Focus&

>>> 10 July-August 2016, Vol.43 No.247

ความผดปกตแตกำาเนด

ปจจบนมยนกวา 25,000 ยนทถกคนพบในจโนมของมนษย ในจ�านวนนมมากกวา 3,000 ยนทเกยวของกบการเกดโรค ปจจยทท�าใหการวจยทมงศกษาพนธกรรมของโรคตาง ๆ ในมนษยไดรบความสนใจมากขน ไดแก มขอมลล�าดบดเอนเอจากโครงการจโนมมนษย (human genome project) จ�านวนมาก ตนทนในการหาล�าดบเบสในดเอนเอลดลงอยางมาก และขอมลล�าดบเบสทเกยวของกบโรคตาง ๆ ในมนษยมมากขน การศกษากลไกการท�างานของยนกบการเกดโรคจะน�าไปสแนวทางในการรกษา โดยแนวทางหนงทก�าลงเปนทสนใจ คอ การเปลยนล�าดบเบส หรอการปรบแตงจโนมในเซลลหรอเนอเยอทเกดโรค โดยเฉพาะโรคทเกดจากยนเดยว (monogenic disease) เชน โรคภมค มกนบกพรองชนด Severe Combined Immonodefficiency: SCID โรคฮโมฟเลย (hemophilia เลอดออกงายแตหยดยาก) เปนตน

ดร.สชาต อดมโสภกจ

สำ�นกง�นคณะกรรมก�รนโยบ�ยวทย�ศ�สตร

เทคโนโลยและนวตกรรมแหงช�ต (สวทน.)

เพอการบ�าบดรกษาการปรบแตงจโนม (Genome Editing)

เทคโนโลยการปรบแตงจโนมเปนเทคโนโลยในการเปลยน รหสพนธกรรมทต�าแหนงจ�าเพาะของสงมชวตใหคงอยอยางถาวร ดวยการท�าใหดเอนเอสายค ณ จดทมล�าดบเบสเปาหมายแยกออกจากกน เรยกวา Double-Stranded Brake: DSB โดยใชเอนไซม Endonuclease โดยทวไปหากปรากฏการณ DSB เกดขนตามธรรมชาตและปลอยทงไวจะเปนอนตรายตอสงมชวต จงมกลไกในการซอมแซม DSB เชน

➲ Homologous Recombination-Directed Repair หรอ Homology-Directed Repair: HDR ซงน�าเอาชนสวนดเอนเอทปกตสอดแทรกเขาไปทดแทนในบรเวณเปาหมายของจโนม

➲ Non-Homologous End Joining: NHEJ เปนการท�าใหสวนของดเอนเอทผดปกตหลดออกไป แลวเชอมปลายโครโมโซมทง 2 ขางทเหลออยเขาหากน ท�าใหยนทผดปกตไมสามารถแสดงออกไดอกตอไป (เรยกวา gene knockout)

เทคโนโลยการปรบแตงจโนมทไดรบการพฒนาในปจจบนสวนใหญใชเอนไซมทเรยกวา Programmable Nuclease ซงม หลายชนด เชน Meganuclease, Zinc Finger Nuclease, TALEN, CRISPR เปนตน

Focus&

July-August 2016, Vol.43 No.247 11 <<<

อยางไรกตาม นกวทยาศาสตรบางกลมมองวาเทคโนโลยนอาจสามารถน�าไปใชรกษาโรคทเกดจากไวรสไดดวย เชน HIV (ไวรสท�าใหเกดโรคเอดส) Human Papilloma Virus: HPV ไวรสท�าใหเกดโรคหด ไวรสตบอกเสบชนดบ (hepatitis B virus) เปนตน

รจกผพทกษเซลลกนกอน

Clustered Regulatory-Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR - อานวา “ครสเพอร”) เปนสวนหนงของดเอนเอซงมล�าดบเบสซ�า ๆ พบไดในสงมชวตชนต�าจ�าพวกแบคทเรย ท�าหนาทคลายภมค มกนแกเซลลในการก�าจดดเอนเอแปลกปลอม โดยมบทบาทในการจดจ�าล�าดบเบสของดเอนเอแปลกปลอมอยางจ�าเพาะ

นอกจากนยงมยนทเกยวของอยางใกลชดกบ CRISPR เรยกวายน CRISPR-associated (cas) ซงสรางเอนไซม Nuclease, Helicase หรอ RNAse ทสามารถตดสายดเอนเอ หรออารเอนเอ จากกน และท�าใหเกลยวคของดเอนเอคลายออกจากกน

CRISPR และเอนไซมจากยน cas ท�างานรวมกนอยางเปนระบบในการท�าลายดเอนเอแปลกปลอม

ยน cas9 เปนยนในกลม Type-II CRISPR-Cas system (เรยกวา CRISPR/Cas9) ซงสรางเอนไซม Nuclease ทมขนาดใหญ สามารถท�าหนาทไดหลายอยางจนกระบวนการท�าลายดเอนเอ แปลกปลอมเสรจสมบรณ

CRISPR/Cas9 ตดดเอนเอดวยคว�มชวยเหลอของอ�รเอนเอนำ�ท�ง (ทมา: Callaway (2016))

เรองหม ๆ ท ไมหม

มความพยายามปลกถายอวยวะของสกรใหแกมนษยมานานแลว โดยประสบความส�าเรจในระดบหนง อยางไรกตาม เซลลของสกรมกมไวรสฝงชนดหนงตวอย เรยกวา Porcine Endogenous Retrovi-ruses: PERVs โดยดเอนเอของไวรสดงกลาวถกผนวกเปนสวนหนง

ของดเอนเอของสกร หากปลกถายอวยวะของสกรใหแกผปวย อาจท�าใหดเอนเอของไวรสดงกลาวรบกวนการท�างานของยนส�าคญของ ผปวย ซงอาจกอใหเกดโรคหรอมะเรง

จากคณสมบตดงกลาวขางตนของ CRISPR/Cas9 จงมแนวคดในการน�ามาประยกตใชเพอปรบแตงยนในสกรส�าหรบน�าอวยวะมาปลกถายในมนษย ผลการศกษาโดย Yang คณะในป 2015 พบวา การใช CRISPR/Cas9 เพอก�าจดดเอนเอของไวรสไดผลประมาณรอยละ 37 ซงตองท�าการศกษาตอไปเพอเพมประสทธภาพ

การทดลองทตนตาตนใจ

เดอนพฤศจกายน ค.ศ. 2013 ลงแสมฝาแฝดตวเมย ชอ หมงหมง และหลงหลง ไดถอก�าเนดขนทสถาบนวจยดานชวการแพทยในเมองคนหมง มณฑลยนนาน สาธารณรฐประชาชนจน เปนการถอก�าเนดแบบไมธรรมดา เนองจากกอนหนานนนกวทยาศาสตรไดทดลองใช CRISPR/Cas9 ไปการปรบเปลยนพนธกรรมของไขทผานการปฏสนธแลว โดยท�าการแกไขยนจ�านวน 3 ยน แลวฝงไขดงกลาวในแมลง ผลปรากฏวาลงฝาแฝดเกดมาโดยมสขภาพด การทดลองนจงเปนครงแรกท CRISPR ถกน�ามาใชเพอการปรบเปลยนพนธกรรมแบบก�าหนดเปาหมายทชดเจน อาจถอเปนจดเรมตนของยคใหมดานชวการแพทยในอนทจะรกษาโรคทมความซบซอน

ยนในจโนมของลงแสมฝ�แฝดคนถกปรบแตงไปถง 3 ยน (ทมา: http://www.technologyreview.com/featuredstory/526511/genome-editing/)

CRISPR ได รบการพฒนาโดยนกวจยทมหาวทยาลยแคลฟอรเนย เบรกลย ฮาวารด เอมไอท และทอน ๆ เปนเครองมอทเชอกนวาจะชวยใหนกวทยาศาสตรท�าการ “ศลยกรรมจโนม” ได คอนขางแมนย�าและงายดาย เปาหมายของการทดลองทคนหมง จงเปนการยนยนวาเทคโนโลยดงกลาวสามารถสรางลงทมการ กลายพนธหลายต�าแหนงในจโนมไดชดแจง

Focus&

>>> 12 July-August 2016, Vol.43 No.247

ปรบแตงจโนมตงแตหลงปฏสนธ

เดอนพฤษภาคมป ทแล ว เป นคร งแรกของโลกทนกวทยาศาสตรจนไดรายงานความส�าเรจของการปรบแตงจโนมของ ตวออนมนษย

คณะผวจยของมหาวทยาลยซนยดเซน ในเมองกวางโจว ซงน�าโดย Junjiu Huang เลอกน�าตวออนทจะไมสามารถเกดมาเปน สงมชวต (non-viable embryo) มาทดสอบ โดยไดตวออนจาก คลนกแหงหนงในทองถน คณะผวจยไดตดยนของโปรตนทมชอวา เบตาโกลบน (β-globin gene) ทผดปกต ซงเกยวของกบโรคโลหตจางเบตาธาลสซเมย (β-thalassemia) ออกจากจโนมโดยใชเอนไซม CRISPR/Cas9 ซงไดผลตามทคาดหวง แตประสทธภาพของการซอมแซมโดยเทคนค HDR ยงอยในระดบต�า คณะผวจยชแจงวา ผลการทดลองของพวกเขาแสดงใหเหนถงอปสรรคทส�าคญในการใชวธดงกลาวในทางการแพทย

“ผมเชอวานเปนรายงานแรกทแสดงการใช CRISPR/Cas9 กบตวออนของมนษยกอนการฝงในมดลก (pre-implantation em-bryo) การศกษานเปนหลกหมดส�าคญพอ ๆ กบเปนการเตอนไปในตว” George Daley นกชววทยาเซลลตนก�าเนดท Harvard Medical School ในบอสตนกลาว “การศกษาของพวกเขาเปนการเตอนอยางชดเจนไปยงผทคดวาเทคโนโลยนมความพรอมส�าหรบการทดสอบในการก�าจดยนทเปนสาเหตของโรค”

ความหวงกบความกงวล

บางคนเหนวาการแกไขยนในตวออนมอนาคตทสดใส เพราะเชอวาจะชวยก�าจดโรคทางพนธกรรมกอนทารกจะถอก�าเนด ในขณะทบางคนมองวางานวจยดงกลาวขามเสนจรยธรรม นกวจยบางคนเตอนวาการเปลยนแปลงพนธกรรมของตวออนเปนการปรบ-เปลยนระดบเซลลสบพนธ จงอาจเปนมรดกตกทอดทสามารถสงตอไปยงสงมชวตรนตอ ๆ ไปได และหากน�าเทคโนโลยนมาใชกบมนษย เราไมสามารถคาดเดาผลกระทบทจะเกดขนกบมนษยรนตอไปในอนาคต

Focus&

July-August 2016, Vol.43 No.247 13 <<<

อนทจรงเทคนคการฉดตวออนดวยเอนไซม CRISPR/Cas9 นถกน�ามาศกษากบเซลลของผใหญและตวออนของสตวแลว แตยง ไมเคยมรายงานการใชงานในตวออนมนษยเชนนมากอน

Huang และคณะตงใจใชเทคนคนเพอ “จดการ” ยนท เปนปญหาอยางจ�าเพาะเจาะจง โดยพวกเขาเลอกใชตวออนทถก สรางขนเพอใชในการปฏสนธในหลอดทดลอง (in vitro fertilization) แตตวออนนมโครโมโซมเพมขนมาอก 1 ชด (ปกตเซลลของคนมโครโมโซม 2 ชด) เพอปองกนไมใหตวออนดงกลาวเตบโตเปนตวเปนตนได แมจะเตบโตไปจนถงขนตอนแรกของการเจรญเตบโต (first stage development) ไดกตาม

คณะผวจยไมไดท�าการทดลองกบเซลลตวออนเพยงเซลลเดยว แตใชเซลลตวออนถง 86 เซลล โดยฉด CRISPR/Cas9 ใหแตละเซลล แลวรอเปนเวลา 48 ชวโมง ซงมากพอส�าหรบกระบวนการซอมแซมดเอนเอ ณ ยนเบตาโกลบน ผลปรากฏวามตวออน 71 เซลลทรอดชวต ในจ�านวนนม 54 เซลลทถกน�ามาทดสอบพนธกรรม และแสดงใหเหนวามเพยง 28 เซลลเทานนทยนเบตาโกลบนถกก�าจดออกไป นอกจากนมเพยงบางสวนนนทมการทดแทนดวยดเอนเอปกต

“ถาคณตองการทจะใชเทคนคนในตวออนปกต คณจะตองมนใจวามนไดผลเกอบ 100%” Huang กลาว “นนเปนเหตผลทเราหยดไวแคน เราคดวายงไมถงเวลา”

เดมรายงานนถกปฏเสธจากวารสาร Science และ Nature สวนหนงเพราะมการคดคานดานจรยธรรม ซง Huang ยอมรบ ค�าวจารณ แตเขาเสรมวา ขอวจารณทตงขอสงเกตวาการทดลอง มประสทธภาพต�าและมอตราการกลายพนธสงนน อาจเปนเพราะ ตวออนทใชในการศกษาเปนตวออนทผดปกต และเขาเลอกใช

ตวออนชนดนเพราะมความคลายคลงกบตวออนมนษยปกตมากกวาตวออนของสตวหรอเซลลของมนษยทเปนผใหญ

“เราตองการทจะแสดงขอมลของเราทเกดขนจรงกบตวออนทเราใช มากกวาเพยงการพดคยเกยวกบสงทจะเกดขนโดยไมมขอมลใด ๆ มารองรบ” เขากลาว

อยางไรกตาม Huang วางแผนทจะหาทางลดอตราการ กลายพนธ โดยทดลองในเซลลของมนษยทเปนผใหญหรอตวออน ของสตว รวมกบการใชเทคนคอน ๆ ทตางจากเดม เชน เทคนคท เรยกวา TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) ซงเปนททราบกนดวาท�าใหเกดการกลายพนธทไมไดตงใจนอยกวา

Focus&

>>> 14 July-August 2016, Vol.43 No.247

คำาถามและคำาตอบ

แมการปรบแตงจโนม จะไดรบความสนใจมากขนเรอย ๆ แตยงคงมค�าถามบางประการทหลายคนยงของใจ ตอไปนคอค�าถามและ ค�าตอบส�าคญ ๆ ทควรร

คำ�ถ�ม สำ�คญอย�งไร เร�รอะไร ขนตอนตอไปคออะไร

1. เราจะลดผลกระทบทเกดกบยน ทมใชเปาหมายไดแคไหน

การปรบแตงจโนมอาจท�าใหเกดความเปลยนแปลงทยนซงไมใชเปาหมาย การใชเทคนคนในหองปฏบตการจงนากงวล และการใชเพอการรกษายงนากงวลกวา

การปรบแตงจโนมดวยเทคนค TALENs มความผดพลาดนอยกวาเทคนค ZFNs และ CRISPR/Cas9

สามารถเพมความจ�าเพาะเจาะจงของ CRISPR/Cas9 ดวยการปรบล�าดบเบสบนสายอารเอนเอน�าทาง (guide RNA) และโครงสรางของ CRISPR

2. การปรบแตงจโนมเหมาะกบการรกษาโรคประเภทใด

ยงเทคนคปรบแตงจโนมใชกบการรกษาโรคไดมากเพยงใด จะชวยใหผปวยไมตองทนทกขทรมานจากโรคเหลานนไดมากขนเปนเงาตามตว

มรายงานความส�าเรจในการใชเทคนคปรบแตงจโนมกบการรกษาผตดเชอ HIV จงมความหวงวาจะใชในการรกษาโรคทไมไดเกดจากพนธกรรมไดดวย

นกวจยตองพยายามหาวธทมประ-สทธภาพในการจดการกบเซลลทมยนเปาหมาย โดยทวไปใช Adenovirus เปนพาหะในการเชาถงเซลล แต CRISPR/Cas9 ทใชในปจจบนมขนาดใหญเกนไป

3. สามารถคาดการณผลกระทบจากการใชเทคนคปรบแตงจโนมไดหรอไม

นกวจยตองสามารถก�าหนดผลทจะเกดขนกบเซลลจากการเปลยนแปลงดเอนเอแมเพยงเลกนอยได

มยาหลายรายการท ใช ร กษาโรค ลมบาหม (epilepsy) หรอมะเรง ดวยการเปลยนโครงสรางทางเคมของ ดเอนเอ แตไมไดเปลยนล�าดบเบส โดยยงไมทราบกลไกทแนชด

นกวจยพยายามปรบปรงเครองมอทใชในการปรบแตงจโนมเพอใหมความแมนย�ามากทสด โดยหวงวาจะท�าใหการแสดงออกของยนเปนไปตามทคาดหวง

4. เราควรจะปรบแตงจโนมของเซลลตวออนมนษยหรอไม

การปรบแตงพนธกรรมอาจชวยปองกนไมใหมการถายทอดโรคไปยงคนรน ตอไปได แตเปนการเปลยนแบบถาวรโดยทเรายงไมทราบกลไกการแสดงของยนอยางแทจรง นอกจากนอาจมคนน�าไปใชในทางทผด

การทดสอบการปรบแตงจโนมในเซลลตวออนของมนษยแบบ Non-Viable Cell เปนการทดสอบวาแนวคดมความเปนไปได โดยยงมอตราความลมเหลวสง หากการปรบแตงในเซลลตวออนแบบ Viable Cell ประสบความส�าเรจ การน�าไปฝงไวในมดลกเปนเรองทจะเกดขนในเวลาอนใกล

นกวทยาศาสตรตองท�างานอยาง ใกลชดกบรฐบาล และตองเปดโอกาสใหสาธารณะแสดงความเหนในการจดท�าแนวปฏบต (guidelines) ในการก�ากบดแลการวจยและการทดสอบทางคลนก และตองบงคบใชอยางจรงจง

เอกสารอางอง

1. http://www.technologyreview.com/featuredstory/526511/

genome-editing/

2. Callaway E. (2016) For the first time, scientists win approval

to edit human embryo genomes. Sci Am. (http://www.scientificamerican.

com/article/biologists-create-more-precise-molecular-scissors-for-ge-

nome-editing/, February 1, 2016)

3. Yang L, et al. (2015) Genome-wide inactivation of porcine

endogenous retroviruses (PERVs). Science, published online October 11,

2015.

4. Liang P, et al. (2015) CRISPR/Cas9-mediated gene editing

in human tripronuclear zygotes. Protein & Cell, 6(5): 363-372.

5. Cox DBT, et al. (2015) Therapeutic genome editing: pros-

pects and challenges. Nat. Medicine 21(2): 121-131.

6. Saey TH et al. (2015) Editing human germline cells sparks

ethics debate. Science News. 187: 16

7. Cyranoski D & Reardon S. (2015) Chinese scientists ge-

netically modify human embryos. Nature doi:10.1038/nature.2015.17378