2019-01-25

1

PODSTAWY

• Populacja• Próba• Zmienne ilościowe- ciągłe (poziom cholesterolu)- dyskretne (l. bakterii)• Zmienne jakościowe- nominalne (płeć)- porządkowe/rangi/ (zaawansowanie choroby)

PODSTAWY

Zmienne• Zależne

(niekontrolowane przez eksperymentatora- genotyp- wada;- zawartość tłuszczu- zawartość białka w mleku• Niezależne(kontrolowane przez eksperymentatora)- czynniki wprowadzane podczas eksperymentu(temperatura, pokarm itp.)

ZMIENNOŚĆ• osobnicza• środowiska, w którym bytują osobniki• pomiędzy badanymi ośrodkami• pomiaru• oceny stanu chorobowego• odpowiedzi immunologicznej• czynnika

Zmienność powoduje, że to co odnotowujemy może byćzłudne i może zabraknąć nam prawdziwych wzorców.

Zmienność powoduje, że nasze wnioski zawsze będąniepewne.

Zmienność powoduje, że będziemy mieć do czynieniaz niepewnością.

2019-01-25

2

TYPY BADAŃ

Randomizacja- losowy rozdział badanych obiektów do grup porównawczych

TYPY BADAŃ• Przekrojowe- oszacowanie rozpowszechnienia; testydiagnostyczne• Powtarzane przekrojowe- zmiany w czasie• Kohortowe- etiologia, prognoza• Przypadek- kontrola- etiologia- wpływ czynników• Eksperyment- badania kliniczne; miara skuteczności szczepionkiitp.

Metoda obserwacyjna

• jedna z najstarszych metod badawczych• do końca XIX wieku była główną metodą

badawczą nauk przyrodniczych• posiada cykliczny charakter (fakty

kończące jeden cykl rozpoczynająnastępny)

• musi być obiektywna

2019-01-25

3

Obserwacja zjawisk staje się metodąbadawczą w momencie, gdy:

- obserwacje organizuje się świadomie icelowo,

- uzyskane informacje gromadzi iinterpretuje jako zjawiska oddziałujące naelementyi procesy danego systemu,

- wnioski utrwala w publikacjach

Metoda obserwacyjna

Metoda eksperymentalna• polega na celowym wprowadzeniu do

procesu poznania czynnikaeksperymentalnego (zmienna niezależna)

• należy wyodrębnić badane zjawisko odniekontrolowanych czynników ubocznych– stworzenie układu wyizolowanego

• stosowana przy badaniu zjawiskpowtarzających się w warunkachprzynajmniej częściowo takich samych

Eksperymenty naukowe:• eksperymenty naturalne (obserwacja

procesu w warunkach rzeczywistych)• eksperymenty laboratoryjne (w warunkach

sztucznych- swobodne manipulowaniezmiennymi biorącymi udział w badaniu)

Metoda eksperymentalna

2019-01-25

4

Metoda badania dokumentów• dokumenty opracowywane i

przechowywane przez firmy czy instytucjedotyczą przeważnie szeroko pojętegosystemu organizacyjno-sprawozdawczego; obejmują zakreszadań, organizację, strukturę, efektyfinansowe, realizację i sprawozdawczość zdziałalności

• odzwierciedlają rzeczywistą działalność iosiągnięcia danej jednostki

• dokument badany - każdy przedmiotmaterialny (w formie dokumentu) zawierającymyśli, wizje, osiągnięcia, propozycje i służącydo odtworzenia rzeczywistej działalności lubstanu badanej struktury

• cenne źródło dotarcia do przyczyn, skutków iwarunków leżących u podstaw zachowańludzkich

• zaleta: możliwość analizy porównawczej

Metoda badania dokumentów

Metoda indywidualnychprzypadków

• analiza konkretnych, wyodrębnionychzdarzeń, zjawisk i osób

• pomocne techniki: wywiad, badaniedokumentów oraz badania środowiskowe

2019-01-25

5

BŁĘDY

BŁĘDY

BŁĘDY• systematyczny obserwatora błąd systematyczny związany z odmiennym traktowaniem

pacjentów (performance bias) błąd systematyczny z diagnozowania, wypaczenie

diagnostyki (detection bias) ; systematyczna różnicapomiedzy grupami w sposobie oceny punktów końcowych

• systematyczny uwikłania(błąd dopasowania czynników wpływających na wystąpienie ryzyka lubbędących wynikiem wystąpienia choroby)

• systematyczny doboru (selection bias)(brak losowości i/lub reprezentatywności próby)

• systematyczny informacyjny(najczęściej błąd pomiaru)

• błąd systematyczny związany z wybiórczym raportowaniemwyników (outcome reporting bias)(publikacja tylko wyników pozytywnych lub odnoszących się do jednejwybranej grupy)

2019-01-25

6

OCENA WIARYGODNOŚCIANALITYCZNYCH BADAŃ

OBSERWACYJNYCH• Czy nie popełniono błędu systematycznego?:• Czy badane grupy były podobne pod względem wszystkich

znanych czynników determinujących stan zdrowia opróczbadanego czynnika?

• Czy w analizie wyników wprowadzono poprawkę nanierównowagę znanych czynników zakłócających?

• Czy ekspozycję i punkty końcowe oceniano w sposóbobiektywny i tak samo w obu grupach?

• Czy badany stan kliniczny oceniano u wszystkich pacjentów,których obserwację rozpoczęto?

• Czy wyniki badania spełniają kryteria wnioskowaniaprzyczynowo skutkowego?

ISTOTNOŚĆ STATYSTYCZNA AISTOTNOŚĆ KLINICZNA

• Analiza w podgrupach, aby dawała wiarygodnewyniki musi spełniać następujące warunki:

-Podział na podgrupy jest sensowny z biologicznegopunktu widzenia np. ♀ vs ♂, lub różne podgrupywiekowe- Analizę zaplanowano przed rozpoczęciem badania- Różnica jest istotna i klinicznie i statystycznie- Różnicę taką zaobserwowano również w innychpodobnych badaniach klinicznych

18

Diagnostyka molekularna w medycynie

Testy prenatalne

Nosicielstwo chorób

Wykrywanie chorób

Dobieranie leków

Monitoring populacji

“Czy naszedziecko jestzdrowe?“

“Na jakiechorobynarażony jestpacjent?

“Czy pacjentjest chory?”

“Jakiego typuleki będąnajlepsze?”

“Jaki zasięg machoroba wpopulacji?”

2019-01-25

7

Diagnostyka molekularna wczoraj i dziś

• P: hodowle patogenów- wady: dużo materiału, długie terminy, kosztowne

i specyficzne podłoża- zalety: przy specyficznym podłożu specyficzna

diagnoza• T: testy bezpośrednie- wady: kosztowne wdrożenie- zalety: duża specyficzność (?), automatyzacja,

mało materiału, łatwe w wykonaniu (na ogół)

MARKERY RAPD

RAPD PCR(Random Amplification of Polymorphic DNA)

• wykorzystywany gdy nie znamy sekwencji starterów;• pozwala namnożyć losowe fragmenty o różnej długości;• w reakcji stosuje się tylko jeden (losowy) starter.

długość około 10 nukleotydów,

zawartość par G/C musi być w granicach 50-80%

nie może zawierać sekwencji palindromowych*

5’ CAATCGCCGT 3’

RAPD PCRhttp://www2.uni-jena.de/biologie/mikrobio/tipps/rapd.html

Tube A-08 5'-GTGACGTAGG-3'

Tube A-09 5'-GGGTAACGCC-3'

Tube A-10 5'-GTGATCGCAG-3'

Tube A-11 5'-CAATCGCCGT-3'

Tube A-12 5'-TCGGCGATAG-3'

Tube A-13 5'-CAGCACCCAC-3'

Tube A-14 5'-TCTGTGCTGG-3'

Tube A-15 5'-TTCCGAACCC-3'

Tube A-16 5'-AGCCAGCGAA-3'

Tube A-17 5'-GACCGCTTGT-3'

Tube A-18 5'-AGGTGACCGT-3'

2019-01-25

8

RAPD PCR

PCR-RFLP

ATAT

GCGC

ATGC

genotyp

-/- +/+ -/+

Produkty PCR

Trawienie specyficzną endonukleazą

-/- +/+ -/+

PCR-RFLP• zastosowanie: diagnostyka

• wykrywanie: mutacje punktowe, insercje i delecje powodujące

zmiany struktury drugorzędowej

• wymagania: sekwencja musi być znana* odpowiednie dobranie enzymu restrykcyjnego,

rozpoznającego miejsce mutacji dowolna długość produktu PCR

• czułość metody: wykrywanie mutacji 100%

2019-01-25

9

PCR – RFLP

SSCP

polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA-Single Strand Conformation Polymorphism

wykorzystuje zmienną ruchliwość elktroforetycznądrugorzędowej struktury DNA

konformery: niestabilne fragmenty jednoniciowego DNA,szybko ulegające renaturacji

aby zachować różnice w migracji konformerów elektroforezapowinna być prowadzona w warunkach natywnych

ATAT

GCGC

ATGC

genotyp

-/- +/+ -/+

Produkty PCR

Denaturacja 90oC; 5min

-/- +/+ -/+

PCR-SSCP

2019-01-25

10

SSCP• zastosowanie: wstępna analiza polimorfizmu badania przesiewowe

• wykrywanie: mutacje punktowe, insercje i delecje powodujące

zmiany struktury drugorzędowej

• wymagania: sekwencja nie musi być znana długość produktu PCR nie dłuższa niż 300pz temperatura rozdziału elektroforetycznego10-20oC dobranie odpowiednich parametrów żelu

• czułość metody: wykrywanie mutacji 80%

różne układy konformerów

A B C D

różne układy konformerów

AB A B

• VNTR (ang. Variable Number of Tandem Repeats) – sekwencjeo zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń.

STR (ang. Short Tandem Repeats) - krótkie tandemowepowtórzeniaSSR (ang. Simple Sequence Repeats) - proste sekwencje

powtarzalneznajdują się w części niekodującej (w intronach)sekwencje mikrosatelitarne charakteryzują się krótkimi

(1-6pz) powtarzanymi motywamimotyw powtarzany jest do 30 razyCała sekwencja tworzy kompleks kilkuset par zasad

DNA MIKROSATELITARNY

2019-01-25

11

JAK WYGLĄDAMIKROSATELITA?

długość powtarzanego motywusekwencje jednonukleotydowe 5’…AAAAAAAAAAAAAAAA…3’ (A)nsekwencje dwunukleotydowe 5’…ACACACACACACACAC…3’ (AC)n

struktura powtarzanego motywusekwencje proste/zupełne 5’…ACACACACACACACAC…3’ (AC)nsekwencje proste przerwane 5’…ACACACCTTACACAC…3’ (AC)nCTT(AC)nsekwencje złożone 5’…ACACACACGTGTGTGT…3’ (AC)n(GT)nsekwencje złożone przerywane 5’…ACACACCTTGTGTGT…3’ (AC)nCTT(GT)n

(AC)3

(AC)5

(AC)20(AC)20 (AC)23(AC)23 (AC)18(AC)25

2019-01-25

12

(AC)20 (AC)20 (AC)24 (AC)24

(AC)20 (AC)24 (AC)20 (AC)24

(AC)20 (AC)24 (AC)20 (AC)24(AC)20 (AC)20 (AC)24 (AC)24

35

PANEL SEKWENCJIMIKROSATELITARNYCH

allel zerowy (ang. null allele) jest zmutowaną kopią genu,która całkowicie utraciła swoje funkcje. Rezultatem utraty funkcji jestcałkowity brak białka (RNA), albo wytworzenie produktuniefunkcjonalnego. Efekt fenotypowy jest identycznyz wystąpieniem delecji.

W przypadku neutralnych markerów molekularnych, allele zerowestanowią niewykrywalne diagnostycznie formy. Wystąpienie mutacji wrejonie wiązania starterów uniemożliwia ich amplifikację

W analizie zmienności genetycznej, istnienie alleli zerowych objawia sięnieproporcjonalnym stosunkiem homo- do heterozygot

2019-01-25

13

UNIKALNY PROFIL GENETYCZNY- KAŻDY OSOBNIK MA SWÓJ „KOD PASKOWY”PODOBNY W POŁOWIE DO KAŻDEGO Z RODZICÓW.

Populacja: zmienność genetyczna- migracje

Jeden gen w dwóch kopiach Jeden gen w dwóch kopiach

179 179 177177

177179

Pula genetyczna osobnika

Każdy z trzech osobnikówposiada identyczne geny(osobniki są w 100%identyczne)

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 2 3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

1 2 3

Każdy z trzech osobnikówposiada te same geny leczw różnych proporcjach(osobniki są do siebiepodobne)

2019-01-25

14

Mutacje dynamiczne-choroba Huntingtona

(CAG)10-26 (CAG)35-41 (CAG) 42-121(CAG)27-35

Normal At risk for expansion Variable penetrance Affected

ATCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGTTC

MARKERY SNP

Allelo-specyficzny PCR (Allele Specific PCR)• wykorzystywany do wykrywania mutacji punktowych SNP;• pozwala na selektywne przyłączanie się starterów w

zależności od sekwencji matrycy• w reakcji stosuje się trzy startery, w tym dwa znakowane

fluorescencyjnie

Taqman Genotyping

2019-01-25

15

DNA Barcoding

DNA BARCODE

• Porównawcza hybrydyzacja genomowa

metoda pozwala na detekcję różnic w ilości kopii DNA pomiędzykontrolnym (referencyjnym) i badanym

180 tys.- 1mln punktów pomiarowych

możliwa jest analiza genomu z jednej komórki pobranejz pięciodniowego blastocytu

amplifikacja materiału genetycznego z jednej komórki następujeprzy użyciu metody MDA (Multiple Displacement Amplification)

aCGH- array Comparative GenomicHybridization

2019-01-25

16

Badania prenatalne- PGSPreimplantation Genetic Screening

Badania prenatalne- PGDPreimplantation Genetic Diagnostic

Testy genetyczne• mukowiscydoza• anemia sierpowata• rdzeniowy zanik mięśni• choroba Huntingtona• hemofilia

Testy cytogenetyczne• zespół Patau• zespół Downa• zespół Edwardsa• zespół Klinefeltera• zespoł Turnera

Badania genetyczne w diagnostycezaburzeń ze spektrum autyzmu

ASDs- Autism Spectrum Disorders

Test subtelomerowy 22 genów metodą MLPAMetoda ilościowa- wykrywa głównie mikrodelecje w 15,16 i 22 chromosomie

Mikromacierz (aCGH), ok 180 tysięcy sond genowych,w w tym 227 skierowanych na ASD

Zespół łamliwego chromosomu X (FraX) - badanieprzesiewowe mutacji w genie FMR1- PCR

2019-01-25

17

Diagnostyka nowotworówNGS (172 geny)

• Pełna analiza regionów kodujących 94 genów

• 284 SNP występujące w 78 genach, skorelowanemetodą GWAS z wystąpieniem nowotworów

• 27 typów nowotworów + jaskra, choroba wieńcowa ichoroba Parkinsona

Diagnostyka „na wszelki wypadek”

• Predyspozycja do cellulitu (gen ACE- odpowiedzialnyza regulację ciśnienia krwi)

• Panel sportowy (38 genów związanych z wydajnościąenergetyczną komórek)

• Panel żywieniowy (13 genów odpowiedzialnych zagłówne procesy metaboliczne)

- nietolerancja laktozy; fruktozy; glutenu- wrażliwość na sód; kofeinę- metabolizm tłuszczy

mtDNA M. dom STR/SNP

Profile indywidualne NIE! (+) +++

Inbred NIE! + +++

Struktura populacji ++ ++ ++

Hybrydyzacja +++ ++ +

Filogenetyka +++ ++ +

2019-01-25

18

Matka

Dziecko 1

Dziecko 3

Dziecko 4

Dziecko 5

Dziecko 2

(homozygota)

Allel po matceAllel po ojcu

2 allel po ojcu (heterozygotycznym)

Mikrosatelity- Nowak, Krysiuk, Borowski 2007

Przykłady hipotez ekologicznych: behawior

pop1

pop8

pop2

pop6

pop3

pop4

pop7

pop5

2

Bariery: otwarta przestrzeń

+----------------------wiosna lewy +------------------2 ! +----------------------wiosna prawy +----------------4 ! ! +----------lato lewy ! +------------------------------1--5 +----------lato prawy ! ! +--------------------------jesień lewy +--------------------------------3 +--------------------------jesień prawy

Bariery: bieżący ciek wodny

Rzeka Biebrza: samce

+------------------wiosna lewy +------------2 ! +------------------wiosna prawy +--------------------------4 ! ! +------------------lato lewy ! +------------1--5 +------------------lato prawy ! ! +--------------------jesień lewy +-------------------------------------3 +--------------------jesień prawy

Rzeka Biebrza: samice

2019-01-25

19

PL

SK

samiec – migracje (2010- 2011)

Filogeneza i filogeografia

identyfikacja metapopulacji

zmienność geograficzna

śledzenie zmienności w czasie

weryfikacja specjacji form

identyfikacja hybryd