01 3,19 20,07 2,36 0,58 1,23 4,33 8,75

Tabela 6. Porównanie błędów dla modelu uniwersalnego oraz uwzględniającego postać leku.

PLS-1 PLS-2

model uniwersalny mod. uwzgl. postać

leku popr. pred. (krotność)

model uniwersalny mod. uwzgl. postać

leku popr. pred. (krotność)

SU

MA

1 0,87 0,009 100 0,05 0,01 5

2 2,32 0,09 26 2,98 0,09 33

3 2,76 0,15 18 2,31 0,21 11

4 2,01 0,18 11 2,97 0,10 30

A

1 0,29 0,08 4 1,93 0,05 39

2 3,09 0,30 10 4,96 0,31 16

3 3,04 0,21 14 3,27 0,19 17

4 1,32 0,70 2 4,52 0,82 6

B

1 8,28 0,72 12 1,88 0,15 13

2 14,16 0,52 27 11,73 1,21 10

3 8,68 0,91 10 7,03 1,43 5

4 5,30 1,68 3 7,43 1,76 4

C

1 2,31 1,11 2 6,85 0,22 31

2 6,09 0,49 12 8,27 1,14 7

3 8,10 0,28 29 1,16 0,11 11

4 3,16 37,35 0,08 27,27 40,03 0,68

D

1 10,41 0,14 74 11,11 0,03 370

2 5,48 1,00 5 4,64 0,99 5

3 192,84 7,49 26 198,98 0,45 442

4 22,49 1,94 12 28,88 4,27 7

E

1 384,19 3,99 96 507,04 0,72 704

2 60,14 1,45 41 43,61 2,60 17

3 6,19 0,48 13 0,50 0,49 1

4 2,08 0,58 4 3,18 0,67 5

F

1 5,35 0,34 16 4,66 0,15 31

2 4,17 1,18 4 4,11 1,39 3

3 8,83 5,31 2 8,41 0,10 84

4 2,73 0,70 4 4,23 2,35 2

G

1 5,40 0,42 13 2,62 0,19 14

2 12,11 1,18 10 14,77 1,38 11

3 122,67 7,42 17 120,61 4,47 27

4 2,30 4,67 0,49 10,62 4,18 3

H

1 2,84 2,17 1 6,93 0,36 19

2 7,05 2,56 3 9,56 0,14 68

3 6,35 2,53 3 9,39 1,90 5

4 6,36 11,50 0,55 3,01 15,59 0,19



Konstrukcja indywidualnych modeli dla pre-paratów ibuprofenu występujących w postaci drażetek oraz tabletek powlekanych znacząco poprawiła jakość przeprowadzanych predykcji (tabela 6). Na ich podstawie można przewidzieć, z bardzo dużą dokładnością, zawartość każdego z zanieczyszczeń (wyjątek – zanieczyszczenie C w preparacie MIG). Niemniej jednak nawet uniwersalny model kalibracyjny umożliwia oszacowanie zawartości sumy zanieczyszczeń z bardzo małym błędem.

7 WNIOSKI

Opracowana metoda chromatograficzna umożliwia rozdzielenie zanieczyszczeń pre-paratów ibuprofenu, a przez to uzyskanie profili zanieczyszczeń o dobrej jakości.

Zastosowanie wielowymiarowych technik eksploracji danych umożliwia ekstrakcję z zarejestrowanych chromatogramów oraz widm istotnej (chemicznie i farmaceutycz-nie) informacji o badanych produktach leczniczych.

Zasadnym jest przygotowywanie pastylki do rejestracji tła (metoda FT-IR) z wykorzysta-niem matrycy umożliwiającej eliminację wpływu substancji nierozpuszczalnych w acetonitrylu. Potwierdza to uzyskanie wy-sokiej korelacji pomiędzy wynikami analizy chemometrycznej danych otrzymanych z wy-korzystaniem obu technik pomiarowych (HPLC i FT-IR).

Z przeprowadzonych analiz wynika, iż naj-większy wpływ na profil zanieczyszczeń, środków leczniczych zawierających ibupro-fen jako substancję czynną ma proces tech-nologiczny służący wytworzeniu odpowied-niej postaci leku. Świadczy o tym wyraźny podział badanych preparatów na dwa sku-piska (tabletki powlekane oraz drażetki), nie-zależnie od metody otrzymania danych oraz zastosowanej techniki chemometrycznej.

Podział preparatów w obrębie wyżej wymie-nionych grup na mniejsze podzbiory może sugerować, iż profil zanieczyszczeń zależy również od drogi syntezy substancji czynnej.

Opracowane modele kalibracyjne PLS oparte na widmach FT-IR przynoszą bardzo dobre rezultaty w predykcji zawartości zanieczysz-czeń w preparatach ibuprofenu; mogą zatem

stanowić cenną alternatywę dla chromato-graficznego oznaczania zanieczyszczeń.

BIBLIOGRAFIA

1) Ammawath W, Che Man Y. (2010) A rapid method for determination of commercial β-carotene in RBD palm olein by Fourier transform infrared spectroscopy. Asian Journal of Food and Agro-Industry 2010; 3(04), 443-452.

2) Chandorkar J, Kotwal V, Dhande N, Gurav S, Pande V, Yadav P. (2008) A sensitive HPLC method for simulta-neous estimation of tamsulosin hydrochloride and its impurities. Pak J Pharm Sci 2008; 21(3), 307-310.

3) Gorog S. (2003) New safe medicines faster: the role of analytical chemistry. Trends in Analytical Chemistry 2003; 22, 407-415.

4) Kalafut P, Kucera R, Klimes J, Sochor J. (2009) An innovate approach to the analysis of 3-[4-(2-methylpro-pyl)phenyl]propanoic acid as an impurity of ibuprofen on a carbon-coated zirconia stationary phase. J Pharm Bio-med Anal 2009; 49, 1150-1156.

5) Leitermann F, Syldatk C, Hausmann R. (2008) Fast quan-titive determination of microbal rhamnolipids from culti-vation boths by ATR-FTIR spectroscopy. Journal of Bio-logical Engineering 2008; 2(13).

6) Lin M, Li M, Rustum A. (2007) Identification of an unknown extraneous contaminant in pharmaceutical pro-duct analysis. J Pharm Biomed Anal 2007; 45, 747-755.

7) Rios-Corripio M, Rios-Leal E, Mojas-Lopez M, Delgado-Macuil R. (2011) FTIR characterization of Mexican honey and its adulteration with sugar syrups by using chemo-metrics methods. Journal of Physics: Conference Series 2011; 274.

8) Sathyaraj A, Satyanarayana V, Basaveswara R. (2011) Gradient RP-HPLC method for the determination of Purity and Assay of Raloxifenehydrochloride in Bulk Drug. Research Journal of Chemical Sciences 2011; 1(2), 9-16.

Analiza zanieczyszczeń preparatów zawierających ibuprofen z … · 2014-03-27 · cyjne w...

Documents

Transcript of Analiza zanieczyszczeń preparatów zawierających ibuprofen z … · 2014-03-27 · cyjne w...