· 2017-03-02 · Index Copernicus ICV = 9,65 (2013) Impact Factor ISI = 0,271 (2013) Punktacja...

Index Copernicus ICV = 9,65 (2013)Impact Factor ISI = 0,271 (2013)Punktacja MNiSW = 15,00 (2013)

http://www.pm.microbiology.pl

Kwartalnik

Tom 54

Zeszyt 2•2015KWIECIE¡ – CZERWIEC

CODEN:

PMKMAV 54 (2)

2015

Advances in Microbiology

POLSKIE TOWARZ YSTWO MIKROBIOLOGÓW

Kwartalnik

Tom 54

Zeszyt 3•2015LIPIEC – WRZESIE¡

CODEN:

PMKMAV 54 (3)

2015



Kwartalnik

Tom 54

Zeszyt 4•2015PAèDZIERNIK – GRUDZIE¡

CODEN:

PMKMAV 54 (4)

2015



RADA REDAKCYJNA

JACEK BARDOWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), DARIUSZ BARTOSIK (Uniwersytet Warszawski),JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki),

NADZIEJA DRELA (Uniwersytet Warszawski), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy),JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków),

MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), JACEK MIĘDZOBRODZKI (Uniwersytet Jagielloński),ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki),

ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski), RADOSŁAW STACHOWIAK (Uniwersytet Warszawski),BOHDAN STAROŚCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUSŁAW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdański),

ELŻBIETA TRAFNY (Wojskowa Akademia Techniczna), STANISŁAWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Państwowy Zakład Higieny),GRZEGORZ WĘGRZYN (Uniwersytet Gdański), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski)

REDAKCJA

JACEK BIELECKI (redaktor naczelny), BOHDAN STAROŚCIAK (zastępca),RADOSŁAW STACHOWIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich)

ADRESY REDAKCJI

Redaktorzy:

Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawskiul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 04, fax (22) 554 14 04

e-mail: [email protected]ład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny

ul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (22) 628 08 22, (22) 621 13 51e-mail: [email protected]

Sekretarz

Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawskiul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 12, fax (22) 554 14 04

e-mail: [email protected]

PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY

Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie)

Adres Redaktora działu Publikacje Metodyczne i Standardyul. Malinowa 11, 72-003 Wołczkowo

tel. 605031324, fax: (91) 3113186, e-mail: [email protected] lub [email protected]

STALI RECENZENCI:

JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków),JÓZEF KUR (Politechnika Gdańska), EUGENIUSZ MAŁAFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki),

ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wrocławiu)

CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOWĄ POMOCĄMINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO

ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1

Informacja o zdjęciu na okładce:Komórki zrekombinowanego szczepu Bacillus subtilis w trakcie inwazji komórek eukariotycznych linii HeLa

(SEM LEO, powiększenie 2 300 X). Ze zbiorów Zakładu Mikrobiologii Stosowanej Instytutu Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego.

P O L S K I E T O W A R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W

Nakład 1150, Objętość 14 ark. wyd., Papier offset 90 g

Skład i druk: Zakład Wydawniczy Letter Quality, tel. 22 115 38 10, 607 217 879e-mail: [email protected]; projekt okładki: Jerzy Grzegorkiewicz

POST. MIKROBIOL.,2015, 54, 2, 95–102http://www.pm.microbiology.pl

* Autor korespondencyjny: Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa, tel. 22 622 00 28; e-mail: [email protected]

1. Wstęp

Ponad dwustuletnia historia prowadzenia szczepień umożliwia dokonanie oceny skuteczności jak również stanowi wyzwanie do podejmowania dalszych działań i strategii mających na celu ograniczenie zachorowań, a nawet eradykację chorób. Zaobserwowano, że korzy- stna sytuacja epidemiologiczna skłania do rezygnowania ze szczepień, a powody decyzji o ich zaniechaniu mogą być trywialne i nie zgodne ze współczesną nauką.

Przeciwnicy szczepień podają powody wyznaniowe oraz światopoglądowe odmawiając zaszczepienia sie-bie lub dzieci. Wspominają, że obowiązek szczepień to ograniczenie wolności i swobód. Przekonują o szkodli-wości preparatów szczepionkowych lub ich składników, przeceniają rolę naturalnej ekspozycji na patogen [25].

Pomimo eradykacji ospy prawdziwej i ograniczenia występowania wielu innych chorób np.: poliomyelitis, błonicy, krztuśca, odry, różyczki sprzeciw wobec szczepień wcale nie zanika, a wręcz staje się coraz popu-larniejszy [18, 19, 33].

2. Działalność ruchu antyszczepionkowego

Przeciwnicy szczepień ochronnych powszechnie nazywani są antyszczepionkowcami. Często zrzeszeni wokół proekologicznych ugrupowań i organizacji, są zwolennikami medycyny naturalnej, a nawet holistycz-nej. Przeciwnicy szczepień dopatrują się związku przy-czynowo-skutkowego pomiędzy pewnymi szczepion-kami, ich składnikami, a występowaniem chorób lub zgonów. Nadal bardzo chętnie dywagują o szkodliwości szczepionki MMR (ang. measles-mumps-rubella; szcze-pionka przeciwko odrze, śwince i różyczce) i jej związku z autyzmem u immunizowanych dzieci. Antyszczepion-kowcy są zwolennikami wyższości naturalnej ekspozy-cji na patogen, nad immunogennym preparatem chro-niącym przed chorobą zakaźną. Ruchy te skupiają także sympatyków wyrobów i leków będących – ich zdaniem – zdrową i bezpieczną alternatywą dla szczepień.

Pierwsze postawy antyszczepionkowe notowano w XVIII w., kiedy Boylston i Mather rozpoczęli wario-lację – uodparnianie poprzez zakażanie materiałem

DZIAŁALNOŚĆ RUCHU ANTYSZCZEPIONKOWEGO,ROLA ŚRODKÓW MASOWEGO KOMUNIKOWANIA

ORAZ WPŁYW POGLĄDÓW RELIGIJNYCHNA POSTAWĘ WOBEC SZCZEPIEŃ OCHRONNYCH

Anna Karolina Marchewka1, Anna Majewska1*, Grażyna Młynarczyk1

1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medycznyul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa, tel. 22 622 00 28

Wpłynęło w listopadzie 2014 r.

1. Wstęp. 2. Działalność ruchu antyszczepionkowego. 3. Rola środków masowego komunikowania na postawę wobec szczepień ochron-nych. 4. Wpływ poglądów religijnych na postawę wobec szczepień ochronnych. 5. Podsumowanie

The activity of antivaccine movement, role of the mass media and influence of religious beliefs on the attitude towards immunization

Abstract: Vaccines have accompanied humans for centuries. On the one hand vaccinology development resulted in growing popularity of infectious diseases prophylaxis, on the other vaccine refusal attitudes have been also noted. Religious or world-view reasons are given by vaccine opponents as an explanation to why they refuse immunization. They mention that obligatory immunization constrains liberty and freedom. They try to convince that vaccines or their components have a noxious effect or they overrate the significance of a natural exposure to pathogens. Despite the fact that smallpox has been eradicated and most of the infectious diseases incidence has dropped, resistance towards vaccination does not decline. Moreover, opposition is getting more and more commonplace. Mass media effectively helps propagate antivaccination idea. The Internet provides its users with a wealth information, both reliable with scientific background and the biased one. What is worrying is the fact that growing number of parents look for information on health related topics on the Internet. Selection of methods and parents’ gullible way of thinking lead to increased likelihood of these parents to believe in falsified and unreliable data. As a result, erroneous perception of the infectious diseases and antivaccination attitudes cause hazardous behaviors, such as so-called a pox-parties, which are previously planned exposures to a certain pathogen. Also celebrities take part in spreading out antivaccinationopinions. Nowadays, society tends to perceive celebrities as role-models and often obey them blindly.

1. Introduction. 2. Activity of antivaccine movement. 3. Role of the mass media on the attitude towards immunization. 4. Influence of religious beliefs on the attitude towards immunization. 5. Summary

Słowa kluczowe: eradykacja, szczepienie, ruch antyszczepionkowyKey words: eradication, vaccination, antivaccine movement

96 ANNA KAROLINA MARCHEWKA, ANNA MAJEWSKA, GRAŻYNA MŁYNARCZYK

zawierającym wirusy ospy prawdziwej [18, 30]. Ze zdecydowaną krytyką spotykał się także angielski lekarz, uznawany za odkrywcę szczepień ochronnych przeciwko ospie prawdziwej – Edward Jenner. Dzia-łania Jennera zapoczątkowały rozwój wakcynologii i w rezultacie doprowadziły do wyeliminowania ospy prawdziwej z powierzchni Ziemi, czego efektem było podpisanie 9 grudnia 1979 roku aktu stwierdzającego eradykację ospy prawdziwej na świecie.

Jenner stosował wakcynację, czyli sposób uod-parniania na ospę prawdziwą przy pomocy materiału zakaźnego pobieranego ze zmian skórnych osób cho-rych na ospę krowią tzw. krowiankę. Następstwem, czego było łagodne przechorowanie krowianki i w efek-cie odporność na chorobę, której ówcześnie żyjący oba-wiali się najbardziej – ospę prawdziwą.

14 maja 1796 r. Jenner zaszczepił trzynastoletniego Jamesa Phipps’a materiałem zakaźnym pobranym od dójki zakażonej krowianką. Treść ze zmiany skórnej zaaplikował poprzez nacięcie na ramieniu chłopca. Po tej interwencji James łagodnie zachorował, po czym pozostał odporny na zakażenie wirusem ospy prawdziwej. Aktywność Jennera nie została przyjęta entuzjastycznie. Zabieg uważano za bolesny i powo-dujący szpecące blizny. Pojawiły się obawy o pocho-dzenie materiału do uodpornienia oraz o jego wpływ na organizm dzieci. Wysuwano argumenty, że szcze-pienie materiałem pobieranym od zwierząt, spowo-duje u zaszczepionych dzieci choroby odzwierzęce lub przyczyni się do przenoszenia innych infekcji (kiła!), chorób nowotworowych czy psychicznych. Bezwzględnie do najciekawszych przykładów obaw należą te, które ilustrują możliwość przekształcania się osób immunizowanych materiałem pochodze-nia zwierzęcego w pół ludzi i pół krowy. Krytykujący ówczesne szczepienie nie wierzyli medycynie, nie ufali Jennerowi. Wykonanie szczepienia przeciwko ospie prawdziwej uznawano także za sprzeciw wobec woli Boga [1, 18, 38, 43, 46].

W połowie XIX w. zaczęto wprowadzać obowiązek wykonywania szczepień przeciwko ospie prawdziwej. Podobnie jak w czasach współczesnych, potraktowano ten proceder jako zamach na wolność i prawa obywa-telskie. W 1840 r. w Wielkiej Brytanii wprowadzono Vaccination Act. Początkowo ustawa gwarantowała nie-odpłatne szczepienia dla ubogich. W 1853 r. dokument zmodyfikowano, ustanawiając obowiązek szczepienia dzieci w ich pierwszych 3 miesiącach życia. Na opie-rających i odmawiających wykonania tego obowiązku rodziców nakładano kary grzywny lub wysyłano do więzień. 14 lat później obowiązek szczepień został nało-żony na wszystkie dzieci do 14 roku życia. Rządowa interwencja spowodowała zamieszki w wielu miastach Wielkiej Brytanii. Rządzącym dano wyraźnie do zrozu-

mienia, że obowiązkowe szczepienia to atak na wolność obywatelską [18, 38].

Pod koniec XIX w. protesty antyszczepionkowe pojawiły się w Stanach Zjednoczonych, skutkując znie-sieniem obowiązku szczepień w kilku stanach. W latach 1901–1903 w Bostonie i okolicach miała miejsce epi-demia ospy prawdziwej. Przymusowe szczepienia zna-lazły wielu oponentów, którzy mówili o pogwałceniu prawa oraz o godzeniu w prawo do dbania o własne ciało w wybrany przez siebie sposób.

Liczne protesty dotyczyły także skojarzonej szcze-pionki DTP uodparniającej przeciwko błonicy (diphtheria), tężcowi (tetanus) i krztuścowi (pertussis). Szczepionkę wprowadzano w wielu krajach na świecie w latach 50. zeszłego stulecia. Ogromnym sukcesem szczepień było ograniczenie przypadków krztuśca, który w owym czasie był poważną, nierzadko śmier-telną chorobą wieku dziecięcego.

Doniesienia z jednego z brytyjskich szpitali o wystą-pieniu niepokojących symptomów ze strony układu nerwowego u zaszczepionych dzieci bardzo szybko przedostały się do środków masowego przekazu. Pow- stało The Association of Parents of Vaccine Damaged Children, towarzystwo, którego misją było przekazy-wanie opinii publicznej wieści o niebezpieczeństwie i ryzyku związanym ze szczepionką DTP. Sympatię rodziców i przeciwników szczepień zyskał Gordon Stewart, profesor na Uniwersytecie w Glasgow, który już wcześniej minimalizował rolę antybiotyków w zwalcza-niu chorób zakaźnych. Steward opublikował w 1977 r. analizę 160 przypadków encefalopatii rzekomo zwią-zanej ze szczepieniem przeciwko krztuścowi. Żarliwa dyskusja społeczna zaowocowała przeprowadzeniem dużego i niezależnego badania, którego wyniki jasno wskazywały, że po zastosowaniu szczepionki istnieje możliwość wystąpienia działań niepożądanych, ale to ryzyko jest niezmiernie niskie. Po tym dochodzeniu w Wielkiej Brytanii zaczęto przeprowadzać kampanie informujące o zagrożeniach związanych z zachorowa-niem i propagujące szczepienia [3, 18, 39].

Również w USA pojawiły się kontrowersyjne donie sienia dotyczące szczepionki DTP. Rozpoczęły się w 1982 r. po emisji filmu dokumentalnego DTP: Vaccine Roulette. Znana z amerykańskich produkcji filmowych Lea Thompson zarzuciła szczepionce silny związek z występowaniem uszkodzeń układu nerwo-wego, szczególnie encefalopatii poszczepiennej. Igno-rowanie zalet i korzyści, emfatyczne ukazanie dzia-łań niepożądanych szczepionki, opowieści rodziców o przerażającym przebiegu choroby, a także pokazanie emocji małych dzieci poddawanych szczepieniu ode-grały ogromną, negatywną rolę w postrzeganiu wartości szczepień ochronnych. Działania Academy of Pediatrics i Centres for Disease Control and Prevention (CDC)

DZIAŁALNOŚĆ RUCHU ANTYSZCZEPIONKOWEGO, ROLA ŚRODKÓW MASOWEGO KOMUNIKOWANIA 97

oraz masowych mediów pomogły w zminimalizowaniu skutków, jakie dla populacji dziecięcej mógł spowodo-wać ów film. Odsetek dzieci zaszczepionych przeciwko krztuścowi w Stanach Zjednoczonych pozostał wów-czas na dość wysokim poziomie [13, 18, 34].

W 1998 roku pojawiła się kolejna reakcja histerii, którą sprowokowała publikacja brytyjskiego gastroen-terologa i naukowca Andrew Wakefield’a. Wyniki prze-prowadzonych przez niego badań wskazały na istnienie związku szczepionki MMR i autyzmu oraz zapalenia jelit u dzieci poddanych szczepieniu. Zrodził się jeden z większych mitów dotyczący szczepień – szczepienia powodują autyzm [2, 9, 18]. Artykuł na ten temat, opu-blikowano w uznanym czasopiśmie Lancet (Lancet 351, 637–641, 1998). Na skutek rozpowszechnienia publi-kacji, odnotowano rezygnację ze szczepienia w wielu krajach Europy i w Stanach Zjednoczonych, co w kon-sekwencji spowodowało zwiększoną liczbę zachorowań na odrę i świnkę [2, 7, 30]. W odpowiedzi na sensacyjne doniesienia, w wielu ośrodkach na świecie przeprowa-dzono szczegółowe badania (epidemiologiczne, biolo-giczne i kliniczne). Rezultatem były wyniki mówiące o braku jakiegokolwiek powiązania między podaniem MMR, a wystąpieniem autyzmu. Pomimo dochodzenia dyskredytującego Wakefield’a jako rzetelnego lekarza i naukowca, on sam i jego zwolennicy nadal starali się tworzyć opozycję dla szczepień. Wakefield’owi British General Medical Council przedstawiło zarzuty kon-fliktu interesów, fałszowania wyników badań i nie-etyczne postępowanie. W 2010 r. wycofano publikację z czasopisma Lancet [7, 13, 18, 24].

Kolejnym przejawem postaw antyszczepionkowych jest ruch Green our vaccines. Aktywiści podali, że celem ruchu jest wywarcie presji na koncerny farmaceutyczne i wymuszenie produkcji szczepionek „ekologicznych”. Żądali usunięcia z preparatów wszelkich „toksyn”, aby stały się przyjazne dla dzieci i środowiska. Aktywiści mieli zastrzeżenia do tiomersalu [9, 13, 18]. Tiomersal to zsyntetyzowany pod koniec lat 20. zeszłego stulecia, organiczny związek rtęci w postaci etylowanej, który znalazł zastosowanie w medycynie jako środek kon-serwujący. Związek ten do dziś wzbudza kontrowersje z powodu podejrzeń o przyczynianie się do rozwoju autyzmu. Próby udowodnienia powiązania etiologicz-nego tiomersalu z autyzmem podejmowali między innymi Mark i David Geier – ojciec i syn. Swoje badania prowadzili w słabo wyposażonym laboratorium znajdu-jącym się w piwnicy ich domu. Przekonania Geierów na temat autyzmu, mimo braku zaplecza naukowego, trafiły do prasy medycznej oraz do rodziców i organiza-cji zaniepokojonych szczepieniami. Mark Geier, w efek-cie, za uprawianie medycyny, która nie była oparta na dowodach utracił licencję uprawniającą do wykony-wania zawodu w USA. Jego syn natomiast, nie mając

wykształcenia medycznego, pełnił obowiązki licencjo-nowanego lekarza, za co został w lipcu 2012 roku uka-rany grzywną [8, 35].

W aktywność przeciwszczepionkową włączyli się celebryci np. aktor Jim Carrey i aktorka, matka auty-stycznego syna, Jenny McCarthy. McCarthy jest żarliwą propagatorką pracy Wakefield’a i Geier’ów. Swoją wie-dzę w zakresie medycyny zdobyła, jak to sama określiła, „na uniwersytecie Google”. McCarthy organizuje rów-nież konferencje Autism One, na których ona i jej goście ujawniają „prawdziwe” fakty o przyczynach autyzmu, tak skrzętnie ukrywane przez środowisko medyków [13, 35]. Liczne badania prowadzone przez Food and Drug Administration (FDA) oraz European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA) wyka-zały, że etylortęć po kilku dniach usuwana jest z orga-nizmu wraz kałem [26]. Oczywiste jest, że należy dążyć do zniesienia ekspozycji na rtęć, dlatego podejmowane są działania zmierzające do usuwania związku z prepa-ratów szczepionkowych [2, 14, 18].

Działalność antyszczepionkowa prowadzona jest również w Polsce.

W naszym kraju przeciwnicy szczepień ochronnych uzyskali wsparcie w osobie prof. dr hab. Marii Doroty Majewskiej. Pani prof. prowadzi własną krucjatę anty-szczepionkową. Głosząc tezy sprzeczne z osiągnię-ciami nauki i nie mając poparcia świata naukowego zdołała przekonać nawet niektórych dziennikarzy. Na temat szkodliwości szczepień wypowiadała się w prasie i w programach telewizyjnych. Tytuł naukowy profesora oraz zatrudnienie w renomowanym Instytucie w War-szawie oraz praca w USA sprawiły że prof. Majewską uznano za wiarygodnego eksperta w zakresie szczepień. Pani prof. oskarża szczepionki, a dokładnie tiomersal, o wywoływanie autyzmu, ADHA i innych zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego [23, 34, 35].

Prof. Majewska polemizując z Marcinem Rodkie-wiczem (dziennikarz i popularyzator nauki) na łamach tygodnika Polityka, twierdzi, że: „Masowe szczepienia nie wyeliminowały chorób zakaźnych, a w niektórych przypadkach mogą być nawet ich przyczyną”. Pani prof. wspomina o krztuścu. Istotnie, w wielu krajach obserwuje się od kilku lat zwiększoną liczbę zachoro-wań. Najważniejszą przyczyną tego zjawiska jest jednak suboptymalna skuteczność szczepionek bezkomórko-wych, które zastąpiły, stosowane od lat 40 XX w., pre-paraty pełnokomórkowe [32, 44]. Zwiększenie zapadal-ności może wynikać również z udoskonalenia metod wykrywania choroby, a także stopniowego wygaszania odporności poszczepiennej, co umożliwia transmisję bakterii z dorosłych na dzieci [29].

Podobnie jak w USA w kwestii szkodliwości szcze-pień ochronnych wypowiadają się celebryci np.: Woj-ciech Cejrowski i piosenkarka Reni Jusis.


3. Wpływ środków masowego komunikowania na postawę wobec szczepień ochronnych

Jeszcze kilkanaście lat temu przeciwnicy szczepień w celach propagandowych wykorzystywali ulotki, bro-szury, wzbudzali zamieszki. W czasach obecnych coraz łatwiej dotrzeć do odbiorców. Z pomocą przychodzą media masowego komunikowania, coraz bardziej zain-teresowane szczepieniami, a może tylko sensacją, która wywinduje oglądalność czy liczbę odsłon i udostęp-nień [46]. Bardzo chętnie przez antyszczepionkowców wykorzystywana jest przestrzeń internetowa. Jest to idealne narzędzie przekazywania informacji, zarówno tych rzetelnych jak i udostępnianych przez samozwań-czych ekspertów. Niepokojący jest fakt, że bardzo często rodzice szukają w sieci informacji na temat szczepień zastępując w ten sposób rozmowę z wykwalifikowanym pracownikiem ochrony zdrowia [4, 40]. Problem ten nie jest tak bardzo nasilony w Polsce jak np. w USA. Wyniki badania Polskiej Biblioteki Internetowej (PBI) podają, że informacji o zdrowiu w Internecie poszukuje ok. 8 mln użytkowników. Najczęściej zapytania dotyczą składu i działania leków oraz diety i odżywiania [27].

Konkretyzując i odnosząc się do tematu szczepień, z badań przeprowadzonych w 2009 r. przez Tarczoń, Domaradzką i Czajkę wynika, że najbardziej popu-larnym źródłem informacji o szczepieniach dla pol-skich rodziców jest lekarz, odpowiedzi takiej udzieliło 97% ankietowanych, na drugim miejscu uplasowała się pielęgniarka z 75% poparciem, farmaceuta stanowi źród ło informacji dla 54% rodziców i dopiero na miejscu czwartym znajduje się Internet – niespełna 48% odpowiedzi polskich respondentów [40]. Nato-miast w Stanach Zjednoczonych i Kanadzie informa-cji o zdrowiu poszukuje ok. 75–80% korzystających z Internetu. Co niepokojące, 52% badanych uważa, że „wszystkie” lub „prawie wszystkie” informacje przez nich znalezione są godne zaufania [17, 47].

Antyszczepionkowcy posługują się różnymi meto-dami w propagowaniu swoich postaw. Kata, w prowa-dzonym badaniu wyróżniła cztery główne mechanizmy zachowań. Pierwszy z nich polega na zdyskredytowa-niu i zniekształcaniu wyników badań oraz nauki [16]. W Internecie do października 2014 r. funkcjonowała strona o nazwie Fourteen Studies (http://www.fourte-enstudies.org/index.html) opracowana i prowadzona przez Generation Rescue – organizację, której założy-cielką jest wymieniona już wcześniej McCarthy. Na portalu opublikowane były badania, które popierały szczepienia i te, które wskazywały na ich szkodliwość. Autorzy strony wymieniając i hierarchizując pro-szcze pionkowe badania dodawali od siebie komen-tarz mówiący o występującym konflikcie interesów, czy niewłaściwej interpretacji wyników. Naturalnie, badania których wyniki sugerowały istnienie związku

szczepienia z autyzmem oceniane były wyżej. Istniała wyraźna tendencja do selekcjonowania badań i faktów oraz promowania tych, które dla ruchu antyszczepion-kowego były wygodne. W trakcie dyskusji z zaniepo-kojonymi rodzicami dawało to podstawę do powołania się na doniesienia naukowe. W serwisie tym autorzy dyskredytowali badaczy i organizacje takie jak: Ame-rykańska Akademia Pediatrii czy Komitet Doradczy ds. Szczepień Ochronnych przy CDC. Misja Fourteen Studies kontynuowana jest na blogu Age of Autism, the Daily Web Newspaper of the Autism Epidemic (http://www.ageofautism.com/2009/04/fourteen-studies-only--if-you-never-read-them.html.12.01.2015).

Historia zmieniających się hipotez jest kolejnym mechanizmem działalności przeciwników szczepień. Kiedy wyniki badań naukowych podważają i w efekcie obalają teorie antyszczepionkowców, ci tworzą i rozpo-wszechniają kolejne. I tak na przykład przeanalizować można historię domniemanego związku autyzmu ze szczepieniem. W temacie tym utworzono pojawiające się po sobie kolejno hipotezy. Pierwsza – szczepionka MMR powoduje autyzm, uszkadzając wyściółkę jelit, co pozwala na przedostawanie się do organizmu bia-łek wywołujących encefalopatię. Badania naukowe obaliły tę hipotezę; nie wykazano związku pomiędzy zachorowaniami na autyzm, a podawaniem szczepionki MMR. Druga hipoteza mówiła, że zawarty w nie-których szczepionkach tiomersal wywiera toksyczny wpływ na ośrodkowy układ nerwowy. Szumne i pełne nadziei przewidywania opozycjonistów, że po wycofa-niu tiomersalu ze składu szczepionek liczba nowych przypadków autyzmu znacznie zmaleje, nie potwier-dziły się. Wkrótce pojawiły się teorie alternatywne, a najpopularniejsza z nich sugerowała, że jednoczesne podawanie kilku szczepionek wpływa niekorzystnie na układ immunologiczny, wchodząc w interakcje z ośrod-kowym układem nerwowym, czego skutkiem są zabu-rzenia autystyczne [8].

Niezależnie od tego jak wiele wiarygodnych dowo-dów zostanie przedstawionych na rzecz wspierania i zwrócenia uwagi na potrzebę wykonywania szcze-pień, antyszczepionkowcy żonglować będą kolejnymi teoriami, w taki sposób, jakiego wymaga sytuacja.

Następnym sposobem jest atakowanie opozycji. Naj- bardziej szkalowanym jest dr Paul A. Offit – współ-twórca szczepionki przeciw zakażeniu rotawirusami, autor książek krytykujących działalność ruchów anty-szczepionkowych. Dr Offit ze strony środowisk zwal-czających szczepienia doczekał się etykietki biostitute czy Dr. Proffit [16, 41].

Omawiając wykorzystanie portali internetowych należy zauważyć w jaki sposób są one konstruowane aby treści antyszczepionkowe były przyswajalne i wydały się przekonujące. Z badań przeprowadzonych przez Wolfe wynika, że strony promujące przeciwsta-


wienie się szczepieniom są przepełnione emocjami oraz oparte na tym by szokować odwiedzających. Wykazano, że ponad połowa (55%) z przeanalizowanych stron zawierała materiał w formie osobistych historii rodzi-ców. Tematyka tych wpisów wszędzie była podobna – „Moje dziecko zostało trwale okaleczone lub zabite. Przyczyna? – poddanie dziecka szczepieniu”. Zdjęcia poszkodowanych dzieci opublikowało 23% tych stron, a 32% zamieściło zdjęcia strzykawek z igłami wkłutymi w dziecięce ramiona [47].

Nierozważni rodzice, przeciwnicy szczepień, błęd-nie rozumieją skutki naturalnej ekspozycji na drobno-ustroje. Od kilku lat wielką popularnością cieszą się spotkania określane jako ospaparty, których celem jest umożliwienie zdrowym dzieciom zakażenia się wirusem ospy wietrznej od chorych rówieśników pod-czas wspólnej, zaplanowanej przez opiekunów zabawy. Rodzice mają nadzieję na łagodny przebieg choroby, a następnie dozgonną odporność, której, jak twier-dzą nie zapewnia szczepienie. Propagowane jest hasło „przechorować zamiast szczepić”. Zwolennikom wydaje się, że ryzyko wystąpienia poważnych powikłań czy śmierci jest minimalne, powikłania te dotyczą wszak tylko pewnego odsetka chorych, ale w skali całego kraju może to być istotna liczba [42, 45].

W Stanach Zjednoczonych na portalu Facebook utworzona została grupa „Find a Pox Party In Your Area” skupiająca przeciwników szczepień. Obecnie już nie istnieje, jednak okazało się, że temat jest nadal aktualny i misja grupy jest kontynuowana na Pox Party. Idea funkcjonowania tych społeczności polega na kontaktowaniu rodziców, których dziecko choruje na ospę wietrzną z rodzicami, którzy zamierzają ekspo-nować dziecko na patogen. Aranżowana jest wspólna zabawa, w przypadku znacznych odległości za pośred-nictwem poczty przesyłane są ubrania, kocyki należące do chorych na ospę wietrzną dzieci, a nawet polizane lizaki. Idea ta zrodziła się w Phoenix, w stanie Arizona, i z dużym prawdopodobieństwem przesyłki wysy-łane były do stanów Kalifornia, Tennessee, Luizjana, Georgia, a nawet do Kanady. Po zerknięciu na mapę z podziałem na stany zauważamy, że paczki z materia-łem zakaźnym podróżowały przez kilka stanów. Stąd ostrzeżenie pełnomocnika prawnego Środkowego Dystryktu Stanu Tennessee Jerry Martin’a, że każdy, kto podejmie się przesłania pocztą tzw. „pox packages” łamie federalne prawo dotyczące przesyłania materia-łów będących zagrożeniem biologicznym [21, 45].

Również w Polsce obserwowane są akty świado-mego kontaktowania dzieci zdrowych z chorymi na ospę wietrzną z zamiarem wywołania choroby. Należy podkreślić, że zachowania takie są sprzeczne z intere-sem publicznym oraz naruszają normy prawne [10, 22].

Dr med. Ewa Duszczyk, pediatra z Kliniki Chorób Zakaźnych Wieku Dziecięcego WUM informuje, że

ospa wietrzna w Polsce postrzegana jest jako łagodna, niemal „obowiązkowa” choroba, a wiedza na temat jej przebiegu i możliwych powikłań jest zbyt uboga. Udział w tzw. „ospa party” wiąże się z nieprzewidywalnym ryzykiem, poważnymi powikłaniami neurologicznymi, zakażeniem latentnym, które może w kolejnych latach życia skutkować półpaścem. Wirus ospy wietrznej zagraża również wrażliwym osobom dorosłym, gdyż przebieg zakażenia jest na ogół poważniejszy, a odse-tek zgonów wyższy. W Polsce, w ciągu roku notuje się około 800–1150 hospitalizacji z powodu powikłań ospy wietrznej.

Ospa wietrzna u kobiet ciężarnych może dawać dodatkowe następstwa w postaci śródmiąższowego zapalenie płuc z podwyższoną śmiertelnością oraz skut-kować zakażeniem wrodzonym [6, 15].

Oprócz wartości naturalnej ekspozycji rodzice należący lub sympatyzujący z ugrupowaniami o cha-rakterze antyszczepionkowym jako kolejne argumenty przeciwko szczepieniom podają fakt, że choroby prze-ciwko którym prowadzone są szczepienia ochronne występują obecnie rzadko. Należy zauważyć, że szcze-pienia są formą interwencji medycznej, w której ochro-nie przed zachorowaniem na choroby zakaźne podlega osoba zaszczepiona oraz osoby z otoczenia. Uodpor-nienie dużego odsetka osób w populacji zapewnia tzw. ochronę zbiorowiskową. Pojęcie to opisano po raz pierwszy w latach 20 XX w., dotyczy odporności całej populacji, przyczynia się do eliminacji, a nawet eradykacji chorób zakaźnych. Powszechne szczepienia zabezpieczają osoby wrażliwe (nie szczepione z powo-dów np. medycznych) przed kontaktem z osobą zaka-żoną [14, 32].

Odsetek osób zaszczepionych w Polsce jest wysoki i wynosi około 95% populacji. Sytuacja taka skutecznie zapobiega szerzeniu się zachorowań na choroby zakaźne. Chronieni są nie tylko ci, którzy zastali zaszczepieni, ale również osoby, które z powodu przeciwwskazań zdro-wotnych nie mogą poddać się szczepieniu [10]. Dzięki czemu, w kraju, notujemy malejącą liczbę zachorowań min. na różyczkę, ospę, odrę, świnkę. Potwierdzające to stwierdzenie dane epidemiologiczne z Narodowego Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny (NIZP-PZH) mogą być mylnie interpretowane przez przeciwników szczepień. Wstępowanie 110 przy-padków odry w 2014 r. w porównaniu z 661 przypad-kami w 1996 r., zmniejszenie zachorowań na nagminne zapalenie przyusznic z 39 596 (1996 r.) do 2511 (2014 r.), a także redukcja zachorowań na różyczkę z 79 262 (1996 r.) do 5 899 (2014 r.) jest oczywistym rezulta-tem szczepień przeciwko tym chorobom, początkowo wykonywanym jako szczepienia zalecane, a następnie od 2004 roku, w ramach szczepień obowiązkowych szczepionką MMR. Realizując cel eliminacji zespołu różyczki wrodzonej, w Polsce, w latach 1988–1989


wprowadzono do programu szczepień ochronnych obligatoryjne szczepienie przeciwko różyczce. Dzięki temu obecnie nie rozpoznaje się przypadków, poważ-nego w skutkach, zespołu różyczki wrodzonej.

Zaniechanie wakcynacji na skutek histerii anty-szczepionkowej stanowi ryzyko nawrotu zachorowań na choroby zakaźne, którym można zapobiegać poprzez szczepienia [48]. Świat boryka się obecnie z ogniskami odry. W XXI w. odnotowania zachorowania na odrę w USA, Kanadzie, Japonii i wielu krajach Europy (Wielka Brytania, Niemcy, Holandia, Bułgaria, Wło-chy, Rumunia). Odra to wysoce zakaźna choroba; jedna zakażona osoba jest wstanie zainfekować 12–18 osób wrażliwych. Na ogół przebiega łagodnie, jednak u części osób obserwowane są poważne powikłania, z których najpoważniejsze oprócz zgonu jest zapalenie płuc, zapa-lenie mózgu oraz występujące kilka lat po ekspozycji na patogen podostre stwardniające zapalenie mózgu (SSPE) [29].

Aktorzy w antyszczepinkowym spektaklu odrzucają zatem osiągnięcia nauki. Utrzymują, że obowiązkowe szczepienia ochronne to ograniczenie swobód obywa-telskich. Dzięki powszechnemu dostępowi do środków masowego przekazu hasła te bardzo szybko się rozprze-strzeniają. Przekaz ma bardzo sugestywną formę, co powoduje, że ruch antyszczepionkowy zyskuje kolej-nych zwolenników.

4. Wpływ poglądów religijnych na postawę wobec szczepień ochronnych

Szczepienia stały się również narzędziem w spo-rach religijnych. Niepokoje dotyczą głównie substancji pomocniczych pochodzenia wołowego i wieprzowego oraz sposobu hodowli szczepów szczepionkowych wirusów. Z niewielką aprobatą spotkają się szczepienia w takich grupach wyznaniowych jak: Amisze, Orto-doksyjni Żydzi, wyznawcy Holenderskiego Kościoła Zreformowanego. Lokalne epidemie chorób, którym można zapobiegać poprzez szczepienia, głównie odry jak i różyczki, poliomyelitis czy krztuśca występowały w przeszłości, a nawet występują obecnie najczęściej wśród wyznawców tych religii [5, 11]. W środkach masowej komunikacji podano informacje na temat używania do produkcji szczepionek komórek pocho-dzących z płodów ludzkich otrzymanych po wykona-niu zabiegu aborcji. Pojawiły się jawne akty nieakcep-towania szczepień ze względów moralnych, etycznych oraz religijnych [12]. Należy wyjaśnić, że do produkcji szczepów szczepionkowych wirusów stosuje się linie komórkowe np.: MRC-5 i WI-38. WI-38 (Wistar Insti-tute 38) to komórki wyizolowane w 1961 r. w Instytucie Wistar (Filadelfia, USA) z komórek płuca trzy miesięcz-nego płodu pochodzącego z legalnie przeprowadzonej

aborcji w Szwecji. Linia komórkowa MRC-5 (Medi-cal Research Council 5) pochodzi z fibroblastów płuc 14 tygodniowego płodu. Aborcji dokonano w 1970 r. w Wielkiej Brytanii z powodu występowania choroby psychicznej u 27 letniej matki. Istotne jest, że aborcje te nie zostały przeprowadzone w celu uzyskania linii komórkowych lecz z powodów uzasadnionych medycz-nie. Należy podkreślać, że do produkcji szczepionek nie są potrzebne kolejne aborcje oraz że ostateczny produkt w postaci szczepionki nie zawiera żadnych komórek ludzkich. Zastrzeżenia dotyczące stosowania linii komórkowych pochodzących z ludzkich płodów w procesie wytwarzania preparatów szczepionkowych wyrazili wyznawcy rzymskiego katolicyzmu i amisze. Wobec jawnego zaniepokojenia wiernych The Natio-nal Catholic Bioethics Center i Vatican’s Pontifical Academy for Life, aby zapobiec niebezpiecznej ten-dencji niechęci do szczepień, zajęły oficjalne stanowi-sko i jednoznacznie wypowiedziały się, że szczepienia preparatem, do którego produkcji wykorzystano linie komórkowe pochodzące z martwych płodów nie są niezgodne z etyką i że szczepiony nie jest współwinny dokonania aborcji. Obie instytucje konsultowały rów-nież sprawę szczepu wirusa różyczki RA/27/3 wyizo-lowanego z nerki martwego płodu, którego matka była chora na różyczkę. W latach 60. XX w. szczep ten był lepiej tolerowany i powodował lepszą odpowiedź immunologiczną niż wszystkie inne ówcześnie znane szczepy wirusa różyczki [11].

Rezygnacja ze szczepień w powodów etyczno-reli-gijnych skupia się również wokół innych zagadnień np. postrzeganiu – przez niektóre z wyznań – choroby jako manifestację uszczerbku duchowego oblicza człowieka, któremu konwencjonalna medycyna nie jest w stanie pomóc. Modlitwa i głęboka wiara są antidotum. Pod-dawanie się szczepieniu może być więc postrzegane jako ingerencja w boską opatrzność. Kluczowym jest, że obecnie większość wyznań i religii nie zakazuje szczepienia. Przedstawiciele największych Kościołów na świecie, obecnie nie negują szczepień, co więcej znamienna część opowiada się za koniecznością uod-pornienia przeciwko poważnym klinicznie lub istotnym epidemiologicznie chorobom [11, 12].

5. Podsumowanie

Szczepienia ochronne to jeden z większych sukce-sów współczesnej medycyny. Konsekwentnie wykony-wane spowodowały ograniczenie zachorowań, zredu-kowały śmiertelność i liczbę hospitalizacji. Umożliwiły eradykację ospy prawdziwej oraz postęp w realizowaniu globalnych inicjatyw zmierzających do wyeliminowana poliomyelitis, zachorowań na odrę i na różyczkę, w tym zespołu różyczki wrodzonej [36].


Prawdopodobnie próby uodpornienia prowa-dzone były już w pierwszym tysiącleciu naszej ery [18]. Masowe szczepienia pojawiły w czasach Edwarda Jennera. W ponad dwustuletniej historii szczepień odnotowano wiele spektakularnych odkryć. Nie należy zapominać o wkładzie polskich badaczy w rozwój wak-cynologii. Do grona najwybitniejszych autorytetów w tej dziedzinie wpisuje się Hilary Koprowski – m.in. twórca pierwszej na świecie szczepionki przeciwko wirusowi polio [20, 28]. Badaczem i popularyzatorem był rów-nież Prof. Marek Niemiałtowski – inicjator i organi-zator Międzynarodowej Konferencji „Szczepionki: postępy w biotechnologii roślin i mikroorga nizmów, odporności antyzakaźnej i terapii antynowotworowej. Obchody 50. rocznicy pierwszego szczepienia dziecka w Polsce przeciwko polio przy użyciu doustnej szcze-pionki profesora Hilarego Koprowskiego”.

W 1959 r. dzięki inicjatywie prof. Feliksa Przesmy-ckiego rozpoczęto masowe szczepienia atenuowaną szczepionką Koprowskiego, co spowodowało zahamo-wanie epidemii, która trwała w Polsce od 1951 roku [19, 37]. Prof. Mirosław Kańtoch badał bezpieczeństwo i skuteczność szczepień przeciwko wirusowi polio, odry i różyczki. Prowadził pionierskie badania nad terato-gennym działaniem wirusa różyczki i kontynuował dzieło prof. Feliksa Przesmyckiego [31].

Dorobek dziesięcioleci nie może być przekreślony aktywnością samozwańczych ekspertów. Nie może być również narzędziem w sporach religijnych. Powinien stanowić podstawę do dalszych badań nad profilaktyką zakażeń, w dobie niewystarczającej liczby leków prze-ciwwirusowych i w związku z narastającym problemem lekooporności wśród bakterii.

Piśmiennictwo

1. Albert M.R., Ostenheimer K.G., Breman J.G.: The Last Smallpox Epidemic in Boston and the Vaccination Controversy, 1901–1903. N. Engl. J. Med. 344, 375–379 (2001)

2. Baker J.P.: Mercury, Vaccines, and Autism: One Controversy, Three Histories. Am. J. Public. Health. 98, 244–253 (2008)

3. Baker J.P.: The pertussis vaccine controversy in Great Britain, 1974–1986. Vaccine, 21, 4003–4010 (2003)

4. Bedford H., Elliman D.: Today’s anti-vaccinationists – how they act and how should we respond? Medycyna Praktyczna – Szczepienia, 3, 15 (2013)

5. Brickman J.P.: The Eradication of Smallpox. Edward Jenner and the First and Only Eradication of a Human Infectious Disease by Hervé Bazin. J. Public. Heath. Pol. 23, 517–519 (2002)

6. Duszczyk E., Marczyńska M., Talarek E.: Ospa wietrzna – czy jest groźną chorobą? Zakażenia, 9, 63–68 (2009)

7. Eggertson L.: Lancet retracts 12-year-old article linking autism to MMR vaccines. CMAJ, 182, 199–200 (2010)

8. Geier M., Geier D.: The potential importance of steroids in the treatment of autistic spectrum disorders and other dis orders involving mercury toxicity. Med. Hypotheses. 64, 946–954 (2005)

9. Gerber J.S., Offit P.A.: Vaccines and autism: a tale of shifting hypotheses. Clin. Infect. Dis. 48, 456–461 (2009)

10. Główny Inspektorat Sanitarny. Zaszczep w sobie chęć szczepie-nia. Komentarz Głównego Inspektora Sanitarnego dotyczący przypadków celowego zakażania przez rodziców swoich dzieci chorobami zakaźnymi w trakcie tzw. ospa-party, http://www.szczepienia.gis.gov.pl/index.php/akcja_informacyjna/aktual no-sci/4 (12 stycznia 2015 roku)

11. Grabenstein J.D.: What the World’s religions teach, applied to vaccines and immune globulins. Vaccine, 31, 2011–2023 (2013)

12. Grzymek J.: Szczepionki, aborcja i klauzula sumienia: co mają ze sobą wspólnego? Medycyna Praktyczna Szczepienia, 2014, http://www.mp.pl/szczepienia/aktualnosci/show.html?id=103928 (12 stycznia2015 roku).

13. History of anti-vaccination movement. The History of Vacci-nes, 2014, http://www.historyofvaccines.org/content/articles/history-anti-vaccination-movements (12 stycznia 2015 roku)

14. Hurley A.M., Tadrous M., Miller E.S.: Thimerosal-Containing Vaccines and Autism: A Review of Recent Epidemiologic Stu-dies. J. Pediatr. Pharmacol. Ther. 15, 173–181 (2010)

15. Jurkowska U., Majewska A., Dmoch-Gajzlerska E., Młynar-czyk G.: Zakażenie alfaherpeswirusami u kobiet w ciąży i ryzyko okołoporodowego zakażenia płodu i noworodka. Nowa Pediatria, 3, 66–71 (2011)

16. Kata A.: Anti-vaccine activists, Web 2.0, and the postmodern paradigm – An overview of tactics and tropes used online by the anti-vaccination movement. Vaccine, 30, 3778–3789 (2012)

17. Kata A.: A postmodern Pandora’s box: Anti-vaccination misin-formation on the Internet. Vaccine, 28, 1709–1716 (2010)

18. Krawczyk E.: Historia ruchu antyszczepionkowego (w) Zdro-wie – przewodnik Krytyki Politycznej. Wydawnictwo Krytyki Politycznej. Warszawa 2012, 303–316

19. Kuryk Ł., Wieczorek M., Litwinska B.: Polio – Zagadkowy wirus. Post. Microbiol. 52, 143–152 (2013)

20. Legocki A.B.: Hilary Koprowski (1916–2013). Nauka, 2, 181–188 (2013).

21. Loew M.: CBS 5 Investigates mail order diseases, 2013, http://www.kpho.com/story/15896021/cbs-5-investigates-mail-order--diseases (12 stycznia 2015 roku)

22. Majak K.: Zatroskani rodzice celowo zarażają swoje dzieci. Ospa – party i zakażone lizaki coraz popularniejsze, http://natemat.pl/79403,zatroskani-rodzice-celowo-zarazaja-swoje-dzieci-ospa-party-i-zakazone-lizaki-coraz-popularniejsze (12 stycznia 2015 roku)

23. Majewska M.D.: Szczepionkowa polemika, zastrzyki kalectwa, racjonalny strach Polityka, 2012, http://www.polityka.pl/tygo-dnikpolityka/nauka/1529867,1,szczepionkowa-polemika.read (12 stycznia 2015 roku)

24. Miller L., Reynolds J.: Autism and vaccination-the current evi-dence. J. Spec. Pediatr. Nurs. 14, 166–172 (2009)

25. Mrożek D.: Wakcynologia Praktyczna. Wydanie III. α-medica press, Bielsko-Biała 2012

26. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny, Oświadczenie, 2009, http://szczepienia.pzh.gov.pl/i/dokumenty/Oswiadczenie.pdf (12 stycznia 2015 roku)

27. Nazarko-Ludwiczak E.: Pacjenci w sieci – popularność tematyki związanej ze zdrowiem w polskim Internecie, 12 czerwca 2012 (online), http://www.zdrowie.abc.com.pl/czytaj/-/artykul/pac-jenci-w-sieci--popularnosc-tematyki-zwiazanej-ze-zdrowiem-w-polskim-internecie?refererPlid=5259205 (12 stycznia 2015 roku)

28. Niemiałtowski M.: Wspomnienie Profesor Hilary Koprowski (1916–2013). Post. Mikrobiol. 52, 2, 133–134 (2013)

29. Orenstein W., Seib K.: Mounting a Good Offense against Measles. N. Engl. J. Med. 371, 1661–1663 (2014)

30. Poland G.A., Jacobson R.M.: The age-old struggle against the antivaccinationists. N. Engl. J. Med. 364, 97–99 (2011)


31. Pracownicy Zakładu Wirusologii Państwowego Zakładu Higieny. Mirosław Kańtoch 1928–2007. Przegl. Epidemiol. 61, 607–608 (2007)

32. Rashid, H., Khandaker G., Booy R.: Vaccination and herd immunity: what more do we know? Curr. Opin. Infect. Dis. 25, 3, 243–249 (2012)

33. Rogalska J., Paradowska-Stankiewicz I.: Mumps in Poland in 2012. Przegl Epidemiol. 68, 191–193 (2014)

34. Rotkiewicz M.: Anatomia strachu. Medycyna Praktyczna Szczepienia, 2, 13–17 (2013)

35. Rotkiewicz M.: Zastrzyk strachu. Polityka, 31, 27–29 (2012) 36. Roush S.W., Murphy T.V.: Vaccine-Preventable Disease Table

Working Group. Historical comparisons of morbidity and mortality for vaccine-preventable diseases in the United States. JAMA, 298, 2155–2163 (2007)

37. Schollenberger A.: Wspomnienie Profesor dr habilitowany Marek Niemiałtowski 1945–2014. Post. Mikrobiol. 53, 3, 207–209 (2014)

38. Smallpox and the antivaccinationists. Biomedical History, 388–389 (2009)

39. Stewart G.: The law tries to decide whether whooping cough vaccine causes brain damage: Professor Gordon Stewart gives evidence. BMJ, 293, 203 (1986)

40. Tarczoń I., Domaradzka E., Czajka H.: Co na temat szczepień wiedzą rodzice pracownicy ochrony zdrowia? Przegl. Lek. 1–2, 27–33 (2009)

41. Wallace A.: An epidemic of fear: how panicked parents skipping shots endangers us all, 2009, http://www.wired.com/2009/10/ff_waronscience/ (12 stycznia 2015 roku)

42. Warchala M.: Dziecięce ospa party, 2012, http://wyborcza.pl/1,76842,10969148,Dzieciece_ospa_party.html (12 stycznia 2015 roku)

43. Williams G.: Angel of death: the story of smallpox. Houndmills, UK Palgrave Macmillan 2011

44. Witt M.A., Arias L., Katz P.H., Truong E.T., Witt D.J.: Reduced risk of pertussis among persons ever vaccinated with whole cell pertussis vaccine compared to recipients of acellular pertussis vaccines in a large US cohort. Clin. Infect. Dis. 56, 1248–1254 (2013)

45. Wheeler B.: Why do parents buy chickenpox lollies? Washing-ton, BBC News, 2011, http://www.bbc.co.uk/news/magazine- 15647434 (12 stycznia 2015 roku)

46. Wolfe R.M., Sharp L.K.: Anti-vaccinationists past and present. BMJ. 325, 430–432 (2002)

47. Wolfe R.M., Sharp L.K., Lipsky M.S.: Content and design attributes of antivaccination web sites. JAMA, 287, 3245–3248 (2002)

48. Wysocki J., Cichowicz-Kostrzyńska M., Jankowska A.: Szcze-pienia w profilaktyce zespołu różyczki wrodzonej Przew. Lek. 6, 101–105 (2003)


* Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

1. Wstęp

W ostatnich latach nastąpiły zmiany w klasyfikacji gronkowców izolowanych od zwierząt. Zastosowanie metod biologii molekularnej umożliwiło dokładną identyfikację poszczególnych gatunków oraz pozna-nie ich występowania. Wnikliwe badania gronkowców izolowanych od psów i innych zwierząt doprowadziły do opisania w roku 2005 nowego gatunku Staphylococcus pseudintermedius, który razem ze Staphylococcus intermedius oraz Staphylococcus delphini zaliczono do tzw. grupy SIG (Staphylococcus intermedius group) [18]. Obecnie wiadomo, że gronkowce dawniej izolowane od psów i rozpoznawane jako S. intermedius, w rzeczywi-stości należą do gatunku S. pseudintermedius. Bakterie te występują najczęściej u psów jako element fizjolo-gicznej mikrobiota skóry i błon śluzowych chociaż mogą być także czynnikiem etiologicznym zapaleń skóry, zapleń ucha zewnętrznego, itp. [4, 21, 37].

Od zwierząt izolowanych jest co najmniej siedem gatunków gronkowców koagulazo-dodatnich,

jak: S. pseudin termedius, S. aureus, S. schleiferi subsp. coagulans, S. delphini, S. intermedius, S. hyicus oraz S. lutrae [4, 21, 37]. Vaclav Hajek opisując w latach siedemdziesiątych S. intermedius jako nowy gatunek zwrócił uwagę na zróżnicowanie cech fenotypowych tych bakterii [31]. Przypuszczano, że może to wynikać równoczesnego występowania u zwierząt więcej niż jednego gatunku gronkowców. Ich klasyfikację upo-rządkowano dopiero po odkryciu S. pseudintermedius oraz utworzeniu grupy SIG. Gatunek S. pseudintermedius wyodrębniono po dokładnej analizie genetycznej szczepów wyizolowanych od kotów, psów, koni i papug. W roku 2007 dwa zespoły przedstawiły wyniki badań wykonanych przy pomocy metod biologii molekular-nej dotyczące szczepów uprzednio rozpoznanych jako S. intermedius. Okazało się, że wszystkie izolaty pocho-dzące od psów, kotów oraz ludzi należały do gatunku S. pseudintermedius. Większość szczepów wyizolowa-nych od gołębi hodowlanych oraz koni zidentyfiko-wano jako S. delphini. Z kolei izolaty od gołębi miejskich w większości rozpoznano jako S. intermedius [62].

STAPHYLOCOCCUS PSEUDINTERMEDIUS– TRUDNO ROZPOZNAWALNY PATOGEN

Magdalena Kizerwetter-Świda1, Dorota Chrobak-Chmiel1, Magdalena Rzewuska1, Marian Binek1

1 Zakład Mikrobiologii, Katedra Nauk Przedklinicznych, Wydział Medycyny Weterynaryjnej,Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

Wpłynęło w czerwcu 2013 r.

1. Wstęp. 2. Grupa Staphylococcus intermedius (SIG, Staphylococcus intermedius group). 3. Występowanie S. pseudintermedius. 4. Potencjał zoonotyczny S. pseudintermedius. 5. Identyfikacja. 6. Typowanie genetyczne. 7. Wykrywanie oporności na meticylinę u szczepów S. pseudinter medius – metody fenotypowe. 8. Wykrywanie oporności na meticylinę u S. pseudintermedius – metody genotypowe. 9. S. pseudin termedius – oporność na antybiotyki i chemioterpautyki. 10. Podsumowanie

Staphylococcus pseudintermedius – a pathogen difficult to identify

Abstract: Staphylococcus pseudintermedius has recently been described as a member of the Staphylococcus genus. Three closely related staphylococci (Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus intermedius and Staphylococcus delphini) with very similar phenotypic characteristics form the S. intermedius group (SIG). In fact, majority of strains previously recognized as S. intermedius isolated from dogs were reclassified to the species S. pseudintermedius. Within the SIG, S. pseudintermedius represents the major pathogenic species and is involved in a wide variety of infections, mainly in dogs, but also in other animal species and humans. Recently, an increase has been observed in the frequency of infections caused by methicillin-resistant S. pseudintermedius (MSRP) in animals, especially in dogs and humans. The identification of S. pseudintermedius in veterinary laboratories is usually not difficult, however, in laboratories working with materials collected from people the risk of misidentification is high. Moreover, the demonstration of the mecA gene may be a challenge in diagnostic laboratories. The objective of this review is to summarize the current knowledge of Staphylococcus pseudintermedius, including MRSP, with the emphasis on taxonomy, occurrence and diagnostics. Furthermore, this review present also the genetic basis of antimicrobial resistance in S. pseudintermedius.

1. Introduction. 2. Staphylococcus intermedius group (SIG) 3. The occurrence of S. pseudintermedius. 4. Zoonotic potential of S. pseudin termedius. 5. Identification. 6. Genetic typing. 7. Detection of methicillin resistance in S. pseudintermedius – phenotypic methods. 8. Detection of methicillin resistance in S. pseudintermedius – genotypic methods. 9. S. pseudintermedius – resistance to antimicrobials. 10. Summary

Słowa kluczowe: Staphylococcus pseudintermedius, identyfikacja, lekoopornośćKey words: Staphylococcus pseudintermedius, identification, drug resistance

104 MAGDALENA KIZERWETTER-ŚWIDA, DOROTA CHROBAK-CHMIEL, MAGDALENA RZEWUSKA, MARIAN BINEK

Narastanie oporności na antybiotyki wśród gron-kowców jest zjawiskiem powszechnie znanym. Istotnym problemem związanym z leczeniem chorób wywoływa-nych przez te bakterie jest ich oporność na antybiotyki β-laktamowe. Opisane zjawisko wynika z obecności genu mecA w obrębie gronkowcowej kasety chromo-somalnej mec (SCCmec – staphylococcal cassette chro-mosome mec). Szczepy S. pseudintermedius niosące gen mecA określane są jako MRSP (methicillin-resistant S. pseudintermedius) i podobnie jak MRSA (methicil-lin-resistant Staphylococcus aureus) są zwykle wielo-lekooporne, ponieważ SCCmec często zawiera również geny oporności na inne antybiotyki i chemioteraputyki. Wzrost częstości występowania u psów zakażeń MRSP szczególnie wyraźnie zaznaczył się po roku 2006 [46, 58, 69]. Szczepy MRSP izolowane są również od kotów, koni, ptaków oraz ludzi [61, 79].

2. Grupa Staphylococcus intermedius (SIG, Staphylococcus intermedius group)

Jednocześnie z odkryciem S. pseudintermedius utwo-rzono również grupę S. intermedius. Obejmuje ona trzy gatunki blisko spokrewnionych gronkowców. Analiza sekwencji genów 16S rRNA gatunków zaliczanych do SIG wykazała, że podobieństwo analizowanych sekwen-cji przekracza 99% [4, 62]. Wiadomo również, że iden-tyfikacja tych bakterii jest szczególnie trudna, gdyż ich cechy fenotypowe często pokrywają się, co powoduje, że rozpoznanie gatunku umożliwiają jedynie metody biologii molekularnej. S. pseudintermedius jest u psów dominującym gatunkiem gronkowców i sporadycznie występuje tylko u innych zwierząt oraz u ludzi. Wyniki badań Guardabassi i wsp. (2012) wskazują na to, że gatunek ten może występować także u lisów, zwierząt należących do psowatych (Canidae) [30].

Gatunek S. delphini pierwotnie został wyizolowany ze zmian ropnych na skórze delfinów, co miało miejsce w roku 1988 [77]. Najnowsze wyniki badań wskazują, że występuje on również u norek, gołębi hodowlanych oraz koni [62]. Najmniej jest danych dotyczących występowania u zwierząt S. intermedius. Na podstawie pracy opublikowanej przez Sasaki i wsp. (2007) wia-domo, że gatunek ten występuje u gołębi miejskich [62].

3. Występowanie S. pseudintermedius

S. pseudintermedius stanowi element fizjologicznej mikrobiota skóry i błon śluzowych psów, jest izolo-wany od 90% zdrowych zwierząt, u których najczęściej występuje na skórze krocza oraz na błonie śluzowej jamy ustnej [12, 19, 21]. Przy rozpoznawaniu nosiciel-stwa zalecane jest pobieranie materiału właśnie z tych

miejsc. Szczepy występujące u psów charakteryzują się dużym zróżnicowaniem cech genotypowych, co przy-puszczalnie związane jest z zachowaniami społecznymi psów, obejmującymi obwąchiwanie poszczególnych osobników, co ułatwia transmisję szczepów między zwierzętami [4, 22]. S. pseudintermedius jako patogen oportunistyczny może być czynnikiem etiologicznym chorób skóry, zakażeń zewnętrznego przewodu słucho-wego, zakażeń ran, układu moczowo-płciowego, czy zakażeń układowych [21, 37].

Transmisji gronkowców sprzyja ich zdolność do utrzymywania się w środowisku. Fakt ten potwierdzają liczne doniesienia dotyczące izolacji S. pseudintermedius, w tym również szczepów opornych na meticy-linę z próbek pochodzących z klinik weterynaryjnych oraz z domów właścicieli psów [4, 22, 32]. Szczegól-nie istotne dla epidemiologii chorób gronkowcowych wydaje się występowanie tych bakterii w środowisku klinik weterynaryjnych, co przyczynia się do transmi-sji na zwierzęta i wywoływania zakażeń szpitalnych i stanowi również potencjalne zagrożenie dla zatrud-nionych tam osób. W badaniach przeprowadzonych w klinikach weterynaryjnych stwierdzono występo-wanie S. pseudintermedius m.in na klawiaturach kom-puterowych [8], a szczepów opornych na meticylinę na telefonach [36] oraz fartuchach noszonych przez lekarzy weterynarii [70].

Nosicielstwo oraz zakażenia o etiologii S. pseudintermedius u kotów domowych są znacznie rzadziej spo-tykane niż u psów [32]. Ponadto klon ST71 t02 II–III S. pseudintermedius izolowany od kotów w Europie jest klonem dominującym w tym rejonie świata u psów, co sugeruje jego przypadkową transmisję. Hariharan i wsp. (2011) z materiału pobranego od kotów ani razu nie wyizolowali S. pseudintermedius, natomiast najczęściej stwierdzali obecność Staphylococcus felis i Staphylococcus simulans [33]. Z kolei Abraham i wsp. (2007) zaob-serwowali występowanie S. pseudintermedius u 22% badanych kotów [1]. Różnica w uzyskanych wyni-kach mogła być spowodowana faktem, że pierwsze ze wspomnianych doświadczeń prowadzono na popula-cji kotów wolnożyjących w miastach, natomiast drugie na grupie kotów, których właścicielami byli studenci oraz pracownicy szkoły weterynaryjnej w USA. Spo-radycznie S. pseudintermedius izolowany jest od kotów z obawami zapalenia skóry, zapalenia zewnętrznego przewodu słuchowego lub ropni [38].

Literatura podaje przypadki występowania S. pseudintermedius, w tym również MRSP u koni. Wydaje się jednak, że od koni najczęściej izolowane są gronkowce złociste oraz S. delphini [48, 78].

Opublikowano także dane dotyczące podklinicz-nego zapalenia gruczołu mlekowego o etiologii MRSP u krów w stadzie we Włoszech [59]. Autorzy tych badań zauważyli, że mimo niskiego rozpowszechnienia bak-

STAPHYLOCOCCUS PSEUDINTERMEDIUS – TRUDNO ROZPOZNAWALNY PATOGEN 105

terii w zainfekowanych ćwiartkach wymienia, w mleku stwierdzano wysoką liczbę komórek somatycznych, co świadczy o silnej indukcji reakcji zapalnej przez wspomniane gronkowce. Zakażenie u krów było w tym przypadku wywołane przez klon ST71 t02 II–III, domi-nujący wśród psów w Europie.

Inny przykładem nietypowego dla MRSP gospo-darza jest szczur wędrowny (Rattus norvegicus) [34]. Szczury jako wektory wielu chorób przenoszących się na ludzi zostały przebadane w Vancouver w Kana-dzie pod kątem występowania gronkowców opornych na meticylinę i okazało się, że wyizolowano od nich szczepy MRSP o właściwościach genotypowych typo-wych dla szczepów psich.

4. Potencjał zoonotyczny S. pseudintermedius

Przypadki izolacji S. pseudintermedius od ludzi są notowane sporadycznie, jednak na szczególną uwagę zasługuje fakt, że częstość izolacji od ludzi, którzy mają stały kontakt z psami, jest większa. Przykładowo, w badaniach przeprowadzonych na 3397 szczepach gronkowców koagulazo-dodatnich wyizolowanych od ludzi, zaledwie dwa z nich rozpoznano jako S. pseudintermedius [47]. Ocenia się, że kolonizacja ludzi przez ten gatunek kształtuje się na poziomie poniżej 1%. Natomiast u właścicieli psów bezobjawowe występowa-nie S. pseudintermedius jest częściej spotykane i stwier-dzono je u 3,7% badanych osób, przy czym szczepy izolowane od ludzi i zwierząt charakteryzowały się identycznymi cechami genotypowymi [32, 63]. Guarda-bassi i wsp. (2004) wykazali obecność S. pseudintermedius na błonie śluzowej nosa u 7 spośród 13 właścicieli psów, u których stwierdzono głębokie ropne zapale-nie skóry [29]. Co więcej 6 szczepów wyizolowanych od ludzi i psów cechowały się tymi samymi profilami PFGE (pulsed field gel electrophoresis).

U zdrowych osób stwierdzano także występowanie szczepów S. pseudintermedius opornych na meticylinę, przy czym częściej odnosiło się to do osób mających stały kontakt z psami. Nosicielstwo MRSP w Ameryce Północnej dotyczy około 5,2% lekarzy weterynarii [53, 82]. Jeśli chodzi o właścicieli psów, odsetek ten jest nawet większy i wynosi 13,3% [22]. Co ciekawe, ponowne badanie bakteriologiczne w kierunku obec-ności MRSP przeprowadzane u właścicieli psów po dwóch miesiącach dało wyniki ujemne, co może suge-rować przejściowy typ nosicielstwa tego gatunku gron-kowca. W przeciwieństwie do tego Paul i wsp. (2011) wykazali, że u lekarzy weterynarii zbadanych ponownie po upływie jednego miesiąca, MRSP nadal były obecne [57]. Powyżsi autorzy zjawisko to tłumaczą ciągłą eks-pozycją lekarzy weterynarii na szczepy MRSP pocho-dzące od pacjentów.

Szczepy MSSP (methicillin-susceptible S. pseudintermedius) oraz MRSP mają zdolność do rozprzestrze-niania się nie tylko wśród zwierząt, ale mogą także przenosić się z psów na ludzi oraz z ludzi na psy. Przy-kład takiej transmisji opisano w klinice weterynaryjnej w Holandii, gdzie od 5 psów oraz jednego kota z zaka-żonych ran pooperacyjnych wyizolowano MRSP [75]. Szczepy o identycznym profilu oporności uzyskano również od chirurga weterynaryjnego oraz od 3 spo-śród 6 pielęgniarek, a także z próbek środowiskowych pobranych w klinice. Co więcej udowodniono również, że szczep MRSP o identycznej charakterystyce wyizolo-wano z błony śluzowej nosa psa, którego właścicielem był pracownik tej kliniki.

Przedstawione powyżej dane wskazują na wielokie-runkową transmisję S. pseudintermedius w tym również pomiędzy psami i ludźmi. Choć nosicielstwo u ludzi ma zwykle charakter przejściowy, to w sprzyjających oko-licznościach może dojść do zakażenia, które podobnie, jak kolonizacja częściej ma miejsce u ludzi kontaktu-jących się z psami.

W poprzednich latach zakażenia u ludzi wywo-ływane przez gronkowce pochodzące od psów doty-czyły głównie ran po pokąsaniu przez te zwierzęta [45]. Zastosowanie metod biologii molekularnej do identyfikacji gronkowców koagulazo-dodatnich izolo-wanych od zwierząt powoduje, że S. pseudintermedius oraz MRSP częściej są rozpoznawane jako przyczyny zakażeń u ludzi, chociaż nadal przypadki te należą do wyjątków. Ostatnio coraz częściej pojawiają się donie-sienia dotyczące zakażeń u ludzi wywoływanych przez gronkowce należące do tego gatunku [40, 74] i dotyczą ran pooperacyjnych [41, 42], zatok [60], serca u osób starszych po wszczepieniu rozrusznika [76], podob-nie żylaków i w konsekwencji owrzodzeń żylakowych u osób starszych [40] oraz ropni mózgu [2]. Doprowa-dzają również do bakteriemii w następstwie instalowa-nia dożylnych kateterów cewników itp. [14]. Opisywane są również przypadki zakażeń wywoływanych przez MRSP, jak np.: szpitalne zapalania płuc [25], nawra- cające zapalenia zatok przynosowych [73], czy zakaże-nia u biorców szpiku kostnego [67]. Pacjenci ci mają zwykle stały kontakt z psami.

Pierwszy opisany przypadek zakażenia przez S. pseudintermedius człowieka pochodzi z Belgii, z roku 2006 [76]. Wyizolowany gatunek rozpoznano na podstawie jego cech genotypowych, przy czym pierwotna diag-noza oparta jedynie na podstawie wyników uzyskanych z testów APIStaph (BioMérieux) oraz Phoenix (BD) wskazywała na S. aureus, z trafnością odpowiednio 88,5% oraz 97%. Jak wiadomo, oba systemy bioche-micznej identyfikacji nie uwzględniają S. pseudintermedius. Badany szczep wyizolowano z miejsca wszczepie-nia rozrusznika serca. Autorzy nie podają informacji na temat kontaktu pacjenta z psem.


Można przypuszczać, że wyniki badań dotyczące występowania S. pseudintermedius u ludzi są zaniżone, ponieważ istnieje duże prawdopodobieństwo błędnego rozpoznawania wspomnianych gronkowców jako nale-żących do S. aureus lub CNS (coagulase-negative sta-phylococci) [4].

Pottumarthy i wsp. (2004) zwracają uwagę na moż-liwość rozpoznania S. pseudintermedius jako S. aureus [60]. Wspomniany zespół opisał przypadek, w którym uzyskano wynik fałszywie dodatni posługując się testem lateksowym wykorzystywanym do wykrywania białka PBP2a S. aureus. Badane szczepy wyizolowano od ludzi i były one β-hemolityczne oraz koagulazo-dodatnie, co sugerowało zakwalifikowanie ich jako MRSA, jednak po zastosowaniu metod biologii molekularnej okazało się, że jest to S. pseudintermedius.

5. Identyfikacja

Precyzyjna identyfikacja gronkowców koagulazo--dodatnich wyizolowanych od psów i innych zwierząt nabrała szczególnego znaczenia wraz z potwierdze-niem występowania u nich patogennych szczepów MRSA oraz MRSP. Z tego powodu zwrócono uwagę na konieczność dokładnego rozpoznawania gatunków w obrębie tej grupy gronkowców. Szczególnie dotyczy to laboratoriów weterynaryjnych, jak również laborato-riów badających materiały pobierane od ludzi. Można przypuszczać, że w przypadku badania próbek pocho-dzących od ludzi prawidłowe rozpoznanie może być nawet trudniejsze, choćby z powodu braku doświad-czenia personelu takich placówek w rozpoznawaniu typowo weterynaryjnych patogenów [4]. Prawidłowa identyfikacja szczepów MRSA oraz MRSP jest szcze-gólnie istotna, ze względu na ich odmienny potencjał zoonotyczny oraz różnice w wartościach granicznych przy określaniu lekowrażliwości [37].

S. pseudintermedius tworzy kolonie okrągłe, śred-niej wielkości, wypukłe, barwy białej. Na podłożu z dodatkiem krwi owczej lub bydlęcej wokół kolonii widoczna jest strefa podwójnej β-hemolizy. Na pod- łożu z krwią końską hemoliza nie jest obserwowana. Szczepy S. pseudintermedius zwykle nie wytwarzają koagulazy związanej (CF, clumping factor). W testach opartych na aglutynacji służących do wykrywania CF, białka A i antygenów powierzchniowych S. aureus rów-nież dają wynik ujemny [4, 21]. Wymienione powy-żej cechy mogą powodować błędne rozpoznanie tego gatunku jako CNS.

Wiadomo również, że u około 30% szczepów gron-kowców złocistych izolowanych od zwierząt obserwuje się kolonie o białej barwie. Pozostałe gatunki gron-kowców koagulazo-dodatnich występujące u zwierząt również tworzą kolonie o podobnym wyglądzie, barwy białej, otoczone strefą β-hemolizy. Może się wydawać, że rozpoznawanie gronkowców koagulazo-dodatnich nie jest trudne. Należy jednak pamiętać, że u około 30% szczepów S. aureus nie stwierdza się aktywności koagulazy [51]. Jak wynika z danych literaturowych oraz badań własnych, także część szczepów S. pseudintermedius daje wynik ujemny w próbie probówkowej na wykrywanie koagulazy, jak również w próbie szkiełko-wej na wykrywanie CF [24].

W tabeli I przedstawiono wybrane cechy bioche-miczne gronkowców koagulazo-dodatnich izolowanych od psów. Porównanie wymienionych w tabeli cech może być pomocne w identyfikacji S. pseudintermedius, jed-nak należy pamiętać, że żadna z cech fenotypowych nie pozwala na właściwe rozpoznanie gatunków w obrębie grupy SIG, a jedynie pewną identyfikację uzyskuje się po zastosowaniu metod biologii molekularnej.

Interpretację wyników badania cech fenotypo-wych utrudniają sprzeczne dane literaturowe, doty-czące wyników niektórych testów biochemicznych. DeVriese i wsp. (2005) podają wynik próby na wytwa-

Hemoliza na podłożu z krwią + + + + +Koagulaza – próba probówkowa +* + + + +*Clumping factor V – V – +Próba Voges Proskauera Słabo (+) – – + +Wytwarzanie kwasu z D-trechalozy + – + – +Wytwarzanie kwasu z D-laktozy + + + – +Wytwarzanie kwasu z D-mannitolu V + – V +Dihydrolaza argininy + – – + +

Tabela IWybrane cechy biochemiczne gronkowców koagulazo-dodatnich izolowanych od psów

V – cecha zmienna; +* – część szczepów daje wynik ujemny

S. pseudintermedius S. delphini S. intermedius S. schleiferi

subsp. cogulans S. aureus


rzanie acetoiny dla S. pseudintermedius jako dodatni [18]. Późniejsze badania przeprowadzone przez inny zespół (Sasaki i wsp. 2007) wskazują, że 66% szczepów z tego gatunku we wspominanej próbie daje wynik słabo dodatni, dodatkowo w większości przypadków wynik jest na tyle słabo wyrażony, że nie jest rozpo-znawany jako dodatni przy pomocy testu Rapid 32ID (bioMérieux) [62]. Dane literaturowe pierwotnie poda-wały, że S. intermedius można odróżnić od dwóch pozo-stałych gatunków z grupy SIG na podstawie ujemnego wyniku testu na wytwarzanie dihydrolozy argininy oraz pozytywnego wyniku beztlenowego rozkładu D-man-nitolu [62]. Wspomniane cechy zostały zweryfikowane i obecnie wiadomo, że również te dane nie są przydatne w identyfikacji bakterii w obrębie grupy SIG [66].

Dane literaturowe z okresu kiedy u zwierząt rozpo-znawano jedynie S. intermedius dokładnie charaktery-zują wspomniane bakterie, jednakże biorąc pod uwagę obecny stan wiedzy, wysoce prawdopodobnym jest, że w rzeczywistości dotyczyły one S. pseudintermedius i w mniejszym stopniu również S. delphini, S. intermedius oraz S. schleiferi subsp. coagulans. Potwierdzają to najnowsze wyniki badań nad S. pseudintermedius roz-poznanych aktualnie metodami biologii molekularnej. Również cechy biochemiczne wspomnianych izolatów nie pokrywają się z cechami gronkowców stwierdza-nych wcześniej u psów jako S. intermedius [19].

Dostępne zestawy komercyjne do identyfikacji gron- kowców na podstawie cech biochemicznych nie po- zwalają na rozpoznanie gatunku S. pseudintermedius, ponieważ nie znaleziono cech biochemicznych cha-rakterystycznych tylko dla tego gatunku. Co więcej zestawy takie są tworzone na podstawie badań szcze-pów pochodzących od ludzi i tworzone bazy danych nie uwzględniają patogenów weterynaryjnych. Potwier-dzają to wyniki badania skuteczności trzech komer-cyjnych testów do identyfikacji gronkowców wyizolo-wanych od zwierząt [24]. Przy pomocy popularnego w Polsce testu API Staph 32 (bioMérieux) prawidłowo rozpoznano wszystkie badane S. aureus, ale wszystkie S. pseudintermedius rozpoznano jako S. intermedius lub wynik testu nie dawał rozpoznania. Badano również test RapID (Remal), przy pomocy którego rozpoznano 81,8% badanych gronkowców złocistych oraz jedynie 4 spośród 12 badanych S. pseudintermedius zidentyfiko-wano jako S. intermedius, pozostałe wyniki wskazywały CNS lub nie uzyskano identyfikacji. Ostatni oceniany test Staph-Zym (Rosco Diagnostica) nie pozwolił na rozpoznanie żadnego z gronkowców złocistych oraz żadnego S. pseudintermedius, uzyskiwane wyniki wska-zywały CNS lub test nie dawał rozpoznania.

Zautomatyzowane systemy szybkiej identyfikacji bakterii oparte na spektrometrii mas typu MALDI ToF (Matrix assisted laser desorption/ionisation time of

flight) mogą być przydatne do identyfikacji gatunków należących do grupy SIG, jeśli stosowane bazy danych uwzględniają również te bakterie. Czułość metody MALDI ToF do identyfikacji S. pseudintermedius oce-niono na 78%, swoistość na 97% [16].

Gatunki należące do grupy SIG są ze sobą blisko spo-krewnione i sekwencjonowanie genów 16S rRNA nie jest przydatne do ich identyfikacji, ponieważ ich podo-bieństwo przekracza 99% [18]. Poszczególne gatunki można rozpoznać na podstawie różnic w sekwencjach innych genów, jak np.: hsp60, sodA, termonukleazy nuc oraz katalazy kat. W laboratoriach często stoso-wana jest łatwiejsza w wykonaniu technika multipleks PCR opracowana do identyfikacji gronkowców koagu-lazo-dodatnich izolowanych od zwierząt, bazująca na sekwencji genu termonukleazy nuc [64]. Opracowano również technikę RFLP-PCR opartą na sekwencji genu katalazy kat [10]. Kolejna technika wykorzystująca tra-wienie produktu PCR polega na amplifikacji fragment genu pta, a uzyskany produkt poddawany jest trawie-niu z użyciem enzymu MboI [3]. Produkty amplifika-cji uzyskane ze szczepów S. pseudintermedius ulegają trawieniu, natomiast produkty ze szczepów S. delphini oraz S. intermedius nie trawią się. Jednak późniejsze wyniki badań wykazały, że przy pomocy tej metody około 1% szczepów S. peudintermedius wykazujących heterogenność w miejscu restrykcyjnym, nie jest roz-poznawanych [71]. Obecnie metoda ta nie znajduje zastosowania w identyfikacji S. pseudintermedius.

Na podstawie wyników badań gronkowców izo-lowanych od różnych gatunków zwierząt, przyjęto, że szczepy pochodzące od psów o charakterystyce feno-typowej uznawanej za typową dla gatunku S. intermedius, można rozpoznawać jako S. pseudintermedius bez stosowania dodatkowych badań metodami biologii molekularnej [19]. Takie postępowanie ma ułatwić codzienną pracę w laboratoriach, jest ono oparte na fakcie, że inne gatunki z grupy SIG u psów praktycz-nie nie występują. Wiadomo również, że precyzyjne rozpoznanie tego gatunku jest możliwe jedynie z uży-ciem metod biologii molekularnej. Ustalono również, że gronkowce izolowane od innych gatunków zwierząt o takiej charakterystyce fenotypowej można rozpoznać jedynie jako należące do grupy SIG, chyba, że stosuje się odpowiednie oznaczenia molekularne [19].

6. Typowanie genetyczne

Metody wykorzystywane do typowania szczepów w obrębie gatunku S. pseudintermedius są analogiczne do metod stosowanych dla S. aureus. Największe zróżni-cowanie uzyskuje się stosując technikę elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (PFGE, pulsed field


gel electrophoresis). Przykładem innej metody jest typowanie z ustaleniem sekwencji nukleotydowej frag-mentów wybranych genów metabolizmu podstawo-wego komórki – MLST (multilocus sequence typing), umożliwiające określenie typu sekwencyjnego bada-nych szczepów. Powszechnie stosowana jest metoda opracowana przez Bannoehr i wsp. (2007) polegająca na sekwencjonowaniu czterech genów (pta, cpn60, tuf, oraz agrD) [5]. W ostatnim czasie opisano nowy sche-mat typowania, który wykorzystuje sekwencje siedmiu genów (tuf, cpn60, pta, purA, fdh, sar oraz ack) [72]. Wykazano w ten sposób jeszcze większe zróżnicowa-nie szczepów S. pseudintermedius. Kolejną metodą jest „spatyping”, czyli typowanie na podstawie polimor-fizmu powtarzalnych regionów genu spa, kodującego białko A, a dokładnie jego zmiennego fragment X [52]. Zauważono jednak, że ponad 50% szczepów S. pseudintermedius wrażliwych na meticylinę nie poddaje się typowaniu przy pomocy tej metody.

Dla szczepów opornych na meticylinę dodatkowo określa się typ gronkowcowej kasety SCCmec. Niektóre typy kasety, jak np.: II, III, V stwierdzono zarówno u MRSA jak i MRSP, a także u innych gatunków gron-kowców, w tym koagulazo-ujemnych [27]. Ponadto u MRSP opisano unikatowe typy kasety SCCmec. Przykładem jednego z nich jest typ określany jako II–III [17]. Powstał on przez połączenie kasety typu III S. aureus oraz kasety typu II S. epidermidis. Inny unika-towy dla MRSP typ kasety SCCmec opisano w Stanach Zjednoczonych u typu sekwencyjnego ST68 [9]. Oka-zał się on skróconą wersją kasety typu V występującej u MRSA i oznaczono go jako VT (truncated version). Ponadto niektóre izolaty, zwykle należące do typu sekwencyjnego ST105 niosą kasety, które nie poddają się typowaniu przy użyciu dostępnych metod i są one określane jako nietypowalne.

Zestawienie wyników uzyskanych przy pomocy opisanych powyżej technik charakteryzuje właściwości genotypowe szczepów MRSP. Stwierdzono, że klonem dominującym w Europie jest ST71-t02-II–III, którego obecność stwierdzano w Niemczech, Szwajcarii, Ho- landii, Danii, Szwecji, we Włoszech oraz w Polsce [5, 9, 12, 39, 58, 61]. Natomiast w Ameryce Północnej domi-nuje klon oznaczony jako ST68-t06-V [5, 58]. Cechy obu linii klonalnych MRSP zapewniające im skuteczne rozprzestrzenianie się wśród psów nie zostały jeszcze scharakteryzowane. W przeciwieństwie do tego wśród szczepów MSSP istnieje ogromna różnorodność i nie stwierdzono dominacji określonego typu sekwen-cyjnego, ani profilu PFGE [9]. Co więcej, w obrębie wspomnianych szczepów są stale opisywane nowe typy sekwencyjne. Ogromne zróżnicowanie genetyczne u MSSP wyraźnie kontrastuje z ograniczoną liczbą typów sekwencyjnych obserwowanych u MRSP.

7. Wykrywanie oporności na meticylinę u szczepów S. pseudintermedius – metody fenotypowe

Do tej pory odnośnie wykrywania meticylinoopor-ności obowiązywały zalecenia opracowane w roku 2008 przez Clinical Laboratory Standards Institute [15] i zgodnie z nimi dla gronkowców koagulazo-dodatnich izolowanych od zwierząt należy stosować kryteria takie jak dla S. aureus, czyli w metodzie dyfuzyjnej używany jest krążek z cefoksytyną, wokół którego strefa zahamo-wania wzrostu o średnicy ≤ 21 mm oznacza oporność szczepu. W teście MIC (Minimal Inhibitory Concentra-tion) dla S. aureus z użyciem oksacyliny rekomenduje się stężenie ≥ 4 µg/ml jako wartość graniczną.

Schisser i wsp. (2009) porównali wyniki oznaczeń uzyskiwane przy zastosowaniu rekomendacji z 2008 oraz 2004 roku i stwierdzili, że graniczna wartość oksacyliny MIC ≥ 4 µg/ml pozwoliła na wykrycie jedy-nie 22 spośród 30 badanych MRSP [68]. Zastosowa-nie zgodnie z rekomendacjami z 2004 roku [55] war-tości granicznej MIC ≥ 0,5 µg/ml umożliwiło wykrycie 29 spośród 30 badanych szczepów. Przy zastosowaniu krążka z oksacyliną oraz przyjęcia średnicy zahamo-wania wzrostu dla wielkości ≤10 mm (rekomendacje z 2008) wykryto 21 szczepów, natomiast przyjęcie średnicy ≤ 17 mm (rekomendacje z 2004) pozwoliło na wykrycie wszystkich 30 szczepów MRSP. Test z cefo-ksytyną, w którym ustalono graniczne średnice zaha-mowania wzrostu ≤ 21 mm, pozwolił na rozpoznanie jedynie 2 szczepów, a przy przyjęciu wielkości średnicy ≤ 24 mm wykryto 13 spośród 30 badanych MRSP.

W doświadczeniu prowadzonym przez Bemisa i wsp. (2009) stwierdzono, że średnica strefy zahamowania wzrostu dla krążka z oksacyliną ≤ 17 mm oraz wartość MIC oksacyliny ≥ 0,5 µg/ml najlepiej koreluje z obec-nością genu mecA u szczepów S. pseudintermedius izolowanych od psów [6]. Zwrócono także uwagę, że większość szczepów MRSP nie jest rozpoznawanych w teście dyfuzyjnym z krążkiem z cefoksytyną i zało-żeniem średnicy strefy zahamowania wzrostu ≤ 24 mm jako granicznej [6, 7, 68].

Rozpoznawanie oporności na meticylinę wśród szczepów S. pseudintermedius wymaga szczególnej uwagi, ponieważ notowano szczepy niosące gen mecA, dla których MIC oksacyliny wynosiło ≥ 0,5 µg/ml, które były wrażliwe w teście dyfuzyjnym z oksacyliną i cefo-ksytyną [20]. U niektórych MRSP zaobserwowano rów-nież heterogenną ekspresję genu mecA, kiedy wokół krążka z oksacyliną nie ma strefy zahamowania wzrostu, a wokół krążka z cefoksytyną pojawia się strefa zahamo-wania wzrostu o średnicy pozwalającej na zakwalifiko-wanie tego szczepu jako wrażliwego na meticylinę [65].

Na podstawie powyższych obserwacji podkomi-sja przy CLSI ds. badania lekowrażliwości patogenów


weterynaryjnych zaleca stosowanie krążka z oksacyliną i przyjęcie granicznej średnicy zahamowania wzrostu wynoszącej ≤ 17 mm oraz wartości granicznej MIC oksacyliny wynoszącej ≥ 0,5 µg/ml [59]. Wspomniana podkomisja podkreśla nieprzydatność stosowania oznaczeń z krążkiem z cefoksytyną do wykrywania MRSP. W przypadkach szczepów wykazujących wie-lolekooporność i wrażliwość na cefoksytynę, sugero-wane jest zbadanie oporności na meticylinę innymi metodami. W 2013 roku CLSI opublikowało nowy dokument dotyczący wykrywania meticylinooporności u gronkowców izolowanych od zwierząt.

W identyfikacji meticylinoopornych szczepów S. pseudintermedius znajduje zastosowanie metoda wykrywania białka PBP2a przy pomocy testów opar-tych na aglutynacji lateksowej. Należy jednak mieć na uwadze fakt, że wspomniana metoda może dawać wynik fałszywie dodatni [60].

Obecnie nie ma dostępnych podłóż selektywnych przeznaczonych jedynie do izolacji meticylinoopor-nych S. pseudintermedius. W tym celu można stosować podłoża selektywne przeznaczone do badania MRSA. Testując różne podłoża selektywne stwierdzono, że najlepszy wzrost MRSP uzyskuje się na podłożu Oxa-cillin resistance screening agar base (ORSAB, Oxoid) oraz Brilliance MRSA agar (Brilliance agar, Oxoid) [35]. Słaby wzrost tych bakterii zaobserwowano na podłożach chromogennych ChROM agar MRSA (BD Diagnostics) oraz ChromID MRSA agar (ChromID, bioMérieux).

8. Wykrywanie oporności na meticylinę u S. pseudintermedius – metody genotypowe

Najbardziej wiarygodną metodą wykrywania opor-ności na meticylinę jest amplifikacja fragmentu genu mecA przy zastosowaniu techniki PCR. Metoda ta nie jest jednak rutynowo stosowana w laboratoriach wetery-naryjnych. Jak podają niektórzy badacze, pewne szczepy wykazują fenotypową wrażliwość na oksacylinę, mimo obecności genu mecA. U takich szczepów prawdopo-dobnie dochodzi do represji produkcji białka PBP2a za pośrednictwem genu represorowego mecI będącego jednym z genów regulatorowych operonu mec [82].

9. S. pseudintermedius – oporność na antybiotyki i chemioterpautyki

Szczepy S. pseudintermedius wrażliwe na meticy-linę na ogół dobrze poddają się leczeniu przy użyciu antybiotyków i chemioterapeutyków powszechnie sto-sowanych w medycynie i weterynarii [37]. Notowana jest wśród nich oporność na penicylinę oraz amoksycy-

linę, ale na ogół wykazują wrażliwość na cefalosporyny, amoksycylinę z kwasem klawulanowym, fluorochino-lony, klindamycynę oraz sulfonamidy [26]. Natomiast leczenie chorób o etiologii MRSP jest szczególnym wyzwaniem dla lekarzy. Pamiętając o wielolekoopor-ności tych szczepów leczenie należy zawsze prowadzić na podstawie wyników antybiogramu [13].

Wielolekooporność szczepów MRSP jest obecnie głównym problemem w klinicznej praktyce wetery-naryjnej małych zwierząt. Wśród szczepów opornych na meticylinę na ogół występuje również oporność na sulfametoksazol z trimetoprimem, gentamicynę, erytromycynę, klindamycynę, fluorochinolony oraz na tetracyklinę. W poszczególnych krajach oporność S. pseudintermedius na antybiotyki notowana jest z róż-nym nasileniem [20, 28, 58, 61]. Oporność na niektóre antybiotyki dotyczyć może nawet 100% badanych szczepów. Stwierdzono również, że szczepy MRSP pochodzące z Ameryki Północnej są często wrażliwe na chloramfenikol, rifampicynę i amikacynę [58]. Z kolei w Europie częściej występuje oporność wspomnianych gronkowców na chloramfenikol oraz wrażliwość na minocyklinę [37, 38, 81]. Świadczy to o różnych profilach oporności u klonów dominujących w tych regionach świata.

Skuteczne w leczeniu zakażeń o etiologii MRSP mogą być: rifampicyna, minocyklina, chloramfenikol, amikacyna oraz wankomycyna. Problemem dla prak-tykujących lekarzy weterynarii jest fakt, że wiele z tych leków nie jest zarejestrowanych do stosowania w wete-rynarii lub nie są przeznaczone do stosowania u psów i kotów. Co więcej, niektóre w dokumencie dotyczą-cym oporności drobnoustrojów opublikowanym przez WHO zostały zaliczone do grupy tzw. niezwykle istot-nych antybiotyków, które powinny być zarezerwowane do leczenia ludzi [23, 73].

Oporność na penicylinę wśród gronkowców jest dość często spotykanym zjawiskiem. Szczepy MSSP wykazują oporność na penicylinę w 50–80%, zależ-nie od regionu świata, gdzie były prowadzone bada-nia [26, 43, 44]. Oporność na penicylinę jest związana z występowaniem genu blaZ, kodującego β-laktamazy o wąskim spektrum substratowym. Z kolei gen mecA występujący u szczepów MRSP warunkuje produk-cję zmienionego białka wiążącego penicyliny PBP2a (PBP2’). Białko to cechuje się małym powinowactwem do antybiotyków β-laktamowych, zdolność do jego wytwarzania zapewnia komórkom bakteryjnym opor-ność na wszystkie antybiotyki β-laktamowe, w tym cefalosporyny oraz karbapenemy. U większości szcze-pów S. pseudintermedius opornych na meticylinę wystę-puje również gen blaZ [38, 58, 64].

Oporność na rifampicynę wśród gronkowców izo-lowanych od zwierząt notowana jest bardzo rzadko. Wśród 103 MRSP Perreten i wsp. (2010) stwierdzili


oporność na ten antybiotyk jedynie u 2 badanych szcze-pów [58]. Z kolei badając mechanizm oporności u tych dwóch izolatów potwierdzono występowanie mutacji w genie rpoB, kodującym podjednostkę β polimerazy RNA [39]. Zwrócono również uwagę na możliwość narastania oporności na rifampicynę przy powszech-nym jej stosowaniu. Aby zapobiegać temu zjawisku zaproponowano użycie rifampicyny w terapii łączo-nej. Wyniki najnowszych badań przeprowadzonych w Brazylii wskazują, że o ile wśród MSSP oporność na rifampicynę utrzymuje się na niskim poziomie (4,1%), to u MRSP dotyczy już 16,7% badanych szczepów [11].

Wśród S. pseudintermedius stwierdzono występowa-nie trzech różnych genów oporności na tetracykliny. Obecność genów tetK oraz tetL warunkuje oporność na tetracyklinę, ale gronkowce pozostają wrażliwe na minocyklinę. Geny tetK oraz tetL kodują białka nale-żące do rodziny transporterów błonowych MFS (major facilitator superfamily), a białka TetK i TetL aktywnie usuwają tetracykliny z komórek bakteryjnych. Nato-miast gen tetM warunkuje oporność na wszystkie tetra-cykliny, w tym również na minocyklinę, koduje białko chroniące rybosomy przed działaniem tetracyklin [80].

Perreten i wsp. (2010) wśród 103 badanych MRSP u 69,9% izolatów stwierdzili oporność na tetracyklinę [58]. Dominował u nich gen tetK (72,2%). Wykryto również obecność genu tetM (25%), jak również nie-których szczepów występowały oba geny tetK i tetM (2,7%). Dominację genu tetK na terenie Europy potwierdzają również wyniki uzyskane w Hiszpanii [28] oraz w Niemczech [69]. Wyniki badań przepro-wadzonych w Polsce świadczą o oporności na tetra-cyklinę u 53,4% szczepów MSSP oraz u 78,6% MRSP [44]. Na podstawie przedstawionych wyników można wnioskować o skuteczności minocykliny wobec szcze-pów MRSP izolowanych w Europie. Z kolei wyniki prac prowadzonych w Korei wskazują na wyraźną dominację genu tetM, którego obecność stwierdzono u 28 spośród 29 badanych S. pseudintermedius [43]. U jednego izo-latu występował gen tetL, natomiast oba geny tetK oraz tetM wykryto u czterech izolatów. Gen tetM występo-wał także u wszystkich badanych MSSP w Tunezji, gdzie oporność na tetracyklinę dotyczyła 40% izolatów [26].

Kolejna praca dotyczyła oporności na minocyklinę wśród 107 szczepów MRSP pochodzących z USA oraz Kanady [80]. Geny tetM i tetK wykryto odpowiednio u 39% oraz 31% badanych MRSP, co oznacza, że wraż-liwość na minocyklinę powinna występować u 31% badanych szczepów. Jednak oporność na ten antybiotyk występowała także u izolatów, u których nie wykazano obecności genu tetM. Autorzy tłumaczą ten fakt obec-nością genów tet innego typu lub istnieniem odmien-nego mechanizmu oporności. Niemniej jednak zasto-sowanie minocykliny pozostaje opcją terapeutyczną wobec zakażeń wywoływanych przez szczepy MRSP

wrażliwe na ten antybiotyk, a oporne na inne tetracy-kliny. Autorzy wspomnianej pracy sugerują również weryfikację wartości granicznych MIC minocykliny, ponieważ u części szczepów uznawanych za wrażliwe zaobserwowano relatywnie wysokie war tości MIC wynoszące 4 µg/ml. Wśród badanych MRSP wyróż-niono nie dwie, a trzy populacje o różnych wartościach MIC. Pierwsza z nich cechowała się niskimi wartoś-ciami MIC ≤ 0,25 µg/ml, druga o wartości MIC wyno-szącej 4 µg/ml oraz trzecia o MIC ≥ 16 µg/ml (wartość graniczna dla szczepów wrażliwych wynosi ≤ 4 µg/ml).

Dane literaturowe wskazują, że oporność na chlo-ramfenikol wśród gronkowców pochodzących od zwie-rząt jest notowana, a częstość występowania tej cechy jest różna w różnych rejonach geograficznych. Zaled-wie 1,8% szczepów MSSP wyizolowanych w Tunezji, wykazało oporność na ten chemioterapeutyk [26]. W badaniach przeprowadzonych na 103 szczepach MRSP pochodzących z Europy oraz Ameryki Północ-nej oporność na chloramfenikol związaną z występowa-niem genu catpC221 stwierdzono u 57,3% izolatów [58]. W Polsce wśród 14 MRSP jedynie 2 szczepy wykazały oporność na chloramfenikol [44]. Podobnie w Hisz-panii tylko jeden spośród 9 badanych MRSP wykazał oporność wynikającą z obecności genu catpC221 [28].Zwracają uwagę wyniki najnowszych badań uzyskane w Brazylii, gdzie oporność na chloramfenikol stwier-dzono u 17,8% badanych MSSP oraz 33,3% MRSP [11].

Obecnie panuje pogląd, że stosowanie wankomy-cyny powinno być zarezerwowane do leczenia zaka-żeń u ludzi wywoływanych przez MRSA [23, 73]. Choć wankomycyna jest dostępna od wielu lat, oporność na nią wśród szczepów MRSA występuje sporadycznie. Do tej pory w medycynie weterynaryjnej nie opisano szczepu MRSP opornego na wankomycynę [28, 44, 58].

Izolaty pochodzące od psów są zwykle wrażliwe na mupirocynę i stwierdzane są u nich niskie wartości MIC [37]. Przeważają wyniki świadczące o wrażliwości badanych szczepów na ten antybiotyk, i to niezależnie czy są to szczepy MSSP czy MRSP [28, 58]. Do tej pory ukazało się jedno doniesienie o oporności cechującej się wysokimi wartościami MIC ≥ 512 µg/ml na mupi-rocynę u S. pseudintermedius, związanej z obecnością plazmidowego genu ileS2, kodującego syntetazę izo-lucylo-tRNA [49]. Taki sam mechanizm oporności występuje u S. aureus. Prawdopodobnie u S. pseudintermedius może także dojść do rozpowszechnienia się genów oporności na mupirocynę, podobnie jak miało to miejsce u S. aureus.

Oporność gronkowców na fluorochinolony może być skutkiem modyfikacji docelowego miejsca działa-nia tych chemioterapeutyków, mutacje występują wtedy w genie gyrA kodującym podjednostkę A gyrazy (topo-izomerazy II) lub w genie grlA, warunkującym wytwa-rzanie topoizomerazy IV [17, 37]. Inny mechanizm


oporności polega na aktywnym usuwaniu fluorochino-lonów z komórek gronkowców i jest związany z obec-nością genu norA odpowiedzialnego za wytwarzanie białka transportowego NorA zlokalizowanego w błonie cytoplazmatycznej [37]. Szczepy wrażliwe na meticylinę zwykle pozostają również wrażliwe na fluorochinolony. Oporność wśród tych szczepów w Polsce wynosi około 5,6% [44] oraz około 20% w Brazylii [11] oraz w Korei [43]. Inaczej kształtuje się oporność na chemioterapu-tyki z tej grupy wśród MRSP, u których oporność może dotyczyć nawet 100% badanych szczepów [28, 81]. W Polsce u 85,7% badanych MRSP stwierdzono opor-ność na fluorochinolony [44]. Podobnie jak u około 90% szczepów MRSP pochodzących z innych krajów Europy i Ameryki Północnej [58].

Mechanizm oporności polegający na modyfika-cji miejsca docelowego na rybosomach związany jest z aktywnością enzymu acetylo-N-metylotransferazy, kodowanego przez geny ermA, ermB lub ermC. Kon-stytutywna synteza tego enzymu skutkuje krzyżową opornością na makrolidy, linkozamidy oraz strepto-graminy B, określanej opornością typu MLSB. Inny mechanizm aktywności polega na aktywnym usuwaniu tych trzech grup antybiotyków z komórek gronkow-ców. U MRSP występować może również enzymatyczna inaktywacja makrolidów, linkozamidów i steptogra-min B, związana z obecnością linkozamido-nukleoty-dylotransferazy, kodowanej przez gen lnuA [37].

Oporność na makrolidy i linkozamidy wśród szcze-pów MSSP występuje z różnym nasileniem w różnych krajach. Zaledwie u jednego szczepu (1,8%) w Tunezji wykryto gen ermB [26], ale oporność na tę grupę anty-biotyków w Brazylii i Korei zanotowano już u około 50% badanych izolatów [11, 43]. Antybiotyki te są nie-skuteczne w przypadku od około 70% (Brazylia) do 100% badanych szczepów MRSP [28, 69, 81]. Potwier-dzają to wyniki uzyskane w naszym kraju, gdzie opor-ność zaobserwowano u 92,8% badanych MRSP [44].

Oporność gronkowców na aminoglikozydy jest najczęściej związana z wytwarzaniem enzymów inakty-wujących i modyfikujących te leki. Mogą być one ace-tylotransferazami (AAC), fosfotransferazami (APH) lub nukleotydylotransferazami (ANT) [37]. Występo-wanie kilku genów warunkujących oporność na tę grupę antybiotyków najczęściej stwierdzana jest wśród MRSP. Często spotykany jest gen aacAaphD kodujący dwuskładnikową transferazę acetylo/fosfotransferazę, warunkującą oporność na gentamicynę, kanamycynę oraz tobramycynę. Gen aadD koduje nukleotydylo-transferazę i odpowiada za oporność na neomycynę, kanamycynę, tobramcynę oraz amikacynę. Kolejny gen aph(3’)IIIa koduje fosfotransferazę, która inakty-wuje neomycynę i kanamycynę [37]. W Polsce opor-ność na streptomycynę oraz gentamicynę występowała odpowiednio u 86,3% i 14,7% badanych szczepów

wrażliwych na meticylinę [44]. Natomiast oporność na oba te antybiotyki stwierdzono u 85,8% badanych MRSP. Perreten i wsp. (2010) oporność na aminogli-kozydy stwierdzili u 93 (90,3%) spośród 103 bada-nych szczepów MRSP [58]. W większości przypad-ków u badanych gronkowców obecne były trzy geny: aac(6’)Ieaph(2’)Ia, aph(3’)III oraz ant(6’)Ia. Trzy izolaty charakteryzowała obecność jedynie pierwszego z wymienionych genów, zaś u pięciu występowały tylko dwa ostatnie geny.

Oporność na linezolid może być wynikiem mutacji w genie rrn, skutkującej modyfikacją miejsca docelo-wego dla linezolidu lub wynikiem ekspresji genu crf, kodującego metylotransferazę modyfikującą 23S rRNA, co skutkuje także opornością na chloramfenikol [37]. Do taj pory nie notowano oporności na linezolid wśród szczepów S. pseudintermedius [28, 58]. Linezolid znaj-duje głównie zastosowanie u ludzi w leczeniu zakażań wywoływanych przez MRSA. Sugerowane jest zarezer-wowanie tego chemioterapeutyku do leczenia ludzi. Jednak wobec braku zakazu jego stosowania w medycy-nie weterynaryjnej, sporadycznie znajduje on zastoso-wanie w leczeniu zakażeń wywoływanych przez MRSP u psów [54]. Mino wysokiej ceny, okazuje się skuteczny, co opisano również w Polsce [50].

10. Podsumowanie

S. pseudintermedius jest nowo opisanym gatunkiem gronkowców koagulazo-dodatnich izolowanych od zwierząt. W rzeczywistości do gatunku tego przeklasy-fikowano większość szczepów uprzednio rozpoznanych jako S. intermedius. Obecnie wiadomo, że S. pseudintermedius jest najczęściej izolowany od psów, ale rów-nież może on występować u innych gatunków zwierząt. Co więcej, coraz częściej izolowany jest z przypadków zakażeń u ludzi. Rozpoznanie gatunku S. pseudintermedius w materiale pochodzącym od psów właściwie nie jest problemem, ale można przypuszcza, że w labora-toriach pracujących z materiałem pobranym od ludzi ten typowy patogen weterynaryjny może nie być pra-widłowo rozpoznawany. Warto zaznaczyć, że osoby mające stały kontakt z psami są uważane za szczególnie narażone na transmisję S. pseudintermedius. Dodatko-wym problemem jest rozprzestrzenianie się wśród tych bakterii oporności na β-laktamy, jak również inne anty-biotyki i chemioteraputyki. Interesujące jest, że mimo identycznego mechanizmu meticylinooporności, nieco inaczej przebiega wykrywanie tego typu oporności wśród szczepów MRSP oraz MRSA. Prezentowana praca ma na celu przybliżenie problemu zaszeregowa-nia taksonomicznego S. pseudintermedius, prawidło-wej identyfikacji szczepów, w tym również oznaczania lekowrażliwości.


Piśmiennictwo

1. Abraham J.L., Morris D.O., Griffeth G.C., Shofer F.S., Ran-kin S.C.: Surveillance of healthy cats and cats with inflammatory skin disease for colonization of the skin by methicillin-resistant coagulase-positive staphylococci and Staphylococcus schleiferi ssp. schleiferi. Vet. Dermatol. 18, 252–259 (2007)

2. Atalay B., Ergin F., Cekinmez M., Caner H., Altinors N.: Brain abscess caused by Staphylococcus intermedius. Acta Neurochir. (Wien.) 147, 347–348 (2005)

3. Bannoehr J., Franco A., Iurescia M., Battisti A., Fitzgerald J.R.: Molecular diagnostic identification of Staphylococcus pseudintermedius. J. Clin. Microbiol. 47, 469–471 (2009)

4. Bannoehr J., Guardabassi L.: Staphylococcus pseudintermedius in the dog: taxonomy, diagnostics, ecology, epidemiology and pathogenicity. Vet. Dermatol. 23, 253–266 (2012)

5. Bannoehr J., Zakour N.L.B., Waller A.S., Guardabassi L., Tho-day K.L., van den Broek A.H.M., Fitzgerald J.R.: Population genetic structure of the Staphylococcus intermedius group: insights into agr diversification and the emergence of methicil-lin-resistant strains. J. Bacteriol. 189, 8685–8692 (2007)

6. Bemis D.A., Jones R.D., Frank L.A., Kania S.A.: Evaluation of susceptibility test breakpoints used to predict mecA-mediated resistance in Staphylococcus pseudintermedius isolated from dogs. J. Vet. Diagn. Invest. 21, 53–58 (2009)

7. Bemis D.A., Jones R.D., Videla R., Kania S.A.: Evaluation of cefoxitin disk diffusion breakpoint for detection of methicil-lin resistance in Staphylococcus pseudintermedius isolates from dogs. J. Vet. Diagn. Invest. 24, 964–967 (2012)

8. Bender J.B., Schiffman E., Hiber L., Gerads L., Olsen K.: Reco-very of staphylococci from computer keyboards in a veterinary medical center and the effect of routine cleaning. Vet. Rec. 170, 414 (2012)

9. Black C.C., Solyman S.M., Eberlein L.C., Bemis D.A., Woron A.M., Kania S.A.: Identification of a predominant mul-tilocus sequence type, pulsed-field gel electrophoresis cluster, and novel staphylococcal chromosomal cassette in clinical iso-lates of mecA-containing, methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius. Vet. Microbiol. 139, 333–338 (2009)

10. Blaiotta G., Fusco V., Ercolini D., Pepe O., Coppola S.: Diver-sity of Staphylococcus species strains based on partial kat (cata-lase) gene sequences and design of a PCR-restriction fragment length polymorphism assay for identification and differentiation of coagulase-positive species (S. aureus, S. delphini, S. hyicus, S. intermedius, S. pseudintermedius, and S. schleiferi subsp. coagulans). J. Clin. Microbiol. 48, 192–201 (2010)

11. Bruno P., Mendes W., Rabello R.F., Lilenbaum W.: Isolation of meticillin-resistant staphylococci in canine skin infections in Rio de Janeiro, Brazil. Vet. Dermatol. 24, 373–375 (2013)

12. Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M.: Antibiotic resistance of canine Staphylococcus intermedius group (SIG) – practical implications. Pol. J. Vet. Sci. 14, 213–218 (2011)

13. Chrobak D., Kizerwetter-Świda M., Rzewuska M., Binek M.: Meticylinooporne szczepy Staphylococcus intermedius wystę-pujące u psów jako potencjalny rezerwuar genu mecA. Post. Mikrobiol. 48, 235–242 (2009)

14. Chuang C.Y., Yang Y.L., Hsueh P.R., Lee P.I.: Catheter-related bacteremia caused by Staphylococcus pseudintermedius refrac-tory to antibiotic-lock therapy in a hemophilic child with dog exposure. J. Clin. Microbiol. 48, 1497–1498 (2010)

15. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI): Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals; approved standard M31-A3, vol. 28, no. 8. CLSI, Wayne, PA (2008)

16. Decristophoris P., Fasola A., Benagli C., Tonolla M., Petrini O.: Identification of Staphylococcus intermedius Group by MALDI--TOF MS. Syst. Appl. Microbiol. 34, 45–51 (2011)

17. Descloux S., Rossano A., Perreten V.: Characterization of new staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) and topo-isomerase genes in fluoroquinolone- and methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius. J. Clin. Microbiol. 46, 1818–1823 (2008)

18. Devriese L.A., F. Haesebrouck i wsp.: Staphylococcus pseudintermedius sp. nov., a coagulase-positive species from animals. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 1569–1573 (2005)

19. Devriese L.A., Hermans K., Baele M., Haesebrouck F.: Staphylococcus pseudintermedius versus Staphylococcus intermedius. Vet. Microbiol. 133, 206–207 (2009)

20. Feng Y., Tian W., Lin D., Luo Q., Zhou Y., Yang T., Deng Y., Liu Y.H., Liu J.H.: Prevalence and characterization of methicil-lin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in pets from South China. Vet. Microbiol. 160, 517–524 (2012)

21. Fitzgerald J.R.: The Staphylococcus intermedius group of bacte-rial pathogens: species re-classification, pathogenesis and the emergence of meticillin resistance. Vet. Dermatol. 20, 490–495 (2009)

22. Frank L.A., Kania S.A., Kirzeder E.M., Eberlein L.C., Bemis D.A.: Risk of colonization or gene transfer to owners of dogs with meticillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius. Vet. Dermatol. 20, 496–501 (2009)

23. Frank L.A., Loeffler A.: Meticillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius: clinical challenge and treatment options. Vet. Dermatol. 23, 283–291 (2012)

24. Geraghty L., Booth M., Rowan N., Fogarty A.: Investigations on the efficacy of routinely used phenotypic methods compared to genotypic approaches for the identification of staphylococcal species isolated from companion animals in Irish veterinary hospitals. Ir. Vet. J. 66, 7 (2013)

25. Gerstadt K., Daly J.S., Mitchell M., Wessolossky M., Cheeseman S.H.: Methicillin-resistant Staphylococcus intermedius pneumo-nia following coronary artery bypass grafting. Clin. Infect. Dis. 29, 218–219 (1999)

26. Gharsa H., Ben Slama K., Gómez-Sanz E., Lozano C., Klibi N., Jouini A., Messadi L., Boudabous A., Torres C.: Antimicrobial resistance, virulence genes, and genetic lineages of Staphylococcus pseudintermedius in healthy dogs in Tunisia. Microb. Ecol. 66, 363–368 (2013)

27. Gómez-Sanz E., Torres C., Lozano C., Zarazaga M.: High diver-sity of Staphylococcus aureus and Staphylococcus pseudintermedius lineages and toxigenic traits in healthy pet-owning house-hold members. Underestimating normal household contact? Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 36, 83–94 (2013)

28. Gómez-Sanz E., Torres C., Lozano C., Sáenz Y., Zarazaga M.: Detection and characterization of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in healthy dogs in La Rioja, Spain. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 34, 447–453 (2011)

29. Guardabassi L., Loeber M.E., Jacobson A.: Transmission of mul-tiple antimicrobial-resistant Staphylococcus intermedius between dogs affected by deep pyoderma and their owners. Vet. Microbiol. 98, 23–27 (2004)

30. Guardabassi L., Schmidt K.R., Petersen T.S., Espinosa-Gon-gora C., Moodley A., Agersø Y., Olsen J.E.: Mustelidae are natu-ral hosts of Staphylococcus delphini group A. Vet. Microbiol. 159, 351–353 (2012)

31. Hájek V.: Staphylococcus intermedius, a new species isolated from animals. Int. J. Syst. Bacteriol. 26, 401–408 (1976)

32. Hanselman B.A., Kruth S.A., Rousseau J., Weese J.S.: Coagulase positive staphylococcal colonization of humans and their house-hold pets. Can. Vet. J. 50, 954–958 (2009)


33. Hariharan H., Matthew V., Fountain J., Snell A., Doherty D., King B., Shemer E., Oliveira S., Sharma R.N.: Aerobic bacte-ria from mucous membranes, ear canals, and skin wounds of feral cats in Grenada, and the antimicrobial drug susceptibility of major isolates. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 34, 129–134 (2011)

34. Himsworth C.G., Patrick D.M., Parsons K., Feng A., Weese J.S.: Methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in rats. Emerg. Infect. Dis. 19, 169–170 (2013)

35. Horstmann C., Mueller R.S., Straubinger R.K., Werckenthin C.: Detection of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius with commercially available selective media. Lett. Appl. Microbiol. 54, 26–31 (2012)

36. Julian T., Singh A., Rousseau J., Weese J.S.: Methicillin-resistant staphylococcal contamination of cellular phones of personnel in a veterinary teaching hospital. BMC Res. Notes. 5, 193 (2012)

37. Kadlec K., Schwarz S.: Antimicrobial resistance of Staphylococcus pseudintermedius. Vet. Dermatol. 23, 276–282 (2012)

38. Kadlec K., L. Guardabassi i wsp.: Molecular analysis of methi-cillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius of feline origin from different European countries and North America. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1826–1828 (2010)

39. Kadlec K., van Duijkeren E., Wagenaar J.A., Schwarz S.: Mole-cular basis of rifampicin resistance in methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius isolates from dogs. J. Antimicrob. Chemother. 66, 1236–1242 (2011)

40. Kelesidis T., Tsiodras S.: Staphylococcus intermedius is not only a zoonotic pathogen, but may also cause skin abscesses in humans after exposure to saliva. Int. J. Infect. Dis. 14, 838–841 (2010)

41. Kempker R., Mangalat D., Kongphet-Tran T., Eaton M.: Beware of the pet dog: a case of Staphylococcus intermedius infection. Am. J. Med. Sci. 5, 425–427 (2009)

42. Kikuchi K., Karasawa T., Piao C., Itoda I., Hidai H., Yamaura H., Totsuka K., Morikawa T., Takayama M.: Molecular confirmation of transmission route of Staphylococcus intermedius in mastoid cavity infection from dog saliva. J. Infect. Chemother. 10, 46–48 (2004)

43. Kim T.J., Na Y.R., Lee J.I.: Investigations into the basis of chlo-ramphenicol and tetracycline resistance in Staphylococcus intermedius isolates from cases of pyoderma in dogs. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health. 52, 119–124 (2005)

44. Kizerwetter-Świda M., Chrobak D., Rzewuska M., Binek M.: Antibiotic resistance patterns and occurrence of mecA gene in Staphylococcus intermedius strains of canine origin. Pol. J. Vet. Sci. 12, 9–13 (2009)

45. Lee J.: Staphylococcus intermedius isolated from dog-bite wounds. J. Infect. 29, 105 (1994)

46. Loeffler A., Linek M., Moodley A., Guardabassi L., Sung J.M., Winkler M., Weiss R., Lloyd D.H.: First report of multiresistant, mecA-positive Staphylococcus intermedius in Europe: 12 cases from a veterinary dermatology referral clinic in Germany. Vet. Dermatol. 18, 412–421 (2007)

47. Mahoudeau I., Delabranche X., Prevost G., Monteil H., Pie-mont Y.: Frequency of isolation of Staphylococcus intermedius from humans. J. Clin. Microbiol. 35, 2153–2154 (1997)

48. Mallardo K., Nizza S., Fiorito F., Pagnini U., De Martino L., Donnarumma G.: A comparative evaluation of methicillin--resistant staphylococci isolated from harness racing-horses, breeding mares and riding-horses in Italy. Asian Pac. J. Trop. Biomed. 3, 169–173 (2013)

49. Matanovic K., Pérez-Roth E., Pintarić S., Šeol Martinec B.: Molecu lar characterization of high-level mupirocin resistance in Sta phy lococcus pseudintermedius. J. Clin. Microbiol. 51, 1005–1007 (2013)

50. Międzobrodzki J., Kasprowicz A., Białecka A., Jaworska O., Polakowska K., Władyka B., Dubin A.: The first case of a Staphy

lococcus pseudintermedius infection after joint prosthesis implantation in a dog. Pol. J. Microbiol. 59, 133–135 (2010)

51. Młynarczyk G,. Kochman M., Lawrynowicz M., Fordymacki P., Młynarczyk A., Jeljaszewicz J.: Coagulase-negative variants of methicillin-resistant Staphylococcus aureus subsp. aureus stra-ins isolated from hospital specimens. Zentralbl. Bakteriol. 288, 373–381 (1998)

52. Moodley A., Stegger M., Ben Zakour N.L., Fitzgerald J.R., Guar-dabassi L.: Tandem repeat sequence analysis of staphylococcal protein A (spa) gene in methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius. Vet. Microbiol. 135, 320–326 (2009)

53. Morris D.O., Boston R.C., O’Shea K., Rankin S.C.: The preva-lence of carriage of meticillin-resistant staphylococci by veteri-nary dermatology practice staff and their respective pets. Vet. Dermatol. 21, 400–407 (2010)

54. Murphy K.M.: The use of linezolid to treat methicillin-resistant staphylococcal infections in dogs and cats. Vet. Dermatol. 19, 110 (2008)

55. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS): Performance standard for antimicrobial disk and dilution suscep-tibility tests for bacteria isolated from animals; informational supplement M31-S1, vol. 24, no. 17. NCCLS, Wayne, PA (2004)

56. Papich M.G.: Proposed changes to Clinical Laboratory Stan-dards Institute interpretive criteria for methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius isolated from dogs. J. Vet. Diagn. Invest. 22, 160 (2010)

57. Paul N.C., Moodley A., Ghibaudo G., Guardabassi L.: Carriage of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in small animal veterinarians: Indirect evidence of zoonotic transmis-sion. Zoonoses Public Health, 58, 533–539 (2011)

58. Perreten V., L. Guardabassi i wsp.: Clonal spread of methicillin--resistant Staphylococcus pseudintermedius in Europe and North America: an international multicentre study. J. Antimicrob. Chemother. 65, 1145–1154 (2010)

59. Pilla R., Bonura C., Malvisi M., Snel G.G., Piccinini R.: Methicil-lin-resistant Staphylococcus pseudintermedius as causative agent of dairy cow mastitis. Vet. Rec. 173, 19 (2013)

60. Pottumarthy S., Schapiro J.M., Prentice J.L., Houze Y.B., Swanzy S.R., Fang F.C., Cookson B.T.: Clinical isolates of Staphylococcus intermedius masquerading as methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 42, 5881–5884 (2004)

61. Ruscher C., Lübke-Becker A., Semmler T., Wleklinski C.G., Paasch A., Soba A., Stamm I., Kopp P., Wieler L.H., Walther B.: Widespread rapid emergence of a distinct methicillin- and multidrug-resistant Staphylococcus pseudintermedius (MRSP) genetic lineage in Europe. Vet. Microbiol. 144, 340–346 (2010)

62. Sasaki T., Kikuchi K., Tanaka Y., Takahashi N., Kamata S., Hiramatsu K. Reclassification of phenotypically identified Staphylococcus intermedius strains. J. Clin. Microbiol. 45, 2770–2778 (2007)

63. Sasaki T., Kikuchi K., Tanaka Y., Takahashi N., Kamata S., Hiramatsu K.: Methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in a veterinary teaching hospital. J. Clin. Microbiol. 45, 1118–1125 (2007)

64. Sasaki T., Tsubakishita S., Tanaka Y., Sakusabe A., Ohtsuka M., Hirotaki S., Kawakami T., Fukata T., Hiramatsu K.: Multiplex--PCR method for species identification of coagulase-positive staphylococci. J. Clin. Microbiol. 48, 765–769 (2010)

65. Savini V., Di Giuseppe N., Fazii P., D’Amario C., D’Antonio D., Carretto E.: Staphylococcus pseudintermedius heterogeneously expresses the mecA gene. Vet. Microbiol. 165, 489–490 (2013)

66. Savini V., Polilli E., Polakowska K., Marrollo R., Białecka A., Kasprowicz A., Fazii P., D’Antonio D., Carretto E., Międzo-brodzki J.: Arginine dehydrolase and β-gentiobiose cannot discriminate within the Staphylococcus intermedius group. Vet. Microbiol. 161, 236–237 (2012)


67. Savini V., E. Carretto i wsp.: Methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius infection in a bone marrow transplant reci-pient. J. Clin. Microbiol. 51, 1636–1638 (2013)

68. Schissler J.R., Hillier A., Daniels J.B., Cole L.K., Gebreyes W.A.: Evaluation of Clinical Laboratory Standards Institute interpretive criteria for methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius isolated from dogs. J. Vet. Diagn. Invest. 21, 684–688 (2009)

69. Schwarz S., Kadlec K., Strommenger B.: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus pseudintermedius detected in the BfT-Germ Vet monitoring programme 2004–2006 in Germany. J. Antimicrob. Chemother. 61, 282–285 (2008)

70. Singh A., Walker M., Rousseau J., Monteith G.J., Weese J.S.: Methicillin-Resistant Staphylococcal Contamination of Clo-thing Worn by Personnel in a Veterinary Teaching Hospital. Vet Surg. doi: 10.1111/j.1532-950X.2013.12024.x (2013)

71. Slettemeås J.S., Mikalsen J., Sunde M.: Further diversity of the Staphylococcus intermedius group and heterogeneity in the MboI restriction site used for Staphylococcus pseudintermedius species identification. J. Vet. Diagn. Invest. 22, 756–759 (2010)

72. Solyman S.M., S.A. Kania i wsp.: Multilocus sequence typing for characterization of Staphylococcus pseudintermedius. J. Clin. Microbiol. 51, 306–310 (2013)

73. Stegmann R., Burnens A., Maranta C.A., Perreten V.: Human infection associated with methicillin-resistant Staphylococcus pseu dintermedius ST71. J. Antimicrob. Chemother. 65, 2047–2048 (2010)

74. Talan D.A., Staatz D., Staatz A., Goldstein E.J., Singer K., Overturf G.D.: Staphylococcus intermedius in canine gingiva and canine-inflicted human wound infections: laboratory cha-racterization of a newly recognized zoonotic pathogen. J. Clin. Microbiol. 27, 78–81 (1989)

75. van Duijkeren E., Houwers D.J., Schoormans A., Broekhuizen--Stins M.J., Ikawaty R., Fluit A.C., Wagenaar J.A.: Transmis-sion of methicillin-resistant Staphylococcus intermedius between humans and animals. Vet. Microbiol. 128, 213–215 (2008)

76. Van Hoovels L., Vankeerberghen A., Boel A., Van Vaeren-bergh K., De Beenhouwer H.: First case of Staphylococcus pseudintermedius infection in a human. J. Clin. Microbiol. 44, 4609–4612 (2006)

77. Varaldo P.E., Kilpper-Bälz R., Biavasco F., Satta G., Schlei fer K.H.: Staphylococcus delphini sp. nov., a coagulase-positive species iso-lated from dolphins. Int. J. Syst. Bacteriol. 38, 436–439 (1988)

78. Wakita Y., Shimizu A., Hájek V., Kawano J., Yamashita K.: Characterization of Staphylococcus intermedius from pigeons, dogs, foxes, mink, and horses by pulsed-field gel electrophoresis. J. Vet. Med. Sci. 64, 237–243 (2002)

79. Weese J.S., van Duijkeren E.: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Staphylococcus pseudintermedius in veterinary medicine. Vet. Microbiol. 140, 418–429 (2010)

80. Weese J.S., Sweetman K., Edson H., Rousseau J.: Evaluation of minocycline susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius. Vet. Microbiol. 162, 968–971 (2013)

81. Yoo J.H., Yoon J.W., Lee S.Y., Park H.M.: High prevalence of fluo roquinolone- and Methicillin-resistant Staphylococcus pseudin termedius isolates from canine pyoderma and otitis externa in veterinary teaching hospital. J. Microbiol. Biotechnol. 20, 798–802 (2010)

82. Youn J.-H., Yoon J.W., Koo H.C., Lim S.-K., Park Y.H.: Preva-lence and antimicrogram of Staphylococcus intermedius group isolates from veterinary staff, companion animals, and the envi-ronment in veterinary hospitals in Korea. J. Vet. Diagn. Invest. 23, 268–274 (2011)


* Autor korespondencyjny: Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Mikrobiologii, ul. Jagiellońska 28, 40-032 Katowice; tel.: 32 2009 442; e-mail: [email protected]

1. Wstęp

Termin bakterie endofityczne odnosi się do grupy bakterii, która stale bytuje w tkankach roślin nie powo-dując przy tym objawów chorobowych. Mikroorgani-zmy te zamieszkują wnętrze prawdopodobnie każdej rośliny występującej na Ziemi. Wiele z tych bakterii korzystnie wpływa na wzrost i rozwój roślin. Wyniki ostatnich badań wskazują, że endofity ułatwiają rośli-nom także adaptację do niekorzystnych warunków środowiska takich jak nadmierne zasolenie [40], brak wody, stres spowodowany pestycydami [5], meta-lami ciężkimi [24, 50] czy węglowodorami [2, 41, 52]. Ponadto, obecność bakterii endofitycznych szczególnie korzystnie wpływa na wzrost i rozwój roślin.

Endofity są grupą mikroorganizmów, na którą w ostatnich latach zwraca się szczególną uwagę. Jednym z najnowszych trendów w biotechnologii środowiskowej jest wykorzystanie bakterii endofitycznych do wspoma-gania procesów fitoremediacji terenów skażonych meta-lami ciężkimi i/lub związkami ropopochodnymi. Nie-które bakterie endofityczne są zdolne do produkowania

nieznanych dotąd substancji o działaniu przeciwgrzy-bowym, przeciwwirusowym oraz przeciwmalarycznym. Dla intensywnie rozwijającego się przemysłu tworzyw sztucznych bakterie te są źródłem polimerów, z których produkuje się między innymi bioplastik [38, 47, 54].

2. Bakterie endofityczne – charakterystyka

Znane już od ok. 120 lat bakterie endofityczne (endofity), to mikroorganizmy izolowane z powierzch-niowo wysterylizowanych organów roślinnych. Mikro-organizmy te zasiedlają zdrowe tkanki roślin wyższych nie powodując żadnych zmian i objawów chorobo-wych u swojego gospodarza. Przypuszcza się, że każda z blisko 300 000 obecnie znanych roślin jest zasiedlana przez jeden lub wiele gatunków bakteryjnych endofi-tów. Dlatego też szansa znalezienia mikroorganizmów o korzystnych i poszukiwanych cechach takich jak pro-dukcja bioaktywnych substancji, nowych antybiotyków, czy zdolność do degradacji ksenobiotyków i wspoma-gania wzrostu roślin, jest bardzo duża [16, 38].

BAKTERIE ENDOFITYCZNE I ICH ZNACZENIEW MIKROBIOLOGII ŚRODOWISKOWEJ,

MEDYCYNIE I PRZEMYŚLE

Małgorzata Pawlik1*, Tomasz Płociniczak1, Zofia Piotrowska-Seget1

1 Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Śląski

Wpłynęło w styczniu 2014 r.

1. Wstęp. 2. Bakterie endofityczne – charakterystyka. 3. Kolonizacja tkanek roślinnych. 4. Endofity promujące wzrost roślin (PGPE). 5. Rola endofitów w fitodegradacji. 6. Rola endofitów w fitoekstrakcji. 7. Endofity w rolnictwie i ochronie roślin. 8. Metabolity endofitów w medycynie. 9. Produkcja bioplastiku. 10. Podsumowanie

Endophytic bacteria and their role in environmental microbiology, medicine and industry

Abstract: Endophytic bacteria have been known for more than 120 years. They live inside plant tissues without causing any apparent symptoms of disease or negative effects on the host. Each of the nearly 300 000 plant species that exist on the earth is host to one or more endophytes. Only a few of these plants have ever been completely studied relative to their endophytic biology. Consequently, the opportunity to find new and beneficial endophytic microorganisms among the diversity of plants in different ecosystems is considerable. During the long co-evolutionary process with their hosts, endophytes have developed many significant and novel characteristics. The relationships between plants and endophytic bacteria are very close. The endophytes which reside inside plant tissues can be classified as ‘obligate’ or ‘facultative’. The first group is strictly dependent on the host plant for their growth and survival and transmission to other plants. The second group has a stage in their life cycle in which they are able to exist outside the host plant. Recent studies have shown that endophytes accelerate the adaptation of plants to unbalanced environmental conditions such as saline soil, drought, stress caused by pesticides, heavy metals or hydrocarbons. Therefore, the exploitation of the interaction of plant endophytes for the remediation of contaminated soils is a promising area; however, role of these microorganisms is still unclear.

1. Introduction. 2. Characterization of endophytic bacteria. 3. Colonization of plant tissues. 4. Plant growth-promoting endophytes (PGPE). 5. The role of endophytes in phytodegradation 6. The role of endophytes in phytoextraction 7. Endophytes in agriculture and plant protection. 8. Endophytic metabolites in medicine. 9. Bioplastic production. 10. Summary

Słowa kluczowe: bakterie endofityczne, fitoremediacja, mechanizmy promujące wzrost roślinKey words: endophytic bacteria, phytoremediation, plant growth-promoting mechanisms

116 MAŁGORZATA PAWLIK, TOMASZ PŁOCINICZAK, ZOFIA PIOTROWSKA-SEGET

Większość poznanych endofitów należy do rodza-jów Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Curtobacterium, Enterobacter, Pseudomonas, Erwinia oraz Microbacterium [18]. Mikroorganizmy endofityczne pochodzą z gleby pozakorzeniowej, ryzosfery i/lub ryzoplany. Potwierdzeniem tej tezy jest fakt, że niektóre bakterie izolowane z tych niszy ekologicznych mają zdolność do kolonizacji tkanek korzeni i łodyg. Endofity naj-liczniej zasiedlają korzenie, ich liczba może osiągnąć nawet 108 j.t.k./g świeżej masy korzenia. W mniejszych ilościach występują one w pozostałych organach roślin-nych, to jest łodygach, liściach a także kwiatach i owo-cach [11, 34, 35].

Bakterie endofityczne dzieli się na dwie podstawowe grupy: obligatoryjne i fakultatywne [16]. Pierwsza grupa jest bardzo ściśle związana ze swoim gospoda-rzem, co związane jest z faktem, że bakterie te utraciły wiele cech umożliwiających im przeżycie poza rośliną. Natomiast druga grupa, endofity fakultatywne to bak-terie, które rezydują wewnątrz tkanek roślinnych tylko przez pewien czas, w określonym stadium rozwojowym rośliny. Ze względu na specyficzność zajmowanej niszy ekologicznej prowadzenie hodowli endofitów w warun-kach laboratoryjnych jest bardzo trudne. To powoduje, że wiedza na temat ilościowego i jakościowego składu zespołów bakterii endofitycznych roślin jest nadal nie-pełna. Trudność w ocenie rzeczywistej bioróżnorodno-ści endofitów wynika, w dużej mierze, z niemożliwości izolacji i hodowli większości z tych mikroorganizmów klasycznymi metodami hodowlanymi. Przełomem w badaniach nad bioróżnorodnością zespołów mikro-organizmów endofitycznych było zastosowanie real--time PCR oraz metody DGGE, które pozwalają na charakterystykę hodowlanej i niehodowlanej frakcji tej grupy mikroorganizmów [11, 15, 20, 23, 29, 31, 36].

3. Kolonizacja tkanek roślinnych

Głównymi drogami wejścia endofitów do rośliny są naturalnie powstające pęknięcia epidermy korzenia głównego, miejsca powstawania korzeni bocznych, strefy wydłużania lub różnicowania korzeni, a także uszkodzenia epidermy powstałe w wyniku działania fitopatogenów. Badania wykorzystujące techniki obra-zowania struktury materiału biologicznego (np. mikro-skopia elektronowa, znakowanie białkiem zielonej fluo-rescencji) pokazują, że mikroorganizmy endofityczne najczęściej kolonizują przestrzenie międzykomórkowe i ksylem. Wewnątrz rośliny mogą się one znajdować w ściśle określonych tkankach, bądź mogą być cyklicz-nie transportowane przez system wiązek przewodzą-cych lub apoplast [11, 19, 35].

Czynnikami determinującymi możliwość przeni-kania endofitów do roślin są aktywny ruch, chemo-

taksja oraz produkcja enzymów degradujących ścianę komórek roślinnych (CWDE, Cell Wall Degrading Enzymes). Mikrobiologiczny rozkład polimerów wchodzących w skład ściany komórkowej jest złożony, a w ich degradacji uczestniczy kilka grup enzymów hydrolitycznych takich jak celulazy, glukanazy, celo-biazy, chitynazy, ksylanazy, pektynazy i poligalakto-uranazy [11]. Jak ważna dla endofitów jest aktywność tych enzymów potwierdzają badania Reinhold-Hurek i wsp., [37] w których wykazano, że bakterie Azocarus sp. BH72 z nieaktywnym genem kodującym endo- glukanazy utraciły zdolność do kolonizacji roślinnego gospodarza. W odróżnieniu jednak od fitopatogenów, bakterie endofityczne wytwarzają znacznie mniej CWDE. Cechą wyróżniającą endofity jest posiadanie rzęsek, a w konsekwencji zdolność do ruchu. W bada-niach nad mikroflorą pszenicy stwierdzono, że liczeb-ność bakterii aktywnie poruszających się jest pięć razy większa wewnątrz korzeni niż w przyległej do nich ryzosferze [16, 18].

4. Endofity promujące wzrost roślin (PGPE)

Wśród bakterii endofitycznych od kilku lat szcze-gólnym zainteresowaniem cieszą się tzw. endofity pro-mujące wzrost roślin (PGPE, Plant Growth-Promoting Endophyte). Mikroorganizmy te poprzez szereg róż-nych mechanizmów stymulują wzrost swojego gospo-darza, umożliwiają zwiększenie biomasy i poprawiają jego żywotność. Do najważniejszych mechanizmów zalicza się wiązanie azotu, produkcję fitohormonów (auksyn, giberelin, cytokinin, kwasu abscysynowego i jasmonowego), syntezę deaminazy kwasu 1-aminocy-klopropano-1-karboksylowego (ACC) oraz zwiększanie biodostępności fosforu (Rys. 1). Mechanizmy poten-cjalnie odpowiedzialne za stymulację wzrostu roślin to również produkcja HCN, amoniaku, sideroforów kompleksujących żelazo, związków hamujących wzrost patogenów oraz biosurfaktantów [14, 25, 32, 46, 55].

Szczególne zainteresowanie skupiają na sobie bak-terie produkujące fitohormony i deaminazę ACC. Auksyna (IAA) wpływa nie tylko na wzrost i rozwój rośliny, ale również na regulację odpowiedzi jej sys-temu odpornościowego. Co ciekawe, IAA może pełnić funkcję cząsteczki sygnalnej w procesie quorum sensing u bakterii uczestniczących w tworzeniu biofilmu. Fitopatogeny wytwarzają auksynę z indolilo-3-aceta-midu (szlak IAM indole-3-acetamide), w odróżnieniu od bakterii symbiotycznych, u których IAA powstaje przez kwas indolilo-3-pirogronowy (szlak IPyA indole--3-pyruvate) [45, 46].

Etylen to hormon produkowany przez rośliny w warunkach narażenia jej na biotyczny i abiotyczny stres. Czynnikami indukującymi jego syntezę są między

BAKTERIE ENDOFITYCZNE I ICH ZNACZENIE W MIKROBIOLOGII ŚRODOWISKOWEJ, MEDYCYNIE I PRZEMYŚLE 117

innymi susza, zasolenie, powódź i/lub obecność fitopa-togenów. Bakteryjna deaminaza ACC obniża u roślin stężenie prekursora etylenu, kwasu 1-aminocyklopro-pano-1-karboksylowego, co prowadzi do zmniejszo-nego uwalniania samego etylenu [16, 25, 30].

5. Rola endofitów w fitodegradacji

Jednym ze sposobów remediacji terenów skażonych związkami organicznymi jest fitodegradacja, która polega na wykorzystaniu roślin wyższych i towarzyszących im bakterii do degradacji szkodliwych substancji [49].

Endofity (podobnie jak bakterie ryzosferowe) uwa-żane są za ważne narzędzia zwiększające efektywność fitodegradacji toksycznych związków organicznych. Wykorzystanie tych bakterii w procesach fitoremediacji wydaje się być szczególnie obiecujące, ponieważ wcho-dzą one w ścisłe interakcje ze swoim gospodarzem. Szereg właściwości bakterii endofitycznych powoduje, że w kooperacji z roślinami mogą istotnie zwiększać tempo usuwania toksycznych substancji aromatycznych ze środowiska. Zdolność endofitów do rozkładu tych związków wynika z ich ewolucyjnego przystosowania do rozkładu metabolitów roślinnych, z których wiele ma strukturę pierścieniową [21, 29, 53].

Rośliny, które są fotoautotrofami nie wykorzystują egzogennych zanieczyszczeń organicznych (ksenobio-tyków) jako źródła węgla i energii, ponieważ węgiel asymilują na drodze fotosyntezy. Za pośrednictwem systemu korzeniowego roślina pobiera związki mine-ralne i wodę. Pobieranie ksenobiotyków przez rośliny jest koniecznym czynnikiem umożliwiającym fito-degradację i udział w tym procesie bakteryjnych endofitów. Niektóre z substancji organicznych jak

np. węglowodory to związki o dużej lipofilowości, co oznacza, że mogą łatwo absorbować na powierzchni korzeni, przenikać przez błony komórkowe i być transportowane do pozostałych części rośliny. Rośliny zazwyczaj przekształcają lipofilowe zanieczyszczenia organiczne do formy mniej toksycznej w celu ochrony wrażliwych układów enzymatycznych. Proces ten opisuje tak zwany model zielonej wątroby (ang. Green liver concept). Obejmuje on trzy podstawowe fazy: (1) bioaktywację czyli enzymatyczną modyfikację związku obniżającą jego toksyczność i/lub lipofilowość, (2) koniugację, połączenie z glutationem, cukrami lub aminokwasami w celu wytworzenia związku hy- drofilowego i (3) sekwestrację/kompartmentalizację polegającą na odkładaniu zmodyfikowanego związku w wakuoli i/lub ścianie komórkowej (Rys. 2) [1]. Gene-ralnie, model zielonej wątroby polega na włączeniu toksycznych związków organicznych w cykle przemian z wykorzystaniem szlaków podstawowego metaboli-zmu. W konsekwencji procesy te umożliwiają prze-kształcenie i zmagazynowanie w wakuoli i/lub ścianie komórkowej mniej toksycznych form tych związków. Bardzo rzadko dochodzi jednak do całkowitej mine-ralizacji zanieczyszczeń [21, 49, 56]. Znacząca rolę w metabolizowaniu tych ksenobiotyków mogą pełnić mikroorganizmy endofityczne, które m.in. rozkładają związki ropopochodne. Endofity zdolne do rozkładu węglowodorów wyizolowano z perzu (Elymus angustus oraz Agropyron elongatum), alternantery (Alternanthera philoxeroides), czosnku (Allium macrostemon), chry-zantemy (Dendranthema indicum) oraz chwastnicy (Echinochloa crusgalli) [31, 41].

Tempo usuwania toksycznych związków organicz-nych z gleby można przyspieszyć poprzez inokula- cję roślin bakteriami endofitycznymi stymulującymi

Rys. 1. Bakteryjne mechanizmy promujące wzrost roślin


przyrost biomasy roślin i/lub zdolnymi do rozkładu tych związków. Ho i wsp. [17] wykazali, że inokulacja Ara bi dopsis thaliana zawiesiną endofitycznej bakterii Achromobacter xylosoxidans F3B umożliwiła roślinom wzrost w obecności wzrastającego stężenia związków aromatycznych. Natomiast zaszczepienie roślin endo-fitem Burkholderia cepacia FX2, poza przyrostem bio-masy prowadziło także do obniżenia poziomu trans-piracji toluenu, co było wynikiem biodegradacji tego związku przez szczep FX2 [48].

Niezwykle interesującym jest fakt, że rośliny tere-nów zanieczyszczonych posiadają zdolność do przycią-gania bakterii endofitycznych degradujących toksyczne związki. Siciliano i wsp. [44] wykazali, że w tkankach korzeni kostrzewy trzcinowej (Festuca arundinacea) liczebność bakterii endofitycznych posiadających geny związane z rozkładem związków ropopochodnych alkB oraz ndoB była odpowiednio dwa i cztery razy większa niż w glebie pozakorzeniowej. Co więcej, liczebność bakterii endofitycznych była pozytywnie skorelowana z koncentracją węglowodorów w glebie.

6. Rola endofitów w fitoekstrakcji

Fitoekstrakcja polega na pobieraniu przez korze-nie zanieczyszczeń metalicznych i magazynowaniu ich w częściach nadziemnych rośliny. Proces ten wyko-rzystuje się do oczyszczania gleb skażonych głównie metalami ciężkimi. Rośliny, które gromadzą w swoich tkankach metale w stężeniu wielokrotnie przekracza-jącym ich zawartość w glebie to hiperakumulatory. Niestety ich niewielkie rozmiary, powolny wzrost i nie-

wielka biomasa ogranicza możliwość ich wykorzystania w fitoekstrakcji. Dlatego obecnie poszukuje się bak-terii endofitycznych, które zwiększają tolerancję roślin (niebędących hiperakumulatorami) na metale ciężkie, stymulują ich wzrost, przyrost biomasy, wpływają na pobieranie metali z gleby, ich transport oraz magazyno-wanie w częściach nadziemnych rośliny. Endofity izolo-wane z hiperakumulatorów (Alyssum bertolonii, Thlaspi caerulescens, Thlaspi goesingense, Nicotiana tabacum), ale także z roślin tolerujących wysokie stężenia metali ciężkich (metalofitów), często wykazują oporność na wysokie stężenia metali ciężkich i posiadają liczne mechanizmy promujące wzrost roślin. Wyniki nie-których badań wskazują, że endofity te redukują tok-syczność metali i zmieniają ich dostępność dla roślin przez zakwaszanie środowiska, wydzielanie kwasów organicznych czy produkcję sideroforów chelatujących nie tylko żelazo, lecz także niektóre metale [34, 50].

Bakterie endofityczne ułatwiają uwalnianie metali ciężkich z niedostępnych kompleksów, zwiększając tym samym mobilizację, na przykład cynku, ołowiu lub kadmu. Wprowadzenie do gleby skażonej ołowiem metaloopornych endofitów Pseudomonas fluorescens G10 oraz Microbacterium sp. G16 spowodowało, że stężenie w glebie rozpuszczalnych form Pb zwiększyło się prawie sześciokrotnie. Co ważne, szczepy te istotnie wpływały na akumulację ołowiu w częściach nadziem-nych rzepaku (Brassica napus), a całkowita zawartość zgromadzonego ołowiu w pędach wzrosła z 76% do 131% (P. fluorescens G10) i od 59% do 80% (Microbacterium sp. G16) w porównaniu z kontrolą traktowaną martwym inokulum [42]. B. napus może gromadzić w swoich tkankach także miedź. Inokulacja sadzonek

Rys. 2. Model zielonej wątroby (Green liver concept) (objaśnienia w tekście) [1]


rzepaku szczepami Ralstonia sp. J1-22-2, Pantoea agglomerans Jp3-3 oraz Pseudomonas thivervalensis Y1-3-9, o wysokiej aktywności deaminazy ACC (213–370 µM α-ketomaślanu/mg∙h) nie tylko zwiększała biomasę tej rośliny, ale powodowała również istotnie wyższą aku-mulację Cu w łodygach i liściach rzepaku w porów-naniu z roślinami nieinokulowanymi [57]. Natomiast tytoń (Nicotiana tabacum) szczepiony kadmoopornym szczepem Sanguibacter sp. S_d. zakumulował aż trzy-krotne więcej Cd w częściach nadziemnych w porów-naniu z nietraktowaną kontrolą [27].

Wydajny proces fitoekstrakcji wspomagany przez endofityczne bakterie zależy nie tylko od gatunku samego mikroorganizmu, ale także od gatunku rośliny. Szczep Bacillus sp. SLS18 w różnym stopniu zwiększał akumulację manganu i kadmu w pędach Sorghum bicolor (Mn-65,2%, Cd-40%), Phytolacca acinosa (Mn-55,2%, Cd-31,1%), Solanum nigrum (Mn-16,6%, Cd-25,6%) w porównaniu do roślin nieinokulowanych [24].

Wysoka zawartość metali ciężkich w glebie jest czynnikiem stresowym dla roślin i często prowadzi do wzmożonej produkcji etylenu, co w konsekwencji skutkuje zahamowaniem wzrostu korzeni i procesu fotosyntezy. Metalotolerancyjne PGPE Methylobacterium oryzae CBMB20 i Burkholderia sp. CBMB40 zdolne do produkcji deaminazy ACC i IAA istotnie zmniejszały ilość uwalnianego przez pomidory (Lycopersicon esculentum) etylenu, zwiększały przyrost ich biomasy i jednocześnie redukowały toksyczny wpływ niklu i kadmu na sadzonki pomidora. Bakterie te ogra-niczały zdolność pomidorów do gromadzenia Ni i Cd w korzeniach i pędach. Obserwowane efekty inokulacji sadzonek pomidorów autorzy tłumaczą posiadaniem przez M. oryzae CBMB20 i Burkholderia sp. CBMB40 mechanizmów promujących wzrost roślin oraz zdol-nością bakterii do akumulacji znacznych ilości jonów Ni i Cd [26].

7. Endofity w rolnictwie i ochronie roślin

Wraz ze zwiększającą się liczbą ludności rośnie zapotrzebowanie na produkty rolne na świecie. Sytua-cja ta zmusza do poszukiwania metod zwiększających wydajność produkcji szczególnie ważnych upraw takich jak ryż, kukurydza, trzcina cukrowa, buraki cukrowe oraz pszenica. Azot jest tak zwanym pierwiastkiem plo-notwórczym. Niestety, powszechnie stosowane nawoże-nie związkami azotowymi jest niewystarczające, gdyż aż 65% wprowadzanych do gleby mineralnych związków azotu jest tracona w wyniku parowania, wypłukiwania i/lub wiązania się z koloidami glebowymi [6].

Rozwiązaniem tego problemu wydaje się być zasto-sowanie szczepionek z bakterii endofitycznych zdolnych do wiązania azotu atmosferycznego i dostarczania go

roślinom uprawnym. Potwierdziły to badania Boddey i wsp. [7], którzy zaobserwowali ponad 60-procentowy wzrost zawartości azotu w roślinach inokulowanych bakteriami wiążącymi azot atmosferyczny. Korzystne oddziaływanie bakterii z rodzaju Herbaspirillum oraz Azospirillum, endofitów wielu roślin, na plonowanie ważnych pod względem przemysłowym odmian ryżu basmati było opisane przez Mirza i wsp. [28]. Jednak ilość związanego i dostarczanego przez bakterie endo-fityczne azotu swoim roślinnym gospodarzom może się znacznie różnić. Na przykład w tkankach dzikiego ryżu (Oryza officinalis) inokulowanego Herbaspirillum sp. B501 zawartość związanego izotopu 15N zwiększyła się aż o 381% w stosunku do kontroli, która nie była trak-towana bakteriami [13]. Natomiast kolonizacja tkanek ryżu przez Burholderia sp. spowodowała zwiększenie zawartości azotu w tkankach tej rośliny o 31% [4]. Uważa się, że różnice te zależą od odmiany i stadium rozwojowego rośliny, szczepu bakterii endofitycznej, metody inokulacji i warunków środowiska.

Wyniki badań molekularnych udowadniają, że pro- mowanie wzrostu roślin i zawartość azotu jest uzależ-niona od obecności u endofitów aparatu enzymatycznego warunkującego wiązanie N2. U roślin inokulowanych dzikimi szczepami z rodzaju Azocarus zaobserwo-wano znaczący przyrost biomasy oraz wzrost zawar-tości azotu w tkankach w porównaniu do roślin inokulowanych mutantami z nieaktywnym genem nif [6].

Nie tylko endofity zdolne do wiązania azotu korzyst-nie wpływają na rośliny. Takie właściwości posiadają także bakterie produkujące fitohormony. Przykładowo, bakterie izolowane z korzeni buraków cukrowych (Beta vulgaris), zdolne do produkcji auksyny stymulowały wzrost sadzonek buraków, zwiększały ich biomasę oraz liczbę liści [43]. Khan i Doty [22] wykazali, że bakterie endofityczne izolowane ze słodkich buraków (Ipomoea batatas) były zdolne do kolonizacji i stymulacji wzro-stu także innych gatunków roślin. Szczepy produkujące największą ilość IAA indukowały szybsze ukorzenianie się i wzrost sadzonek topoli. Inny endofit Burkholderia phytofirmans PsJN izolowany z cebuli jest także endo-fitem naturalnie występującym w tkankach ziemnia-ków, pomidorów oraz winorośli. U tej ostatniej rośliny obserwowano przenikanie tych bakterii przez elementy naczyń ksylemu do pozostałych tkanek [12, 39].

Występowanie bardzo ścisłego związku między endofitami a roślinami stało się podstawą ich poten-cjalnego wykorzystania jako środków ochrony roślin. Liczne bakterie endofityczne znane są z antagonistycz-nego działania wobec patogennych bakterii i grzybów. Konkurują one o niszę ekologiczną oraz mikro i makro-elementy, indukują ISR (Indukowana Odporność Sys-temiczna) u roślin, produkują antybiotyki lub inne związki hamujące wzrost patogenów. Ardanov i wsp. [3] wykorzystali dwa gatunki bakterii endofitycznych:


Pseudomonas sp. oraz Methylobacterium sp. jako śro-dek ochronny w uprawie ziemniaków. Inokulacja roślin zawiesiną bakterii skutecznie chroniła uprawy przed patogenną bakterią Pectobacterium atrosepticum (Erwinia carotovora supp. atroseptica), która wywołuje chorobę zwaną czarną nóżką. Oba szczepy endofi- tów nie tylko indukowały odporność roślin, ale także promowały wzrost ich pędów. Z kolei, odporność przeciw grzybowym patogenom Verticillium sp. oraz Botrytis cinerea uzyskiwały pomidory oraz winorośl, które inokulowano endofitycznymi bakteriami B. phytofirmans PsJN [8, 12].

Ochronny wpływ bakterii endofitycznych Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1, Paenibacillus polymyxa YUPP-8 oraz Bacillus subtilis YUPP-2 przeciwko fitopa-togenom bawełny obserwowali także Yang i wsp. [51]. Wyniki doświadczeń polowych wykazały, że poraże-nie pleśniami było widoczne tylko u 5,2% roślin ino-kulowanych bakteriami endofitycznymi, podczas gdy w kontroli poziom ten wynosił aż 33,5%.

8. Metabolity endofitów w medycynie

Prowadzone są także badania nad wykorzystaniem endofitów do produkcji metabolitów, które mogą być stosowane jako efektywne narzędzia do walki z cho-robami ludzi, roślin i zwierząt. Szacuje się, że 51% nowo odkrytych substancji produkowanych jest przez endofity, natomiast tylko 38% przez mikroorganizmy glebowe [47]. Wśród endofitów poszukuje się bakterii, które są zdolne do produkcji nowych antybiotyków, związków przeciwnowotworowych, lotnych związków organicznych, związków przeciwgrzybiczych, antywiru-sowych, insektycydów oraz immunosupresantów [38].

Przykładem takiej bakterii jest Pseudomonas viridiflawa izolowana z traw. Ten endofit ma zdolność do pro-dukcji antygrzybicznych substancji, ekomycyn, repre-zentujących nowo poznaną grupę związków należących do lipopeptydów. Hamują one rozwój patogenów czło-wieka takich jak Candida albicans oraz Cryptococcus neoformans. Ze względu na fakt, że aż 45% biologicznie aktywnych substancji produkowanych jest przez pro-mieniowce, głównie Streptomyces sp., endofity należące do tego rodzaju są szczególnie poszukiwane. Streptomyces NRRL 30562, wyizolowany z czarnego pnącza (Kennedia nigriscans), produkuje munumbicyny A-D, peptydy o działaniu antybiotycznym oraz przeciw-malarycznym. Z kolei, 6-prenylindol produkowany przez Streptomyces sp. TP-A0595 wykazuje aktywność przeciwgrzybiczą, tak jak antymycyna 18 izolowana z innego szczepu Streptomyces albidoflavus [10, 33].

W ostatnich latach szczególne intensywnie poszu-kuje się związków przeciwnowotworowych. Dobrze znany cytostatyk należący do diterpenów to taksol sto-

sowany w leczeniu nowotworów jajnika, sutka i płuc. Związek należący do tej samej grupy i o podobnych właściwościach, paklitaksol, wyizolowano z endofitycz-nych bakterii z rodzaju Kitasatospora sp. Pterocydina, naftomycina to kolejne substancje o działaniu przeciw-nowotworowym produkowane przez Streptomyces sp.

Izolowane z roślin Monstera sp. endofityczne bak-terie Streptomyces sp. MSU-2110 produkują korona-mycynę, która działa przeciwmalarycznie, a w dodatku wykazuje wysoką aktywność przeciwko grzybowemu patogenowi C. neoformans [10, 33, 38, 47].

9. Produkcja bioplastiku

Poza typowo medycznym zastosowaniem sub-stancji produkowanych przez endofity, poszukuje się także bakterii produkujących biopolimery, które mogą być wykorzystane jako bioplastiki. Lemoigne w 1926 opisał pierwszy bioplastik (poli-3-hydroksymaślan (PHB)) produkowany przez Bacillus megaterium. Jest to jeden z najczęściej wytwarzanych poliestrów pocho-dzenia bakteryjnego. Okazuje się, że w genomie wielu mikroorganizmów, w tym endofitów, można odnaleźć geny warunkujące syntezę PHB. Obecnie poszukuje się szczepów, które pozwolą zwiększyć wydajność pro-dukcji PHB i usprawnić cały ten proces. Obiecujące badania w tym zakresie przeprowadził Catalan i wsp. [9]. Wykazały one, że Herbaspirillum seropedicae, dia-zotroficzny endofit, produkuje dużą ilość PHB podczas hodowli z wykorzystaniem różnych źródeł węgla. Bada-nia te mogą przyczynić się do usprawnienia procesu produkcji biopolimerów i powstania nowych biomate-riałów o szerokim zakresie zastosowań [38].

10. Podsumowanie

Mikroorganizmy endofityczne są niezwykle ważne w prawidłowym rozwoju rośliny. Bakterie te posiadają liczne mechanizmy wspomagające wzrost roślin oraz szlaki degradacyjne wielu metabolitów, często tok-sycznych dla roślinnych gospodarzy. Dlatego też duże nadzieje wiąże się z możliwością wykorzystania bakterii endofitycznych we wspomaganiu fitoremediacji.

Opracowanie skutecznych metod wykorzystania bakterii endofitycznych i ryzosferowych w usuwaniu zanieczyszczeń jest obecnie jednym z ważniejszych nurtów badawczych w zakresie biotechnologii i mikro-biologii środowiskowej. Wydaje się, że wykorzystanie bakterii endofitycznych o określonych zdolnościach metabolicznych stwarza szansę na znaczne zwiększe-nie efektywności procesów fitodegradacji w usuwaniu węglowodorów z gleby. Nowo izolowane szczepy mogą stać się punktem wyjścia do dalszych badań nad endo-


fitami, ich potencjałem degradacyjnym, aktywnością w tkankach roślinnych oraz wspomaganiem remediacji zanieczyszczonego środowiska.

PodziękowaniaBadania finansowane ze środków grantu MNiSW/NCN nu-

mer 2013/09/N/NZ9/01606. Małgorzata Pawlik jest stypendystką w ramach projektu „Dokto-

RIS – Program stypendialny na rzecz innowacyjnego Śląska” współ-finansowanego przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.

Piśmiennictwo

1. Abhilash P.C., Jamil S., Singh N.: Transgenic plants for enhanced biodegradation and phytoremediation of organic xenobiotics. Biotechnol. Adv. 27, 474–488 (2009)

2. Andreolli M., Lampis S., Poli M., Gullner G., Bir O.B., Vallini G.: Endophytic Burkholderia fungorum DBT1 can improve phyto-remediation efficiency of polycyclic aromatic hydrocarbons. Chemosphere, 92, 688–694 (2013)

3. Ardanov P., Ovcharenko L., Zaets I., Kozyrovska N., Pirt-tila A.M.: Endophytic bacteria enhancing growth and disease resistance of potato (Solanum tuberosum L.). Biol. Control, 56, 43–49 (2011)

4. Baldani V.L.D., Baldani J.I., Dobereiner J.: Inoculation of rice plants with the endophytic diazotrophs Herbaspirillum seropedicae and Burkholderia spp. Biol. Fert. Soils, 30, 485–491 (2000)

5. Becerra-Castro C., Kidd P.S., Prieto-Fernández Á., Weyens N., Acea M.J., Vangronsveld J.: Endophytic and rhizoplane bacteria associated with Cytisus striatus growing on hexachlorocyclo-hexane-contaminated soil: isolation and characterization. Plant Soil, 340, 413–433 (2011)

6. Bhattacharjee R.B., Singh A., Mukhopadhyay S.N.: Use of nitro-gen-fixing bacteria as biofertiliser for non-legumes: prospects and challenges. Appl. Microbiol. Biotechnol. 80, 199–209 (2008)

7. Boddey R.M., Oliveira O.C.D., Urquiaga S., Reis V.M., Oliva-res F.L.D., Baldani V.L.D., Döbereiner J.: Biological nitrogen fixation associated with sugarcane and rice: contributions and prospects for improvement. Plant Soil, 174, 195–209 (1995)

8. Bordiec S., Paquis S., Lacroix H., Dhondt S., AitBarka E., Kauff-mann S., Jeandet P., Mazeyrat-Gourbeyre F., Clement Ch., Bail-lieul F., Dorey S.: Comparative analysis of defence responses induced by the endophytic plant growth-promoting rhizobac-terium Burkholderia phytofirmans strain PsJN and the non--host bacterium Pseudomonas syringae pv. pisi in grapevine cell suspensions. J. Exp. Bot. 62, 595–603 (2011)

9. Catalan A.I., Ferreira F., Gill P.R., Batista S.: Production of poly-hydroxyalkanoates by Herbaspirillum seropedicae grown with different sole carbon sources and on lactose when engineered to express the lacZ lacY genes. Enzyme Microb. Tech. 40, 1352–1367 (2007)

10. Chandra S.: Endophytic fungi: novel sources of anticancer lead molecules. Appl. Microbiol. Biotechnol. 95, 47–59 (2012)

11. Compant S., Clement Ch., Sessitsch A.: Plant growth-promoting bacteria in the rhizo- and endosphere of plants: their role, colo-nization, mechanisms involved and prospects for utilization. Soil Biol. Biochem. 42, 669–678 (2010)

12. Compant S., Kaplan H., Sessitsch A., Nowak J., AitBarka E., Clement C.: Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by Burkholderia phytofirmans strain PsJN: from the rhizosphere to inflorescence tissues. FEMS Microbiol. Ecol. 63, 84–93 (2008)

13. Elbeltagy A.K., Sato N.T., Suzuki H., Ye B., Hamada T., Isawa T., Mitsui H., Minamisawa K.: Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp. isolated from wild rice species. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5285–5293 (2001)

14. Forchetti G., Masciarelli O., Alemano S., Alvarez D., Abdala G.: Endophytic bacteria in sunflower (Helianthus annuus L.): iso-lation, characterization, and production of jasmonates and abscisic acid in culture medium. Appl. Microbiol. Biotechnol. 76, 1145–1152 (2007)

15. Hardoim P.R., Andreote F.D, Reinhold-Hurek B., Sessitsch A., van Overbeek L.S., van Elsas J.D.: Rice root-associated bacteria: insights into community structures across 10 cultivars. FEMS Microbiol. Ecol. 77, 154–164 (2011)

16. Hardoim P.R., Overbeek L.S., van Elsas J.D.: Properties of bacte-rial endophyte and their proposed role in plant growth. Trends Microbiol. 16, 463–471 (2008)

17. Ho Y.N., Mathew D.C., Hsiao Ch.H., Shih Ch.H., Chien M.F., Chiang H.M., Huang Ch.Ch.: Selection and application of endo-phytic bacterium Achromobacter xylosoxidans strain F3B for improving phytoremediation of phenolic pollutants. J. Hazard. Mater. 219–220, 43–49, (2012)

18. Hung P.Q., Kumar S.M., Govindsamy V., Annapurna K.: Isola-tion and characterization of endophytic bacteria from wild and cultivated soybean varieties. Biol. Fertil. Soils, 44, 155–162 (2007)

19. Hurek T., Reinhold-Hurek B., van Montagu M., Kellenberger E.: Root colonization and systemic spreading of Azoarcus sp. strain BH72 in grasses. J. Bacteriol. 176, 1913–1923 (1994)

20. Janpen P., Kiwamu M., Kamonluck T., Nantakorn B., Neung T.: The communities of endophytic diazotrophic bacteria in culti-vated rice (Oryza sativa L.). Appl. Soil Ecol. 42, 141–149 (2009)

21. Khan S., Afzal M., Iqbal S., Khan Q.M.: Plant-bacteria partner-ships for the remediation of hydrocarbon contaminated soils. Chemosphere, 90, 1317–1332 (2013)

22. Khan Z., Doty S.L.: Characterization of bacterial endophytes of sweet potato plants. Plant Soil, 322, 197–207 (2009)

23. Kuklinsky-Sobral J., Araujo W.L., Rodrigo Mendes R., Pizzirani--Kleiner A.A., Azevedo J.L.: Isolation and characterization of endophytic bacteria from soybean (Glycine max) grown in soil treated with glyphosate herbicide. Plant Soil, 273, 91–99 (2005)

24. Luo S., Xu T., Chen L., Chen J., Rao Ch., Xiao X., Wan Y., Zeng G., Long F., Liu Ch., Liu Y.: Endophyte-assisted promotion of biomass production and metal-uptake of energy crop sweet sor-ghum by plant-growth-promoting endophyte Bacillus sp. SLS18. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 1745–1753 (2012)

25. Ma Y., Prasad M.N.V., Rajkumar M., Freitas H.: Plant growth promoting rhizobacteria and endophytes accelerate phytoreme-diation of metalliferous soils. Biotechnol. Adv. 29, 248–258 (2011)

26. Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sa T.: Metal tolerating methylo-trophic bacteria reduces nickel and cadmium toxicity and pro-motes plant growth of tomato (Lycopersicon esculentum L.). Chemosphere, 69, 220–228 (2007)

27. Mastretta C., Taghavi S., van der Lelie D., Mengoni A., Galardi F., Gonnelli C., Barac T., Boulet J., Weyens N., Vangronsveld J.: Endophytic bacteria from seeds of Nicotiana tabacum can reduce cadmium phytotoxicity. Int. J. Phytoremediat. 11, 251–267 (2009)

28. Mirza M.S., Rasul G., Mehnaz S., Ladha J.K., So R.B., Ali S., Malik K.A. Beneficial effects of inoculated nitrogen-fixing bac-teria on rice (w) The quest for nitrogen fixation in rice, red. J.K. Ladha, P.M. Reddy, International Rice Research Institute, Los Banos, 2000, s. 191–204

29. Moore F.P., Barac T., Borremans B., Oeyen L., Vangronsveld J., van der Lelie D., Campbell C.D., Moore E.R.B.: Endophytic bac-terial diversity in poplar trees growing on a BTEX-contaminated site: the characterisation of isolates with potential to enhance phytoremediation. Syst. Appl. Microbiol. 29, 539–556 (2006)


30. Nikolic B., Schwab H., Sessitsch A.: Metagenomic analysis of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase gene (acdS) operon of an uncultured bacterial endophyte colonizing Solanum tuberosum L. Arch. Microbiol. 193, 665–676 (2011)

31. Phillips L.A., Germida J.J., Farrell R.E., Greer Ch.W.: Hydrocar-bon degradation potential and activity of endophytic bacteria associated with prairie plants. Soil Biol. Biochem. 40, 3054–3064 (2008)

32. Płociniczak T., Kukla M., Wątroba R., Piotrowska-Seget Z.: The effect of soil bioaugmentation with strains of Pseudomonas on Cd, Zn and Cu uptake by Sinapis alba L. Chemosphere, 9, 1332–1337 (2013)

33. Qin S., Xing K., Jiang J.H., Xu L.H., Li W.J.: Biodiversity, bioac-tive natural products and biotechnological potential of plant--associated endophytic actinobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89, 457–473 (2011)

34. Rajkumar M., Ae N., Freitas H.: Endophytic bacteria and their potential to enhance heavy metal phytoextraction. Chemosphere, 77, 153–160 (2009)

35. Reinhold-Hurek B., Hurek T.: Life in grasses: diazotrophic endo-phytes. Trends Microbiol. 6, 139–144 (1998)

36. Reinhold-Hurek B., Hurek T.: Living inside plants: bacterial endophyte. Curr. Opin. Biotechnol. 14, 435–443 (2011)

37. Reinhold-Hurek B., Maes T., Gemmer S., van Montagu M., Hurek T.: An endoglucanase is involved in infection of rice roots by the not-cellulose-metabolizing endophyte Azoarcus sp. strain BH72. Mol. Plant Microbe Interact. 19, 181–188 (2006)

38. Ryan R., Germaine K., Franks A., Ryan D.J., Dowling D.N.: Bac-terial endophyte: recent developments and applications. FEMS Microbiol. Lett. 278, 1–9 (2008)

39. Sessitsch A., Coenye T., Sturz A.V, Vandamme P., AitBarka E., Salles J.F., van Elsas J.D, Faure D., Reiter B., Glick B.R., Wang--Pruski G., Nowak J.: Burkholderia phytofirmans sp. nov., a novel plant-associated bacterium with plant-beneficial properties. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 1187–1192 (2005)

40. Sgroy V., Cassán F., Masciarelli O., Florencia M., Papa D., Laga-res A., Luna V.: Isolation and characterization of endophytic plant growth-promoting (PGPB) or stress homeostasis-regu-lating (PSHB) bacteria associated to the halophyte Prosopis strombulifera. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 371–381 (2009)

41. Sheng X., Chen X., He L.: Characteristics of an endophytic pyrene-degrading bacterium of Enterobacter sp. 12J1 from Allium macrostemon Bunge. Int. Biodeterior. Biodegrad. 62, 88–95 (2008a)

42. Sheng, X.F., Xia, J.J., Jiang, C.Y., He L.Y., Qian M.: Characteri-zation of heavy metal-resistant endophytic bacteria from rape (Brassica napus) roots and their potential in promoting the growth and lead accumulation of rape. Environ. Pollut. 156, 1164–1170 (2008b)

43. Shi Y., Lou K., Li Ch.: Promotion of plant growth by phytohor-mone-producing endophytic microbes of sugar beet. Biol. Fertil. Soils, 45, 645–653 (2009)

44. Siciliano S.D., Fortin N., Mihoc N., Wisse G., Labelle S., Beaumier D., Ouellette D., Roy R., Whyte L.G., Banks M.K.,

Schwab P., Lee K., Greer Ch.W.: Selection of specyfic endophytic bacterial genotypes by plants in response to soil contamination. Appl. Environ. Microbiol. 67, 2469–2475 (2001)

45. Spaepen A., Vanderleyden J., Remans R.: Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol. Rev. 31, 425–448 (2007)

46. Taghavi S., Garafola C., Monchy S., Newman L., Hoffman A., Weyens N.,Barac T., Vangronsveld J., van der Lelie D.: Genome survey and characterization of Endophytic bacteria exhibiting a beneficial effect on growth and development of poplar trees. Appl. Environ. Microbiol. 75, 748–757 (2009)

47. Wang K., Dai Ch.Ch.: Endophytes: a potential resource for bio-synthesis, biotransformation, and biodegradation. Ann. Microbiol. 61, 207–215 (2011)

48. Wang Y., Zhao W., He X., Chen J., Geng X., Xiao M.. Induc-tion of toluene degradation and growth promotion in corn and wheat by horizontal gene transfer within endophytic bacteria. Soil Biol. Biochem. 42, 1051–1057 (2010)

49. Weyens N., van der Lelie D., Taghavi S., Vangronsveld J.: Phyto-remediation: plant-endophyte partnerships take the challenge. Curr. Opin. Biotech. 20, 248–254 (2009)

50. Xinxian L., Xuemei Ch., Yagang Ch., Woon-Chung W.J., Zebin W., Qitang W.: Isolation and characterization endophy-tic bacteria from hyperaccumulator Sedum alfredii hance and their potential to promote phytoextraction of zinc polluted soil. World J. Microbial Biotechnol. 27, 1197–1207. (2011)

51. Yang P., Sun Z., Liu S., Lu H., Zhou Y., Sun M.: Combining anta-gonistic endophytic bacteria in different growth stages of cotton for control of Verticillium wilt. Crop Prot. 47, 17–23 (2013)

52. Ying X., Dongmei G., Judong L., Zhenyu W.: Plant-microbe inte-ractions to improve crude oil degradation. Energy Procedia, 5, 844–848 (2011)

53. Yousaf S., Afzal M.,. Reichenauer T.G., Brady C.L., Sessitsch A.: Hydrocarbon degradation, plant colonization and gene expres-sion of alkane degradation genes by endophytic Enterobacter ludwigii strains. Environ. Pollut. 159, 2675–2683 (2011)

54. Yousaf S., Andria V., Reichenauer T.G., Smalla K., Sessitsch A.: Phylogenetic and functional diversity of alkane degrading bac-teria associated with Italian ryegrass (Lolium multiflorum) and Birdsfoot trefoil (Lotus corniculatus) in a petroleum oil-conta-minated environment. J. Hazard. Mater. 184, 523–532 (2010)

55. Youssef N.H., Duncan K.E., Nagle D.P., Savager K.N., Knapp R.M., McInerney M.J.: Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms. J. Microbiol. Methods, 56, 339–346 (2004)

56. Zhan X., Liang X., Xu G., Zhou L.: Influence of plant root mor-phology and tissue composition on phenantrene uptake: Step-wise multiple linear regression analysis. Environ. Pollut. 179, 294–300 (2013)

57. Zhang Y.F., He L.Y., Chen Z.J., Wang Q.Y., Qian M., Sheng X.F.: Characterization of ACC deaminase-producing endophytic bac-teria isolated from copper-tolerant plants and their potential in promoting the growth and copper accumulation of Brassica napus. Chemosphere, 83, 57–62 (2011)


* Autor korespondencyjny: Katedra Mikrobiologii i Biotechnologii Stosowanej, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie, ul. Papieża Pawła VI 3, 71-459 Szczecin; tel./fax 91 449 65 40; e-mail: [email protected]

1. Wstęp

Od końca lat ’80 pojawiło się wiele publikacji doty-czących patogenności Listeria monocytogenes. Pro-wadzone badania analizowały korelację określonego serotypu L. monocytogenes z obecnością genów wirulencji. Okazało się bowiem, że nie wszystkie szczepy tego gatunku mają geny patogenności.

Nowym aspektem badań związanym z rodzajem Listeria było również wyizolowanie listeriopodobnych szczepów atypowych z prób żywności oraz ze środo-wiska naturalnego. Morfologia i pewne cechy bioche-miczne szczepów wskazywały na ich przynależność do rodzaju Listeria. Mikroorganizmy te posiadały jednak unikatowe i odmienne właściwości, które nie pozwalały na ich klasyfikację do konkretnego gatunku Listeria.

Identyfikacja wyizolowanych szczepów atypowych opierała się na wykorzystaniu metod biochemicznych pozwalających na szczegółowe określenie cech feno-typowych bakterii, jak również na analizie genotypu badanych szczepów [1, 22, 23, 35, 50, 59, 60].

Kilka z wyizolowanych szczepów atypowych skla-syfikowano jako nowe gatunki Listeria [1, 22, 23, 35]. Pojawiły się również szczepy, których analiza wykazała przynależność do dwóch znanych już gatunków Listeria. Szczepy te cechowały się jednak atypową zdolnością do hemolizy [59, 60].

2. Charakterystyka rodzaju Listeria

L. monocytogenes po raz pierwszy została opisana przez Murray’a w 1926 roku [44]. Oficjalne odkrycie bakterii przypada jednak na rok 1924, kiedy to z choru-jących na posocznicę królików i świnek morskich wyizo-lowano nieznane dotychczas drobnoustroje [4]. Murray początkowo określił wyodrębniony mikroorganizm jako Bacterium monocytogenes. Dopiero w 1940 roku Harvey Pirie zmienił nazwę rodzaju na Listeria [24].

Do 1961 roku L. monocytogenes była jedynym przed- stawicielem Listeria sp., który do tego czasu uważany był za rodzaj monotypowy. W kolejnych latach do

POSTĘPY BADAŃ NAD BAKTERIAMI RODZAJU LISTERIA

Kamila Beata Muskalska1*, Barbara Szymczak1

1 Katedra Mikrobiologii i Biotechnologii Stosowanej,Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie

Wpłynęło w marcu 2014 r.

1. Wstęp. 2. Charakterystyka rodzaju Listeria. 2.1. Filogenetyczne pokrewieństwo pomiędzy gatunkami rodzaju Listeria. 2.2. Serotypy. 2.3. Geny charakterystyczne dla Listeria sp. 2.3.1. Mechanizmy wirulencji L. monocytogenes. 2.4. Chorobotwórczość L. monocytogenes. 3. Szczepy atypowe. 3.1. Szczepy atypowe wyizolowane z sera. 3.2. Atypowa niehemolityczna L. seeligeri. 3.3. Atypowa hemolityczna L. innocua. 3.4. L. marthii. 3.5. L. rocourtiae. 3.6. L. weihenstephanensis. 3.7. L. fleischmannii. 4. Podsumowanie

Progress in research on the genus Listeria

Abstract: The Listeria-like atypical strains have been identified in the natural environment and in the food samples lately. In recent times, Listeria monocytogenes isolates were characterized for molecular serogroup identification by multiplex PCR. Subsequently, virulence genes were detected. The results of the study show that the presence or absence of some virulence genes depends on the serotype of L. monocytogenes. The phylogenetic position and phenotypic character of isolated strains similar to Listeria spp. were studied. The atypical strains were examined based on diagnostic tests (hemolysis, CAMP, sugar fermentation, motility at 25°C) commonly used to identify Listeria. The isolates were highly similar phenotypically. The rrs gene sequence (encoding 16S rRNA) was analyzed in comparison to the genus Listeria. 16S rRNA sequencing data showed that these strains belong to the genus Listeria, but were different from all other known species. Phylogenetic distance from six known species of the genus Listeria indicated that they represent a novel species. The names Listeria marthii, Listeria rocourtiae, Listeria weihenstephanensis and Listeria fleischmannii were proposed for the four novel species isolated from samples obtained from the natural environment and food. Moreover, the presence of natural atypical hemolytic Listeria innocua strains and natural atypical nonhemolytic Listeria seeligeri isolates was observed. These strains differed from known L. innocua and L. seeligeri in only one of the hly gene.

1. Introduction. 2. Characterization of the genus Listeria. 2.1. Phylogenetic relation between species of the genus Listeria. 2.2. Serotypes. 2.3. The specific genes of the Listeria sp. 2.3.1. Mechanisms of virulence of L. monocytogenes. 2.4. Diseases associated with L. monocytogenes. 3. Atypical strains. 3.1. Atypical strains isolated from cheese. 3.2. Atypical nonhemolytic L. seeligeri strains. 3.3. Atypical hemolytic L. innocua strains. 3.4. L. marthii. 3.5. L. rocourtiae. 3.6. L. weihenstephanensis. 3.7. L. fleischmannii. 4. Summary

Słowa kluczowe: nowe gatunki, rodzaj Listeria, serotyp, szczepy atypoweKey words: new species, genus of Listeria, serotype, atypical strains

124 KAMILA BEATA MUSKALSKA, BARBARA SZYMCZAK

Listeria sp. dołączały Listeria denitryficans (1961), Listeria grayi (1966), Listeria murrayi (1971). Listeria innocua, Listeria welshimeri oraz Listeria seeligeri zostały dodane do rodzaju w 1983 roku [16]. Listeria ivanovii została włączona jako ostatnia w 1985 roku. Rozdzielono ją następnie na dwa podgatunki L. ivanovii subsp. ivanovii i L. ivanovii subsp. londoniensis [22]. Jednak dalsze badania zarówno genotypowe jak i fenotypowe dokonały kolejnych weryfikacji. W kon-sekwencji L. murrayi włączono do gatunku L. grayi, a L. denitryficans została zaklasyfikowana do nowego rodzaju Jonesia, w wyniku czego przyjęła nazwę Jonesia denitryficans [39]. W wyniku powyższych zmian, aż do niedawna wśród rodzaju Listeria wyróżnić można było sześć gatunków: L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri oraz L. grayi [59].

Wszystkie mikroorganizmy zaklasyfikowane do rodzaju Listeria to Gram-dodatnie krótkie pałeczki o długości 1,2 µm i szerokości 0,5 µm [4, 40], które zazwyczaj występują pojedynczo lub tworzą krótkie łańcuszki [40]. Mogą również organizować się w sku-piska palisadowe i przyjmować kształt liter V i Y [51]. Listeria spp. nie wytwarzają spor ani otoczki. Są to mikroorganizmy względnie beztlenowe oraz psychro-trofowe [2], rosną w szerokim zakresie temp. 0–45°C oraz przy pH 6–9 [23]. Najlepiej rozwinięte zdolności adaptacyjne posiada L. monocytogenes, która wzrasta również w temperaturze –2 °C oraz przy pH sięgają-cym do 4,4. Natomiast całkowita inaktywacja bakterii tego gatunku obserwowana jest dopiero w temperatu-rze powyżej 75°C [61]. Cechą identyfikacyjną wszyst-kich gatunków Listeria jest zdolność do ruchu w temp. 25°C [38], jak również fakt, iż są katalazo-dodatnie oraz oksydazo-ujemne [23]. Gatunki Listeria różnią się natomiast zdolnością do fermentacji cukrów oraz właściwościami litycznymi w stosunku do erytrocytów różnych gatunków zwierząt m.in. końskich, owczych [30], króliczych jak również człowieka [40]. Stanowi to podstawę do odróżniania gatunków hemolitycznych od pozostałych niehemolitycznych [59].

Wszystkie bakterie z rodzaju Listeria a w szczegól-ności L. monocytogenes tolerują ekstremalne warunki takie jak: niskie pH, niska temperatura oraz wysokie zasolenie. Te właściwości powodują, że są one szeroko rozpowszechnione w wielu naturalnych i miejskich środowiskach [23]. Można wyizolować je z różnych biocenoz [59] m.in. z gleby, ścieków, wody, pasz tzw. kiszonek czy produktów spożywczych [28].

W rutynowej procedurze identyfikacji szczepów bak-teryjnych pod względem ich przynależności do okreś-lo nego gatunku stosuje się metody fenotypowe, wśród których wykorzystywane są m.in. testy API Listeria, jak i niekiedy metody genetyczne oparte na reakcji PCR [35].

Co więcej szczepy bakterii należące do Listeria sp. charakteryzują się określonym serotypem [28, 37] oraz

posiadają typowe dla siebie warianty genów. Determi-nują one zarówno przynależność szczepów do jednego z sześciu występujących gatunków [5], jak również pozwalają na określenie pokrewieństwa pomiędzy gatunkami [12, 22].

2.1. Filogenetyczne pokrewieństwo pomiędzy gatunkami rodzaju Listeria

Gatunki Listeria wykazują między sobą różny sto-pień pokrewieństwa. Obecnie wyróżnia się dwa klady zawierające odpowiednie gatunki bakterii. Pierwszy z kladów składa się z L. monocytogenes i L. innocua a drugi obejmuje L. seeligeri, L. ivanovii oraz L. welshimeri. Oba klady zawierają zarówno przedstawicieli gatunków posiadających odpowiednie warianty kla-stra genów wirulencji tj. L. monocytogenes, L. ivanovii i L. seeligeri jak również te gatunki, które go nie mają tj. L. innocua i L. welshimeri [12]. Ciekawy jest fakt, że klaster genów wirulencji ma tą samą lokalizację genomową, pomimo iż bakterie należą do dwóch róż-nych kladów [22].

Interesujące jest również, że istnieje bliskie pokre-wieństwo pomiędzy gatunkami patogennymi i nie-patogennymi. Chorobotwórcza L. monocytogenes jest najbliższa filogenetycznie z niezjadliwą L. innocua. Natomiast patogenna L. ivanovii z L. seeligeri, która pomimo posiadanego klastra wirulencji uważana jest za formę niepatogenną. Może być to związane z brakiem innych nieznanych jeszcze czynników, które wpływają na zdolności chorobotwórcze L. seeligeri [12].

Prowadzone badania filogenetyczne sugerują więc obecność wspólnego przodka dla obu wymienionych kladów. Przodek ten posiadał klaster genów wirulen-cji, po czym wystąpiły dwie niezależne delecje, które doprowadziły do straty powyższego klastra genów u pozostałych niepatogennych członków obu kladów.

Status L. grayi jest do tej pory nieokreślony [22]. Wiadomo jedynie, iż jest najbardziej odległa filogene-tycznie od pozostałych gatunków Listeria [12].

2.2. Serotypy

Szczepy bakteryjne należące do określonych gatun-ków rodzaju Listeria różnią się dodatkowo między sobą determinantami antygenowymi znajdującymi się na powierzchni komórki. Różnice antygenowe są wynikiem obecności różnych związków chemicznych takich jak białka błonowe czy kwas lipotejchojowy, które warunkują strukturę błony komórkowej [25]. Takie odmienności pomiędzy szczepami mogą być identyfikowane dzięki wykorzystaniu typowania sero-logicznego. Pozwala to na bardziej szczegółowy podział Listeria spp. ze względu na posiadany serotyp, który określany jest na podstawie ciepło-stabilnego antygenu

POSTĘPY BADAŃ NAD BAKTERIAMI RODZAJU LISTERIA 125

somatycznego O (15 podtypów I–XV) oraz ciepło-labil-nego antygenu rzęskowego H (4 podtypy A-D) i deter-minowany ich odpowiednią kombinacją [28].

Początkowo do przeprowadzania serotypowania wykorzystywano przede wszystkim metody immuno-logiczne, które opierały się na specyficznej reakcji anty-gen-przeciwciało [56]. W wyniku tego wśród szczepów L. monocytogenes wyróżniono 12 serotypów (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e i 7) [37]. Niektóre źródła podają jednak występowanie dodatkowo trzy-nastego serotypu tj. 4ab [25]. W przypadku L. seeligeri wymieniono natomiast 7 serotypów (1/2a, 1/2b, 3b, 4a, 4b, 4c i 6b), jeden w L. ivanovii (5) i kilka w L. innocua, L. welshimeri, L. grayi (1/2b, 6a i 6b) [28].

Ze wszystkich serotypów L. monocytogenes za najbar-dziej niebezpieczne dla człowieka uważane są 1/2a, 1/2b i 4b, którym przypisuje się 95% przypadków ludzkiej listeriozy [33, 34]. Z powyższych trzech serotypów 4b jest przyczyną 50% zachorowań w skali światowej [20].

Przeprowadzone badania szczepów bakteryjnych należących do gatunku L. monocytogenes wykazały, iż istnieje również zależność pomiędzy ich serotypem a przynależnością do odpowiedniej linii filogenetycz-nej, którą określano metodami genetycznymi [36]. Jak do tej pory wśród gatunku wyróżniono 3 odrębne linie ewolucyjne. Klasyfikację przeprowadzono na podsta-wie różnic w sekwencji nukleotydowej 3 genów: flaA (kodujący flagelinę), iap (kodujący p60) i hly (kodu-jący LLO) [29]. Co więcej każdej linii filogenetycznej przyporządkowano odpowiednie serotypy [10, 13, 53].

Po raz pierwszy podziału takiego dokonał Piffaretti i wsp., w 1989 roku, kiedy to badał powiązania gene-tyczne wśród wyizolowanych szczepów L. monocytogenes. Wyodrębnił on wówczas dwie linie filogenetyczne I i II do których przyporządkował następujące serotypy 1/2b, 4b, 4a do linii ewolucyjnej I, natomiast 1/2c i /2a do II [48]. Wielu autorów kolejnych publikacji opiera się właśnie na niniejszym podziale, uzupełnia-jąc go w kolejne serotypy oraz wprowadzając zmiany m.in. w postaci dodania kolejnej trzeciej linii ewolucyjnej [10, 46].

metodę multiplex PCR, L. monocytogenes została po-

d zie lona przez niego na 5 grup serotypowych skorelo-wanych z odpowiednią linią ewolucyjną [13].

Grupa serotypowa (1/2b; 3b; 7) (1/2a; 3a) (4a; 4c) (4b; 4d; 4e) (1/2c; 3c)

Tabela IPodział L. monocytogenes na 5 grup serotypowych w zależności od

linii filogenetycznej

W tabeli pogrubieniem zaznaczono serotypy będące najczęstszą przyczyną ludzkiej listeriozy.

Linia filogenetyczna I IIIII

Grupa serotypowa (1/2a; 3a) (1/2b; 3b; 7) (4a; 4c) (1/2c; 3c) (4b; 4d; 4e)

W tabeli pogrubieniem zaznaczono serotypy będące najczęstszą przyczyną ludzkiej listeriozy.

Linia filogenetyczna I IIIII

Tabela IIPodział L. monocytogenes na 5 grup serotypowych zastosowany

w metodzie multiplex PCR

Powyższy podział przyjmowany jest obecnie jako najbardziej poprawny. Jednakże istnieje również inny, który w 2004 wprowadził Doumith. Wykorzystując

Ostatnio pojawiają się jednak publikacje informu-jące o wyodrębnieniu wśród linii filogenetycznej III trzech podgrup tj. IIIA, IIIB, IIIC, z których IIIB w istotnym stopniu odróżnia się od dwóch pozosta-łych [10]. Stanowi to podstawę do utworzenia kolejnej IV grupy filogenetycznej [10, 53]. Okazuje się również, że przebadane szczepy w zależności od swojego sero-typu mogą posiadać lub być pozbawione określonych genów kodujących wirulencję L. monocytogenes [53].

2.3. Geny charakterystyczne dla Listeria sp.

Wszystkie gatunki Listeria posiadają gen rrs kodu-jący 16S rRNA [35]. Analiza tego genu pozwala na określenie przynależności rodzajowej dzięki stwier-dzeniu obecności produktu o długości 938 pz [3]. Sekwencja 16S rRNA pozwoliła w przeszłości ostatecz-nie ustalić odrębność rodzaju Listeria od pozostałych blisko spokrewnionych rodzajów bakterii m.in. Brochotrix sp. [51]. Obecnie pierwszym etapem identyfika-cji genetycznej, jaką przeprowadza się w celu określe- nia przynależności bakterii do Listeria sp. jest właśnie analiza sekwencji 16S rRNA. Na tej podstawie ustalany jest stopień pokrewieństwa z pozostałymi gatunkami [1, 22, 23, 35, 50, 59, 60].

Istotną częścią genomu bakterii Listeria jest rów-nież obecność lub brak wspominanego wcześniej kla-stra genów wirulencji [22], określanego także wyspą patogenności Listeria tzw. LiPI (Listeria Pathogeni- city Island) [12]. Wśród genów klastra, prfA stanowi plejotropowy regulator wirulencji [28], którego produkt aktywuje transkrypcję wszystkich genów LiPI tj. hly, plcA, mpl, actA i plcB [41]. Geny klastra kodują białka niezbędne bakteriom do przeżycia wewnątrz komórek oraz umożliwiające im przemieszczanie się w obrębie tkanek [12].

Wśród genów wyspy patogenności Listeria bardzo ważny jest gen hly kodujący hemolizynę. Gen warun-kujący hemolityczność L. monocytogenes, L. ivanovii i L. seeligeri zlokalizowany jest pomiędzy genami prs i ldh. Brak niniejszego genu w genomie L. innocua,


L. welshimeri oraz L. grayi czyni je gatunkami niehe-molitycznymi [59]. Z trzech gatunków posiadających gen hly tylko dwa są chorobotwórcze: L. monocytogenes (dla człowieka i zwierząt) i L. ivanovii (dla zwierząt). L. ivanovii jest patogenem zwierzęcym w szczegól ności infekującym bydło [23] i owce [22]. Uważany za nie-patogenny dla człowieka był jednak przyczyną pojedyn-czych zakażeń u ludzi [12].

Pozostałe geny należące do LiPI to plcA i plcB kodują dwie fosfolipazy, gen mpl metaloproteazę, a gen actA białko warunkujące polimeryzację włókien akty-nowych. Wymienione białka pozwalają na wydostanie się z fagosomu komórki żywiciela i rozprzestrzenianie międzykomórkowe.

Druga grupa genów jest odpowiedzialna za kodo-wanie białek z rodziny internalin w zakażonych tkan-kach, stanowi co najmniej 27 różnych białek, a każdego roku opisywanych jest kilka nowych. Występują one zarówno u patogennych jak i niepatogennych gatunków Listeria. Wśród nich wymienić można geny związane ze zdolnością do wirulencji tj. inlA i inlB kodujące białka odpowiedzialne za inwazję komórek różnych typów [12] oraz gen inlC i inlJ [53].

Charakterystycznym dla wszystkich gatunków ge nem jest również iap. Posiada on konserwatywny region na końcach 5’ i 3’, taki sam dla wszystkich przedstawicieli Listeria spp. Domeną różnicującą iap u poszcze-gólnych gatunków jest jego specyficzny region zloka-lizowany w centralnej części genu [5]. Gen iap jest również czynnikiem warunkującym wirulencję i pato-genność u L. monocytogenes [28] dzięki kodowanemu zewnątrzkomórkowemu białku p60 (invasion-associa-ted protein) [63]. Oprócz udziału w procesie wirulen-cji białko p60 jest odpowiedzialne za przeprowadzenie prawidłowego podziału komórkowego dzięki aktyw-ności hydrolazy mureiny [6, 52].

Cechą charakterystyczną genu iap u L. monocytogenes jest domena, która składa się z tandemu powtarzają-cych się sekwencji (TRS): ACAAAT. Domena ta koduje centralną część białka p60, odpowiadając kolejno dwóm aminokwasom takim jak: treonina i asparagina. Fakt ten wykorzystuje się do wykrywania różnic pomiędzy szczepami L. monocytogenes [11].

2.3.1. Mechanizmy wirulencji L. monocytogenes

L. monocytogenes jest wewnątrzkomórkowym pato-genem, który ma zdolność pokonywania trzech głów-nych barier w organizmie ludzkim: bariery jelitowej, bariery łożyskowej oraz bariery krew-mózg. Bakterie tego gatunku potrafią wnikać do różnego typu komórek niefagocytujących oraz przemieszczać się w tkankach w wyniku przechodzenia z komórki do komórki [58].

Pierwszą przeszkodą, z którą spotyka się L. monocytogenes jest wysoce kwasowe środowisko (pH 2,0)

żołądka żywiciela oraz obecność soli kwasów żółcio-wych. Zdolność L. monocytogenes do przeżycia i przejś-cia przez stadium żołądkowe jest możliwa, dzięki obecności białkowej podjednostki polimerazy RNA (RNAP) – alternatywny czynnik sigma σB (kodowany przez sigB). Reguluje on geny chroniące bakterie przed stresem tj.: opuCA, lmo1421, bsh oraz związane z nimi białka. Bez poprawnie funkcjonującego genu sigB, prze-żywalność L. monocytogenes w warunkach stresowych jest znacznie osłabiona.

W kolejnym, jelitowym etapie infekcji L. monocytogenes przylega i wnika do komórek żywiciela w spo-sób bierny dzięki procesowi fagocytozy, jak i aktywnie przez działanie listeriowych białek powierzchniowych tj. internalin, wśród których najbardziej znaczące i najlepiej scharakteryzowane są internalina A (InlA) i internalina B (InlB) [38]. Dwa inne białka z tej samej rodziny: InlC i InlJ kodowane przez geny inlC i inlJ odgrywają znacznie mniejsza rolę od InlA i InlB. Geny te określane są jako jedne z bardziej istotnych marke-rów wirulencji [53]. Delecja w genie inlC lub inlJ znacz-nie osłabia zdolności patogenne L. monocytogenes [38].

Po wniknięciu bakterii do komórki gospodarza jest ona zamykana w pęcherzyku fagocytarnym, z którego uwalnia się przechodząc do cytoplazmy. Ucieczka L. monocytogenes jest możliwa dzięki obecności mole-kuł związanych z procesami wirulencji tj.: listerioli-zynie O (LLO) kodowanej przez gen hly, oraz dwóm fosfolipazom kodowanym przez geny plcA i plcB, jak również pomocniczej metaloproteazie. Należy podkreś-lić, że gen hly odgrywa bardzo istotną rolę w patoge-nezie L. monocytogenes, ponieważ szczepy posiadające mutację tego genu nie są chorobotwórcze [38].

Przedostawaniu się L. monocytogenes do kolejnych komórek oraz rozprzestrzenianiu infekcji w obrębie organizmu gospodarza sprzyja obecności powierzch-niowego białka ActA odpowiedzialnego za zdolność do ruchu [38] (Tab. III).

Ostatnie badania wskazują na obecność kolejnego czynnika wirulencji jakim jest nowoodkryty peptyd hemolityczny – listeriolizyna S (LLS) [9]. Prowadzone doświadczenia sugerują, że LLS odgrywa rolę w przeży-walności L. monocytogenes, ponieważ warunkuje odpor-ność względem granulocytów obojętnochłonnych przez co podnosi potencjał chorobotwórczy bakterii.

Wytwarzanie LLS związane jest ze stresem oksy-dacyjnym, co sugeruje iż peptyd ten może poprawiać zdolności LLS-pozytywnych szczepów L. monocytogenes do ucieczki z fagosomu lub makrofagów, jak rów-nież może to stanowić kluczowy element jeśli chodzi o patogenność bakterii [8]. Należy zaznaczyć, że LLS nie jest tak rozpowszechniona jak LLO i jest ograni-czona do linii I linii ewolucyjnej.

Jak na razie nie sprawdzono całej puli genów wiru-lencji, lecz tylko wybrane czynniki. Pozwoliło to jed-


nak wnioskować, że odpowiednie serotypy różnicują bakterie pod względem posiadanych genów zjadliwo-ści. Szczególnie ubogie w geny wirulencji zdają się być szczepy należące do trzeciej linii ewolucyjnej o seroty-pie 4a i 4c, które to charakteryzują się często brakiem inlJ, inlC, iap czy LLS. Może to stanowić powód do polemiki nad ich zdolnościami chorobotwórczymi, pomimo iż należą do potencjalnie chorobotwórczego gatunku [37, 46, 53].

2.4. Chorobotwórczość L. monocytogenes

L. monocytogenes jest odpowiedzialna za wywoły-wa nie tzw. listeriozy [31]. Bakteria infekuje wątrobę i trzustkę, obecna jest w płynie mózgowo-rdzeniowy oraz we krwi [57]. Do zakażeń dochodzi w wyniku spożywania zanieczyszczonej bakteriami żywności [55]. Częste są również zakażenia płodów i noworod-ków od matki [49].

L. monocytogenes może być przyczyną zachorowań wśród zdrowych dorosłych [57] i osób z grupy wyso-kiego ryzyka tzw. YOPI (Young, Old, Pregnat, Immu-nocompromised) wśród których wymienia się: osoby starsze, kobiety w ciąży, osoby z osłabionym układem odporności [43], alergicy, chorzy po przeszczepach, dia-betycy, dzieci [61], noworodki lub niemowlęta w wieku okołoporodowym [28]. W zależności od podatności organizmu ludzkiego listerioza może mieć różnoraki przebieg [57].

Ok. 20% wszystkich zachorowań na listeriozę doty-czy osób dorosłych [33]. Choroba występuje u nich głównie w formie łagodnej zwykle bez objawów lub z objawami grypopodobnymi. Obserwuje się także postać jelitową z bólem brzucha i biegunką [42]. Szcze-gólnie niebezpieczne są przypadki, w których choroba przybiera postać ostrą w postaci bakteriemii czy zapale-nia opon mózgowych [43]. Większość potwierdzonych zachorowań dotyczy osób powyżej 65 roku życia.

U ludzi z obniżoną odpornością chorujących na nowotwory, cukrzycę, HIV/AIDS, choroby wątroby czy będących po przeszczepie, przebieg listeriozy jest zazwy-czaj ciężki. Choroba objawia się w postaci posocznicy, zapalenia opon mózgowych oraz bardzo poważnych infekcji atakujących centralny układ nerwowy [57].

Listerioza jest szczególnie niebezpieczna dla kobiet w ciąży [15], stanowi bowiem duże zagrożenie poronie-niem, urodzeniem martwego lub zarażonego dziecka, jak również przedwczesnych narodzin [49]. Noworodki zainfekowane L. monocytogenes chorują na zapalenie płuc, sepsę i zapalenie opon mózgowych.

L. monocytogenes jest mikroorganizmem groźnym nie tylko dla populacji ludzkiej. Bakteria wywołuje bowiem zachorowania również u zwierząt [57]. Przy-czyną listeriozy zwierzęcej jest przede wszystkim L. mo nocytogenes, a stosunkowo rzadko L. ivanovii. Listerioza notowana jest często u przeżuwaczy (bydło, kozy, owce). Zostają one zainfekowane w wyniku spo-żywania zanieczyszczonych kiszonek, w których pato-gen może przeżyć ponad 2 lata. Bakteria może również rozmnażać się w kiszonkach, gdy ich pH przekracza 5. U wszystkich gatunków zakażenie może doprowadzić do zapalenia łożyska i macicy, być przyczyną ronień, przedwczesnych porodów oraz śmierci płodu. Nowo-rodki, które przeżyją stają się nosicielami bakterii. U bydła rzadko występują objawy kliniczne w postaci posocznicy czy zapalenia mózgu, częste natomiast są poronienia w 4–7 miesiącu ciąży.

Oprócz zwierząt przeżuwających również trzoda chlewna może ulec infekcji. W tym wypadku do zakażeń dochodzi drogą pokarmową, oddechową czy przez spojówki oczu. U trzody chlewnej mogą wystę-pować zakażenia bezobjawowe, ale także posocznica czy postać nerwowa. Zdarza się, że jedynym objawem listeriozy mogą być ronienia.

Na infekcję narażone są również psy, koty, drób, ptaki, ryby, owady, kleszcze, skorupiaki i ostrygi. Ze względu na wysokie niebezpieczeństwo związane

iap P60 umożliwia adhezję bakterii do komórek gospodarza [5].inlA InlA oddziałuje z E-kadheryną, prowadząc do rearanżacji cytoszkieletu i fagocytozy przez internalizację do komórek nabłonka jelita [38].inlB InlB reaguje z receptorami Met i Clq, umożliwiając internalizację hepatocytów, fibroblastów oraz komórek nabłonka [38].inlC, inlJ InlC i InlJ odgrywają rolę w późniejszych pozajelitowych stadiach infekcji [38].hly LLO pozwala na przejście z fagosomu [26] do cytoplazmy, dzięki lizie błony pęcherzyka fagocytarnego [39].plcA, plcB PlcA i PlcB wspomagają LLO w lizie błony wakuolarnej i ułatwiają ucieczkę z fagosomu [38].mpl Mpl aktywuje białko PlcB [62].atcA AtcA pozwala na migrację L. monocytogenes do sąsiednich komórek, dzięki ogonowi aktynowemu [38].

Tabela IIIGeny wirulencji L. monocytogenes i funkcja kodowanych białek

W tabeli w nawiasach kwadratowych podano pozycje cytowanego piśmiennictwa.

Gen Funkcja kodowanego białka


z infekcją L. monocytogenes, listerioza jest w Polsce chorobą podlegającą obowiązkowemu rejestrowi [21].

Pierwsze udokumentowane przypadki ludzkiej liste-riozy przenoszonej drogą pokarmową sięgają 1981 roku. W jednej z prowincji w Kanadzie doszło tam do zakaże-nia 7 osób dorosłych i 34 dzieci w okresie okołoporodo-wym. Przyczyną zachorowań była sałatka tzw. coleslaw, a źródło zakażenia stanowiła L. monocytogenes obecna w magazynowanej kapuście. Istnieją również wcześniej-sze doniesienia o zakażeniach, pochodzące z 1979 roku. Wówczas zachorowały 23 osoby. Epidemia ta była zwią-zana ze spożyciem sałatki z surowych warzyw takich jak: seler, pomidor i sałata. Źródłem zanieczyszczenia bakteriami L. monocytogenes była sałata [17].

Obecnie listerioza uważana jest za chorobę poważną [33], ponieważ cechuje się wysokim poziomem śmier-telności 20–30% [15]. W państwach Unii Europejskiej odsetek chorych na listeriozę wzrósł o 19,1% porów-nując rok 2008 i 2009. W 2009 roku odnotowano 1601 zachorowań, poziom ten utrzymywał się również w 2010 roku. W 2009 roku L. monocytogenes dopro-wadziła do 270 zgonów [33]. Natomiast w Stanach Zjednoczonych mikroorganizm ten był przyczyną 2500 zachorowań, 2289 hospitalizacji i 449 zgonów [33, 43]. W 2011 roku wybuchła w USA epidemia listeriozy spowodowana spożyciem melona kantalupa, która przyniosła 146 zachorowań, 29 zgonów i 1 poronienie [53]. Listerioza stanowi więc jedną ze śmiertelnych chorób przenoszonych drogą pokarmową odnotowy-wanych na terenie Stanów Zjednoczonych czy krajów Unii Europejskiej [33, 53].

W Polsce w oparciu o dane z Meldunków Rocz-nych NIZP-PZH/GIS dotyczących zachorowań na choroby zakaźne i zatrucia, rejestruje się również przypadki zachorowań na listeriozę. Dokumenty te obrazują występowanie choroby w latach 1970–2009. Największa liczba zachorowań miała miejsce w roku: 1979 (32 zachorowań), 1977 (26 zachorowań) oraz 1978 (25 zachorowań). Natomiast w roku 1986 i 1990 nie odnotowano żadnych wystąpień ludzkiej listeriozy. Kolejne częste pojawienie się choroby zarejestrowano dopiero w roku 2002 (31 zachorowań), 2005 (22 zacho-rowań), 2006 (28 zachorowań) i w 2007 (43 zacho-rowań). Łącznie w latach 1970–2008 na terenie Pol-ski odnotowano 371 przypadków listeriozy, z czego 289 osób było hospitalizowane, a 16 chorych zmarło [18]. Istotny jest fakt, że opisywane zachorowania sta-nowią w Polsce głównie odosobnione przypadki. Jak do tej pory w ramach prowadzonego w Polsce nadzoru sanitarnego zgłoszono dwa niewielkie ogniska zatruć pokarmowych, jedno w roku 2005 a drugie w 2010 [32].

Wysoki poziom zachorowań na listeriozę związany jest z powszechnym występowaniem L. monocytogenes w środowisku, a co za tym idzie ze skażoną żywnoś-cią [33]. Z tego względu istnieje obowiązek badania

produktów spożywczych pod względem obecności powyższego patogenu. Amerykańska Agencja Żyw ności i Leków ogłosiła bowiem „zero tolerancji” (< 1 orga-nizm na 25 g próby) dla Listeria spp. w żywności [7]. Niniejsza norma obowiązuje także w Polsce i innych krajach Unii Europejskiej.

L. monocytogenes w stosunkowo dużych ilościach obecna jest w określonych grupach żywności takich jak: miękkie sery, sery pleśniowe, pasztety, niepaste-ryzowane mleko [33], lody [54], różne typy mięsa takie jak: fermentowane wędliny, parówki, hot-dogi [33], indyk, szynka RTE (ready-to-eat) [45] czy pro-dukty pochodzenia morskiego [61] m.in. wędzone na zimno lub na ciepło łososie, krewetki, małże, marynaty, sałatki rybne [55]. L. monocytogenes znajduje się rów-nież w wielu rodzajach warzyw [43], owocach [14] oraz sokach owocowych [54].

Dokładna identyfikacja mikroorganizmów wyizo-lowanych z żywności czy środowiska odgrywa zatem istotną rolę. Badania takie oprócz wykrycia lub wyklu-czenia obecności L. monocytogenes, pozwalają również na wyizolowanie szczepów o nowych nietypowych cechach, które mogą być groźne dla zdrowia człowieka.

3. Szczepy atypowe

Szczepy atypowe z definicji są mikroorganizmami nieposiadającymi określonej cechy lub cech charakte-rystycznych dla danego gatunku, bądź też posiadające nowe odmienne cechy, które odgrywają znaczącą rolę w systematyce.

Doniesienia o występowaniu szczepów posiadają-cych nietypowe właściwości pojawiają się sporadycznie już w starszych publikacjach, lecz traktowane są tam jako anomalia [19].

Jednak dopiero od niedawna udaje się wyizolować listeriopodobne szczepy atypowe, które pomimo wyso-kiego podobieństwa do poznanych już gatunków nie wykazują przynależności do żadnego z nich.

Obecnie ukazały się publikacje, które informują o pojawianiu się takich mikroorganizmów [1, 22, 23, 35, 50, 59, 60]. Kilka z wyizolowanych szczepów aty-powych sklasyfikowano już jako nowe gatunki Listeria, kolejno dołączały Listeria marthii [22], Listeria rocourtiae [35], Listeria weihenstephanensis [23] oraz Listeria fleischmannii [1], jak również pojawiły się szczepy charakteryzujące się atypową zdolnością do hemolizy tj.: niehemolityczna L. seeligeri [59] oraz hemolityczna L. innocua [60].

Pierwsze doniesienia o występowaniu listerio po-dobnych szczepów atypowych zostały opublikowane w 1998 roku. Szczepy wyizolowano podczas rutynowej analizy mikrobiologicznej sera na obecność L. mono cytogenes. Z dwóch gatunków serów: miękki z czer-wonym przerostem oraz miękki dojrzewający ser pleś-


niowy pozyskano cztery szczepy (MB417, MB419, MB421, MB422).

Fenotypowo bakterie różniły się tylko jedną cechą w stosunku do pozostałych gatunków Listeria, nie wyka-zywały one bowiem zdolności do ruchu w temp. 25°C.

Analiza sekwencji genu 16S rRNA wykazała homo-logię szczepów atypowych na poziomie 94% w stosunku do pozostałych gatunków Listeria. Badania potwierdziły, że wyizolowane mikroorganizmy należą do odrębnego taksonu, bardziej spokrewnionego z rodzajem Listeria niż z Brochothrix sp.

Dalsze badania zdecydują czy powyższe szczepy atyowe utworzą osobny taksonomicznie rodzaj czy zo- staną zaklasyfikowane jako nowy gatunek Listeria [50].

3.1. Atypowa niehemolityczna L. seeligeri

Kolejne informacje o pojawieniu się szczepów aty-powych Listeria ukazały się w 2006 roku. Z prób z żyw-ności tj. surowego mleka i mięsa z krabów oraz z prób środowiskowych pochodzących ze słonych bagien, ujść wody oraz osadu, wyizolowano siedem szczepów (LS159, LS165, LS160, SE107, SE116, LS166, 2436KA).

Przeprowadzone testy wskazywały na jeden z gatun-ków należących do Listeria. Ze względu na fakt, że badane szczepy nie wykazywały zdolności do lizy ery-trocytów, wykluczono ich przynależność do hemo-litycznych L. monocytogenes, L. seeligeri i L. ivanovii. Badane szczepy nie powodowały rozkładu L-ramnozy i mannitolu, natomiast fermentowały D-ksylozę. Cechy fenotypowe mikroorganizmów sugerowały, iż są to przedstawiciele gatunku L. welshimeri.

Dopiero analiza genetyczna oparta na hybrydyzacji z wykorzystaniem mikromacierzy DNA oraz zsekwen-cjonowaniu genów iap, prfA i 16S rRNA pozwoliła na prawidłową klasyfikację badanych bakterii. W wyniku wykonanych badań okazało się, iż są to atypowe nie-hemolityczne szczepy L. seeligeri, a powodem braku genu hly była delecja w centralnej części klastra genów wirulencji [59].

3.2. Atypowa hemolityczna L. innocua

Rok później opublikowano kolejne badania doty-czące listeriopodobnych szczepów atypowych. Wówczas z prób żywności wyizolowano bakterie, które sklasyfiko-wano jako atypowy gatunek L. innocua z niespecyficzną dla siebie zdolnością do przeprowadzania hemolizy.

Szczepy posiadały w swoim genomie klaster genów analogiczny do wyspy patogenności LiPI występując m.in. u L. monocytogenes. Obecność klastra z genem hly determinowała zdolności hemolityczne badanych bak-terii. Dalsza analiza genetyczna pozyskanych szczepów nie wykazała jednak obecności innych genów wirulen-cji specyficznych dla L. monocytogenes.

Pojawienie się atypowych hemolitycznych szczepów L. innocua sugeruje, że L. monocytogenes oraz L. innocua musiały posiadać i wywodzić się od wspólnego przodka [60].

3.3. L. marthii

W 2010 roku ukazały się kolejne doniesienia o szcze-pach atypowych, które zostały sklasyfikowane jako nowy gatunek Listeria. Cztery listeriopodobne szczepy (FSL S4-120T, FSL S4-696, FSL S4-710, FSL S4-965) pochodziły z naturalnego środowiska jezior Finger znaj-dujących się na terenie Parku Narodowego w Nowym Jorku. Szczepy atypowe zostały wyizolowane z próbek gleby, wody płynącej oraz stojącej na terenie parku.

Bakterie fenotypowo przypominały rodzaj Listeria. Były to Gram-dodatnie, względnie beztlenowe, zdolne do ruchu w temp. 25°C, niehemolityczne oraz niewy-twarzające spor pałeczki.

Przeprowadzona analiza sekwencji genu 16S rRNA wykazała bliskie filogenetyczne pokrewieństwo z L. mo nocytogenes (99,3–99,8%) i L. innocua (99%) oraz bar-dziej odległe relacje z L. welshimeri, L. seeligeri i L. grayi. Kolejno wykonano hybrydyzację DNA, która wykazała stosunkowo dużą różnicę pomiędzy szczepami aty-powymi a L. monocytogenes oraz L. innocua.

Ostatecznie opierając się na cechach fenotypowych oraz na genotypowej odrębności od L. monocytogenes i L. innocua, cztery wyizolowane szczepy zostały skla-syfikowane jako nowy gatunek tj. L. marthii. Mikro-organizm ten określony jest jako niepatogenny, do tej pory niepowiązany z występowaniem chorób u ludzi czy zwierząt [22].

3.4. L. rocourtiae

W tym samym roku opisano również kolejny gatu-nek L. rocourtiae, który wyizolowano z sałaty w austriac- kim laboratorium w Salzburgu. Scharakteryzowanie tego szczepu dało podstawy do wyodrębnienia go jako nowego gatunku Listeria.

Badany szczep wykazywał cechy charakterystyczne dla rodzaju Listeria. Była to Gram-dodatnia, nie wytwa-rzająca spor pałeczka, która cechowała się zdolnością do ruchu oraz obecnością katalazy. Względnie beztle-nowy i niehemolityczny szczep atypowy wykazywał wzrost tylko na jednym z użytych podłóż chromogen-nych. Tworzone przez niego kolonie na podłożu Rapid’ L. mono były białe i otoczone żółtym halo, co świad-czyło, iż nie posiada on enzymu PIPLC, ale cechuje się zdolnością do metabolizmu ksylozy.

Analiza genetyczna sekwencji genu rrs (kodującego 16S rRNA) wykazała przynależność szczepu do rodzaju Listeria, a badania filogenetyczne ostatecznie potwier-dziły obecność odrębnego gatunku. Szczep nazwano


L. rocourtiae w celu upamiętnienia francuskiego bio- loga Jocelyne Rocourt, który specjalizował się w syste-matyce Listeria.

Na podstawie analizy hodowli komórkowej i bada-niach przeprowadzonych na myszach szczep ostatecz-nie został oznaczony jako awirulentny [35].

3.5. L. weihenstephanensis

Najnowsza publikacja z 2013 roku opisała kolejne dwa listeriopodobne szczepy atypowe wyizolowane z rzęsy trójrowkowej Lemna trisulca (roślina wodna), która została pobrana ze stawu wodnego w Bawarii.

W wyniku analizy sekwencji 16S rRNA wyizolowa-nych szczepów okazało się, że wykazują one blisko spo-krewnione z nowym gatunkiem tj. L. rocourtiae (homo-logia 22,5%) i są bardziej odległe filogenetycznie od pozostałych gatunków Listeria. Ze względu na różnice fenotypowe i genotypowe w stosunku do L. rocourtiae, szczepy zostały sklasyfikowane jako nowy gatunek L. weihenstephanensis.

L. weihenstephanensis to regularne pałeczki o śred-nicy 0,4–0,5 µm i długości 2–4,5 µm. Nie tworzą spor ani otoczki. Rosną w warunkach beztlenowych oraz wykazują zdolność do ruchu w hodowlach w zakre-sie temp. 15–30°C. Optymalne parametry dla wzrostu tego gatunku to pH 7–8 oraz temp. 28–34°C, w temp. 38°C obserwuje się brak wzrostu. L. weihenstephanensis jest niehemolityczny oraz niepatogenny dla człowieka i zwierząt [23].

3.6. L. fleischmannii

Następnym niedawno odkrytym i opublikowanym w 2013 roku gatunkiem, który dołączył do rodzaju Listeria jest L. fleischmannii. W tym przypadku szczepy atypowe pochodziły z sera szwajcarskiego. Pierwsze trzy szczepy (LU2006-1(T), LU2006-2, LU2006-3) wyizolowano z odrębnych prób tego samego rodzaju sera. Kolejno po 5 latach udało się pozyskać jeszcze jeden szczep (A11-3426) o takich samych właściwoś-ciach jakie przedstawiali jego poprzednicy.

Cztery „nowoodkryte” szczepy pozyskano z jed-nakowego rodzaju sera, wzrastającego w tych samych warunkach piwnicznych, co świadczyło o tym, iż badane mikroorganizmy wykazywały cechy adapta-cyjne do środowiska, w którym rosły.

Właściwości fenotypowe i chemotaksonomiczne szczepów atypowych świadczyły o ich przynależności do Listeria sp. Jednak ich odrębność określona na podstawie hybrydyzacji DNA, nie pozwalała na zakla-syfikowanie ich do żadnego z dotychczas poznanych gatunków.

Ze względu na swoją odmienność bakterie zostały oznaczone jako nowy gatunek L. fleischmannii. Szczepy

nie posiadają zdolności do hemolizy oraz nie są choro-botwórcze dla ludzi [1].

4. Podsumowanie

Nie wszystkie szczepy L. monocytogenes odpowie-dzialne są za wywoływanie epidemii listeriozy. Co wię-cej w żywności występują różne serotypy tego gatunku. Mikroorganizmy o serotypach 3a, 3c, 3b, 7, 4d, 4e izo-lowane są z niewielką częstotliwością i bardzo rzadko stanowią przyczynę ludzkiej listeriozy. Pow szech- niej pojawiają się natomiast bakterie o serotypach 1/2a oraz 1/2b, 4b.

Jak wspomniano wcześniej bardzo ważnym aspek-tem determinującym patogenność szczepów jest dodatkowo posiadanie istotnych markerów wirulencji m.in.: genu inlC, inlJ, inlA, jak również listeriolizyny S. Czynniki wirulencji nie występują jednak u wszystkich szczepów L. monocytogenes. Często ich obecność jest powiązana z odpowiednim serotypem mikroorganizmu.

Obowiązujące obecnie normy dla L. monocytoge nes (w tym polska norma dotycząca żywności ISO 11290-2) nie zawierają obowiązku badania przyna- leżności do określonego serotypu, jak również obec-ności genów wirulencji. W tej sytuacji aktualne normy eliminują żywność w przypadku stwierdzenia L. monocytogenes identyfikowanej na podstawie kilku prostych testów biochemicznych. Znajomość serotypu i czyn- ników wirulencji pozwoliłaby poznać potencjalne możli wości chorobotwórcze szczepów zidentyfikowa-nych jako L. monocytogenes oraz wykrywać właściwości nowych gatunków czy szczepów atypowych [1, 22, 23, 35, 50, 59, 60].

Szczepy atypowe w starszym piśmiennictwie uwa-żane za anomalia, obecnie coraz częściej pojawiają w środowisku naturalnym i produktach spożywczych. Od 2006 do 2013 roku wyizolowano już kilka listerio-podobnych szczepów atypowych, które ostatecznie sklasyfikowano do konkretnych gatunków.

Rodzaj Listeria składający się do tej pory z sześciu gatunków, został powiększony o kolejne cztery. Z śro-dowiska naturalnego jezior Finger pozyskano gatunek L. marthii, a z rosnącej w bawarski stawie rzęsy trójrow-kowej wyizolowano L. weihenstephanensis. Kolejne dwa nowe gatunki otrzymano z prób żywności. L. rocourtiae stanowiła pojedynczy szczep wyizolowany z sałaty, natomiast L. fleischmannii została pozyskana z prób sera szwajcarskiego [1, 22, 23, 35].

W trakcie przygotowywania artykułu do druku odkryto siedem nowych gatunków, a wśród nich: L. floridensis, L. aquatica, L. cornellensis, L. grandensis, L. riparia (środowisko), L. booriae i L. newyorkensis (żywność). Co więcej wyodrębniono również szczepy, które w prawdzie ostatecznie sklasyfikowano jako dwa ze znanych już gatunków Listeria, jednak różniące się


od nich zdolnością do przeprowadzania hemolizy. Z prób żywności wyizolowano atypową hemolityczną L. innocua, natomiast zarówno z produktów spożyw-czych jak i środowiska naturalnego pozyskano atypową niehemolityczną L. seeligeri [59, 60].

Występowanie listeriopodobnych szczepów atypo-wych staje się więc zjawiskiem coraz bardziej powszech-nym. Pomimo ukazania się jak do tej pory dopiero kilku publikacji związanych z tą tematyką, istnieje wysokie prawdopodobieństwo izolowania kolejnych takich szczepów. Co więcej mogą stać się one pionierem nowego gatunku lub posiadać unikatowe właściwości, podobnie jak powyższe szczepy, opublikowane w ostat-nim czasie w literaturze naukowej.

Fakty te pozwalają na spekulacje i wysnuwanie hipo-tez, że być może istnieje jeszcze wiele nieodkrytych nisz ekologicznych, z których wyizolować można nieznane do tej pory mikroorganizmy. Tak więc ciągłe badanie, zarówno środowiska, jak i produktów żywnościowych będących z nim w ścisłym kontakcie, jest niezwykle ważnym aspektem pozwalającym na progres i przełomy w dziedzinie mikrobiologii. Kolejne nowe odkrycia mogą wzbogacić królestwo bakterii w dodatkową pulę mikroorganizmów o nowych nietypowych cechach, jak również pozwolą zgłębić wiedzę na temat ciągle jeszcze nie do końca poznanego mikrośrodowiska.

Praca napisana na podstawie pracy magisterskiej pod kierun-kiem dr inż. Barbary Szymczak z Katedry Mikrobiologii i Biotech-no logii Stosowanej Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Techno-logicznego w Szczecinie.

Piśmiennictwo

1. Bertsch D., Rau J., Eugster M.R., Haug M.C., Lawson P.A., Lacroix C., Meile L.: Listeria fleischmannii sp. nov., isolated from cheese. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 526–532 (2013)

2. Bille J., Catimel B., Bannerman E., Jacquet C., Yersin M.N., Caniaux I., Monget D., Rocourt J.: API Listeria, a new and pro-mising one-day system to identify Listeria isolates. Appl. Environ. Microbiol. 58, 1857–1860 (1992)

3. Border P.M., Howard J.J., Plastow G.S., Siggens K.W.: Detection of Listeria species and Listeria monocytogenes using polymerase chain reaction. Lett. Appl. Microbiol. 11, 158–162 (1990)

4. Brugère-Picoux J.: Ovine listeriosis. Small Rum. Res. 76, 12–20 (2008)

5. Bubert A., Hein I., Rauch M., Lehner A., Yoon B., Goebel W., Wagner M.: Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR. Appl. Environ. Microbiol. 65, 4688–4692 (1999)

6. Bubert A., Kestler H., Götz M., Böckmann R., Goebel W.: The Listeria monocytogenes iap gene as an indicator gene for the study of PrfA-dependent regulation. Mol. Gen. Genet. 1, 54–62 (1997)

7. Butman B.T., Plank M.C., Durham R.J., Mattingly J.A.: Mono-clonal antibodies which identify a genus-specific Listeria anti-gen. Appl. Environ. Microbiol. 54, 1564–1569 (1988)

8. Clayton E.M., Hill C., Cotter P.D., Ross R.P.: Real-time PCR assay to differentiate listeriolysin S-positive and -negative stra-

ins of Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 77, 163–171 (2011)

9. Cotter P.D., Draper L.A., Lawton E.M., Daly K.M., Groeger D.S., Casey P.G., Ross R.P., Hill C.: Listeriolysin S, a novel peptide haemolysin associated with a subset of lineage I Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 4, DOI:10.1371/journal.ppat.1000144 (2008)

10. Davis R., Mauer L.J.: Subtyping of Listeria monocytogenes at the haplotype level by Fourier transform infrared (FT-IR) spectro-scopy and multivariate statistical analysis. Int. J. Food Microbiol. 150, 140–149 (2011)

11. De Mello J.F., Einsfeldt K., Frazzon A.P.G., Da Costa M., Frazzo J.: Molecular analysis of the iap gene of Listeria monocytogenes isolated from cheeses in Rio Grande do Sul. Brazil. Braz. J. Microbiol. 39, 169–172 (2008)

12. Den Bakker H.C., Cummings C.A., Ferreira V., Vatta P., Orsi R.H., Degoricija L., Barker M., Petrauskene O., Fur-tado M.R., Wiedmann M.: Comparative genomics of the bac-terial genus Listeria: Genome evolution is characterized by limited gene acquisition and limited gene loss. BMC Genomics, 11, 1471–2164 (2010)

13. Doumith M., Buchrieser C., Glaser P., Jacquet C., Martin P.: Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 42, 3819–3822 (2004)

14. Dzwolak W.: (Nie)bezpieczne warzywa i owoce. Przem. Spoż. 9, 51–55 (2008)

15. Esteban J.I., Oporto B., Aduriz G., Juste R.A., Hurtado A.: Faecal shedding and strain diversity of Listeria monocytogenes in healthy ruminants and swine in Northern Spain. BMC Vet. Res. 5, 1746–6148 (2009)

16. Farber J.M., Peterkin P.I.: Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 55, 476–511 (1991)

17. Francis G.A., Thomas C., O’Beirne D.: The microbiological safety of minimally processed vegetables. Int. J. Food Sci. Technol. 34, 1–22 (1999)

18. Galińska E., Knap J.P., Stroczyńska-Sikorska M.: Listerioza – mało znana, niebezpieczna choroba zakaźna. Med. Ogólna, 16, 516–527 (2010)

19. Garbacz K., Galiński J.: Atypowe szczepy gronkowca złocistego (Staphylococcus aureus) nieposiadające koagulazy lub czynnika zlepnego (CF). Post. Mikrobiol. 45, 39–43 (2006)

20. Gilbreth S.E., Call J.E., Wallace F.M., Scott V.N., Chen Y., Luchansky J.B.: Relatedness of Listeria monocytogenes isola-tes recovered from selected ready-to-eat foods and listeriosis patients in the United States. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8115–8122 (2005)

21. Gliński Z., Kostro K.: Listerioza współczesnym zagrożeniem. Życie Wet. 7, 577–581 (2012)

22. Graves L.M., Sauders B.D. i współ.: Listeria marthii sp. nov., isolated from the natural environment, Finger Lakes National Forest. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60, 1280–1288 (2010)

23. Halter E.L., Neuhaus K., Scherer S.: Listeria weihenstephanensis sp.nov., isolated from the water plant Lemna trisulca of German fresh water pond. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 641–647 (2013)

24. Harvey P.J.H.: Listeria: change of name for a genus of bacteria. Nature 145, 264 (1940)

25. Hodzic S., Hukic M.: Presence and serological characteristics of Listeria monocytogenes in meat and meat products. Health Med. 6, 2593–2599 (2012)

26. Izar B., Mraheil M.A., Hain T.: Identification and role of regu-latory non-coding RNAs in Listeria monocytogenes. Int. J. Mol. Sci. 12, 5070–5079 (2011)

27. Jagielski T., Osińska O.A., Bielecki J.: Molekularne determi-nanty wirulencji Listeria monocytogenes II. Czynniki wirulen-cji uczestniczące w wewnątrzkomórkowym etapie patogenezy: listeriolizyna O (LLO), fosfolipazaB (PlcB), metaloproteaza


(Mpl), fosfolipaza A (PlcA), i białko ActA. Post. Mikrobiol. 45, 303–313 (2006)

28. Jeyaletchumi P., Tunung R., Margaret S.P., Son R., Farinaz-leen M.G., Cheah Y.K.: Detection of Listeria monocytogenes in foods. Int. Food Res. J. 17, 1–11 (2010)

29. Jinneman K.C., Hill W.E.: Listeria monocytogenes lineage group classification by MAMA-PCR of the listeriolysin gene. Curr. Microbiol. 43, 129–133 (2001)

30. Johnson J., Hitchins A.D. i współ.: Natural atypical Listeria innocua strains with Listeria monocytogenes Pathogenicity Island 1 genes. Appl. Environ. Microbiol. 70, 4256–4266 (2004)

31. Kastbjerg V.G., Gram L.: Industrial disinfectants do not select for resistance in Listeria monocytogenes following long term exposure. Int. J. Food Microbiol. 160, 11–15 (2012)

32. Kołakowska A., Madajczak G.: Pałeczki Listeria monocytogenes w zakażeniach ludzi. Przegl. Epidemiol. 65, 57–62 (2011)

33. Kramarenko T., Roasto M., Meremäe K., Kuningas M., Põltsama P., Elias T.: Listeria monocytogenes prevalence and sero-type diversity in various foods. Food Control 30, 24–29 (2013)

34. Kuenne C., Voget S., Pischimarov J., Oehm S., Goesmann A., Daniel R., Hain T., Chakraborty T.: Comparative analysis of plas mids in the genus Listeria. Plos One, 5, DOI: 10.1371/jour-nal.pone.0012511 (2010)

35. Leclercq A., Allerberger F. i współ.: Listeria rocourtiae sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 60, 2210–2214 (2010)

36. Lee S., Ward T.J., Graves L.M., Wolf L.A., Sperry K., Siletzky R.M., Katharioua S.: Atypical Listeria monocytogenes serotype 4b stra-ins harboring a lineage II-Specific Gene Cassette. Appl. Environ. Microbiol. 78, 660–667 (2012)

37. Liu D.: Identification, subtyping and virulence determination of Listeria monocytogenes, an important foodborne pathogen. J. Med. Microbiol. 55, 645–659 (2006)

38. Liu D., Lawrence M.L., Ainsworth A.J., Austin F.W.: Toward an improved laboratory definition of Listeria monocytogenes virulence. Int. J. Food Microbiol. 118, 101–115 (2007)

39. Low J.C., Donachie W.: A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. The Vet. J. 153, 9–29 (1997)

40. Mclauchun J., Ress C.E.D.: Genus Listeria (w) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes, red. De Vos P., Boone D.R., Garrity G.M., Castenholz R.W., Bren-ner D.J., Krieg N.R., Staley J.T., Springer, Dordrecht, 2009, s. 244–257

41. Milohanic E., Glaser P., Coppée J.Y., Frangeul L., Vega Y., Vázquez-Boland J.A., Kunst F., Cossart P., Buchrieser C.: Trans-criptome analysis of Listeria monocytogenes identifies three groups of genes differently regulated by PrfA. Mol. Microbiol. 47, 1613–1625 (2003)

42. Molenda J.: Listerioza – patogeneza, perspektywy bezpieczeń-stwa żywności. Med. Wet. 65, 151–154 (2009)

43. Molinos A.C., Abriouel H., Omar N.B., Valdivia E., Lopez R.L., Maqueda M., Canamero M.M., Galvez A.: Effect of immersion solutions containing enterocin AS-48 on Listeria monocytogenes in vegetable foods. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7781–7787 (2005)

44. Murray E.G.D., Webb R.E., Swann M.B.R.: A disease of rab-bits characterized by a large mononuclear leucocytosis, caused by a hitherto undescribed bacillus Bacterium monocytogenes (n. sp.). J. Pathol. Bacteriol. 29, 407–439 (1926)

45. Myers K., Montoya D., Cannon J., Dickson J., Sebranek J.: The effect of high hydrostatic pressure, sodium nitrite and salt con-centration on the growth of Listeria monocytogenes on RTE ham and turkey. Meat Sci. 93, 263–268 (2013)

46. Niederhauser C., Candrian U., Hofelein C., Jermini M., Buhler H.P., Luthy J.: Use of polymerase chain reaction for detection

of Listeria monocytogenes in food. Appl. Environ. Microbiol. 58, 1564–1568 (1992)

47. Osińska O.A., Jagielski T., Bielecki J.: Molekularne determinanty wirulencji Listeria monocytogenes I. Patogeneza listeryjna. Czyn-niki wirulencji: białka powierzchniowe uczestniczące w adhezji do komórek gospodarza. Post. Mikrobiol. 45, 209–220 (2006)

48. Piffaretti J.C., Kressebuch H., Aeschbacher M., Bille J., Banner-man E., Musser J.M., Selander R.K., Rocourt J.: Genetic characte ri- zation of clones of the bacterium Listeria monocytogenes causing epidemic disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3818–3822 (1989)

49. Pinto A.D., Novello L., Montemurro F., Bonerba E., Tantillo G.: Occurrence of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods from supermarkets in Southern Italy. New Microbiol. 33, 249–252 (2010)

50. Rijpens N., Vlaemynck G., Rossau R., Herman L., Jannes G.: Unidentified Listeria-like bacteria isolated from cheese. Appl. Environ. Microbiol. 27, 198–202 (1998)

51. Rocourt J., Buchrieser C.: The genus Listeria and Listeria monocytogenes: phylogenetic position, taxonomy and identification (w) Listeria, listeriosis and food safetly: Third Edition, red. Ryser E.T., Marth E.H, Taylor & Francis Group, Boca Raton, 2007, s. 1–21

52. Schmid M.W., Ng E.Y.W., Lampidis R., Emmerth M., Wal-cher M., Kref J., Goebel W., Wagner M., Schleifer K.-H.: Evo-lutionary history of the genus Listeria and its virulence genes. Syst. Appl. Microbiol. 28, 1–18 (2005)

53. Shen J., Rump L., Zhang Y., Chen Y., Wang X., Meng J.: Mole-cular subtyping and virulence gene analysis of Listeria monocytogenes isolates from food. Food Microbiol. 35, 58–64 (2013)

54. Shrinithivihahshini N.D., Sheelamary M., Mahamuni D., Chithradevi R.: Occurrence of Listeria monocytogenes in food and ready to eat food products available in Tiruchirappalli, Tamil Nadu, India. World J. Life Sci. Med. Res. 4, 70–75 (2011)

55. Slama B.R., Bekir K., Miladi H., Noumi A., Bakhrouf A.: Adhe-sive ability and biofilm metabolic activity of Listeria monocytogenes strains before and after cold stress. Afr. J. Biotechnol. 61, 12475–12482 (2012)

56. Snehal J., Bhave M., Palombo E.A.: Methods used for the detec-tion and subtyping of Listeria monocytogenes. J. Microbiol. Meth. 88, 327–341(2012)

57. Todd E.C.D., Notermans S.: Surviellance of listeriosis and its causative pathogen, Listeria monocytogenes. Food Control. 22, 1484–1490 (2011)

58. Vázquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty T., Domínguez-Bernal G., Goebel W., González-Zorn B., Weh land J., Kreft J.: Listeria pathogenesis and molecular virulence determi-nants. Clin. Microbiol. Rev. 3, 584–640 (2001)

59. Volokhov D., George J., Anderson C., Duvall R.E., Hitchins A.D.: Discovery of natural atypical nonhemolytic Listeria seeligeri iso-lates. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2439–2448 (2006)

60. Volokhov D.V., Duperrier S., Neverov A.A., George J., Buchrie-ser C., Hitchins A.D.: The presence of the internalin gene in natural atypically hemolytic Listeria innocua strains suggests descent from L. monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1928–1939 (2007)

61. Walczycka M.: Metody inaktywacji i hamowania wzrostu Listeria monocytogenes w przetworach mięsnych. Żywn. Nauk. Technol. Jakość. 43, 61–72 (2005)

62. Ward T.J., Gorski L., Borucki M.K., Mandrell R.E., Hutchins J., Pupedis K.: Intraspecific phylogeny and lineage group iden-tification based on the prfA virulence gene cluster of Listeria monocytogenes. J. Bacteriol. 186, 4994–5002 (2004)

63. Wiedmann M., Bruce J.L., Keating C., Johnson A.E., Mcdonough P.L., Batt C.A.: Ribotypes and virulence gene polymorphisms sug-gest three distinct Listeria monocytogenes lineages with differen-ces in pathogenic potential. Infect. Immun. 65, 2707–2716 (1997)


* Autor korespondencyjny: Katedra Immunologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Szczeciński, ul. Felczka 3c, 71-412 Szczecin; tel. (91) 444 16 05; e-mail: [email protected]

1. Wprowadzenie

FAO/WHO słowo „probiotyk” definiuje jako żywe drobnoustroje, które wprowadzone w odpowiednich ilościach wywołują pożądany efekt w organizmie gospodarza, jednak obecne badania wykazały, że immunostymulujące właściwości mają także metabo-lity tych zarazków oraz martwe komórki bakterii pro-biotycznych [4, 33, 50, 54, 59]. Obecnie probiotykami określa się drobnoustroje wyizolowane z przewodu pokarmowego zdrowego organizmu, a liczne badania potwierdzają ich korzystny wpływ na zdrowie czło-wieka, co stało się podstawą do stosowania probioty-ków – zarówno w profilaktyce, jak i w leczeniu wielu schorzeń. Bakterie probiotyczne poprzez stymulowa-nie układu odpornościowego (UO) ssaków znalazły, zastosowanie w przeciwdziałaniu takich schorzeń, jak biegunki, w tym biegunki infekcyjne i po-antybioty-kowe [8, 16, 19, 21, 41, 43, 47, 54, 58, 60, 62, 63, 66], schorzenia alergiczne [1, 5, 7, 9, 12, 18, 20, 21, 26, 30, 31, 35, 37, 39, 57], nowotworowe [11, 13, 19, 29, 30, 37, 43, 49, 61] oraz schorzenia infekcyjne [ 2, 15, 17, 23–25, 27, 32, 33, 38, 39, 42, 44, 46, 51–53, 55, 56, 64, 65]. Badania wykazały, że nawet mimo przynależ-ności do tego samego gatunku, różne szczepy bakterii wykazują zróżnicowany efekt probiotyczny, stąd przy ich doborze do zastosowania w preparatach probio-

tycznych, należy wybrać szczep o dobrze udokumen-towanym działaniu w badaniach klinicznych [10, 28]. Warto dodać, że ważną rolę spełniają probiotyki u osób starszych, u których w wyniku zmian w mikrośrodowi-sku jelit, stopniowo osłabiają się funkcje UO, głównie komórek dendrytycznych (DC), co określane jest jako immunostarzenie. Stan ten można zniwelować stosując bakterie probiotyczne [22], tym bardziej, że komórki DC znajdujące się na pograniczu wrodzonej i nabytej odporności są swoistym celem immunomodulacji przez probiotyki [14, 34]. Również zaletą kuracji probioty-kowej jest sposób ich podawania do organizmu (drogą pokarmową) pod postacią leku, suplementu diety lub w formie produktu spożywczego.

2. Probiotyki, a wybrane schorzenia u ludzi

2.1. Biegunki

Jednym z niepożądanych stanów chorobowych u ludzi są biegunki, które mogą być wywołane m.in. przez takie bakterie, jak Escherichia sp., Salmonella sp., Shigella sp., Campylobacter sp., czy Clostridium difficile, które ze względu na zubożenie komensalnej mikroflory bakteryjnej w jelitach mogą wystąpić także po leczeniu antybiotykami [19]. Patogeneza chorób

PROBIOTYKI A WYBRANE SCHORZENIA U LUDZI

Beata Tokarz-Deptuła1*, Joanna Śliwa-Dominiak2,Mateusz Adamiak1, Wiesław Deptuła2

1 Katedra Immunologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Szczeciński2 Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Szczeciński

Wpłynęło w lipcu 2014 r.

1. Wprowadzenie. 2. Probiotyki, a wybrane schorzenia u ludzi. 2.1. Biegunki. 2.2. Alergie. 2.3. Procesy nowotworowe. 2.4. Infekcje wirusem HIV. 3. Podsumowanie

Probiotics and the selected diseases in humans

Abstract: Probiotics are supplements or foods based on microorganisms isolated from the gastrointestinal tract of healthy humans. They have a highly positive effect on macroorganisms reducing the risk of potential pathogenic bacterial growth and influencing the host immune response. It has been proved that the microflora in the digestive tract ecosystem is conditioned by the presence of diarrhea and allergies Also other disorders, recorded already in the neonatal period, when the immune system was differentiating in the direction of pro-inflammatory and/or pro-alergic, can have an impact on the microflora. The administration of probiotic microorganisms and (or) chemotherapeutic agents, including antibiotics, improves the quality of the therapy because it results in the restoration of the balance between pro-and anti-inflammatory response of the gastrointestinal tract in such diseases as diarrhea, allergies, tumor processes, as well as in viral infections, including HIV infection.

1. Introduction. 2. Probiotics and the selected diseases and infections in humans. 2.1. Diarrhea. 2.2. Allergy. 2.3. Cancer processes. 2.4. HIV infection. 3. Summary

Słowa kluczowe: alergie, biegunki, infekcje wirusowe odporność, schorzenia nowotworoweKey words: allergy, cancer diseases, diarrhea, immunity, viral infections

134 BEATA TOKARZ-DEPTUŁA, JOANNA ŚLIWA-DOMINIAK, MATEUSZ ADAMIAK, WIESŁAW DEPTUŁA

związanych z wystąpieniem biegunek jest najczęściej powiązana z kolonizacją przewodu pokarmowego przez drobnoustroje pochodzenia zewnętrznego, choć czę-stym sprawcą powstawania biegunek są także natural-nie zasiedlające układ pokarmowy bakterie z rodziny Enterobacteriaceae. Wykazano, że bakterie probiotyczne Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus LC 705 mają znaczący wpływ na adhezję bakterii Escherichia coli, a L. casei Shirota, Lactobacillus johnsoni LJI, zmniejszają zdolność adhezji szczepu Salmonella Typhimurium [19]. Także bakterie bytujące w śluzowce żołądka – Helicobacter pylori mogą powodować stany zapalne, w tym prowadzące do pro-cesów rozrostowych [19]. Obecność H. pylori dopro-wadza do powstawania w błonie śluzowej procesów zapalnych, co prowadzi do pobudzenia elementów UO i produkcji cytokin zapalnych m.in. IFN-γ, IL-2, IL-8, TNF-α [43]. W celu wyeliminowania tego zarazka sto-suje się obecnie antybiotyki i chemioterapeutyki [19], choć także w badaniach in vitro, jak i in vivo wyka-zano, że probiotyki przynoszą pozytywny efekt wobec tej bakterii, ponieważ szczepy L. reuteri, L. salivarius i Bacillus subtilis, hamują wzrost oraz adhezję H. pylori do nabłonka żołądka [19]. W badaniach in vitro wyka-zano dodatkowo, że L. johnsonii wpływa na zmniejsze-nie ilości H. pylori w trzonie i dnie żołądka, a ponadto zmniejsza stan zapalny tego narządu [21]. Udowod-niono także, że bakterie probiotyczne podawane razem z antybiotykami zwiększają skuteczność niwelowania zakażeń H. pylori i zmniejszają częstotliwość ich nawro-tów. Uważa się, że przyczyną takiego stanu może być immunomodulacyjne działanie probiotyków, które biorą czynny udział w zachowaniu równowagi między odpowiedzią pro- i przeciwzapalną. U osób zainfekowa-nych H. pylori i przyjmujących bakterie probiotyczne, obserwuje się zwiększoną lokalną syntezę IgA, co pro-wadzi do stabilizacji funkcji MALT (mucosa-associated lymphoid tissue), w tym GALT (gut-associated lym-phoid tissue) [21]. Wykazano, że stosując L. rhamnosus GG lub L. casei subsp. casei, Saccharomyces boulardii wraz z antybiotykami w zakażeniu H. pylori dochodzi do zmniejszenia się ubocznych skutków powstałych w wyniku działania tych bakterii [54, 62, 66].

W przypadku biegunek wywołanych rotawiru-sami, przy których to infekcjach podawano w terapii tylko bakterie probiotyczne, takie jak L. rhamnosus GG wykazano, że stan kliniczny niemowląt ulegał znacznej poprawie po podaniu bakterii Bifidobacterium lactis lub L. reuteri [54, 62, 63], choć efektywność probio-tycznego leczenia tego schorzenia, zależało w dużej mierze od podawanych szczepów oraz ich dawkowa-nia. Najbardziej zadowalające efekty były widoczne po zastosowaniu dawki 1011 jtk, choć szczepem o najle-piej udokumentowanej skuteczności w leczeniu tych ostrych biegunek infekcyjnych był L. rhamnosus GG,

który podawany w dawce 1010–1011 jtk, pozwolił na skrócenie czasu wystąpienia biegunek [43]. Badania wykazały, że suplementacja diety u niemowląt B. lactis i Streptococcus thermophilus, powoduje zmniejszenie u nich częstości biegunek związanych z antybioty-kami (AAD – antibiotic-associated diarrhea) [8, 62]. Stan taki powoduje zwiększenie wytwarzanie krótko-łańcuchowych kwasów tłuszczowych w okrężnicy, co stymuluje wchłanianie sodu w komórkach nabłonka jelita grubego oraz zmniejsza przepuszczalność jelitową i ogranicza inwazję patogennymi mikroorganizmami, co prowadzi do zmniejszenia objawów biegunki [41, 60, 62]. Ponadto wykazano, że L. rhamnosus, w przypadku biegunek na tle rotawirusów wpływa na odpowiedź immunologiczną, głównie poprzez zwiększenie syntezy IgA [21]. Działanie to powoduje również pozytywny efekt w przypadku biegunek związanych ze zuboże-niem mikroflory bakteryjnej po antybiotykoterapii lub zaburzeniach metabolicznej funkcji mikroflory jelito-wej [19]. Te ostatnie stany powodują osłabienie opor-ności na kolonizację przewodu pokarmowego przez patogeny chorobotwórcze, co najczęściej prowadzi do zainfekowania tego układu przez Clostridium difficile. Drobnoustroje te produkując i wydzielając toksyny A i B, powodują nasilenia biegunki, co w efekcie może skutkować zniszczeniem śluzówki jelita, przyczyniając się do rzekomo-błoniastego zapalenia jelit. Wykazano, że probiotyki wykazują zdolność do uwalniania związ-ków hamujących wzrost tych drobnoustrojów, co zaob-serwowano po podawaniu Saccharomyces boulardii oraz L. rhamnosus GG [21, 47]. Bardzo pozytywny wpływ na zapobieganie biegunkom po antybiotyko terapii, które dotykają około 5–39% pacjentów, mają rów-nież bakterie kwasu mlekowego, których efektywność związana jest z kombinacją tych bakterii [54]. Udo-wodniono, że podawanie preparatów probiotycznych już w trakcie przyjmowania antybiotyków, powoduje łagodzenie objawów i dochodzi do przywracania pełnej homeostazy bakteryjnej śluzówki jelitowej [54]. Bada-nia wykazały, że najlepszy czas w rekolonizacji jelita bakteriami tlenowymi i beztlenowymi uzyskano po połączeniu szczepów probiotycznych takich jak B. bifidum i L. acidophilus [54]. Ponadto biegunka jest, obok bólów brzucha i wzdęć, jednym z objawów nietoleran-cji laktozy, wynikającej z obniżenia aktywności laktazy. Udowodniono, że szczepy probiotyczne mogą wytwa-rzać ten enzym, zwiększając jego ilość w orga nizmie, co prowadzi do ograniczenia objawów i zwiększenia przyswajania wapnia [16].

2.2. Alergie

U zdrowego człowieka górny i dolny odcinek prze-wodu pokarmowego, jest w stałym kontakcie ze środo-wiskiem zewnętrznym, a ciągła kolonizacja bakteryjna

PROBIOTYKI A WYBRANE SCHORZENIA U LUDZI 135

jest jedną z cech przewodu pokarmowego, z wyjątkiem być może jelit płodu. Kolonizacja przewodu pokarmo-wego jest procesem dynamicznym, który zmienia się w ciągu życia i jest wysoce uzależniony od spożywa-nych pokarmów, w tym mikrobów, które wpływają na stan jego homeostazy. U zdrowego dorosłego czło-wieka szacuje się, że przewód pokarmowy zawiera 1012 do 1014 bakterii. Stąd nie dziwi fakt, że obecność tych komensalicznych bakterii ma wpływ na wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną. Wykazano, że utrzymanie homeostazy przewodu pokarmowego wiąże się z prawidłowym wchłanianiem substancji odżywczych, które tworzą mikrośrodowisko dla wzro-stu komensalnych bakterii, które swoiście reagują na zarazki chorobotwórcze i bodźce zapalne. Udowod-niono, że w patogenezie alergii pokarmowej zależ-nej od IgE ważna jest wrodzona i nabyta odporność warunkowana florą komensaliczną [37]. Zarejestro-wano, że spożycie żywności przez zdrowego czło-wieka prowadzi do stanu tolerancji immunologicznej w przewodzie pokarmowym, co zapobiega szkodliwej odpowiedzi odpornościowej po kolejnych ekspozycji na tę żywność [37]. Ta doustna tolerancja na żywność jest aktywnym procesem, który opiera się na szeregu skomplikowanych interakcji pomiędzy składnikami wrodzonej i nabytej odporności układu immunolo-gicznego. Wykazano, że komórkami, które odgrywają bardzo ważną rolę w utrzymaniu tolerancji na alergeny pokarmowe są komórki nabłonkowe przewodu pokar-mowego oraz np. komórki M i komórki dendrytyczne przewodu pokarmowego [37]. Dowiedziono u zwierząt hodowanych w warunkach sterylnych od urodzenia, że brak mikroflory jelitowej powoduje narażenie ich na rozwój nietolerancji pokarmowej. Za podstawę tego mechanizmu uważa się m.in. niedostateczną stymula-cję receptorów TLR4 występujących na nabłonku prze-wodu pokarmowego [37]. U zwierząt doświadczalnych wykazano, że dawka i częstotliwość ekspozycji na aler-geny żywnościowe przyczynia się do indukcji tolerancji żywnościowej. U ludzi prenatalna ekspozycja na nie-które produkty w diecie matki, wykazała powstawanie alergii z obecnością specyficznej dla danego alergenu IgE we krwi u noworodków, choć wpływu tego działa-nia uczulającego na późniejszy rozwój kliniczny alergii pokarmowej, nie wykazano [37].

Jak już wcześniej opisano, probiotyki mają immuno-modulujący wpływ na organizmy ssaków, lecz intensyw-ność tego procesu zależy przede wszystkim od podanego szczepu probiotycznego [31, 57]. Wykazano, że proces powstawania alergii związany jest ze zmianą mikroflory jelitowej już w okresie noworodkowym, kiedy układ odpornościowy dziecka dopiero się kształtuje i różni-cuje w kierunku pro-zapalnym i/lub pro-alergicznym [35]. Stwierdzono, że dzieci z alergią posiadają wyż-szą całkowitą liczbę bakterii beztlenowych, natomiast

w mniejszej liczbie występują u nich grzyby, co dowo-dzi, że ekosystem mikroflory ich przewodu pokarmo-wego jest powiązany z predyspozycją do występowania alergii i wykazano, że wczesna kolonizacja bakteriami kwasu mlekowego, zmniejsza ryzyko wystąpienia alergii pokarmowej [31]. Tak jak wspomniano, działanie antyalergiczne po zastosowaniu bakterii probiotycz-nych jest ściśle zależne od szczepu, ale także dawki, jak również od sposobu podawania probiotyku [30]. Szczep L. rhamnosus GG podawany wraz z L. rhamnosus Lc705 oraz Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS i Bifidobacterium animalis ssp. lactis Bb12, powodują u osób z alergią zmniejszenie ekspresji genów zwią-zanych z reakcją alergiczną ze strony bazofilów [31]. Dostarczanie do organizmu takich szczepów probio-tycznych, jak np. L. gaseri i L. coryniformis daje pozy-tywne efekty w zmniejszaniu ilości IgE w surowicy krwi, jak również powoduje znaczny wzrost liczby limfocytów Treg, choć także dowiedziono, że podczas zmniejszenia ilości IgE dochodzi do zwiększenia ilości IgA [31, 37]. Podawanie probiotyków powoduje także zmiany we wrodzonej odporności, w tym znaczący wzrost aktyw-ności komórek NK (natural killer) [31]. Stwierdzono, że po podawaniu bakterii szczepów L. casei LOCK 0900, L. casei LOCK 0908 oraz L. paracasei LOCK 0919, wzra-sta produkcja IL-12, IL-18, IFNγ, TNFα oraz TGF-β, co zwiększa odpowiedź antyalergiczną typu Th1 [31]. Probiotyki oddziałują również na stan i funkcję narzą-dów biorących udział w alergii. Przy atopowym zapale-niu skóry u niemowląt pozytywny wpływ mają szczepy L. rhamnosus GG, L. rhamnosus 19070-2 i L. reuteri DSM 12246, które poprawiają funkcję bariery jelitowej, poprzez zmniejszenie jej przepuszczalności [31]. Bada-nia dotyczące podawania probiotyków i obserwacja ich profilaktycznego wpływu na rozwój alergii wykazały, że matczyna suplementacja probiotykami w okresie ciąży i laktacji miała kluczowe znaczenie dla rozwoju uczu-lenia u niemowląt z grupy ryzyka, szczególnie wśród matek z atopią [21]. Wykazano, że probiotykoterapia powoduje w mleku matek wzrost stężenia TNF-β2 – cytokiny o działaniu przeciwzapalnym oraz zmniej-szającej ryzyko rozwinięcia się alergii w okresie pierw-szych dwóch lat życia dziecka [21]. Obecność bakterii z rodzaju Bifidobacterium i Lactobacillus w mikroflorze jelitowej jest ściśle powiązana z występowaniem skórnych alergii atopowych. Również podawanie szczepów L. rhamnosus GG ma profilaktyczne dzia-łanie i prowadzi do zmniejszania ryzyka wystąpienia alergii u niemowląt [21]. Badania wykazały, że kar-mienie piersią wpływa także na skład flory bakteryjnej poprzez zwiększenie liczby Bifidobacterium sp. [20]. Wykazano, że ludzkie mleko zawierające dużą ilość nie ulegających trawieniu oligosacharydów, podobnie jak błonnik i pochodząca z cykorii inulina oraz pochodzące z laktozy krótkołańcuchowe galakto-oligosacharydy


(scGOS) selektywnie podtrzymują wzrost szczepów Lactobacillus sp. i Bifidobacterium sp. [5].

Badania dotyczące wpływu probiotyków na orga-nizm ludzi cierpiących na związany z alergią katar sienny wykazały ich pozytywne działanie. Stwier-dzono, że osoby wrażliwe na pyłki traw, które przyj-mowały bakterie L. casei Shirota, miały niższy poziom IgE, a wyższy IgG w organizmie, w porównaniu z grupą kontrolną otrzymującą placebo [26]. Wykazano, że eks-pozycja komórek nabłonkowych jelit na DNA pocho-dzący z E. coli lub Salmonella enterica serovar Dublin, wywołuje wzmożoną produkcję IL-8 przez te komórki [1, 12], a DNA Lactobacillus rhamnosus GG, zapobiega indukowanej przez NF-κB produkcji IL-8 przez komórki nabłonkowe jelit [18]. Podobnie, ekspozycja tych jeli-towych komórek wobec genomowego DNA z Bifidobacterium breve M-16V, wykazuje zwiększoną sekre-cję IFN-γ i IL-10 przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej np. limfocyty, monocyty [9]. Równolegle ze wspomnianym badaniem wykazano, że hodowla komórek dendrytycznych w pożywce kondycjonowa-nej z komórkami nabłonkowymi jelit, a indukowanej DNA S. enterica serovar Dublin, wytwarza zwiększoną ilość cytokin prozapalnych, czego nie zaobserwowano w obecności Bifidobacterium breve [7]. Badania te suge-rują, że nie wszystkie szczepy bakterii probiotycznych, są potencjalnie skuteczne w leczeniu chorób przewodu pokarmowego, w tym schorzeniach alergicznych.

2.3. Procesy nowotworowe

Występowanie chorób nowotworowych jest u czło-wieka ściśle powiązane z uwarunkowaniami gene-tycznymi, choć schorzenia te zależą również od sta-tusu immunologicznego organizmu, na który to stan wpływają bakterie probiotyczne oraz komensalna flora bakteryjna, choćby obecna w przewodzie pokarmo-wym [30]. Stwierdzono, że głównymi szczepami pro-biotycznymi mającymi pozytywny wpływ na procesy karcynogenezy są L. acidophilus oraz B. longum, jako że bakterie L. acidophilus, wpływają na spadek aktyw-ności 1, 2-dimetylohydrozyny, zaś szczepy B. longum zmniejszają aktywność 2-amino-3-metylo-limida-zal (4, 5-t) choliny [13, 19, 30]. Dowiedziono także [61], że zabite szczepy L. casei (LC9018), wpływają na indukcję mechanizmów odpowiedzi immunologicznej przeciwko komórkom nowotworowym. Testowana in vitro na komórkach nowotworowych linii HT-29 mie-szanka bakterii probiotycznych L. helveticus, Bifidobacterium sp., L. acidophilus lub Streptococcus thermophilus i L. delbrueckii subsp. bulgaricus, wykazała zwiększoną aktywność peptydu dipeptydylowego, co spowodowało zahamowanie o 50% wzrostu komórek nowotworo-wych [61]. Wykazano także, że szczep L. rhamnosus GG, obniża w kale aktywność β-glukurunidazy, nitro-

reduktazy i hydrolazy, dając tym samym efekt przeciw-nowotworowy [61]. Dowiedziono, że codzienne poda-wanie pacjentom po usunięciu guza i cierpiącym na nowotwór pęcherza L. casei, zahamowało rozrost tego nowotworu. Zarejestrowano także występowanie bez-pośredniego wpływu bakterii probiotycznych na nowo-twory jelita grubego [21]. Ponadto stwierdzono pozy-tywny wpływ probiotyków na zapobieganie i leczenie nowotworów jelita grubego poprzez aktywację odpo-wiedzi immunologicznej gospodarza oraz produkowa-nie antymutagennych i antykarcynogennych substancji [43]. Podawane u ludzi probiotyki zmieniają warunki fizykochemiczne jelita grubego, co prowadzi do zmiany aktywności metabolicznej organizmów bytujących w nich. Dowiedziono, że podanie L. rhamnosus oraz B. animalis ssp. lactis Bb12, obniża ryzyko pojawienia się nowotworu jelita grubego poprzez reakcje z endo- lub egzogennymi substancjami rakotwórczymi [43]. W tych badaniach wykazano pozytywną korelację między obecnością niektórych szczepów Lactobacillus sp. i Eubacterium aerofaciens, a zmniejszonym ryzy-kiem wystąpienia nowotworu w tym odcinku przewodu pokarmowego [40]. Przyjmuje się, że rozpoczęcie pro-cesów nowotworowych w organizmie zachodzi wiele lat przed zdiagnozowaniem, z kolei kolonizacja prze-wodu pokarmowego przez mikroflorę jelitową to proces bardzo dynamiczny, zmieniający się pod wpływem np. pH czy różnic w zawartości składników pokarmowych i tlenu. Stąd trudno znaleźć pewną korelację między procesem nowotworowym, a inicjującą go mikroflorą [11]. Pomimo obiecujących wyników na zwierzętach, nadal brak jest przekonujących dowodów dotyczą-cych oceny skuteczności probiotyków w hamowa-niu kancerogenezy m.in. w jelicie grubym człowieka. Dotychczasowe badania epidemiologiczne dotyczące roli diety w kancerogenezie jelitowej są jednak bardzo niejednorodne, bo są prowadzone nietypowo, jako że badane populacje bakterii oraz definiowane czynniki dotyczących oceny stanu chorobowego nie były ukie-runkowane bezpośrednio na analizę wpływu probio-tyków na rozwój choroby [11]. Niedawno wykazano, że korzystne środowiskowe mikroorganizmy integrują odpornościowe i neuroendokrynne czynniki w całym organizmie, w konsekwencji moduluje fenotyp lim-focytów T regulatorowych, utrzymując równowagę odporności ogólnoustrojowej i określając przeznaczenie zmian przed-nowotworowych w kierunku regresji [49].

2.4. Infekcje wirusem HIV

HIV należy do rodziny Lentiviridae i znane są dwa rodzaje wirusa: HIV-1 i HIV-2, które są transmitowane do organizmu człowieka w zbliżony sposób i powodują podobne objawy kliniczne. Różnią się one pod wzglę-dem struktury genetycznej, antygenowości i choro-


botwórczości, bo HIV-2 jest mniej zakaźny w porów-naniu z wirusem HIV-1, jako że wykazuje on mniej wydajną transmisję i jest prawie wyłącznie rejestro-wany w Afryce Zachodniej [51]. Szczegółowe badania molekularne wykazały różnorodność flory bakteryjnej pochwy u kobiet zakażonych HIV [56]. W badaniu porównano różnorodność flory bakteryjnej pochwy kobiet zakażonych HIV z lub bez bakteryjnego zapa-lenia pochwy (BV – bacterial vaginosis), jak również kobiet HIV-negatywnych z i bez BV. Większa różno-rodność mikroorganizmów wykryto u kobiet HIV+BV+ w porównaniu z kobietami HIV–BV+. Ponadto u kobiet HIV+BV+ wykryto trzy dodatkowe taksony należące do rodziny Propionibacteriaceae oraz rodzaju Anaerococcus i Citrobacter. Większa różnorodność flory bakteryjnej w pochwie kobiet HIV+, może być związane z tłumie-niem odporności i promowaniem wzrostu patogenów pochwy. Ponadto, nie wykazano żadnych znaczących różnic pomiędzy kobietami HIV+BV– i HIV–BV–, których bakteryjna flora jest zdominowany przez gatunki Lactobacillus sp. [46]. Z kolei mikroflora u HIV+BV– wykazała obecność, chociaż w niskich stężeniach, bakterii z rodziny Bifidobacteriaceae, Coriobacterineae oraz zarazków z rodzaju Catonella i Prevotella [56]. Nie-które doniesienia [36, 44] wykazały, że Candida sp. jest również często stwierdzana u kobiet zakażonych HIV, co sugeruje, że odporność dolnych dróg rodnych jest znacznie ograniczona w czasie infekcji HIV. Mikroflora bakteryjnego zapalenia pochwy wykryta w kilku profi-lach bakteryjnych kobiet zakażonych HIV, to najczęś ciej Prevotella bivia lub zarazki z rzędu Clostridiales (praw-dopodobnie pochodzące z jelit) oraz bakterii z rodziny Lachnospiraceae. Natomiast bakteryjne zapalenie pochwy wydaje się być bardziej nagminne u kobiet HIV+ z komórkami CD4+ ≤ 200 komórek/mm3 [55]. Odsetek Lactobacillus crispatus u kobiet z liczbą komó-rek CD4+ ≤ 200 komórek/mm3 jest znacznie niższy niż u kobiet z wysoką liczbą limfocytów CD4+ [55]. Zare-jestrowano, że E. coli, Veillonella parvula i Neisseria sp. aktywując receptory TLR4 na powierzchni błony śluzo-wej tego układu, hamują również infekcję HIV-1 [42]. Niemniej jednak, u niektórych kobiet HIV+, normalna mikroflora pochwy reprezentowana jest przez produ-kujące H2O2 L. crispatus lub L. jensenii, ale również L. iners i L. gasseri [3, 24, 55]. Szczególnie interesująca jest obecność normalnej mikroflory pochwy zdomino-wanej przez Lactobacillus sp. u kobiet zakażonych HIV, co nie łączyło się ze wzrostem poziomu RNA HIV, stąd przypuszcza się, że Lactobacillus sp. może być zaanga-żowany w zmniejszanie „wydalania” HIV i późniejszej transmisji wirusa. Ponadto, wykazano, że wykrywanie L. crispatus jest związane z obniżeniem o 35% ryzyka rozprzestrzeniania RNA HIV-1 w komórkach gospo-darza [38]. W przypadku kobiet stosujących wysoce aktywną terapię antyretrowirusową stosowanie L. jen

senii prowadziło do obniżenia poziomu RNA HIV-1 [38]. Wyniki te stanowią ważną zachętę do zbadania potencjału egzogennie stosowanych gatunków Lactobacillus sp. w probiotykach przy leczeniu BV i profilaktyki zakażenia HIV. Jak wspom niano, mikroflora pochwy zdominowana przez bakterie z rodzaju Lactobacillus jest jak się wydaje bardzo ważnym czynnikiem odgry-wającym kluczową rolę w zapobieganiu wielu chorób układu moczowo-płciowego, w tym bakteryjne zapa-lenia pochwy, infekcje grzybicze oraz infekcje powo-dowane przez wirusy HIV i HSV-2 [46]. Mechani-zmy oddziaływania probiotyków wobec HIV łączą się z bezpośrednim hamującym działaniem na mikroflorę pochwy poprzez produkcje przez nie kwasu mleko-wego, H2O2, bakteriocyn oraz lektyn [42]. Badania wykazały, że kwas mlekowy w pH ok. 4, znosi ujemny ładunek z powierzchni tego wirusa, spowalniając jego aktywność poprzez zwiększone uwalnianie TGF-β przez nabłonek, a w połączeniu z kwasem poliryboinozylowo: polirybocytydylowym, powoduje wzrost wydzielania IL-8 oraz IL-1β, które to cytokiny pobudzają odporność przeciwwirusową [42]. Ponadto, pośrednie mecha-nizmy związane z zapobieganiem wzrostowi mikroor-ganizmów związanych z BV u kobiet, stymulacją układu odpornościowego i/lub funkcji bariery nabłonkowej w drogach rodnych (GUALT) i mogą być również brane pod uwagę, choć nadal wiele szczegółów trzeba rozwi-kłać, jak choćby dotyczące infekcji wirusem HIV [46]. W prawdzie, w ciągu ostatnich lat, wzrosła liczba badań podkreślających potencjał egzogennie stosowanych probiotyków w promowaniu zdrowia ludzkiego, także w zakresie zapobiegania i leczenia zakażeń wirusowych [65]. Mimo tych faktów dopiero od niedawna prowadzi się badania z bakteriami probiotycznymi Lactobacillus sp., w których był badany potencjał tych drobnoustro-jów w poprawie jakości życia pacjentów zakażonych HIV, a nawet w zapobieganiu tej infekcji [52, 53]. Wydaje się, że uzasadnieniem tych badań jest i to, że probiotyki mogą mieć podwójną rolę w zależności od miejsca w makroorganizmie. Z jednej strony, mogą być stosowane w celu zwiększenia liczby Lactobacillus sp. na błonie śluzowej pochwy, które jest punktem wyjś- cia dla zakażeń HIV, jak również do transmisji wirusa. Z drugiej strony zewnętrznie stosowane bakterie kwasu mlekowego mogą być stosowane do leczenia i zapobie-gania BV często związanych z zakażeniami HIV. Otóż, wykazano, że dzienna doustna dawka L. rhamnosus GR-1 i L. reuteri RC-14, powoduje dobrą kolonizacje bakterii w pochwie, z jednoczesną redukcją towarzy-szących patogenów bakteryjnych i drożdżowych w tej niszy [52, 53]. Również ważnym jest fakt, że egzogen-nie stosowane probiotyki mogą wywierać korzyści zdrowotne poprzez aktywność błony śluzowej prze-wodu pokarmowego, która jest identyfikowana jako miejsce początkowej replikacji HIV. Powstaje zatem


pytanie, czy blokowanie pierwszego etapu kaskady – nieszczelnego jelita – może zapobiegać HIV przed dalszym rozwojem i ostatecznie zachować zainfekowa-nych zdrowszymi [64]. Różne organizmy probiotyczne stosowano w przewodzi pokarmowym, głównie bak-terie kwasu mlekowego i bifidobakterie, wykazywały wzmocnienie bariery nabłonka jelitowego, zmniej-szenie stanu zapalnego i wspieranie odpowiedzi typu Th-1. Zarejestrowano, że probiotyki mogą poprawić funkcję bariery jelitowej i zmniejszyć translokację bakterii poprzez poprawę korzystnego oddziaływania pomiędzy komensalną mikroflorą jelitową i gospo-darzem, zarówno podczas zdrowia, jak i choroby [15, 32]. Ponadto, probiotyki mogą przywrócić homeostazę GALT poprzez, wywoływanie regulacyjnych mecha-nizmów, aby obniżyć stan zapalny [6, 45]. Badania in vitro wykazały, że probiotyki mogą „odciągać” układ odpornościowy od stanów dominujących odporności typu Th-2 [23, 27] i poprzez to wpływać na komórki dendrytyczne by nakierowywały komórki T w kierunku polaryzacji odporności typu Th-1 [39], w ten sposób powodując odnowienie jelitowej tolerancji. Ponadto, probiotyki są w stanie stworzyć środowisko jelitowe mniej korzystne dla patogenów poprzez wytwarzanie związków przeciwbakteryjnych, obniżenie pH oraz zmniejszenie zdolności adhezji i inwazji patogenów. Uzyskana wiedza mogłaby pozwolić zapobiec zakaże-niom przewodu pokarmowego i poprawić jakość życia pacjentów z np. HIV, jednak dla urzeczywistnienia tego celu wymagane są dalsze badania [25].

3. Podsumowanie

Wyniki wielu badań wykazały pozytywny wpływ probiotyków na makroorganizm podczas różnego rodzaju zaburzeń w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu, w tym infekcji, co nadaje im duże zna-czenie w poprawianiu zdrowia. Wydaje się, że bakte-rie probiotyczne mogą stać się powszechną, a do tego naturalną alternatywą dla syntetycznych leków, będąc dobrym elementem wspomagania swoistego leczenia farmakologicznego. Należy jednak pamiętać, że wybór odpowiednich szczepów bakterii wydaje się kluczowy dla uzyskania pożądanego efektu leczenia z zastosowa-niem probiotyków. Ponadto, jak się wydaje, czas kuracji może odgrywać istotną rolę w skuteczności poprawy stanu zdrowia człowieka za pomocą probiotyków.

Piśmiennictwo

1. Akhtar M., Watson J.L., Nazli A., McKay D.M.: Bacterial DNA evokes epithelial IL-8 production by a MAPK-dependent, NF-κB-independent pathway. FASEB J. 17, 1319–1321 (2003)

2. Amdakar S., Singh V., Singh D.D.: Probiotic therapy: immu-nomodulating approach toward urinary tract infection. Curr. Microbiol. 63, 484–490 (2011)

3. Balkus J.E., Mitchell C., Agnew K., Liu C., Fiedler T., Cohn S.E., Luque A., Coombs R., Fredricks D.N., Hitti J.: Detection of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in the vagina: a comparison of culture and quantitative PCR among HIV-1 seropositive women. BMC Infect. Dis. 12, 188–193 (2012)

4. Bernardeau M., Vernoux J.P., Gueguen M.: Safety and efficacy of probiotic lactobacilli in promoting growth in post-weaning Swiss mice. Int. J. Food Microbiol. 77, 19–27 (2002)

5. Boehm G., Stahl B., Jelinek J., Knol J., Miniello V., Moro G.E.: Prebiotic carbohydrates in human milk and formulas. Acta Paediatr. Suppl. 94, 18–21 (2005)

6. Braat H., van den Brande J., van Tal E., Hommes D., Peppelen-bosch M., van Deventer S.: Lactobacillus rhamnosus induces peripheral hyporesponsiveness in stimulated CD4+ T cells via modulation of dendritic cell function. Am. J. Clin. Nutr. 80, 1618–1625 (2004)

7. Campeau J.L., Salim S.Y., Albert E.J., Hotte N., Madsen K.L.: Intestinal epithelial cells modulate antigen-presenting cell responses to bacterial DNA. Infect. Immun. 80, 2632–2644 (2012)

8. Correa N.B., Peret Filho L.A., Penna F.J., Lima F.M., Nicoli J.R.: A randomized formula controlled trial of Bifidobacterium lactis and Streptococcus thermophilus for prevention of anti-biotic-associated diarrhea in infants. J. Clin. Gastroenterol. 39, 385–389 (2005)

9. de Kivit S., Kraneveld A.D., Knippels L.M., van Kooyk Y., Gars-sen J., Willemsen L.E.: Intestinal epithelium – derived galectin-9 is involved in the immunomodulating effects of non digestible oligosaccharides. J. Innate. Immun. 5, 625–638 (2013)

10. de Kivit S., Tobin M.C., Forsyth C.B., Keshavarzian A., Lan-day A.L.: Regulation of intestinal immune responses through TLR activation: implications for pro- and prebiotics. Front Immunol. 5, 1–7 (2014)

11. Wasilewska E, Złotkowska D, Pijagin M.E.: Rola mikroflory jeli-towej i bakterii probiotycznych w profilaktyce i rozwoju raka jelita grubego, Post. Hig. Med. Dośw. 67, 837–847 (2013)

12. Ewaschuk J.B., Backer J.L., Churchill T.A., Obermeier F., Krause D.O., Madsen K.L.: Surface expression of Toll-like recep-tor 9 is upregulated on intestinal epithelial cells in response to pathogenic bacterial DNA. Infect. Immun. 75, 2572–2579 (2007)

13. Femia A.P., Luceri C., Dolara P., Giannini A., Biggeri A., Salva-dori M., Clune Y., Collins K.J., Paglierani M., Caderni G.: Antitumorigenic activity of the prebiotic inulin enriched with oligofructose in combination with the probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis on azoxymethane-indu-ced colon carcinogensis in rats. Carcinogensis, 23, 1953–1960 (2002)

14. Feyisetan, O., Tracey, C., Hellawell, G.O.: Probiotics, dendritic cells and bladder cancer. BJU Int. 109, 1594–1597 (2012)

15. Forsyth C.B., Farhadi A., Jakate S.M., Tang Y., Shaikh M., Keshavarzian A.: Lactobacillus GG treatment ameliorates alco-hol-induced intestinal oxidative stress, gut leakiness, and liver injury in a rat model of alcoholic steatohepatitis. Alcohol, 43, 163–172 (2009)

16. Fuller R. Probiotics in human medicine. Gut, 32, 439–442 (1991)17. Gajewska J., Błaszczyk M.K.: Probiotyczne bakterie fermentacji

mlekowej. Post. Mikrobiol. 51, 55–65 (2012)18. Ghadimi D., Vrese M., Heller K.J., Schrezenmeir J.: Effect of

natural commensal – origin DNA on toll-like receptor 9 (TLR9) signaling cascade, chemokine IL-8 expression and barrier inte-gritiy of polarized intestinal epithelial cells. Inflamm. Bowel. Dis. 16, 410–427 (2010)


19. Górska S., Jarząb A., Gamian A.: Bakterie probiotyczne w prze-wodzie pokarmowym człowieka, jako czynnik stymulujący układ odpornościowy. Post. Hig. Med. Dośw. 63, 653–667 (2009)

20. Haarman M., Knol J.: Quantitative real-time PCR assays to identify and quantify fecal Bifidobacterium species in infants receiving a prebiotic infant formula. Appl. Environ. Microbiol. 71, 2318–2324 (2005)

21. Heczko P.B., Strus M., Jawień M., Szymański H.: Medyczne zastosowanie probiotyków. Wiad. Lek. 58, 11–12 (2005)

22. Hopkins, M.J., Sharp, R., Macfarlane, G.T.: Age and disease rela-ted changes in intestinal bacterial popular-ions assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. Gut, 48, 198–205 (2001)

23. Hougee S., Vriesema A.J., Wijering S.C., Knippels L.M., Fol-kerts G., Nijkamp F.P., Knol J., Garssen J.: Oral treatment with probiotics reduces allergic symptoms in ovalbumin-sensitized mice: a bacterial strain comparative study. Int. Arch. Allergy Immunol. 151, 107–117 (2010)

24. Hummelen R., Fernandes A.D., Macklaim J.M., Dickson R.J., Changalucha J., Gloor G.B., Reid G.: Deep sequencing of the vaginal microbiota of women with HIV. PLoS ONE 5, e12078 (2010)

25. Hummelen R., Vos A.P., van’t Land B., van Norren K., Reid G.: Altered host-microbe interaction in HIV: a target for interven-tion with pro- and prebiotics. Int. Rev. Immunol. 29, 485–513 (2010)

26. Ivory K., Chambers S.K., Pin C., Prieto E., Arques J.L., Nico-letti C.: Oral delivery of Lactobacillus casei Shirota modifies allergen-induced immune responses in allergic rhinitis. Clin. Exp. Allergy, 8, 1282–1289 (2008)

27. Iwabuchi N., Takahashi N., Xiao J.Z., Yonezawa S., Yaeshima T., Iwatsuki K., Hachimura S.: Suppressive effects of Bifidobacterium longum on the production of Th2-attracting chemokines induced with T cell-antigen-presenting cell interactions. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 55, 324–334 (2009)

28. Jach M., Łoś R., Maj M., Malm A.: Probiotyki – aspekty funk-cjonalne i technologiczne. Post. Mikrobiol. 52, 161–170 (2013)

29. Kaur I.P., Chopra K., Saini A.: Probiotics: potential pharmaceu-tical applications. Eur. J. Pharm. Sci. 15, 1–9 (2002)

30. Książyk J.: Probiotyki i prebiotyki w karcynogenezie. Pediatria Współcz. Gastroenterol. Hepatol. Żyw. Dziecka, 4, 61–62 (2002)

31. Łoś-Rycharska E., Czerwionka-Szaflarska M.: Probiotyki w zapo-bieganiu i leczeniu alergii. Pediatria Polska, 87, 478–488 (2012)

32. Luyer M.D., Buurman W.A., Hadfoune M., Speelmans G., Knol J., Jacobs J.A., Dejong C.H., Vriesema A.J., Greve J.W.: Strain-specific effects of probiotics on gut barrier integrity fol-lowing hemorrhagic shock. Infect. Immun. 73, 3686–3692 (2005)

33. Maeada N., Nakamura Y., Hirose Y., Murosaki S., Yamamoto Y., Kase T., Yoshikai Y.: Oral administration of heat-killed Lacto-bacillus plantarum L-137 enhances protection against infuenza virus infection by stimulation of type I interferon production in mice. Int. Immunopharmacol. 9, 1122–1125 (2009)

34. Meijerink, M., Wells, J.M.: Probiotic modulation of dendritic cells and T cell responses in the intestine. Benef. Microbes, 1, 317–326 (2010)

35. Michałkiewicz J., Krotkiewski M., Gockowska L., Wyszomir-ska-Gołda M., Helmin A., Dzierżanowska D., Madaliński K.: Immodulujący wpływ probiotyków na reakcje odpornościowe. Medius, http://www.imed.pl/index.php?PAGE=telegram&TEL_CUR_ID=138&return=archives (18.07.2014)

36. Minkoff H.L., Eisenberger-Matityahu D., Feldman J., Burk R., Clarke L.: Prevalence and incidence of gynecologic disorders among women infected with human immunodeficiency virus. Am. J. Obstet. Gynecol. 180, 824–836 (1999)

37. Minnicozzi M., Sawyer R.T., Fenton M.J.: Innate immunity in allergic disease. Immunol. Rev. 242, 106–127 (2011)

38. Mitchell C., Balkus J.E., Fredricks D., Liu C., McKernan--Mullin J., Frenkel L.M., Mwachari C., Luque A., Cohn S.E., Cohen C.R., Coombs R., Hitti J.: Interaction between Lactobacilli, bacterial vaginosis-associated bacteria, and HIV type 1 RNA and DNA genital shedding in U.S. and Kenyan women. AIDS Res. Hum. Retroviruses, 29, 13–19 (2012)

39. Mohamadzadeh M., Olson S., Kalina W.V., Ruthel G., Dem-min G.L., Warfield K.L., Bavari S., Klaenhammer T.R.: Lactobacilli activate human dendritic cells that skew T cells toward T helper 1 polarization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 2880–2885 (2005)

40. Moore W.E., Moore L.H.: Intestinal floras of populations that have a high risk of colon cancer. Appl. Environ. Microbiol. 61, 3202–3207 (1995)

41. Morais M.B., Jacob C.M.: The role of probiotics and prebiotics in pediatric practice. J. Pediatr. (Rio J.), 82, 189–197 (2006)

42. Mossop H., Linhares I.M., Bongiovanni A.M., Ledger W.J., Witkin S.S.: Influence of lactic acid on endogenous and viral rna-induced immune mediator production by vaginal epithelial cells. Obstet. Gynecol. 118, 840–846 (2011)

43. Nowak A., Śleżewska K., Libudzisz Z., Socha J.: Probiotyki-efekty zdrowotne. Żywność, Nauka, Technologia, Jakość, 4, 20–36 (2010)

44. Ohmit S.E., Sobel J.D., Schuman P., Duerr A., Mayer K., Rom-palo A., Klein R.S.: Longitudinal study of mucosal Candida spe-cies colonization and candidiasis among human immunodefi-ciency virus (HIV)-seropositive and at-risk HIV-seronegative women. J. Infect. Dis. 188, 118–127 (2003)

45. Pessi T., Sutas Y., Hurme M., Isolauri E.: Interleukin-10 genera-tion in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus GG. Clin. Exp. Allergy, 30, 1804–1808 (2000)

46. Petrova M. I., van den Broek M., Balzarini J., Vanderleyden J., Lebeer S.: Vaginal microbiota and its role in HIV transmission and infection. FEMS Microbiol. Rev. 37, 762–792 (2013)

47. Piekarska M., Wandałowicz A., Mięgoć H.: Zakażenie Clostridium difficile – diagnostyka, profilaktyka i leczenie. Pol. Merk. Lek. 214, 278–282 (2014)

48. Popova M., Molimard P., Courau S., Crociani J., Dufour C., Le Vacon F., Carton T.: Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. App. Microb. 113, 1305–1318 (2012)

49. Poutahidis T., Kleinewietfeld M., Erdman S. E.: Gut microbiota and the paradox of cancer immunotherapy. Front Immunol. 5, 1–5 (2014)

50. Rachmilewitz D., Karmeli F., Takabayashi K., Hayashi T., Leider--Trejo L., Lejder-Trejo L., Lee J., Leoni L.M., Raz E.: Immuno-stimulatory DNA ameliorates experimental and spontaneous murine colitis. Gastroenterology, 122, 1428–1441 (2002)

51. Reeves J.D., Doms R.W.: Human immunodeficiency virus type 2. J. Gen. Virol. 83, 1253–1265 (2002)

52. Reid G., Charbonneau D., Erb J., Kochanowski B., Beuerman D., Poehner R., Bruce A.W.: Oral use of Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L. fermentum RC-14 significantly alters vaginal flora: randomized, placebo-controlled trial in 64 healthy women. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 35, 131–134 (2003)

53. Reid G.: Probiotic Lactobacilli for urogenital health in women. J. Clin. Gastroenterol. 42, 234–236 (2008)

54. Ryżko J.: Zastosowanie probiotyków w gastroenterologii dzie-cięcej. Pediatria Współcz. Gastroenterol. Hepatol. Żyw. Dziecka 13, 115–119 (2009)

55. Spear G.T., Gilbert D., Landay A.L., Zariffard R., French A.L., Patel P., Gillevet P.M.: Pyrosequencing of the genital microbiotas of HIV-seropositive and -seronegative women reveals


Lactobacillus iners as the predominant Lactobacillus species. Appl. Environ. Microbiol. 77, 378–381 (2011)

56. Spear G.T., Sikaroodi M., Zariffard M.R., Landay A.L., French A.L., Gillevet P.M.: Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131–1140 (2008)

57. Surma D.: Wpływ probiotyków na układ immunologiczny człowieka. Nutrilife, http://www.NutriLife.pl/index.php?art=33 (18.07.2014)

58. Szachta P., Adamska A., Gałęcka M., Cichy W., Roszak D.: Rola probiotyków w chorobach alergicznych. Pediatria Współcz. Gastroenterol. Hepatol. Żyw. Dziecka, 13, 181–183 (2011)

59. Szachta P., Pazgrat M., Cichy W., Muszyński Z., Ignyś I.: Szczepy probiotyczne – perspektywy i bezpieczeństwo. Gastroenterol. Pol. 16, 37–41 (2009)

60. Szajewska H., Mrukowicz J.: Meta-analysis: non-pathogenic yeast Saccharomyces boulardii in the prevention of antibiotic-associa-ted diarrhoea. Aliment. Pharmacol. Ther. 22, 365–372 (2005)

61. Trafalska E., Grzybowska K.: Probiotyki – alternatywa dla anty-biotyków? Wiad. lek. 57, 9–10 (2004)

62. Vieira A.T., Teixeira M.M., Martins F.S.: The role of probiotics and prebiotics in inducing gut immunity. Front. Immunol. 4, 1–12 (2013)

63. Wanke M., Szajewska H.: Probiotics for preventing healthcare--associated diarrhea in children: A meta-analysis of randomized controlled trials. Pediatria Polska, 89, 8–16 (2014)

64. Wenner M.: A cultured response to HIV. Nat. Med. 15, 594–597 (2009)

65. WHO/FAO. Evaluation of health and nutritional properties of powder milk and live lactic acid bacteria. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organi-zation Expert Consultation Report (2001)

66. Wiese M., Andryszczyk M., Eijaszewicz A., Kubiszewska I., Helmin-Basa A., Kaszewski W., Gackowska L., Urbańska M., Motyl I., Michałkiewicz J. Szczepy bakterii probiotycznych oraz ich zastosowanie w wybranych jednostkach chorobowych (w) Wybrane aspekty bezpieczeństwa stosowania probiotyków. Wpływ czynników endogennych i egzogennych na układ odpor-nościowy, red. E. Skopińska-Różewska, A.K. Siwicki, S.c. Olsztyn, Olsztyn, 2012, s. 223–232


* Autor korespondencyjny: Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecz-nikowa 1, 02-096 Warszawa; tel. 22 5541216; e-mail: [email protected]

1. Charakterystyka bakterii kwasu mlekowego – potencjalne zastosowanie w immunoprofilaktyce

Bakterie kwasu mlekowego (Lactic Acid Bacteria – LAB) to Gram-dodatnie, nie wytwarzające spor bak-terie o niskiej zawartości par GC w genomie. Grupa ta została wyodrębniona ze względu na zdolność do przeprowadzania fermentacji węglowodanów z wytwo-rzeniem kwasu mlekowego, nie zaś ze względu na powiązania filogenetyczne. Choć większość z nich to beztlenowce, niektóre gatunki tolerują niewielkie stę-żenie tlenu. Bakterie z grupy LAB charakteryzuje silna auksotrofia, w związku z tym występują w środowiskach uwzględniających ich duże wymagania pokarmowe, a więc bogatych w aminokwasy, puryny i pirymidyny. Można je odnaleźć w mleku i jego pochodnych, są rów-nież składnikami flory fizjologicznej (mikrobiota) m.in. płazów, ptaków, wielu ssaków, w tym człowieka. Do tej grupy mikroorganizmów zalicza się gatunki należące do rodzajów: Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc i Lactobacillus. I choć LAB otrzymały sta-tus organizmów bezpiecznych dla zdrowia ludzkiego (Generally Regarded as Safe – GRAS), należy pamiętać,

że należą do nich również bakterie patogenne, takie jak Streptococcus pyogenes i Streptococcus pneumoniae [20].

Wartość światowego rynku wykorzystującego właś-ciwości bakterii kwasu mlekowego szacowana jest na 100 miliardów Euro. Do niedawna bakterie z grupy LAB były używane głównie w produkcji i konserwacji produktów spożywczych. Coraz większe zainteresowa-nie budzą jednak jako organizmy probiotyczne [23], które – zgodnie z definicją zaproponowaną przez WHO – po podaniu w odpowiednich ilościach, wywołują korzystne skutki zdrowotne [26]. Spośród wielu mikro-organizmów produkujących kwas mlekowy w procesie fermentacji cukrów, jedynie nieliczne są uważane za gatunki probiotyczne. Bakterie te modulują florę bak-teryjną jelita i tym samym utrzymują jego homeostazę. Zapewniają ochronę przed chorobotwórczymi bakte-riami konkurując z nimi o kolonizowaną powierz chnię. Mogą przy tym wydzielać związki hamujące wzrost patogenów (kwas mlekowy, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, nadtlenek wodoru, substancje o charak-terze bakteriocyn) [39]. Dodatkowo stymulują działa- nie układu odpornościowego oraz obniżają ryzyko wystąpienia reakcji alergicznych. Obecnie probiotyczne

BAKTERIE KWASU MLEKOWEGO (LAB)JAKO WEKTORY DO KONSTRUKCJI SZCZEPIONEK

Agnieszka Wyszyńska1, Patrycja Kobierecka1,Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka1*

1 Zakład Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski

Wpłynęło w październiku 2014 r.

1. Charakterystyka bakterii kwasu mlekowego o potencjalnym zastosowaniu w immunoprofilaktyce. 2. LAB jako nośniki heterologicznych antygenów bakteryjnych, pasożytniczych i wirusowych. 2.1. Porównanie drogi podania. 2.2. Rola lokalizacji i ilości antygenu. 2.3. Porównanie skuteczności działania żywych szczepów LAB i cząstek GEM (Grampositive Enhancer Matrix). 3. LAB jako szczepionki DNA. 4. Modulacja działania układu odpornościowego. 5. LAB w immunoterapiach chorób nowotworowych. 6. Podsumowanie

LAB (lactic acid bacteria) as live vectors for the development of safe mucosal vaccines

Abstract: Lactic acid bacteria are a group of Gram-positive bacteria that include many species, such as Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc and others. They have health benefits such as immunomodulation and production of antimicrobial substances active against gastric and intestinal pathogens and other microbes. Over the past decade, there has been increasing interest in the use of LAB as mucosal delivery vectors. They represent an attractive alternative for vaccinations employing attenuated bacterial pathogens. In this review, we focused on recent results on the use of lactic acid bacteria as delivery vehicles for heterologous antigens, cytokines, and DNA vaccines. To date, many bacterial, parasitic and viral antigens have been successfully expressed in LAB strains, mainly in L. lactis and Lb. plantarum, and their positive immunological outcomes were documented using mainly mouse model and oral, intragastric or intranasal route of immunization.

1. Characterization of lactic acid bacteria with immunoprophylactic effects. 2. LAB as delivery vehicles for bacterial, parasitic and viral antigens. 2.1. Comparison of administration routes. 2.2. Amount and localization of antigens. 2.3. Comparison of live and killed LAB vaccines – GEM (Grampositive Enhancer Matrix) particles, 3. LAB as a DNA vaccine. 4. Modulation of immune system. 5. LAB in cancer therapy. 6. Conclusions

Słowa kluczowe: antygeny, bakterie kwasu mlekowego, cząstki GEM, immunoprofilaktyka, szczepionka DNAKey words: antigens, DNA vaccine, GEM particles, immunoprophylaxis, Lactic acid bacteria

142 AGNIESZKA WYSZYŃSKA, PATRYCJA KOBIERECKA, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

szczepy mają największe znaczenie we wspomaganiu leczenia chorób układu pokarmowego (głównie bie-gunek o etiologii wirusowej, jak też biegunek poanty-biotykowych) oraz zaburzeń autoimmunologicznych [28, 39]. Dostrzeżono również ich pozytywny wpływ na przebieg chorób metabolicznych (hiperlipidemia, cukrzyca, otyłość) [1]. Probiotykom przypisuje się także łagodzenie objawów nietolerancji laktozy, zwiększenie wchłaniania składników odżywczych przez jelita, obni-żenie poziomu cholesterolu, poprawę perystaltyki jelit, a także zmniejszenie aktywności enzymów związanych z powstawaniem nowotworów [28].

Najlepiej scharakteryzowanym gatunkiem należą-cym do grupy LAB jest zdolny do przeprowadzania homofermentacji, mezofilny Lactococcus lactis. Pozna-nie pełnych sekwencji nukleotydowych genomów przedstawicieli tego gatunku, łatwość ich hodowli, jak również opracowanie szerokiej gamy narzędzi inży-nierii genetycznej sprawiły, że L. lactis jest wykorzy-stywany jako organizm modelowy [11, 94]. W bada-niach najczęściej stosowane są bezplazmidowe szczepy L. lactis subsp. lactis IL1403 i L. lactis subsp. cremoris MG1363, których genomy poznano odpowiednio w 1999 i 2007 roku [23]. Genom szczepu MG1363 ponownie zsekwencjonowano w roku 2010, co pozwo-liło skorygować liczne błędy powstałe w wyniku pierw-szego sekwencjonowania [49].

W ciągu ostatnich lat wzrosło również zainteresowa-nie bakteriami z rodzaju Lactobacillus. Do rodzaju tego zaliczono ponad 180 gatunków [63], jednakże najwięk-sza uwaga skupia się na szczepach o potwierdzonych właściwościach probiotycznych, a więc m.in. bakteriach z gatunków: Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acido philus i Lactobacillus helveticus [28]. Zsekwencjonowanie geno-mów 20 wybranych przedstawicieli rodzaju Lactobacillus pozwoliło dostrzec duże zróżnicowanie materiału genetycznego w obrębie tego rodzaju. Tak na przykład genomy przebadanych gatunków różnią się wielkoś-cią (od 1,78 Mpz w przypadku Lactobacillus johnsonii FI9785 do 3,3 Mpz w przypadku Lb. plantarum WCFS1) a zawartość par GC waha się w zakresie od 33% do 51% [42]. Badania przeprowadzone przez Kanta i wsp. doprowadziły do zdefiniowania pangenomu Lactobacillus. Spośród tworzących go 14000 genów, 383 z nich zaliczono do genów rdzeniowych (LCG, Lactobacillus core genome) [42].

Od ponad dwudziestu lat trwają intensywne bada-nia nad możliwością wykorzystania bakterii kwasu mle-kowego w charakterze bakteryjnego nośnika związków o działaniu terapeutycznym lub profilaktycznym, mię-dzy innymi związków modulujących aktywność układu immunologicznego, antygenów czy enzymów [7]. LAB umożliwiają przeprowadzenie immunizacji drogą ślu-

zówkową, co jest bardziej praktyczne od standardowej iniekcji i co zwiększa skuteczność walki z patogenami, dla których to właśnie śluzówka jest główną drogą wni-kania do organizmu człowieka. Dostarczenie antygenu przy użyciu szczepów bakterii kwasu mlekowego może zaindukować odpowiedź immunologiczną zarówno w błonach śluzowych (sIgA), jak i ogólnoustrojową reakcję układu odpornościowego [7]. O atrakcyjności bakterii kwasu mlekowego w immunoprofilaktyce lub terapii decyduje również ich oporność na działanie niskiego pH soku żołądkowego oraz zdolność przy-legania do powierzchni nabłonka jelitowego. Ponadto niektóre ze szczepów LAB mają właściwości adiu-wantów, co oznacza, że mogą wzmacniać odpowiedź immunologiczną zaindukowaną przez przenoszony antygen. Zaletą LAB może być również zdolność do produkcji bakteriocyn, czyli małych białek o właściwoś-ciach antybakteryjnych. Tak na przykład rozważana jest możliwość wykorzystania szczepów Lb. salivarius NRRL B-50053 i Lb. salivarius SMXD51 do opraco-wania szczepionki przeciwko kampylobakteriozie dla kurcząt. Wymienione szczepy produkują bakteriocyny o działaniu antagonistycznym wobec bakterii rodzaju Campylobacter (odpowiednio L-1077 i SMXD51) [56, 85]. Możliwość liofilizacji bakterii kwasu mlekowego sprawia także, że nie wymagają one przechowywania w niskiej temperaturze, a w celu podania preparatu nie jest wymagany wyspecjalizowany personel.

Wszystkie wyżej wymienione cechy bakterii kwasu mlekowego a w szczególności prozdrowotne właści-wości oraz wysoki stopień bezpieczeństwa powodują, że są one atrakcyjną alternatywą dla innych wektorów stosowanych do konstrukcji szczepionek, takich jak ate-nuowane szczepy różnych gatunków mikroorganizmów patogennych, liposomów czy mikrocząstek. Prezento-wana publikacja stanowi przegląd dotychczasowych osiągnięć dotyczących zastosowania LAB w immuno-profilaktyce.

2. Bakterie LAB jako nośniki heterologicznych antygenów bakteryjnych, pasożytniczych i wirusowych

W ostatnich latach opracowano wiele strategii po- zwalających na wydajną ekspresję genów kodujących bakteryjne, wirusowe i pasożytnicze antygeny w szcze-pach LAB, głównie rodzajów Lactococcus i Lactobacillus. Z wykorzystaniem różnych modeli zwierzęcych (głównie model mysi) udokumentowano pozytywny, immunologiczny efekt aplikowania tego typu prototy-pów szczepionek, niezależnie od drogi podania. W nie-których badaniach analizowano także efekt ochronny immunizacji. Liczba publikacji dotyczących tego tematu znacznie przekroczyła liczbę 100.

BAKTERIE KWASU MLEKOWEGO (LAB) JAKO WEKTORY DO KONSTRUKCJI SZCZEPIONEK 143

Bakterie kwasu mlekowego cechuje olbrzymia róż-norodność fizjologiczna i genetyczna. Różna jest ich zdolność do utrzymywania się i namnażania w uod-parnianym organizmie. Ponadto często odmienny skład osłon komórkowych u bakterii z grupy LAB warunkuje różnice w stymulowanej odpowiedzi immunologicznej. Dlatego też schematy immunizacji opracowane dla szczepionek powstałych w oparciu o zastosowanie jako nośnika obcych antygenów jednych gatunków często nie są odpowiednie gdy do immunizacji wykorzystu-jemy inny gatunek LAB. Dane uzyskiwane przez różne grupy badawcze nie są spójne, a trudności z ich porów-nywaniem wynikają z zastosowania w eksperymentach różnych antygenów, różnych nośników i odmiennych schematów immunizacji. W dalszym fragmencie tego podrozdziału omówione zostaną parametry mające wpływ na odpowiedź odpornościową indukowaną prototypami szczepionek LAB.

2.1. Porównanie drogi podania i szczepu nośnikowego

Pierwsze doniesienie dotyczące wykorzystania LAB jako wektora szczepionkowego pochodzi z 1990 roku i dotyczy immunizacji przeciwko Lactococcus mutans. W eksperymencie wykorzystano zabite komórki Lactococcus lactis produkujące białko PAc (antygen I/II) zlokalizowane na powierzchni komórki. Dożołądkowa immunizacja myszy skutkowała produkcją specyficz-nych przeciwciał IgG i IgA, tak więc po raz pierwszy pokazano, że LAB mogą stanowić atrakcyjną alter-natywę dla klasycznych nośników bakteryjnych [40]. Liczne badania dotyczące roli przedstawicieli grupy LAB jako bakteryjnego nośnika zostały wykonane z zastoso-waniem jako antygenu C-końcowego fragmentu toksyny tężca (TTFC). Ten fragment toksyny jest silnie immu-nogennym białkiem intensywnie badanym jako poten-cjalny składnik skojarzonej szczepionki DTP (przeciwko tężcowi, błonicy i krztuścowi) mający zastąpić inaktywo-waną toksynę. Antygen był produkowany w komórkach różnych gatunków bakterii z grupy LAB (L. lactis, Lactobacillus spp. oraz Streptococcus gordonii), różniących się przeżywalnością w kolonizowanych niszach ekolo-gicznych. Badania przeprowadzone z wykorzystaniem L. lactis i Lb. plantarum w charakterze nośników TTFC mogą sugerować wyższą skuteczność szczepów rodzaju Lactobacillus, szczególnie przy zastosowaniu szczepów zmutowanych w genie kodującym racemazę alaniny, enzym biorący udział w syntezie ściany komórkowej. Wniosek ten jednak nie jest jednoznaczny ponieważ gen kodujący TTFC był w obu nośnikach wyrażany z trud-nych do porównania promotorów (promotor induko-wany nizyną i konstytutywny promotor) [32].

Wpływ nośnika na poziom odpowiedzi immunolo-gicznej i skuteczność immunizacji analizowano także

w odniesieniu do potencjalnej szczepionki antymala-rycznej. W eksperymencie opracowano szczep pro-dukujący MSA2 (merozoite surface antigen), białko powierzchniowe Plasmodium falciparum, dobrze scha-rakteryzowany antygen, do ekspresji którego dochodzi na etapie merozoitu (jedna z form rozwojowych w cyklu życiowym pasożyta). Eksperyment przeprowadzono w kilku wariantach: antygen produkowany w komór-kach L. lactis, Lactobacillus reuteri i Lb. salivarius był związany z peptydoglikanem za pomocą wiązań kowa-lencyjnych lub niekowalencyjnych oraz zlokalizowany na powierzchni komórek traktowanych TCA. Dodat-kowo w badaniach wykorzystano różne genetyczne linie myszy. Zaobserwowano znaczące różnice w poziomie indukcji i rodzaju indukowanej odpowiedzi odpor-nościowej, zależne od rodzaju gospodarza, rodzaju nośnika jak i lokalizacji antygenu [60]. Również do immunizacji anty-Helicobacter wykorzystywano szczep L. lactis lub Lb. plantarum (alr–). Stosowanym antyge-nem był gen kodujący podjednostkę B ureazy (UreB). Pozytywny efekt (indukcję specyficznych przeciwciał i obniżenie poziomu kolonizacji myszy przez H. felis) zaobserwowano jedynie w przypadku zastosowania szczepu Lactobacillus [19, 46].

Wpływ nośnika na poziom indukcji układu odpor-nościowego i skuteczność działania prototypu szcze-pionki analizowano również w odniesieniu do szczepio-nek przeciwko S. pneumoniae. Badania przeprowadzano głównie na modelu mysim po donosowej immunizacji. Zakażenia S. pneumoniae są odpowiedzialne za około 11% przypadków zgonów dzieci do lat pięciu w skali światowej. Pneumokoki wywołują głównie zapalenie płuc, mogą być również przyczyną ogólnoustrojowych, inwazyjnych infekcji, takich jak np. sepsa czy zapalenie opon mózgowych. Licencjonowane szczepionki anty – S. pneumoniae zawierają polisacharydy bakteryjne (polisaccharide vaccine – PSV), które w niektórych preparatach skoniugowane są z białkiem nośnikowym (CMR197 – nieaktywna zmutowana toksyna błonicza). Rolą białka nośnikowego jest włączenie do odpowie-dzi immunologicznej limfocytów T, co skutkuje induk-cją odporności u dzieci poniżej drugiego roku życia. Szczepy S. pneumoniae charakteryzują się olbrzymią różnorodnością serotypową (opisano ponad 90 sero-typów), tak więc szczepionki są skuteczne tylko prze-ciwko tym serotypom, których polisacharydy wchodzą w skład preparatu. Do najczęściej stosowanych aktual-nie szczepionek należy siedmiowalentna szczepionka PCV7 zawierająca białko CMR197 oraz PCV23 zło-żona z polisacharydów 23 serotypów S. pneumoniae [57]. Ze względu na wielolekooporność tego patogena oraz różną geograficzną dystrybucję serotypów prowadzone są liczne badania dotyczące opracowania sku-tecznych preparatów w oparciu o konserwowane biał-kowe antygeny. Jednym z kandydatów do zastosowania


jako wektor dostarczający antygeny są szczepy LAB. Jako antygeny stosowane są polisacharydy otoczkowe (CPS) oraz liczne antygeny białkowe (pneumococcal surface antygen – PsaA; pneumococcal surface protein – PspA; pneumococcal protective protein – PppA) pro-dukowane przez gatunki rodzajów Lactobacillus i Lactococcus jako białka o różnej lokalizacji. Wyczerpujące informacje o zastosowaniu LAB w immunizacji anty – S. pneumoniae znajdują się w pracy przeglądowej autorstwa Villena i wsp. [92]. Wstępne eksperymenty udokumentowały, że donosowe podanie szczepu L. lactis produkującego wewnątrzkomórkowy antygen PspA jest skuteczniejsze niż donosowa lub podskórna immu-nizacja oczyszczonym rekombinowanym białkiem [35]. Pierwsze próby immunizacji z zastosowaniem szczepu Lb. casei zawierającego gen pspA S. pneumoniae sklono-wany na plazmidzie pod kontrolą indukcyjnego lakto-zowego promotora nie wykazały stymulacji odpowiedzi odpornościowej, prawdopodobnie ze względu na niski poziom antygenu. Dlatego w badaniach porównujących immunogenność szczepów LAB niosących gen pspA zastosowano konstytutywny silny promotor. Z przeba-danych czterech szczepów (L. lactis, Lb. casei, Lb. plantarum i Lb. helveticus) najniższy poziom odpowiedzi odpornościowej zaobserwowano dla L. lactis, co było skorelowane z niskim poziomem antygenu i krótkim czasem obecności w śluzówce nosa. Szczepy rodzaju Lactobacillus kolonizowały śluzówkę nosa przez około trzy dni i stymulowały znaczący poziom zarówno IgG jak i IgA, choć był on zależny od gatunku użytego nośnika. Badania zwróciły uwagę na różnice pomię-dzy gatunkami Lactobacillus dotyczące ich aktyw-ności adiuwantowej [65]. Adiuwantowy efekt działa-nia Lb. plantarum zaobserwowano także przy analizie skuteczności działania dwu rodzajów LAB będących nośnikami antygenu E7 wirusa HPV jako szczepionek terapeutycznych. Choć Lb. plantarum indukował niż-szy poziom odpowiedzi odpornościowej niż L. lactis, to podanie tego szczepu skutkowało znacznie szybszą regresją nowotworu [18]. Skuteczność nośnika może być jednak uzależniona od rodzaju antygenu, jego prezentacji i sposobu ekspresji badanego genu. Szczep L. lactis wyrażający antygen PppA S. pneumoniae jako białko powierzchniowe po donosowej immunizacji indukował silną odpowiedź śluzówkową oraz w zna-czący sposób podwyższał poziom odporności myszy na infekcję kilkoma serotypami S. pneumoniae. Został on wykorzystany w eksperymentach doustnej immunizacji anty – S. pneumoniae (patrz niżej) [55].

Większość prototypów szczepionek opracowywa-nych z zastosowaniem szczepów LAB jako nośników dotyczy chorób zakaźnych przeciwko patogenom wni-kającym do naszego organizmu poprzez błony śluzowe przewodu pokarmowego, oddechowego lub układu mo- czopłciowego. Z tego powodu stosowane są różne drogi

podania. I tak np. w przypadku S. pneumoniae anali-zowano skuteczność głównie szczepionek podawanych donosowo, w wypadku H. pylori. głównie doustnie lub dożołądkowo. W niektórych przypadkach stosowano także iniekcje domięśniowe lub podanie preparatu dootrzewnowo. Ponieważ układ odpornościowy zwią-zany z błonami śluzowymi MALT (mucosaassociated limphoid tissue ) stanowi wspólną sieć obejmującą cały organizm, doustna immunizacja, dzięki zdolności lim-focytów do migracji, zapewnia także ogólnoustrojową odporność na błonach śluzowych innych narządów.

Podanie antygenu doustnie jest najprostszą i najko-rzystniejszą z ekonomicznego punktu widzenia drogą aplikacji szczepionek. Obniżenie śmiertelności wśród dzieci z powodu infekcji S. pneumoniae wymaga za - szczepienia dużej liczby dzieci w krajach rozwijających się. Fakt ten w połączeniu z obserwowaną skuteczno-ścią działania szczepów LAB jako nośników antygenów S. pneumoniae przy immunizacji donosowej zainspi-rował do badania skuteczności tych szczepionek po podaniu doustnym. W tych eksperymentach szczep L. lactis zawierający gen pppA wyrażany z promotora indukowanego nizyną został użyty do immunizacji dorosłych jak i młodych myszy. Stwierdzono indukcję zarówno specyficznych przeciwciał w jelitach jak i sty-mulację ogólnoustrojowej odpowiedzi odpornościo-wej (IgG w surowicy). Immunizacja podnosiła poziom odpor ności myszy na infekcję choć efekt był zależny od serotypu szczepu zastosowanego w eksperymencie ochronnym [90, 91].

2.2. Rola lokalizacji i ilości antygenu

Wpływ lokalizacji antygenu w komórce szczepu nośnikowego na efektywność immunizacji badano wielo krotnie. Obok drogi podania, zastosowanego schematu immunizacji, rodzaju szczepu nośnikowego oraz rodzaju i ilości antygenu jest to z pewnością jeden z czynników determinujących poziom i rodzaj indu-kowanej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Dotychczasowe wyniki nie pozwalają jednak jedno-znacznie stwierdzić, w którym przedziale komórko-wym powinien być umiejscowiony antygen, by efekt immunizacji był skuteczny.

Obce białka zlokalizowane w cytoplazmie LAB, nawet jeśli w naturalnym gospodarzu są wydzielane na zewnątrz komórki (np. fragment C toksyny tężca), wywołują zwykle zadowalający poziom odpowiedzi immunologicznej (humoralnej i komórkowej) [30, 73]. Taka lokalizacja pozwala antygenom na uniknię-cie degradacji przez proteazy występujące w układzie pokarmowym, ale jednocześnie sprawia, że stają się one dostępne dla układu odpornościowego gospodarza dopiero po lizie komórek szczepu nośnikowego. Uwal-nianie większej ilości cytoplazmatycznego antygenu


in vivo umożliwia zastosowanie szczepów z mutacją w genie alr, kodującym racemazę alaninową. Enzym ten katalizuje reakcję izomeryzacji L-alaniny do D-ala-niny i jest niezbędny w procesie syntezy peptydoglikanu i kwasów tejchojowych. Zastosowanie szczepów LAB przechodzących lizę w środowisku pozbawionym ala-niny wykorzystano z powodzeniem kilkukrotnie [19, 32, 36]. Tak na przykład wprowadzenie mutacji alr do genomu szczepu L. lactis produkującego TTFC skut-kowało 20–30-krotnym wzrostem specyficznej odpo-wiedzi immunologicznej w porównaniu do szczepu dzikiego niosącego dokładnie ten sam rekombinowany plazmid [32]. Cytoplazmatyczna lokalizacja antygenu czasem bywa letalna dla komórki bakterii nośnikowej. Wewnątrzkomórkowa produkcja białka E7 ludzkiego papillomawirusa typu 16 (HPV-16) prowadziła do szybkiej jego degradacji. Sytuacji nie poprawiło uży-cie szczepu L. lactis niezdolnego do produkcji proteazy ClpP. Dopiero konstrukcja rekombinowanego plazmidu umożliwiającego zakotwiczenie kodowanego antygenu E7 w osłonach bądź jego wydzielenie do środowiska doprowadziło do produkcji większej ilości natywnego białka E7 [9, 17]. Nadprodukcja białka umiejsco- wionego w cytoplazmie może więc wywoływać efekt toksyczny i często stanowi obciążenie metaboliczne dla komórek nośnika.

Opracowano kilka strategii mających na celu „wysy-łanie” heterologicznych białek na powierzchnię ko- mórek szczepów LAB lub do otaczającego je środowi-ska. Do sekrecji antygenu powszechnie wykorzystywana jest sekwencja sygnalna białka Usp45 (unknown secreted protein of 45 kDa) – jedynego białka Lactococcus lactis wydzielanego w znaczących ilościach do środowiska [87]. Generalnie stosowane są dwie strategie prezenta-cji obcych antygenów na powierzchni komórek LAB; wykorzystujących wytworzenie wiązań kowalencyjnych lub niekowalencyjnych. Pierwsza z nich prowadzi do umieszczenia na C-końcu heterologicznego antygenu tzw. sekwencji kotwiczącej, która składa się z konserwo-wanego motywu LPXTG (Leu-Pro – dowolny amino-kwas – Thr-Gly), regionu hydrofobowego i fragmentu zbudowanego z pozytywnie naładowanych aminokwa-sów, co umożliwia kowalencyjne związanie hybrydo-wego białka z peptydoglikanem w procesie zależnym od aktywności sortazy A (SrtA) [15]. Jak dotąd do zapew-nienia powierzchniowej lokalizacji różnych antygenów wykorzystano motyw LPXTG proteinazy PrtP Lactococcus [69], proteinazy PrtB Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus [43], białka M6 S. pyogenes [25, 74, 95] oraz białka A Staphylococcus ureus [83]. Powierzchniową lokalizację antygenu umożliwia również dołączenie do jego C-końca domeny LysM. Powtórzone motywy LysM mają zdolność niekowalencyjnego wiązania się z peptydoglikanem a ich najczęstszym źródłem w bada-niach aplikacyjnych jest autolizyna L. lactis AcmA [12,

48, 64, 69, 71]. W 2011 roku zidentyfikowano lipopro-teinę BmpA, składnik klasycznego transportera typu ABC, odpowiedzialną za import puryn [5]. Aktualnie badana jest możliwość zastosowania tego białka jako nośnika antygenów, który jednocześnie zapewni ich powierzchniową lokalizację [96].

Pierwsza praca, której celem było ustalenie zna-czenia lokalizacji antygenu w indukcji odpowiedzi immunologicznej powstała z wykorzystaniem wspo-mnianego wcześniej fragmentu C toksyny tężca (TTFC) [73]. Autorzy oceniali immunogenność rekombino-wanych szczepów Lb. plantarum NCIMB8826 produ-kujących TTFC w trzech komórkowych lokalizacjach (cyto plazma, forma wydzielana do środowiska, forma zakotwiczona w osłonach komórkowych) po podaniu preparatu myszom podskórnie, dożołądkowo bądź donosowo. Odpowiedź immunologiczna (specyficzne IgG w surowicy) powstała po aplikacji podskórnej nie zależała od umiejscowienia antygenu w komórce nośnika. Natomiast przy podaniu rekombinowanych szczepów Lb. plantarum na powierzchnie śluzowe żołądka lub nosa najlepszy efekt uzyskano w przypadku cytoplazmatycznej lokalizacji antygenu. W tym ukła-dzie fragment C toksyny tężca powstawał w największej ilości i w tym upatruje się przyczynę obserwowanych różnic. Również badania Grangette i wsp. wskazują na znaczenie ilości powstającego w komórkach nośnika antygenu przy podaniu dożołądkowym. Znacząca odpowiedź immunologiczna powstawała po podaniu szczepu Lactobacillus NCIMB8826/pMEC127, produ-kującego duże ilości białka TTFC [30]. Przy mniejszej ilości antygenu o lokalizacji cytoplazmatycznej obser-wowano wzrost poziomu przeciwciał klasy IgG tylko w sytuacji gdy szczep podano donosowo. Niemniej jednak przeciwciała te nie neutralizowały toksyny tężca. Efekt ochronny obserwowano tylko wtedy, gdy na śluzówkę nosa podawano szczepy LAB produkujące wyższe stężenia antygenu, co przemawia za tym, że ilość antygenu ma znaczenie w indukcji przeciwciał o wyż-szej awidności [30, 31].

Zastosowanie różnych szczepów nośnikowych czy odmiennej drogi podania często uniemożliwia porów-nanie i jednoznaczną ocenę znaczenia lokalizacji anty-genu w indukcji odpowiedzi immunologicznej. Dlatego na uwagę zasługują badania Marelli’ego i wsp. dotyczące zastosowania L. lactis jako nośnika białka VP8 rotawi-rusa. U myszy doustnie immunizowanych szczepem L. lactis produkującym cytoplazmatyczną formę anty-genu VP8 obserwowano znaczący poziom jelitowych przeciwciał klasy IgA. U zwierząt, którym aplikowano L. lactis z białkiem VP8 zakotwiczonym w osłonach, oprócz wzrostu specyficznych przeciwciał klasy sIgA odnajdywanych w błonach śluzowych przewodu pokarmowego, odnotowano również indukcję przeciw-ciał klasy IgG. Przy wykorzystaniu linii komórkowej


MA-104 badano następnie zdolności infekcyjne cząstek wirusowych inkubowanych z przeciwciałami izolowa-nymi od immunizowanych zwierząt. Okazało się, że podanie immunizowanym zwierzętom szczepu L. lactis z białkiem VP8 umiejscowionym w osłonach zapew-niało powstanie przeciwciał umożliwiających100% neu-tralizację właściwości infekcyjnych cząstek wirusowych, podczas gdy lokalizacja cytoplazmatyczna antygenu doprowadzała do powstania przeciwciał wywołujących 50% redukcję infekcyjności wirusa [51]. Użycie innego antygenu rotawirusa, mianowicie białka VP7, dostar-czyło odmiennych danych. Przeciwciała zaindukowane formą białka zakotwiczoną w osłonach nie mają właści-wości neutralizujących cząstek wirusowych. Najwyższą immunogenność wykazywał natomiast szczep L. lactis wydzielający białko VP7 do środowiska [66].

Nie ma wątpliwości że zarówno ilość powstają-cego antygenu jak i jego umiejscowienie w komórkach nośnika muszą być brane pod uwagę w procesie kon-struowania szczepionek. Trudno jednak rozstrzygnąć, która z zastosowanych strategii przyniesie oczekiwane rezultaty. Publikacje z ostatnich lat zwracają też uwagę na znaczenie losów antygenu po przeniesieniu do uod-parnianego organizmu. Tak na przykład niezwykle pozytywny efekt uzyskano tworząc fuzję antygenu PA Bacillus anthracis (protective antigen) z peptydem umożliwiającym jego dostarczenie do komórek dendry-tycznych (DC). Doustna aplikacja szczepów Lb. acidophilus NCFM i Lactobacillus gasseri ATCC 33323 pro-dukujących taką fuzję zapewniła 100% ochronę myszy przed infekcją wąglikiem, podczas gdy wykorzystanie szczepów LAB kodujących antygen PA pozbawiony sygnału kierującego do DC skutkowało jedynie 30% efektem ochronnym [58, 59].

2.3. Porównanie skuteczności działania żywych szczepów LAB i cząstek GEM

W 2005 roku opracowano system nośnikowy, który opiera się na wykorzystaniu niemodyfikowanych gene-tycznie bakterii z grupy LAB [12]. Komórki L. lactis traktowane są gorącym kwasem trójchlorooctowym (TCA), co pozbawia je białek powierzchniowych oraz zawartości cytoplazmy. Peptydoglikan pozostaje nato-miast nietknięty zapewniając kształt cząstek zbliżony do żywych komórek. Powstałe cząstki nazwano GEM (Grampositive Enhancer Matrix). Utrata kwasów lipo-tejchojowych zapewnia cząstkom GEM, w porównaniu do szczepów żywych, możliwość związania większej ilo-ści heterologicznych hybrydowych białek posiadających na C-końcu domenę LysM pochodzącą z białek LAB. Brak w tej procedurze rekombinowanego DNA elimi-nuje ryzyko jego niekontrolowanego rozpowszechnie-nia w środowisku. Dodatkową zaletą tej strategii jest

stabilność cząstek GEM i możliwość długiego ich prze-chowywania [12, 88]. Jednak przewagą użycia w proce-sie immunizacji niektórych żywych szczepów LAB (np. Lactobacillus) jest ich zdolność do kolonizowania jelit, co zmniejsza liczbę dawek szczepiennych i w znaczący sposób upraszcza procedury immunizacji. Cząstki GEM są usuwane z organizmu gospodarza, przez co indukcja odpowiedzi immunologicznej o podobnej sile wymaga kilkukrotnego podania preparatu.

GEM-y, choć pozbawione białek powierzchnio-wych, zachowują właściwości prozapalne charaktery-styczne dla żywych bakterii. Indukują proces dojrzewa-nia komórek dendrytycznych i makrofagów, produkcję cytokin prozapalnych oraz czynnika martwicy nowo-tworu (TNFα) [2, 3]. Jak dotąd cząstki GEM zastoso-wano jako nośniki w procesach uodparniania dla trzech antygenów S. pneumoniae (IgA1 protease – IgA1p, putative proteinase maturation protein A – PpmA, streptococcal lipoprotein – SlrA), białka LcrV Yersinia pestis oraz antygenu MSA2 (merozoit surface antigen) Plasmodium falciparum [2, 3, 69, 70]. U myszy, którym podano odpowiednio zmodyfikowane cząstki GEM obserwowano podwyższoną odpowiedź immunolo-giczną (IgG, IgA).

Badania Saluja i wsp. wykazały, że cząstki GEM mają właściwości adiuwantu. Większość dostępnych na rynku szczepionek przeciw grypie, podawana domięś niowo bądź podskórnie, indukuje ogólnoustrojową odpo-wiedź immunologiczną. Szczepionki te nie są jednak zdolne do zaindukowania niezbędnej do ochrony górnych dróg oddechowych odpowiedzi śluzówko-wej. Analizując właściwości adiuwantowe cząstek GEM donosowo zaaplikowano myszom komercyjnie dostępną, monowalentną szczepionkę H3N2 zawiera-jącą hemaglutyninę oraz cząstki GEM. W odróżnie-niu od innych doświadczeń antygen wirusa grypy nie był zakotwiczony na powierzchni GEM-ów, a stano-wił oddzielny składnik szczepionki. U zwierząt tych odnotowano podobną odpowiedź ogólnoustrojową (IgG) jak u myszy, którym domięśniowo podano samą szczepionkę przeciwko grypie. Jednakże odpowiedź śluzówkowa (sIgA) była znacząco wyższa. Zaobserwo-wano również podwyższoną liczbę komórek produku-jących INF-γ, co wskazuje na dominującą odpowiedź typu Th1 [75]. Przy zastosowaniu cząstek GEM jako adiuwantu nawet 5-krotnie zmniejszona dawka hema-glutyniny wywoływała efekt ochronny u myszy [76].

Obiecujące wyniki badań prowadzonych z wykorzy-staniem cząstek GEM wywołały zainteresowanie firmy biotechnologicznej Mucosis. Obecnie kończy się I faza badań klinicznych opracowanej przez tą firmę szcze-pionki przeciwko grypie (FluGEM) przeznaczonej dla ludzi. Jest to jak dotąd jedyna szczepionka bazująca na wykorzystaniu jako nośnika bakterii kwasu mlekowego na tak zaawansowanym etapie badań.


3. Bakterie LAB jako szczepionki DNA

W prowadzonych od ponad 20 lat badaniach udo-kumentowano, że genetyczna immunizacja z zastoso-waniem plazmidowego DNA stanowi obiecującą strate-gię nie tylko immunoprofilaktyki chorób infekcyjnych ale i immunoterapii chorób nowotworowych. Immuni-zacja DNA prowadzi do indukcji zarówno humoralnej jak i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Ta druga jest szczególnie interesująca ponieważ jest to typ odpowiedzi immunologicznej odgrywający istotną rolę w immunoterapii chorób nowotworowych jak i immu-noprofilaktyce chorób wywoływanych przez bakterie wewnątrzkomórkowe, zdolne do inwazji do niefagocy-tujących eukariotycznych komórek. Plazmidowy DNA może być dostarczany do organizmu uodpornianego drogą domięśniowej iniekcji (tzw. nagi DNA – naked DNA) lub przy użyciu odpowiednich bakteryjnych nośników. Ten drugi proces, w znaczący sposób zwięk-szający ilość DNA docierającego do komórek prezen-tujących antygen (antigen presenting cells – APC) nosi nazwę bakteriofekcji. Dodatkowo produkcja antygenu w komórkach eukariotycznych zapewnia przepro-wadzenie potranslacyjnych modyfikacji antygenów lub ich epitopów – procesów, które często nie zacho-dzą w komórkach prokariotycznych. Prowadzone jak dotąd intensywne badania koncentrowały się na zasto-sowaniu jako nośników DNA atenuowanych bakterii enteroinwazyjnych takich jak Salmonella spp., Yersinia enterocolitica czy Listeria monocytogenes lub też odpo-wiednio zmodyfikowanych komórek Escherichia coli produkujących listeriolizynę O L. monocytogenes lub/i inwazynę Y. enterocolitica [21, 77]. Rozwój inżynierii genetycznej oraz nowych strategii sekwencjonowania otworzył możliwości wykorzystania również bak terii kwasu mlekowego w immunizacji DNA. Pierwsze badania wykazały, że efektem trzygodzinnej inkuba-cji niemodyfikowanego genetycznie nieinwazyjnego szczepu L. lactis MG1363, niosącego plazmidowy DNA, z komórkami CaCo-2 jest przekazanie DNA do komó-rek eukariotycznych i ekspresja jego genów. W tych eks-perymentach zastosowano eukariotyczną kasetę ekspre-syjną zawierającą ulegający transkrypcji pod kontrolą promotora wirusa CMV cDNA kodujący białko BLG (krowia β-laktoglobulina, główny alergen krowiego mleka) umieszczoną na wahadłowym plazmidzie zdol-nym do replikacji w komórkach E. coli i L. lactis [33]. Proces przekazania DNA miał także miejsce in vivo po doustnym podaniu myszom szczepu produkującego badany alergen. W komórkach jelita cienkiego zwierząt stwierdzono obecność cDNA, produkcję białka oraz dodatkowo odnotowano produkcję specyficznych prze-ciwciał klasy IgG i IgA. Mechanizm warunkujący obec-ność genu blg w komórkach eukariotycznych nie został wyjaśniony. Istnieją co najmniej dwie możli wości: albo

komórki eukariotyczne pobierają uwolniony w jelicie z komórek L. lactis plazmidowy DNA albo L. lactis, jest zdolny, z niedużą częstością, do inwazyjności [16].

Kilka czynników uznawane jest za krytyczne w pro-cesie uzyskania skutecznych szczepionek DNA. Plaz-midowy DNA powinien być ze stosunkowo dużą wydajnością uwalniany z komórek bakterii nośniko-wej do cytozolu komórki eukariotycznej, chroniony przed degradacją, by ostatecznie dotrzeć do jądra komórkowego, gdzie podlega procesowi transkryp-cji. Powstały mRNA po transporcie do cytozolu ulega translacji a produkowane białko rozpoznawane jako endogenny antygen prezentowane jest z cząsteczkami MHC klasy I indukując odpowiedź komórkową. Część antygenu uwalniana z komórek pobierana jest przez APC, co skutkuje indukcją odpowiedzi humoralnej. Ponieważ bakterie LAB nie są raczej zdolne do inwa-zyjności podjęto próby konstrukcji szczepów zdolnych do kontaktu z komórkami eukariotycznymi zakłada-jąc, że ten proces powinien skutkować ich internali-zacją. Intensywnie przebadano proces przekazywania plazmidowego DNA do komórek eukariotycznych stosując dwa typy rekombinowanych L. lactis: wyraża-jących zewnątrzkomórkowo białko FnBPA (białko A wiążące fibronektynę S. aureus) ora InlA (internalina L. monocytogenes). Jako geny reporterowe (cDNA) sto-sowano, wyżej opisany gen blg oraz gfp (gen kodujący białko zielonej fluorescencji). Doświadczenia, w których badano wpływ FnBPA na wydajność procesu zarówno w eksperymentach in vitro jak i in vivo wykazały, pod-wyższenie ilości DNA genu reporterowego na terenie komórek eukariotycznych, co jednak nie powodowało podwyższenia ilości produkowanego białka. Dodat-kowo przedstawione dane sugerują różny mechanizm procesu w warunkach in vitro i in vivo [68]. Podobnie podwyższony poziom inwazyjności i dostarczania pla-zmidu kodującego GFP obserwowano w eksperymen-tach in vitro w wypadku L. lactis wyrażającego główną inwazynę InlA Listeria monocytogenes. Receptorem dla internaliny A jest E-kadheryna. Ze względu na struk-turę różnych E-kadheryn InlA rozpoznaje ludzką ale nie mysią E-kadherynę. Skonstruowanie szczepu L. lactis NZ9000 wyrażającego zmutowaną co do miejsca, powierzchniową InlA pozwoliło na przeprowadzenie eksperymentów in vivo, które udokumentowały raz jeszcze podwyższoną inwazyjność szczepu in vitro, choć in vivo nie zaobserwowano podwyższonego poziomu produkcji analizowanego białka (BLG) [22, 38]. Przed-stawione wyżej analizy in vitro oraz dane z eksperymen-tów in vivo dotyczące uodparniania przeciwko S. pneumoniae czystym plazmidowym DNA [27, 86] sugerują duży potencjał aplikacyjny bakterii kwasu mlekowego jako szczepionek DNA. Aczkolwiek wiele problemów pozostaje nadal do wyjaśnienia szczególnie w świetle ostatnich badań wskazujących na różnice w rodzaju


indukowanej odpowiedzi immunologicznej pomiędzy natywnymi a rekombinowanymi szczepami jak i zależ-ności rodzaju odpowiedzi immunologicznej od drogi podania szczepionki DNA [67].

4. Modulacja działania układu immunologicznego

Szczepy bakterii kwasu mlekowego, w szczególności te o udokumentowanych właściwościach probiotycz-nych, mogą wpływać na działanie układu immunolo-gicznego gospodarza. Mechanizm leżący u podstaw tych oddziaływań nie został do końca wyjaśniony, zwłaszcza, że każdy ze szczepów LAB może modulować funkcjonowanie układu immunologicznego w sposób charakterystyczny jedynie dla siebie.

Przegląd badań wykazuje, że probiotyczne szczepy LAB hamują produkcję prozapalnych cytokin (np. IL-8, tumor necrosis factor α – TNF-α) powstających w odpo-wiedzi na kontakt komórek nabłonkowych jelita z pato-genami [41, 54, 98]. Jednocześnie indukują wytwarzanie przeciwzapalnych czynników takich jak TGF-β (trans forming growth factor β) oraz TSLP (thymic stromal lymphopoietin), co prowadzi do różnicowania niedoj-rzałych komórek dendrytycznych [97]. Wśród cytokin wydzielanych przez komórki dendrytyczne i makro-fagi w odpowiedzi na obecność szczepów probiotycz-nych na szczególną uwagę zasługują dwie z nich: IL-12 i IL-10. Pierwsza prowadzi do różnicowania komórek T CD4+ w komórki typu Th1 oraz zwiększa aktywność cytotoksyczną komórek NK (natural killers). Druga zaś działa immunosupresyjnie i przeciwzapalnie [78].

Szczepy indukujące produkcję IL-12 wydają się bar-dziej skuteczne w zapobieganiu infekcjom, hamowaniu alergii i obniżaniu ryzyka wystąpienia nowotworów. Zaś szczepy, które stymulują produkcję IL-10 skutecz-nie przeciwdziałają nadmiernej odpowiedzi immunolo-gicznej, co może znaleźć zastosowanie w leczeniu IBD (inflammatory bowel diseases), chorób autoimmunolo-gicznych oraz alergii. Opisano również szczepy, które prawdopodobnie w zależności od rodzaju komórek zaangażowanych w odpowiedź immunologiczną i bodź-ców pochodzących od mikroflory komensalnej, mogą indukować wytwarzanie zarówno IL-10 jak i IL-12, a tym samym wykazywać skuteczność w terapii różnych chorób. Przykładem takich wielofunkcyjnych probioty-ków są: Lactobacillus casei Shirota (LcS) i Lb. rhamnosus GG [79]. I choć coraz więcej badań klinicznych wska-zuje na zasadność stosowania preparatów probiotycz-nych w leczeniu wymienionych wyżej schorzeń [24, 45, 50, 78], istnieją także doniesienia o niekorzystnym ich wpływie na zdrowie pacjentów [10].

Zdecydowanie największą uwagę poświęca się moż-liwości zastosowania bakterii z grupy LAB w terapii przewlekłych stanów zapalnych przewodu pokarmo-

wego (inflammatory bowel disease – IBD), takich jak choroba Crohna (Crohn’s disease – CD) czy wrzodzie-jące zapalenie jelita grubego (ulcerative colitis – UC). Dane eksperymentalne wskazują, że choroby te uwa-runkowane są niewłaściwą odpowiedzią immunolo-giczną na fizjologiczną florę bakteryjną a w ich roz-woju odgrywają rolę czynniki zarówno środowiskowe jak i genetyczne [47]. Schorzenia IBD wymagają stałego stosowania leków immunosupresyjnych i przeciwzapal-nych [79]. Zaobserwowano, że podanie osobom cho-rym na UC szczepu E. coli Nissle 1917 czy też Lb. rhamnosus GG zapobiega równie skutecznie nawrotom choroby, co mesalazyna, przeciwzapalny lek stosowany w terapii IBD [72, 99]. Dokładny mechanizm działa-nia probiotyków, który prowadzi do złagodzenia obja-wów stanu zapalnego jelit nie jest dokładnie poznany. Przypuszcza się, że szczepy probiotyczne przywracają różnorodność mikroflory jelitowej, zapobiegając domi-nacji gatunków, które są zaangażowane w patogenezę UC [44]. Nie można również wykluczyć, że polepszenie stanu zdrowia pacjentów związane jest z oddziaływa-niem przyjmowanych szczepów probiotycznych na ich układ immunologiczny [50].

Podejmowane są również próby wykorzystania szczepów LAB do przenoszenia cząstek umożliwia-jących sterowanie rodzajem indukowanej odpowie-dzi immunologicznej. Badania prowadzone przez Steidlera w 2000 roku wykazały, że podanie myszom IL-10–/– szczepu L. lactis wydzielającego zachowującą biologiczną aktywność mysią IL-10 (mIL-10) zapobie-gało rozwojowi zapalenia jelita grubego. Pozytywny efekt – redukcję objawów chorobowych – uzyskano również podając ten sam szczep myszom ze stanem zapalnym jelita zaindukowanym DSS (dextran sulfate sodium) [80]. Wyniki uzyskane na modelu zwierzę-cym zachęciły badaczy do sprawdzenia skuteczności powyższego preparatu u ludzi. Małej grupie pacjentów cierpiących na chorobę Crohna podano szczep L. lactis, w genomie którego gen kodujący syntetazę tymidy-lanu (thyA) zastąpiono przez sekwencję nukleotydową kodującą dojrzałą ludzką IL-10 (hIL-10). Tak przygo-towane komórki bakteryjne (LLThy12) nie przeżywają w środowisku pozbawionym tyminy bądź tymidyny. U pacjentów nie obserwowano efektów ubocznych, które pojawiały się podczas podskórnej aplikacji rekom-binowanej hIL-10 (Tenovil). Niewielka grupa chorych, jak też brak odpowiednich kontroli nie pozwolił jednak na wiarygodną ocenę skuteczności LLThy12 [13, 14, 81]. W 2009 roku zakończono II etap badań klinicz-nych. Nie odnotowano istotnych statystycznie różnic w gojeniu śluzówki pomiędzy grupą badaną i grupą otrzymującą placebo [53]. I choć szereg eksperymen-tów demonstruje użyteczność terapii z wykorzystaniem IL-10 w chorobach o charakterze zapalnym na mysich modelach [29, 52], u ludzi wyniki dotychczasowych


badań wskazują na dużo mniejszą rolę tej interleukiny w leczeniu stanów zapalnych. Naukowcy nie ustają jed-nak w poszukiwaniu sposobu zwalczania chorób IBD przy wykorzystaniu szczepów z grupy LAB. Są one m.in. wykorzystywane do przenoszenia innych czą-stek odgrywających ważną rolę w ochronie i naprawie śluzówki jelitowej, np. peptydów TFF (trefoils factors) [89]. Intensywnie bada się możliwość dostarczania do miejsc objętych stanem zapalnym za pośrednictwem LAB enzymów antyoksydacyjnych (katalaza, dysmu-taza nadtlenkowa) [93], jak również inhibitorów pro-teaz (elafina) [61] a więc czynników oddziałujących na elementy układu immunologicznego. Dodatkowo poszukuje się nowych szczepów kolonizujących ślu-zówkę jelita, użycie których umożliwiłoby połączenie naturalnych własności z właściwościami przenoszo-nych heterologicznych białek. Świetnym przykładem jest komensal okrężnicy Bacteroides ovatus. Zdolność wykorzystywania ksylanu przez Bacteroides ovatus pozwala na regulowaną produkcję białek terapeutycz-nych dla IBD: KGF-2 (keratinocyte growth factor2) bądź TGF-β1 (transforming growth factorβ1), w odpo-wiedzi na obecność tego polisacharydu w diecie [34].

Cytokiny odgrywają ważną rolę w sygnalizacji komórkowej, przesyłaniu bodźców i kierowaniu odpo-wiedzią układu immunologicznego. Zastosowanie wektorów LAB eksprymujących antygeny patogen-nych mikroorganizmów oraz wydzielane do środowi-ska cytokiny powinny zagwarantować skuteczniejszą reakcję układu odpornościowego. Pierwsze badania dotyczące zastosowania cytokin w immunizacji z wyko-rzystaniem L. lactis prowadził Steidler i wsp. Donosowe podanie myszom szczepu L. lactis produkującego jed-nocześnie fragment C toksyny tężca (TTFC) i jedną z biologicznie aktywnych mysich cytokin: IL-2 lub IL-6 indukowało znacząco wyższy poziom specyficz-nych przeciwciał IgG w porównaniu do L. lactis pro-dukującego jedynie TTFC [82, 84]. W ostatnich latach intensywnie badane jest oddziaływanie IL-12 na układ odpornościowy. Biologicznie aktywna interleukina 12 jest heterodimerem składającym się z dwóch różnych podjednostek: p35 i p40. Stymuluje proliferację, akty-wację i cytotoksyczność limfocytów Th1 i komórek NK oraz wytwarzanie przez te komórki IFN-γ i TNF. Jednym z obiecujących przykładów zastosowania IL-12 w immunoprofilaktyce jest opracowanie szczepionki przeciwko leiszmaniozie. Jest to pasożytnicza cho-roba ludzi i zwierząt, której czynnikiem etiologicznym są jednokomórkowe wiciowce z rodzaju Leishmania. Każdego roku notuje się 50 tys. przypadków śmierci powodowanych przez leiszmaniozę na całym świecie. Opracowano szczep L. lactis umożliwiający ekspresję antygenu pochodzącego z L. major: homologa aktywo-wanej kinazy C (LACK), oraz szczep zdolny do sekrecji aktywnej mysiej IL-12. W efekcie podskórnego poda-

nia myszom obu tych szczepów rozwijała się swoista odpowiedź Th1 [37]. Obiecujące wyniki zachęciły bada-czy do stworzenia szczepu zdolnego do jednoczesnej ekspresji antygenu LACK oraz IL-12. Jego aplikacja prowadzi do rozwoju odpowiedzi immunologicznej chroniącej myszy przed kolejną infekcją L. major [36].

5. Bakterie LAB w immunoterapiach chorób nowotworowych

Rak szyjki macicy (cervical cancer – CxCa) jest jed-nym z najczęściej powodujących śmierć kobiet nowo-tworów. Czynnikiem ryzyka wystąpienia zmian nowo-tworowych jest zakażenie genitalnymi typami ludzkiego wirusa brodawczaka (human papilloma virus – HPV). Aktualnie dostępna jest szczepionka profilaktyczna przeciw onkogennym typom HPV, która – podana przed inicjacją seksualną – wykazuje wysoką skutecz-ność. Niemniej jednak w dalszym ciągu poszukuje się nowych sposobów ochrony przed zakażeniami wirusem brodawczaka, jak też podejmowane są próby stworzenia preparatów o charakterze terapeutycznym. W badania te wpisuje się wykorzystanie szczepu L. lactis do eks-presji genu onkoproteiny E7 papilloma wirusa HPV-16. Eksperymenty przeprowadzone przez grupę badawczą Cortés-Péreza wykazały, że donosowa immunizacja samic myszy komórkami L. lactis eksponującymi na swej powierzchni antygen E7 indukuje wysoki poziom odpowiedzi komórkowej (IL-2 oraz IFN-γ) [17]. Uzy-skany prototyp szczepionkowy nieco zmodyfikowano, co doprowadziło do znaczącego wzrostu specyficznej odpowiedzi immunologicznej typu komórkowego. Razem z komórkami L. lactis prezentującymi na swo-jej powierzchni białko E7 podano komórki L. lactis produkujące rekombinowaną IL-12 [8]. Cytokina ta wywiera silne immunomodulujące działanie obejmu-jące stymulację wydzielania IFN-γ, hamowanie gałęzi Th2 i stymulację Th1 [4, 62]. IL-12 przeciwdziała rów-nież angiogenezie i podana miejscowo powoduje regre-sję istniejących guzów i ograniczenie przerzutów na modelu mysim. Takie jej właściwości powodują, że jest ona brana pod uwagę w immunoterapii nowotworów. Podanie myszom donosowo szczepów L. lactis (scIL-12) i L. lactis (E7) zapewniło znaczącą ochronę przeciwko rozwojowi raka u myszy, którym podano podskórnie TC1/E7 (E7expressing TC1 tumor cell line) – komórki nowotworowe, które umożliwiają ekspresję białka E7 na letalnym poziomie [6]. Zaobserwowano również, że aplikacja tych szczepów zwierzętom z nowotwo- rami zaindukowanymi przez podanie TC1/E7 prowa-dzi do znaczącej regresji nowotworów w porównaniu z grupą kontrolną [6]. Wskazuje to na możliwość zasto-sowania LAB zarówno w profilaktyce jak i terapii anty--nowotworowej.


6. Podsumowanie

Od pierwszego doniesienia dotyczącego wykorzy-stania bakterii kwasu mlekowego jako wektora szcze-pionkowego minęło wiele lat. W ciągu tego czasu opu-blikowano wiele badań, w których stosowano bakterie kwasu mlekowego jako nośniki obcych antygenów do immunizacji głównie przeciwko patogenom wnikają-cym do organizmu człowieka poprzez błony śluzowe układu oddechowego oraz pokarmowego. Prezento-wane wyniki badań są trudne do porównywania oraz interpretacji ze względu na ogromną różnorodność fizjologii w obrębie bakterii z grupy LAB. Charakte-ryzuje je różna zdolność do przetrwania w środowisku jelitowym. Interakcje bakterii z powierzchnią nabłon-kową oraz komórkami układu limfatycznego także mogą być odmienne u poszczególnych szczepów nawet tego samego gatunku. Podsumowując, należy podkreś-lić, że prawdopodobnie dla różnych szczepionek wyko-rzystujących LAB jako nośniki antygenów konieczne będzie opracowywanie odmiennych pod względem lokalizacji antygenu w komórce nośnika konstruktów genetycznych oraz schematów immunizacji.

PodziękowaniaPraca powstała w wyniku realizacji projektu badawczego o nr

2011/03/B/NZ1/00592 finansowanego ze środków Narodowego Centrum Nauki.

Piśmiennictwo

1. Aggarwal J., Swami G., Kumar M.: Probiotics and their Effects on Metabolic Diseases: An Update. J. Clin. Diagn. Res. 7, 173–177 (2013)

2. Audouy S.A., van Roosmalen M.L., Neef J., Kanninga R., Post E., van Deemter M., Metselaar H., van Selm S., Robillard G.T., Leenhouts K.J. et al.: Lactococcus lactis GEM particles dis - playing pneumococcal antigens induce local and systemic immune responses following intranasal immunization. Vaccine, 24, 5434–5441 (2006)

3. Audouy S.A., van Selm S., van Roosmalen M.L., Post E., Kanninga R., Neef J., Estevao S., Nieuwenhuis E.E., Adrian P.V., Leenhouts K. et al.: Development of lactococcal GEM-based pneumococcal vaccines. Vaccine, 25, 2497–2506 (2007)

4. Barth H., Klein R., Berg P.A., Wiedenmann B., Hopf U., Berg T.: Induction of T helper cell type 1 response and elimination of HBeAg during treatment with IL-12 in a patient with therapy--refractory chronic hepatitis B. Hepatogastroenterology, 48, 553–555 (2001)

5. Berlec A., Zadravec P., Jevnikar Z., Strukelj B.: Identification of candidate carrier proteins for surface display on Lactococcus lactis by theoretical and experimental analyses of the surface proteome. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1292–1300 (2011)

6. Bermudez-Humaran L.G., Cortes-Perez N.G., Lefevre F., Guimaraes V., Rabot S., Alcocer-Gonzalez J.M., Gratadoux J.J., Rodriguez-Padilla C., Tamez-Guerra R.S., Corthier G. et al.: A novel mucosal vaccine based on live Lactococci expressing E7 antigen and IL-12 induces systemic and mucosal immune

responses and protects mice against human papillomavirus type 16-induced tumors. J. Immunol. 175, 7297–7302 (2005)

7. Bermudez-Humaran L.G., Kharrat P., Chatel J.M., Langella P.: Lactococci and lactobacilli as mucosal delivery vectors for thera-peutic proteins and DNA vaccines. Microb. Cell Fact. 10 Suppl 1, S4 (2011)

8. Bermudez-Humaran L.G., Langella P., Cortes-Perez N.G., Gruss A., Tamez-Guerra R.S., Oliveira S.C., Saucedo- -Cardenas O., Montes de Oca-Luna R., Le Loir Y.: Intranasal immunization with recombinant Lactococcus lactis secreting murine interleukin-12 enhances antigen-specific Th1 cytokine production. Infect. Immun. 71, 1887–1896 (2003)

9. Bermudez-Humaran L.G., Langella P., Miyoshi A., Gruss A., Guerra R.T., Montes de Oca-Luna R., Le Loir Y.: Production of human papillomavirus type 16 E7 protein in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 68, 917–922 (2002)

10. Besselink M.G., van Santvoort H.C., Buskens E., Boerme-ester M.A., van Goor H., Timmerman H.M., Nieuwenhuijs V.B., Bollen T.L., van Ramshorst B., Witteman B.J. et al.: Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomi-sed, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet, 371, 651–659 (2008)

11. Bolotin A., Mauger S., Malarme K., Ehrlich S.D., Sorokin A.: Low-redundancy sequencing of the entire Lactococcus lactis IL1403 genome. Antonie Van Leeuwenhoek, 76, 27–76 (1999)

12. Bosma T., Kanninga R., Neef J., Audouy S.A., van Roosma-len M.L., Steen A., Buist G., Kok J., Kuipers O.P., Robillard G. et al.: Novel surface display system for proteins on non-geneti-cally modified Gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 72, 880–889 (2006)

13. Braat H., Rottiers P., Hommes D.W., Huyghebaert N., Remaut E., Remon J.P., van Deventer S.J., Neirynck S., Peppelenbosch M.P., Steidler L.: A phase I trial with transgenic bacteria expressing interleukin-10 in Crohn’s disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 4, 754–759 (2006)

14. Buruiana F.E., Solà I., Alonso-Coello P.: Recombinant human interleukin 10 for induction of remission in Crohn’s disease. Cochrane Database of Systematic Reviews (2010)

15. Call E.K., Klaenhammer T.R.: Relevance and application of sortase and sortase-dependent proteins in lactic acid bacteria. Front. Microbiol. 4, 73 (2013)

16. Chatel J.M., Pothelune L., Ah-Leung S., Corthier G., Wal J.M., Langella P.: In vivo transfer of plasmid from food-grade tran siting lactococci to murine epithelial cells. Gene Ther. 15, 1184–1190 (2008)

17. Cortes-Perez N.G., Bermudez-Humaran L.G., Le Loir Y., Rodri-guez-Padilla C., Gruss A., Saucedo-Cardenas O., Langella P., Montes-de-Oca-Luna R.: Mice immunization with live lacto-cocci displaying a surface anchored HPV-16 E7 oncoprotein. FEMS Microbiol. Lett. 229, 37–42 (2003)

18. Cortes-Perez N.G., Lefevre F., Corthier G., Adel-Patient K., Langella P., Bermudez-Humaran L.G.: Influence of the route of immunization and the nature of the bacterial vector on immu-nogenicity of mucosal vaccines based on lactic acid bacteria. Vaccine, 25, 6581–6588 (2007)

19. Corthesy B., Boris S., Isler P., Grangette C., Mercenier A.: Oral immunization of mice with lactic acid bacteria producing Helicobacter pylori urease B subunit partially protects against chal-lenge with Helicobacter felis. J. Infect. Dis. 192, 1441–1449 (2005)

20. Daniel C., Roussel Y., Kleerebezem M., Pot B.: Recombinant lactic acid bacteria as mucosal biotherapeutic agents. Trends Biotechnol. 29, 499–508 (2011)

21. Daudel D., Weidinger G., Spreng S.: Use of attenuated bacteria as delivery vectors for DNA vaccines. Expert Rev. Vaccines, 6, 97–110 (2007)


22. de Azevedo M., Karczewski J., Lefevre F., Azevedo V., Miyoshi A., Wells J.M., Langella P., Chatel J.M.: In vitro and in vivo characterization of DNA delivery using recombinant Lactococcus lactis expressing a mutated form of L. monocytogenes Internalin A. BMC Microbiol. 12, 299 (2012)

23. de Vos W.M.: Systems solutions by lactic acid bacteria: from paradigms to practice. Microb. Cell Fact. 10 Suppl 1, S2 (2011)

24. Delcenserie V., Martel D., Lamoureux M., Amiot J., Boutin Y., Roy D.: Immunomodulatory effects of probiotics in the intesti-nal tract. Curr. Issues Mol. Biol. 10, 37–54 (2008)

25. Dieye Y., Usai S., Clier F., Gruss A., Piard J.C.: Design of a pro-tein-targeting system for lactic acid bacteria. J. Bacteriol. 183, 4157–4166 (2001)

26. FAO/WHO: Health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lacticacid bacteria, http://www.who.int/foodsafety/ publications/fs_management/en/pro-biotics.pdf (15 października 2014 roku)

27. Ferreira D.M., Miyaji E.N., Oliveira M.L., Darrieux M., Areas A.P., Ho P.L., Leite L.C.: DNA vaccines expressing pneumococcal surface protein A (PspA) elicit protection levels comparable to recombinant protein. J. Med. Microbiol. 55, 375–378 (2006)

28. Fontana L., Bermudez-Brito M., Plaza-Diaz J., Munoz--Quezada S., Gil A.: Sources, isolation, characterisation and evaluation of probiotics. Br. J. Nutr. 109 Suppl 2, S35–50 (2013)

29. Frossard C.P., Steidler L., Eigenmann P.A.: Oral administra-tion of an IL-10-secreting Lactococcus lactis strain prevents food-induced IgE sensitization. J. Allergy Clin. Immunol. 119, 952–959 (2007)

30. Grangette C., Muller-Alouf H., Geoffroy M., Goudercourt D., Turneer M., Mercenier A.: Protection against tetanus toxin after intragastric administration of two recombinant lactic acid bac-teria: impact of strain viability and in vivo persistence. Vaccine, 20, 3304–3309 (2002)

31. Grangette C., Muller-Alouf H., Goudercourt D., Geoffroy M.C., Turneer M., Mercenier A.: Mucosal immune responses and protection against tetanus toxin after intranasal immunization with recombinant Lactobacillus plantarum. Infect. Immun. 69, 1547–1553 (2001)

32. Grangette C., Muller-Alouf H., Hols P., Goudercourt D., Delcour J., Turneer M., Mercenier A.: Enhanced mucosal deli-very of antigen with cell wall mutants of lactic acid bacteria. Infect. Immun. 72, 2731–2737 (2004)

33. Guimaraes V.D., Innocentin S., Lefevre F., Azevedo V., Wal J.M., Langella P., Chatel J.M.: Use of native lactococci as vehicles for delivery of DNA into mammalian epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 72, 7091–7097 (2006)

34. Hamady Z.Z.: Novel xylan-controlled delivery of therapeutic proteins to inflamed colon by the human anaerobic commensal bacterium. Ann. R. Coll. Surg. Engl. 95, 235–240 (2013)

35. Hanniffy S.B., Carter A.T., Hitchin E., Wells J.M.: Mucosal delivery of a pneumococcal vaccine using Lactococcus lactis affords protection against respiratory infection. J. Infect. Dis. 195, 185–193 (2007)

36. Hugentobler F., Di Roberto R.B., Gillard J., Cousineau B.: Oral immunization using live Lactococcus lactis co-expressing LACK and IL-12 protects BALB/c mice against Leishmania major infection. Vaccine, 30, 5726–5732 (2012)

37. Hugentobler F., Yam K.K., Gillard J., Mahbuba R., Olivier M., Cousineau B.: Immunization against Leishmania major infec-tion using LACK- and IL-12-expressing Lactococcus lactis indu-ces delay in footpad swelling. PLoS One, 7, e30945 (2012)

38. Innocentin S., Guimaraes V., Miyoshi A., Azevedo V., Lan-gella P., Chatel J.M., Lefevre F.: Lactococcus lactis expressing either Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein A or Listeria monocytogenes internalin A can efficiently internalize

and deliver DNA in human epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 75, 4870–4878 (2009)

39. Isolauri E., Salminen S., Ouwehand A.C.: Microbial-gut inter-actions in health and disease. Probiotics. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 18, 299–313 (2004)

40. Iwaki M., Okahashi N., Takahashi I., Kanamoto T., Sugita-Koni-shi Y., Aibara K., Koga T.: Oral immunization with recombinant Streptococcus lactis carrying the Streptococcus mutans surface protein antigen gene. Infect. Immun. 58, 2929–2934 (1990)

41. Jijon H., Backer J., Diaz H., Yeung H., Thiel D., McKaigney C., De Simone C., Madsen K.: DNA from probiotic bacteria modu-lates murine and human epithelial and immune function. Gastroenterology, 126, 1358–1373 (2004)

42. Kant R., Blom J., Palva A., Siezen R.J., de Vos W.M.: Compara-tive genomics of Lactobacillus. Microb. Biotechnol. 4, 323–332 (2011)

43. Kim T.W., Igimi S., Kajikawa A., Kim H.Y.: Display of hete-rologous proteins on the surface of Lactococcus lactis using the H and W domain of PrtB from Lactobacillus delburueckii subsp. bulgaricus as an anchoring matrix. J. Appl. Microbiol. 104, 1636–1643 (2008)

44. Kuhbacher T., Ott S.J., Helwig U., Mimura T., Rizzello F., Klees-sen B., Gionchetti P., Blaut M., Campieri M., Folsch U.R. et al.: Bacterial and fungal microbiota in relation to probiotic therapy (VSL#3) in pouchitis. Gut, 55, 833–841 (2006)

45. Lee J., Seto D., Bielory L.: Meta-analysis of clinical trials of pro-biotics for prevention and treatment of pediatric atopic derma-titis. J. Allergy Clin. Immunol. 121, 116–121 e111 (2008)

46. Lee M.H., Roussel Y., Wilks M., Tabaqchali S.: Expression of Helicobacter pylori urease subunit B gene in Lactococcus lactis MG1363 and its use as a vaccine delivery system against H. pylori infection in mice. Vaccine, 19, 3927–3935 (2001)

47. Leone V.A., Cham C.M., Chang E.B.: Diet, gut microbes, and genetics in immune function: can we leverage our current knowledge to achieve better outcomes in inflammatory bowel diseases? Curr. Opin. Immunol. 31C, 16–23 (2014)

48. Lim S.H., Jahanshiri F., Rahim R.A., Sekawi Z., Yusoff K.: Sur-face display of respiratory syncytial virus glycoproteins in Lactococcus lactis NZ9000. Lett. Appl. Microbiol. 51, 658–664 (2010)

49. Linares D.M., Kok J., Poolman B.: Genome sequences of Lactococcus lactis MG1363 (revised) and NZ9000 and comparative physiological studies. J. Bacteriol. 192, 5806–5812 (2010)

50. Lorea Baroja M., Kirjavainen P.V., Hekmat S., Reid G.: Anti--inflammatory effects of probiotic yogurt in inflammatory bowel disease patients. Clin. Exp. Immunol. 149, 470–479 (2007)

51. Marelli B., Perez A.R., Banchio C., de Mendoza D., Magni C.: Oral immunization with live Lactococcus lactis expressing rota-virus VP8 subunit induces specific immune response in mice. J. Virol. Methods. 175, 28–37 (2011)

52. Marinho F.A., Pacifico L.G., Miyoshi A., Azevedo V., Le Loir Y., Guimaraes V.D., Langella P., Cassali G.D., Fonseca C.T., Oliveira S.C.: An intranasal administration of Lactococcus lactis strains expressing recombinant interleukin-10 modulates acute allergic airway inflammation in a murine model. Clin. Exp. Allergy, 40, 1541–1551 (2010)

53. Martin R., Miquel S., Ulmer J., Kechaou N., Langella P., Bermu-dez-Humaran L.G.: Role of commensal and probiotic bacteria in human health: a focus on inflammatory bowel disease. Microb. Cell Fact. 12, 71 (2013)

54. Matsumoto S., Hara T., Hori T., Mitsuyama K., Nagaoka M., Tomiyasu N., Suzuki A., Sata M.: Probiotic Lactobacillus-indu-ced improvement in murine chronic inflammatory bowel dise-ase is associated with the down-regulation of pro-inflammatory cytokines in lamina propria mononuclear cells. Clin. Exp. Immunol. 140, 417–426 (2005)


55. Medina M., Villena J., Vintini E., Hebert E.M., Raya R., Alva-rez S.: Nasal immunization with Lactococcus lactis expressing the pneumococcal protective protein A induces protective immunity in mice. Infect. Immun. 76, 2696–2705 (2008)

56. Messaoudi S., Kergourlay G., Dalgalarrondo M., Choiset Y., Ferchichi M., Prevost H., Pilet M.F., Chobert J.M., Manai M., Dousset X.: Purification and characterization of a new bacte-riocin active against Campylobacter produced by Lactobacillus salivarius SMXD51. Food Microbiol. 32, 129–134 (2012)

57. Moffitt K.L., Malley R.: Next generation pneumococcal vaccines. Curr. Opin. Immunol. 23, 407–413 (2011)

58. Mohamadzadeh M., Duong T., Sandwick S.J., Hoover T., Klaen-hammer T.R.: Dendritic cell targeting of Bacillus anthracis pro-tective antigen expressed by Lactobacillus acidophilus protects mice from lethal challenge. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 4331–4336 (2009)

59. Mohamadzadeh M., Durmaz E., Zadeh M., Pakanati K.C., Gramarossa M., Cohran V., Klaenhammer T.R.: Targeted expression of anthrax protective antigen by Lactobacillus gasseri as an anthrax vaccine. Future Microbiol. 5, 1289–1296 (2010)

60. Moorthy G., Ramasamy R.: Mucosal immunisation of mice with malaria protein on lactic acid bacterial cell walls. Vaccine, 25, 3636–3645 (2007)

61. Motta J.P., Bermudez-Humaran L.G., Deraison C., Martin L., Rolland C., Rousset P., Boue J., Dietrich G., Chapman K., Kharrat P. et al.: Food-grade bacteria expressing elafin protect against inflammation and restore colon homeostasis. Sci. Transl. Med. 4, 158ra144 (2012)

62. Nastala C.L., Edington H.D., McKinney T.G., Tahara H., Nalesnik M.A., Brunda M.J., Gately M.K., Wolf S.F., Schrei-ber R.D., Storkus W.J. et al: Recombinant IL-12 administration induces tumor regression in association with IFN-gamma pro-duction. J. Immunol. 153, 1697–1706 (1994)

63. National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=1578 (2 lutego 2015 roku)

64. Okano K., Zhang Q., Kimura S., Narita J., Tanaka T., Fukuda H., Kondo A.: System using tandem repeats of the cA peptidogly-can-binding domain from Lactococcus lactis for display of both N- and C-terminal fusions on cell surfaces of lactic acid bacte-ria. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1117–1123 (2008)

65. Oliveira M.L., Areas A.P., Campos I.B., Monedero V., Perez--Martinez G., Miyaji E.N., Leite L.C., Aires K.A., Lee Ho P.: Induction of systemic and mucosal immune response and decrease in Streptococcus pneumoniae colonization by nasal inoculation of mice with recombinant lactic acid bacteria expressing pneumococcal surface antigen A. Microbes Infect. 8, 1016–1024 (2006)

66. Perez C.A., Eichwald C., Burrone O., Mendoza D.: Rotavirus vp7 antigen produced by Lactococcus lactis induces neutralizing antibodies in mice. J. Appl. Microbiol. 99, 1158–1164 (2005)

67. Pontes D., Azevedo M., Innocentin S., Blugeon S., Lefevre F., Azevedo V., Miyoshi A., Courtin P., Chapot-Chartier M.P., Langella P. et al.: Immune response elicited by DNA vaccination using Lactococcus lactis is modified by the production of surface exposed pathogenic protein. PLoS One, 9, e84509 (2014)

68. Pontes D., Innocentin S., Del Carmen S., Almeida J.F., Leblanc J.G., de Moreno de Leblanc A., Blugeon S., Cherbuy C., Lefevre F., Azevedo V. et al.: Production of Fibronectin Binding Protein A at the surface of Lactococcus lactis increases plasmid transfer in vitro and in vivo. PLoS One, 7, e44892 (2012)

69. Ramasamy R., Yasawardena S., Zomer A., Venema G., Kok J., Leenhouts K.: Immunogenicity of a malaria parasite antigen displayed by Lactococcus lactis in oral immunisations. Vaccine, 24, 3900–3908 (2006)

70. Ramirez K., Ditamo Y., Rodriguez L., Picking W.L., van Roosma-len M.L., Leenhouts K., Pasetti M.F.: Neonatal mucosal immu-nization with a non-living, non-genetically modified Lactococcus lactis vaccine carrier induces systemic and local Th1-type immunity and protects against lethal bacterial infection. Mucosal Immunol. 3, 159–171 (2010)

71. Ravnikar M., Strukelj B., Obermajer N., Lunder M., Berlec A.: Engineered lactic acid bacterium Lactococcus lactis capable of binding antibodies and tumor necrosis factor alpha. Appl. Environ. Microbiol. 76, 6928–6932 (2010)

72. Rembacken B.J., Snelling A.M., Hawkey P.M., Chalmers D.M., Axon A.T.: Non-pathogenic Escherichia coli versus mesalazine for the treatment of ulcerative colitis: a randomised trial. Lancet, 354, 635–639 (1999)

73. Reveneau N., Geoffroy M.C., Locht C., Chagnaud P., Merce-nier A.: Comparison of the immune responses induced by local immunizations with recombinant Lactobacillus plantarum pro-ducing tetanus toxin fragment C in different cellular locations. Vaccine, 20, 1769–1777 (2002)

74. Ribeiro L.A., Azevedo V., Le Loir Y., Oliveira S.C., Dieye Y., Piard J.C., Gruss A., Langella P.: Production and targeting of the Brucella abortus antigen L7/L12 in Lactococcus lactis: a first step towards food-grade live vaccines against brucellosis. Appl. Environ. Microbiol. 68, 910–916 (2002)

75. Saluja V., Amorij J.P., van Roosmalen M.L., Leenhouts K., Huckriede A., Hinrichs W.L., Frijlink H.W.: Intranasal delivery of influenza subunit vaccine formulated with GEM particles as an adjuvant. AAPS J. 12, 109–116 (2010)

76. Saluja V., Visser M.R., Ter Veer W., van Roosmalen M.L., Leen-houts K., Hinrichs W.L., Huckriede A., Frijlink H.W.: Influenza antigen-sparing by immune stimulation with Gram-positive enhancer matrix (GEM) particles. Vaccine, 28, 7963–7969 (2010)

77. Schoen C., Loeffler D.I., Frentzen A., Pilgrim S., Goebel W., Stritzker J.: Listeria monocytogenes as novel carrier system for the development of live vaccines. Int. J. Med. Microbiol. 298, 45–58 (2008)

78. Shida K., Nanno M.: Probiotics and immunology: separating the wheat from the chaff. Trends Immunol. 29, 565–573 (2008)

79. Shida K., Nanno M., Nagata S.: Flexible cytokine production by macrophages and T cells in response to probiotic bacteria: a possible mechanism by which probiotics exert multifunctional immune regulatory activities. Gut Microbes, 2, 109–114 (2011)

80. Steidler L., Hans W., Schotte L., Neirynck S., Obermeier F., Falk W., Fiers W., Remaut E.: Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10. Science, 289, 1352–1355 (2000)

81. Steidler L., Neirynck S., Huyghebaert N., Snoeck V., Vermeire A., Goddeeris B., Cox E., Remon J.P., Remaut E.: Biological conta-inment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinal delivery of human interleukin 10. Nat. Biotechnol. 21, 785–789 (2003)

82. Steidler L., Robinson K., Chamberlain L., Schofield K.M., Remaut E., Le Page R.W., Wells J.M.: Mucosal delivery of murine interleukin-2 (IL-2) and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect. Immun. 66, 3183–3189 (1998)

83. Steidler L., Viaene J., Fiers W., Remaut E.: Functional display of a heterologous protein on the surface of Lactococcus lactis by means of the cell wall anchor of Staphylococcus aureus protein A. Appl. Environ. Microbiol. 64, 342–345 (1998)

84. Steidler L., Wells J.M., Raeymaekers A., Vandekerckhove J., Fiers W., Remaut E.: Secretion of biologically active murine interleukin-2 by Lactococcus lactis subsp. lactis. Appl. Environ. Microbiol. 61, 1627–1629 (1995)


85. Svetoch E.A., Eruslanov B.V., Levchuk V.P., Perelygin V.V., Mitsevich E.V., Mitsevich I.P., Stepanshin J., Dyatlov I., Seal B.S., Stern N.J.: Isolation of Lactobacillus salivarius 1077 (NRRL B-50053) and characterization of its bacteriocin, including the antimicrobial activity spectrum. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2749–2754 (2011)

86. Vadesilho C.F., Ferreira D.M., Moreno A.T., Chavez- -Olortegui C., Machado de Avila R.A., Oliveira M.L., Ho P.L., Miyaji E.N.: Characterization of the antibody response elicited by immunization with pneumococcal surface protein A (PspA) as recombinant protein or DNA vaccine and analysis of protec-tion against an intranasal lethal challenge with Streptococcus pneumoniae. Microb. Pathog. 53, 243–249 (2012)

87. van Asseldonk M., Rutten G., Oteman M., Siezen R.J., de Vos W.M., Simons G.: Cloning of usp45, a gene encoding a secreted protein from Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363. Gene, 95, 155–160 (1990)

88. van Roosmalen M.L., Kanninga R., El Khattabi M., Neef J., Audouy S., Bosma T., Kuipers A., Post E., Steen A., Kok J. et al.: Mucosal vaccine delivery of antigens tightly bound to an adjuvant particle made from food-grade bacteria. Methods, 38, 144–149 (2006)

89. Vandenbroucke K., Hans W., Van Huysse J., Neirynck S., Demet-ter P., Remaut E., Rottiers P., Steidler L.: Active delivery of tre-foil factors by genetically modified Lactococcus lactis prevents and heals acute colitis in mice. Gastroenterology, 127, 502–513 (2004)

90. Villena J., Medina M., Racedo S., Alvarez S.: Resistance of young mice to pneumococcal infection can be improved by oral vacci-nation with recombinant Lactococcus lactis. J. Microbiol. Immunol. Infect. 43, 1–10 (2010)

91. Villena J., Medina M., Raya R., Alvarez S.: Oral immunization with recombinant Lactococcus lactis confers protection aga-inst respiratory pneumococcal infection. Can. J. Microbiol. 54, 845–853 (2008)

92. Villena J., Oliveira M.L., Ferreira P.C., Salva S., Alvarez S.: Lactic acid bacteria in the prevention of pneumococcal respiratory infection: future opportunities and challenges. Int. Immunopharmacol. 11, 1633–1645 (2011)

93. Watterlot L., Rochat T., Sokol H., Cherbuy C., Bouloufa I., Lefe-vre F., Gratadoux J.J., Honvo-Hueto E., Chilmonczyk S., Blugeon S. et al.: Intragastric administration of a superoxide dismutase--producing recombinant Lactobacillus casei BL23 strain attenu-ates DSS colitis in mice. Int. J. Food Microbiol. 144, 35–41 (2010)

94. Wegmann U., O’Connell-Motherway M., Zomer A., Buist G., Shearman C., Canchaya C., Ventura M., Goesmann A., Gasson M.J., Kuipers O.P. et al.: Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. J. Bacteriol. 189, 3256–3270 (2007)

95. Wieczorek A.S., Martin V.J.: Engineering the cell surface display of cohesins for assembly of cellulosome-inspired enzyme com-plexes on Lactococcus lactis. Microb. Cell Fact. 9, 69 (2010)

96. Zadravec P., Mavric A., Bogovic Matijasic B., Strukelj B., Berlec A.: Engineering BmpA as a carrier for surface display of IgG-binding domain on Lactococcus lactis. Protein Eng. Des. Sel. 27, 21–27 (2014)

97. Zeuthen L.H., Fink L.N., Frokiaer H.: Epithelial cells prime the immune response to an array of gut-derived commensals towards a tolerogenic phenotype through distinct actions of thymic stromal lymphopoietin and transforming growth fac-tor-beta. Immunology, 123, 197–208 (2008)

98. Zhang L., Li N., Caicedo R., Neu J.: Alive and dead Lactobacillus rhamnosus GG decrease tumor necrosis factor-alpha-induced interleukin-8 production in Caco-2 cells. J. Nutr. 135, 1752–1756 (2005)

99. Zocco M.A., dal Verme L.Z., Cremonini F., Piscaglia A.C., Nista E.C., Candelli M., Novi M., Rigante D., Cazzato I.A., Ojetti V. et al.: Efficacy of Lactobacillus GG in maintaining remission of ulcerative colitis. Aliment. Pharmacol. Ther. 23, 1567–1574 (2006)


* Autor korespondencyjny: Zakład Zoologii, Katedra Biologii Środowiska Zwierząt, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w War-szawie, ul. Ciszewskiego 8, 02-786 Warszawa; tel. 663 777 860; e-mail: [email protected]

BAKTERIE XENORHABDUS I PHOTORHABDUS,NICIENIE ENTOMOPATOGENICZNE I OWADY

– FUNKCJONOWANIE W ZŁOŻONYMUKŁADZIE SYMBIONT – PASOŻYT – ŻYWICIEL

Kornelia Kucharska1*, Dariusz Kucharski2, Barbara Zajdel3

1 Zakład Zoologii, Katedra Biologii Środowiska Zwierząt, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie2 Zakład Ekologii, Instytut Zoologii, Uniwersytet Warszawski

3 Pracownia Pszczelnictwa, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

Wpłynęło w listopadzie 2014 r.

1. Wprowadzenie. 2. Powstawanie pasożytnictwa nicieni u owadów. 3. Funkcjonowanie układu nicienie entomopatogeniczne – bakterie mutualistyczne – owady. 4. Mechanizmy odpornościowe owadów. 4.1. Odporność fizjologiczna: behawioralna. 4.2. Odporność fizjologiczna: bariery anatomiczno-fizjologiczne. 4.3. Odporność nabyta: polipeptydy i białka odpornościowe. 4.4. Odporność wewnętrzna: komórkowa i humoralna. 5. Mechanizmy odpornościowe nicieni entomopatogenicznych i mutualistycznych bakterii. 6. Podsumowanie

Bacteria Xenorhabdus and Photorhabdus, entomopathogenic nematodes and insects – their rolein the complex symbiont-parasite-host relationship

Abstract: Bioinsecticides based on nematodes are becoming increasingly popular agents for pest control. Nematodes used in these insecticides owe their properties to the presence of symbiotic bacteria. Representatives of two genera – Xenorhabdus and Photorhabdus can be found in the digestive tracts of, respectively, Steinernematidae and Heterorhabditidae nematodes. Nematodes have a number of properties, allowing them to penetrate the host integument, breaking the immune defenses, multiplicating in his body, killing the host and finally producing invasive forms, viable in the external environment. Bacterial symbionts are responsible for some of these abilities, since they produce toxins lethal to the victim and maintain adequate conditions for the development of their vectors. The bacteria are an example of one organism living in another as a symbiont, and functioning as a pathogen for another one. The relationship nematodes-mutualistic bacteria-insect is formed. The immune system has the ability to fight against insect entomopathogens, however, a variaty of adaptation mechanisms of parasites and symbionts, molecular mimicry and destruction of phagocytic cells among others, enables them to survive in the host. With an effective biocidal properties, nematodes which are in a mutualist relationship with bacteria, become perfect and safe for use in the environment pest control agents . Transgenic plants producing Xenorhabdus and Photorhabdus toxins can be as effective as those producing Bacillus thuringiensis toxins.

1. Introduction. 2. The emergence of nematode parasitism in insects. 3. System functioning of entomopathogenic nematodes-mutualistic bacteria-insects. 4. Defense mechanisms of insects. 4.1. Physiological resistance: behavioral aspect. 4.2. Physiological resistance: anatomical-physiological barriers. 4.3. Acquired immunity: polypeptides and immune proteins. 4.4. Internal resistance: cellular and humoral factors. 5. Immune mechanisms of entomopathogenic nematodes and mutualist bacteria. 6. Summary

Słowa kluczowe: bakterie mutualistyczne, bioinsektycyd, nicienie entomopatogeniczne, reakcje odpornościowe owadaKey words: mutualist bacteria, bioinsecticide, entomopathogenic nematodes, insect immune system

1. Wprowadzenie

Już w XVIII wieku, szwedzki przyrodnik, Karol Linneusz stwierdził, że wszystkie owady – szkodniki mają swoich wrogów [6, 7]. Naturalne zarażenia owadów przez nicienie entomopatogeniczne znane są w Europie już od roku 1923. Pasożyty te i związane z nimi symbio-tyczne bakterie Xenorhabdus i Photorhabdus odgrywają ważną rolę w naturalnej redukcji populacji szkodliwych owadów nie tylko w uprawach rolnych i ogrodniczych, ale również w magazynach i pomieszczeniach hodow-lanych w różnych regionach świata [42].

Pierwszym biopreparatem, opartym na bazie orga-nizmów żywych, był Skeeter Doom. Środek ten poja-wił się na rynku amerykańskim w 1976 i przeznaczony był do zwalczania komarów. Preparat zawierał nicienie

Romanomermis culicivorax. Obecnie na świecie jest kil-kadziesiąt zarejestrowanych biopreparatów opartych na bazie różnych gatunków i szczepów nicieni entomo-patogenicznych oraz ich bakterii mutualistycznych. Nicienie te należą do dwóch rodzin: Steinernematidae i Heterorhabditidae [25, 53, 89]. Przykładowymi pre-paratami zawierającymi nicienie entomopatogeniczne Steinernema feltiae i Heterorhabditis bacteriophora są odpowiednio: Nemaplus (Firma E-nema, Niemcy), Entonem (KOPPERT, Holandia) oraz Larvanem (KOPPERT), Nematop (Firma E-nema). Biopreparat Owinema był produkowany w Polsce przez kilkanaście lat od 1994 roku przez Przedsiębiorstwo Ogrodnicze OWIPLANT Spółka z o.o. w Owińskach koło Poznania. Przeznaczony był on głównie do zwalczania ziemiórek w uprawach szklarniowych i w pieczarkarniach.

BAKTERIE XENORHABDUS I PHOTORHABDUS, NICIENIE ENTOMOPATOGENICZNE I OWADY 155

Każdego roku rośnie liczba dostępnych na rynku bioinsektycydów. Związane jest to m.in. z ogranicze-niem lub zakazem stosowania środków chemicznych niebezpiecznych dla środowiska, uruchomieniem w wielu krajach produkcji preparatów biologicznych, finansowaniem programów badawczych w ramach UE oraz uproszczeniami podczas rejestracji bioprepara-tów (np. program REBECA – Regulation of Biological Control Agents) [49, 89, 90]. W licznych przypadkach nicienie entomopatogeniczne stały się alternatywą dla insektycydów chemicznych [95].

Nicienie entomopatogeniczne i związane z nimi symbiotyczne bakterie są przedmiotem licznych badań m.in. parazytologów, mikrobiologów, immunobiolo-gów, genetyków, biochemików. Powstało wiele szcze-gółowych i interdyscyplinarnych prac dotyczących nicieni oraz towarzyszących im bakterii Xenorhabdus i Photorhabdus. Celem niniejszej pracy jest uporządko-wanie wiedzy z ostatnich, kilkunastoletnich badań nad działaniem złożonego układu: nicienie entomopatoge-niczne – mutualistyczne bakterie – owady oraz poka-zanie nowych możliwości praktycznego wykorzystania bakterii związanych z nicieniami.

2. Powstawanie pasożytnictwa nicieni u owadów

Według różnych danych literaturowych pasożyty stanowią od 20 do 70% wszystkich opisanych gatun-ków zwierząt [59, 69]. W grupie nicieni 50% to gatunki pasożytnicze [66]. Ewolucję nicieni od form saprofa-gicznych i bakteriofagicznych do pasożytów roślin i zwierząt ilustrują stosunki panujące wśród nicieni żyjących w glebie. Występują tam gatunki dwuśrodo-wiskowe, przebywające w glebie i odżywiające się mar-twą materią organiczną, czasami wnikające również do tkanek roślinnych i zwierzęcych, którymi żywią się oraz we wnętrzu których rozmnażają się (pasożytnic-two fakultatywne). Prawdopodobnie ewolucja pasożyt-nictwa nicieni entomopatogenicznych była podobna, z tą różnicą, że przebiegała ona w środowisku wod-nym, np. w mule dennym, w kale zwierząt – będącymi jednocześnie środowiskiem życia nicieni i owadów [73, 77, 85]. Optymalne do tego warunki istniały nie tylko w glebie i mule, ale również pod korą drzew [77]. Nicienie stopniowo zasiedlały ciało owadów wchodząc przez jego naturalne otwory. Początkowo docierały do powłok ciała, potem do bardziej dostępnych narządów np. narządów płciowych oraz jamy ciała [6].

Wśród nicieni entomopatogenicznych wyróżnia się trzy rodzaje pasożytnictwa:

a) pasożytnictwo fakultatywne,b) pasożytnictwo obligatoryjne: – pasożyty obligatoryjnie nieletalne, – pasożyty obligatoryjnie letalne,

c) pasożytnictwo związane z mutualistycznymi bakteriami.

Nicienie entomopatogeniczne (EPN) to różne gatunki nicieni, które podczas swojego rozwoju wykazują cechy patogeniczności w stosunku do wybranych grup stawonogów, zwłaszcza owadów. Nicienie te są zdolne do wnikania do ciała żywiciela, ale ich cykl życiowy nie jest zsynchronizowany z cyklem rozwojowym owada. Ich rozwój zachodzi w hemocelu i tkankach żywiciela. Śmierć owada jest spowodowana uwalnianymi z prze-wodu pokarmowego nicieni, bakteriami. Nicienie ento-mopatogeniczne pełnią rolę „żywej strzykawki”. Należą do nich gatunki z rodzin Steinernematidae i Hetero-rhabditidae [13].

Droga od saprofagii i bakteriofagii do pasożytnictwa w ciele owadów była długa. Wejście w symbiotyczny związek z bakteriami spowodowało powstanie układu zwanego pasożytnictwem pośrednim. W trakcie ewo-lucji nicienie entomopatogeniczne rozwinęły liczne przystosowania do pasożytnictwa wewnętrznego [75, 76]. Zmieniał się również sposób zasiedlania żywiciela. Początkowo pasożyty penetrowały otwór odbytowy, jelito tylne i środkowe, potem stopniowo opanowały pozostałe narządy wewnętrzne i hemocel [74, 77].

3. Funkcjonowanie układu nicienie entomopatogeniczne – bakterie mutualistyczne – owady

Larwy nicieni entomopatogenicznych żyją w mu - ualistycznym związku z Gram-ujemnymi bakteriami z rodziny Enterobacteriacae. Bakterie te zainteresowały badaczy ze względu na możliwość wykorzystania tych organizmów w biologicznych metodach zwalczania różnych gatunków szkodników. Badania da Silva i in. [23] pokazały, że możliwe jest zabicie larw komarów samymi bakteriami, bez obecności ich zwierzęcych wektorów. Szczególnie wysoką śmiertelność, sięgającą ponad 70%, uzyskano w wyniku działania Photorhabdus luminescens. Uważa się, że w przyszłości geny bak-terii Xenorhabdus i Photorhabdus będą wykorzystywane do tworzenia roślin genetycznie zmodyfikowanych odpornych na szkodniki oraz że zastąpią toksynę Bt pochodzącą z Bacillus thuringiensis (Berliner 1915) [23, 29, 35, 45, 46, 50]. Rośliny transgeniczne, syntetyzujące toksyny wytwarzane przez Xenorhabdus nematophila charakteryzują się wysoką odpornością na żerowanie foliofagów. Owady atakujące liście uzyskiwały mniejszą masę ciała, a więc i szansę na zamknięcie cyklu rozwo-jowego, o ok. 90% w stosunku do grupy kontrolnej. Ich śmiertelność była również wyższa [50].

Symbiotyczne bakterie z rodzaju Xenorhabdus zasiedlają pęcherzyk jelitowy (ventriculus) nicienia z rodziny Steinernematidae, natomiast bakterie z rodzaju Photo rhabdus zasiedlają jelito nicienia z rodziny

156 KORNELIA KUCHARSKA, DARIUSZ KUCHARSKI, BARBARA ZAJDEL

Hetero rhabditidae [2, 17, 18, 20, 44, 51, 86]. W Tabeli I przedstawiono przykładowe gatunki bakterii występu-jące u określonych gatunków i szczepów EPN [2, 3, 44, 70].

Bakterie te należą do Gram-ujemnych pałeczek, które nie tworzą spor i są fakultatywnie tlenowe. Wystę-pują pojedynczo, w parach lub tworzą łańcuchy. Mikro-organizmy te korzystają z nicieni jako wektorów, za pomocą których przenoszone są do organizmu owada (rys. 1) [16, 55, 61, 85].

Cykl rozwojowy nicieni entomopatogenicznych i przenoszonych przez nie bakterii trwa: 10–14 dni (Steinernematidae) i 10–16 dni (Heterorhabditidae) [14, 47, 70]. Nicienie entomopatogeniczne przechodzą przez cztery stadia larwalne, przy czym trzecie stadium (L3) u Steinernematidae oraz drugie (L2) i trzecie (L3) u Heterorhabditidae to wolnożyjąca larwa (larwa inwa-zyjno-przetrwalnikowa, IJ3) bytująca w glebie [21, 69]. Stadium inwazyjno-przetrwalnikowe posiada w prze-wodzie pokarmowym symbiotyczne bakterie (od 200 do 2000 komórek bakteryjnych) i nie pobiera pokarmu. Larwy nicieni mają niedrożny otwór gębowy i odby-towy, uwstecznioną torebkę gębową oraz zamkniętą gardziel. Źródłem energii, na tym etapie rozwoju, są substancje zapasowe zgromadzone wcześniej w komór-kach jelita i gruczołach hypodermalnych [67, 84].

Po odnalezieniu potencjalnego żywiciela – zwykle owada, nicienie wnikają do jego ciała przez przetchlinki, otwór pokarmowy i odbytowy, zranienia oraz przez miękki oskórek okrywający ciało [12, 47, 54, 57, 62, 63, 81]. U nicieni entomopatogenicznych stwierdzono także bierną transmisję, wraz z pokarmem lub wodą

[77]. Nicienie z rodzaju Steinernema wchodzą do żywi-ciela przeważnie przez jego naturalne otwory. Mogą one także wydzielać enzymy, które częściowo rozpuszczają chitynowy oskórek, co pozwala im na wniknięcie przez kutykulę. Nicienie z rodzaju Heterorhabditis, wyposa-żone w ząb kutykularny, przebijają przegrody między-segmentalne kutykuli, miejsca połączeń stawowych szczęk i odnóży owada [1, 47, 54, 67]. Sposób wnikania zależy od wielkości i kształtu otworów oraz stadium rozwojowego owadów. H. zealandica najczęściej docie-rają do wnętrza Popilia japonica przez oskórek i prze-tchlinki [16, 47, 54, 67, 92]. Głównymi miejscami doce-lowymi pasożytów w organizmie owada są: jelito, jama ciała, układ rozrodczy i cewki Malpighiego [41].

Nicienie entomopatogeniczne uwalniają proteinazy, które osłabiają układ odpornościowy żywiciela poprzez inhibicję białek AMP niszczących patogeny. W ten spo-sób stwarzają środowisko, korzystne do zasiedlenia przez bakterie [16, 36, 50, 92]. Czas uwolnienia symbio-tycznych bakterii zależy m. in. od gatunku zarażonego owada. X. nematophila jest uwalniany w organizmie Manduca sexta po 2 godzinach od momentu wniknięcia nicieni [83], a w ciele Popillia japonica po 4–8 godzi-nach [91]. Uwolnienie bakterii Xenorhabdus spp. (od 10 do 200 komórek) [5, 17, 68] do hemolimfy żywiciela odbywa się na drodze defekacji [57, 61], z kolei bakterie Photorhabdus spp. wydostają się przez otwór gębowy [18]. W przypadku S. carpocapsae liczba uwolnio-nych komórek X. nematophila wyniosła od 30 do 200 [17]. Niepobierające pokarmu stadium L3 przechodzi w stadium L4, które jest zdolne do odżywiania się.

P. luminescens (Thomas i Poinar, 1979) Boemare i in., 1993 H. bacteriophora, H. megidis, H. marelatusP. luminescens podgat. akhurstii Fischer-Le Saux i in., 1999 H. indicaP. luminescens podgat. kayaii Hazir i in., 2004 H. bacteriophoraP. luminescens podgat. laumondii Fischer-Le Saux i in., 1999 H. bacteriophora HP88P. luminescens podgat. thracensis Hazir i in., 2004 H. bacteriophoraP. temperata Fischer-Le Saux i in., 1999 H. zealandica, H. bacteriophora NC1, H. megidis (szczep neoarktyczny)P. temperata podgat. temperata Fischer-Le Saux i in., 1999 H. megidis (szczep palearktyczny)

Tabela IPrzykłady występowania bakterii u EPN

Gatunek bakterii z rodzaju Xenorhabdus Gatunek/szczep nicienia entomopatogenicznegoz rodzaju Steinernema

X. bovienii (Akhurst, 1983) Akhurst i Boemare (1993) S. affine, S. feltiae, S. intermedium, S. krausseiX. budapestensis Lengyel i in., 2005 S. bicornutumX. ehlersii Lengyel i in., 2005 S. longicaudumX. innexi Lengyel i in., 2005 S. scapterisciX. nematophila (Poinar i Thomas, 1965) Thomas i Poinar (1979) S. carpocapsaeX. poinarii (Akhurst, 1983) Akhurst i Boemare (1993) S. cubanum, S. glaseriX. stockiae Tailliez i in., 2006 S. siamkayaiX. szentirmaii Lengyel i in., 2005 S. rarum

Gatunek bakterii z rodzaju Photorhabdus Gatunek/szczep nicienia entomopatogenicznegoz rodzaju Heterorhabditis


Proces ten nosi nazwę „recovery” i jest stymulowany przez sygnały chemiczne pochodzące z hemolimfy żywiciela oraz pochodzące od mutualistycznych bak-terii. Bodźce chemiczne odbierane są przez receptory znajdujące się na powierzchni ciała nicieni [22, 26, 43]. Po uwolnieniu bakterii, które są swoistym czynni-kiem stymulującym, następuje dalszy rozwój nicienia a bakterie odżywiające się tkankami martwego owada namnażają się intensywnie. Z kolei nicienie odży- wiają się głównie obumarłymi bakteriami oraz rozkła-danymi pod wpływem bakterii tkankami owada [14, 27, 41]. W ciągu kolejnych 10–48 godzin owad prze- staje pobierać pokarm i ginie zabity przez egzoenzymy, metaloproteiny i kompleksy toksyn bakteryjnych [23, 27, 28, 41, 65, 70, 96]. Stwierdzono, że uwolnienie 1–3 komórek bakteryjnych do hemocelu może dopro-wadzić do śmierci owada [10, 77].

Śmierć owada następuje na skutek zakażenia ogól-no ustrojowego podczas którego dochodzi do utraty wody, pozbawienia składników odżywczych i uszko-dzeń mechanicznych. Objawy zarażenia owada to pobudzenie lub zwolnienie motoryczne, konwulsje, zmiana zabarwienia i obrzęk ciała, paraliż i w rezultacie śmierć [41, 58, 82]. Wniknięcie do ciała owada nawet jednej larwy inwazyjnej może być śmiertelne [77].

U larw nicieni w stadium L4 z drożnym układem pokarmowym, zaczyna rozwijać się układ rozrodczy. W kolejnym etapie rozwoju nicienie osiągają dojrzałość płciową (w temperaturze 22–25°C, trwa to ok. 3–4 dni od momentu zasiedlenia owada) [78]. Nicienie pokole-nia pasożytniczego, w przypadku rodziny Steinernema-tidae to generacja złożona z samic i samców, czyli poko-lenie amfimiktyczne, a u rodziny Heterorhabditidae z osobników hermafrodytycznych. W obrębie rodzaju Steinernema, wyjątkiem jest gatunek S. hermaphroditum, u którego w czasie rozwoju również występują hermafrodyty [4].

Dojrzałe płciowo osobniki „olbrzymie” osiągają rozmiary ciała rzędu 6–18 mm długości (samice) i 3,5–3 mm długości (samce) [14, 67]. Samice charak-teryzują się wysoką płodnością. Jedna samica składa od 1500 do 15000 jaj. Z jaj rozwija się druga generacja nicieni i kończy się tym samym okres rozwoju nazy-wany pasożytniczym, a rozpoczyna okres rozwoju saprobiotycznego. Generacja saprobiotyczna odżywia się martwą materią organiczną. Liczba pokoleń rozwi-jających się w organizmie owada zależy od ilości zaso-bów pokarmowych. Przy niewielkim zagęszczeniu, samice pierwszego pokolenia składają więcej jaj, przy czym część z nich rozwija się w ich macicy. Zjawisko to nazywane jest endotokia matricida. Nicienie stadium L1 po opuszczeniu jaj odżywiają się najpierw narządami rodnymi, a potem pozostałymi wnętrznościami samicy, co doprowadza do jej śmierci. W tym czasie przechodzą one jeszcze jedno lub dwa linienia i jako larwy L2 lub L3

wychodzą z ciała martwej samicy do hemocelu owada. Z jaj złożonych przez samice „olbrzymie” w ciele owada rozwijają się kolejno stadia L1, L2, L3. Stadium IJ3 może już opuścić ciało żywiciela. W zależności od ilości dostępnego pokarmu może pojawić się również kolejne pokolenie samic i samców „małych” („normalnych”). W przypadku obu omawianych rodzin nicieni drugie pokolenie jest rozdzielnopłciowe. Rozmiary „małych” samic i samców wynoszą odpowiednio 0,7–3,5 mm i 0,7–1,6 mm długości. Samice drugiego pokolenia są mniej płodne i składają ok. 200 jaj. Podczas wyczerpy-wania się pokarmu większość jaj rozwija się w macicach samic nicieni drugiego pokolenia. Wylęgają się z nich larwy L1, które zjadają wszystkie narządy wewnętrzne samicy, doprowadzając do jej śmierci. Przechodzą także jedno (u Heterorhabditidae) lub dwa linienia (u Steinernematidae) i opuszczają ciało samicy, prze-dostając się do hemocelu owada. Na tym etapie larwy inwazyjno-przetrwalnikowe pobierają komórki bak-teryjne do swojego przewodu pokarmowego, zanika torebka gębowa, a układ pokarmowy staje się nie-drożny. Po wyczerpaniu zapasów pokarmowych larwy opuszczają ciało owada i migrują do ziemi. Początkowo populacja wielostadialna, złożona ze wszystkich sta-diów rozwojowych nicieni przekształca się w popula-cję monostadialną, złożoną z jednego stadium rozwo-jowego nicieni, które opuszczają ciało martwego owada i migrują do gleby. IJ3 przenoszące mutualistyczne bak-terie aktywnie poszukują następnego żywiciela. Przy braku owadów żywicielskich w glebie, EPN mogą prze-trwać ok. 1,5 roku, nie tracąc zdolności inwazyjnych. W rzadkich przypadkach, w ciele owada rozwija się jeszcze trzecie pokolenie nicieni. Zjawisko to związane jest z dostępnością zasobów pokarmowych w organiz-mie żywiciela [2, 4, 13, 14, 17, 19, 71, 77].

Ciało martwego owada nie rozkłada się szybko, gdyż nie rozwijają się w nim inne gatunki mikroorga-nizmów. Spowodowane jest to obecnością substancji antybiotycznych (pochodne stilbenów, furanu i fenoli, bakteriocyny – limicyna i ksenorabdicina), które ha- mują rozwój grzybów, bakterii gnilnych oraz chronią przed padlinożercami. Ponadto bakterie Xenorhabdus sp. i Photorhabdus sp. stanowią silną konkurencję dla innych mikroorganizmów [2, 8, 34, 37, 80, 87]. Ciało owada początkowo jest zmumifikowane (gumowate i czerwone), z upływem czasu ciemnieje, staje się miękkie i kleiste, aż w końcu ulega rozpadowi [33]. W przypadku braku symbiotycznych bakterii nicie-nie entomopatogeniczne mogą zarażać owady, ale nie mogą się rozmnażać lub liczba osobników potomnych jest nieduża. Takie, pozbawione symbiontów nicienie nazywamy formami aksenicznymi [16, 36, 47, 93].

Migracja larw do gleby może zostać zatrzymana podczas niekorzystnych warunków środowiskowych (niska temperatura i wilgotność podłoża). Okres


wstrzymania wędrówki może wynosić 50 dni [11]. Larwy inwazyjno-przetrwalnikowe mogą również prze-chodzić w stan diapauzy, która może trwać 3 lata [88].

Bakterie z rodzajów Xenorhabdus i Photorhabdus występują w dwóch fenotypach. Bakterie fazy pierw-szej (pierwotnej) są mniejsze (3–4 µm długości) i pro-dukują większą ilość toksyn, enzymów sekrecyjnych (proteazy, lipazy, fosfolipazy), antybiotyków, pigmen-tów i białek membranowych OpnB. Ich kolonie najczęś-ciej mają kształt kolisty lub jajowaty o nieregularnych brzegach, są śluzowate, wypukłe o barwie oliwkowej z jaśniejszą otoczką, posiadają inkluzje. Larwy inwa-zyjno-przetrwalnikowe nicieni (IJ3) transportują i przechowują tylko bakterie z fazy pierwszej. Bakterie pierwotne obecne są w ciele owada do kilku godzin od momentu uwolnienia, potem przekształcają się w formę wtórną. Bakterie fazy I stymulują reprodukcję nicieni w organizmie owada. Rola bakterii fazy II (wtórnej) nie została jeszcze dokładnie określona, ale może to być mechanizm adaptacji tych bakterii do środowiska zewnętrznego – glebowego. Są one w stanie przeżyć poza organizmem owada i nicienia. Bakterie fazy II są większe (6–7 µm długości) i nie produkują enzymów oraz antybiotyków. Ich kolonie są płaskie o barwie czer-wono-brązowej, bez jasnej otoczki i charakteryzują się nieregularnymi krawędziami, nie są śluzowate, posia-dają niewiele inkluzji. U kilku gatunków Xenorhabdus

stwierdzono przemianę z formy wtórnej w formę pier-wotną. Takiego zjawiska nie zaobserwowano natomiast u gatunku P. luminescens [30, 38]. Występowanie dwóch fenotypów jednego gatunku bakterii jest przykładem zjawiska, kiedy jeden organizm żyje w innym jako sym-biont, a funkcjonuje jako patogen dla drugiego organi-zmu. Powstaje układ nicień – mutualistyczna bakteria – owad [14, 24].

4. Mechanizmy odpornościowe owadów

Życie w środowisku glebowym, w którym pasożyty stanowią dużą część fauny wpłynęło na pojawienie się u owadów szeregu mechanizmów odpornościowych [21, 32]. Owady w toku ewolucji rozwinęły skuteczne strategie zwiększające szanse ich przeżycia i ochronę przed nicieniami entomopatogenicznymi związanymi z bakteriami. Odporność owadów można podzielić na kilka rodzajów:

1. Odporność fizjologiczna: a) behawioralna b) bariery anatomiczno-fizjologiczne2. Odporność nabyta: a) polipeptydy i białka odpornościowe3. Odporność wewnętrzna: a) komórkowa i humoralna [31, 32, 41, 52].

Rys. 1. Cykl życiowy bakterii towarzyszących nicieniom entomopatogenicznym (fot. K. i D. Kucharscy)

Nicienie (stadium IJ3)wnikają do ciała owada

i uwalniają bakterie.

Bakterie produkują toksyny i enzymysekrecyjne, które zabijają gospodarza

i rozkładają jego tkanki.

Nicienie (stadium IJ3)przenoszą bakterie

do następnego owada.

Nicienie (stadium IJ3) z bakteriami w jelicieopuszczają ciało owada.

Bakterie namnażają się i odżywiająszczątkami owada.

Nicienie rozmnażają się w ciele martwegoowada i odżywiają się jego tkankami, rozłożonymi

przez bakterie oraz obumarłymi bakteriami.

Cykl życiowymutualistycznych

bakterii


4.1. Odporność fizjologiczna: behawioralna

Specyficzne zachowania owadów często nie sprzy-jają inwazji pasożytniczej. Wysoki współczynnik defe-kacji u larw żukowatych ogranicza ryzyko zarażenia przez otwór odbytowy. Intensywne ocieranie otworu gębowego u pędraków oraz unikanie nicieni poprzez ucieczkę są często spotykane wśród entomofauny glebowej. Do szczególnych zjawisk można zaliczyć budowanie ścian oddzielających zarażone osobniki od zdrowych współmieszkańców u termitów, formowa-nie kokonów, oprzędów oraz osłonek z ziaren podłoża [31, 41, 47, 48, 57]. Poczwarki Lepidoptera i bobówki Diptera są w mniejszym stopniu podatne na zarażenie. W przypadku poczwarek Ostrinia nubilalis tylko 30% było zarażonych nicieniami S. carpocapsae, w porówna-niu ze 100% zarażeniem larw i imagines [56]. Podobne wyniki uzyskano w przypadku barciaka większego [72]. Różne osłonki i oprzędy stanowią mechaniczne bariery, które utrudniają zarażenie ofiar [64].

4.2. Odporność fizjologiczna: bariery anatomiczno-fizjologiczne

Ten typ obrony można zaliczyć do tzw. odporności mechanicznej przeciw inwazyjnej. Celem odporności fizjologicznej jest niedopuszczenie entomopatoge-nów do jamy ciała. Ciało owada osłonięte jest przez szkielet zewnętrzny. Komórki jednowarstwowego nabłonka leżącego na błonie podstawowej wytwa-rzają trójwarstwowy oskórek (kutykulę). Najbardziej wewnętrzna warstwa (endokutykula) zbudowana jest głównie z chityny (od 14 do 60%) i białek. Warstwa środkowa (egzokutykula) jest zbudowana ze sklerotyny i chityny, natomiast najcieńsza, zewnętrzna warstwa (epikutykula) jest utworzona z kutykuliny oraz sub-stancji o właści wościach tłuszczowców. U niektórych gatunków kutykula pokryta jest jeszcze warstwą wosku. Na powierzchni ciała niektórych owadów, dodatkowo odkładane są również białka o właściwościach przeciw-bakteryjnych i przeciwgrzybiczych. Oskórek stanowi twardą, nierozpuszczalną, chemicznie dość odporną barierę ochronną przed pasożytami [31, 41, 60].

Jelito przednie i tylne posiada wyściółkę chitynową, która chroni przed przedostaniem się pasożytów i pato-genów do jamy ciała. Z kolei jelito środkowe zaopa-trzone jest w błonę perytroficzną, zbudowaną z chityny, białek, mukopolisacharydów i substancji podobnych do kwasu hialuronowego a nabłonek pokryty warstwą śluzu. Substancje te uniemożliwiają przemieszczanie się wirusów, bakterii i pasożytów. Działanie chemiczne hamujące rozwój patogenów mają: pH treści jelitowej, substancje antybiotyczne oraz enzymy bakteriolityczne wytwarzane przez symbiotyczną mikroflorę jelitową

owada. Otwór gębowy jest wąski, silnie umięśniony, zaopatrzony w chitynowe filtry i różnego rodzaju wąsy hamujące wnikanie pasożytów do środka. Otwór odby-towy jest zaciśnięty przez mięśnie, a przetchlinki są wąskie, pokryte szczecinami i włoskami. Układ tchaw-kowy oprócz obecności chitynowych sit charakteryzuje się niską wilgotnością i brakiem substancji pokarmo-wych, co stwarza niekorzystne warunki do kolonizacji organizmu owada i rozwoju patogenów [15, 40, 52].

Także przegrody międzysegmentalne są grube i gęste. Przełamanie tych barier następuje tylko przy współpracy nicieni i bakterii. Wspólnie produkują one enzymy chitynolityczne i dezaktywujące owadzie białka, co tworzy wrota zarażenia. Uszkodzenie pierwszej linii obrony aktywuje mechanizmy obrony wewnętrznej owada [31, 32, 41, 47, 57].

4.3. Odporność nabyta: polipeptydy i białka odpornościowe

Do najważniejszych polipeptydów i białek odpor-nościowych należą: cekropiny, i attacyny. Cekropiny niszczą bakterie Gram-ujemne. Cząsteczki cekropin są syntetyzowane pod wpływem sygnału pochodzą-cego z hemocytów wypełnionych sfagocytowanymi bakteriami, które po kontakcie z komórkami ciała tłuszczowego pobudzają je do syntezy mRNA odpor-nościowego, który z kolei aktywuje szereg reakcji kata-lizujących powstanie cekropin. W usuwaniu patogenów istotną rolę odgrywają również attacyny. Ich działanie jest słabsze niż działanie cekropin oraz dotyczy tylko komórek będących w fazie wzrostu, natomiast komórki fazy spoczynkowej są niewrażliwe. Attacyny osłabiają ścianę komórkową patogenów, czyniąc ją bardziej wraż-liwą na działanie cekropin i lizozymu [9, 15, 21, 52].

4.4. Odporność wewnętrzna: komórkowa i humoralna

Po rozpoznaniu ciał obcych organizm ofiary uru-chamia natychmiast reakcję odpornościową. Bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne są rozpoznawane przez białka PGRP (peptidoglycan recognition proteins) oraz GNBP (Gram-negative binding protein) wykrywające obecność składników ściany komórkowej mikro-organizmów – peptydoglikanu, lipopolisacharydu [16, 52]. Następuje interakcja czynników komórkowych i humoralnych. Uruchomiona zostaje kaskada reakcji obronnych w celu przywrócenia równowagi organizmu. Odróżnienie substancji obcej od składników własnych możliwe jest przy współpracy różnych typów krwinek, głównie plazmocytów i hemocytów ziarnistych. Głów-nymi zadaniami hemocytów są: pinocytoza, fagocytoza, nodulacja, inkapsulacja, melanizacja, koagulacja krwi,


detoksykacja organizmu oraz gojenie ran [31, 32, 39]. Jako pierwsza zostaje aktywowana odporność komór-kowa. Procesami wchodzącymi w jej zakres są: fago cy-toza, obronne odczyny hemocytarne: nodulacja, segre-gacja, inkapsulacja.

a) Fagocytoza:Jest to najstarszy filogenetycznie sposób obrony.

Mechanizm fagocytozy można podzielić na kilka eta-pów: rozpoznanie substancji jako obcej dla organizmu (receptory na błonach wyspecjalizowanych komó-rek rozpoznają substancje obce), chemotaksja – ruch w kierunku patogenu, przyłączenie obcej substancji do receptora błony fagocytu, pochłanianie na drodze endocytozy, powstanie fagolizosomu wewnątrz którego zachodzą procesy trawienne. W wyniku fagocytozy dochodzi do strawienia obcej substancji przez specy-ficzne komórki owada (hemocyty fagocytujące obda-rzone ruchem ameboidalnym – plazmocyty i granulo-cyty) lub jej odłożenia w wakuolach pełniących funkcję „zbiorników odpadów”. Liczba hemocytów rośnie wraz ze wzrostem liczby uwolnionych do hemocelu owada bakterii mutualistycznych EPN. Fagocytoza jest sku-tecznym mechanizmem obronnym dopóki nie zosta-nie przekroczona liczba patogenów, której wartość jest indywidualna dla każdego gatunku.

b) Nodulacja:Po przekroczeniu pewnej określonej liczby pato-

genów fagocytoza jest wspomagana przez nodulację (tworzenie guzków). Komórki fagocytarne wypełnione obcym materiałem są otaczane kilkoma warstwami hemocytów, a następnie ulegają melanizacji (synteza barwnika – melaniny). Po melanizacji guzki izolują obce substancje od tkanek i płynów jamy ciała owada.

c) Segregacja:Wychwytywanie małych cząstek i przechowywanie

ich w nieruchomych komórkach osierdziowych.

d) Inkapsulacja:Drobne cząsteczki o średnicy poniżej 10 µm (wirusy,

bakterie) są fagocytowane przez pojedyncze hemocyty. Cząsteczki o średnicy przekraczającej 10 µm (pasożyty i ich jaja, strzępki grzybni) ulegają inkapsulacji (tworze-nie otoczek). Proces ten jest inicjowany przez hemocyty, które rozpoznają ciała obce, a następnie powlekają ich powierzchnię specyficznymi związkami chemicznymi oraz własną cytoplazmą komórkową (część hemocytów ulega lizie po kontakcie z pasożytami). Substancja obca wraz z otoczką hemocytarną tworzy kapsułę o trójwar-stwowej budowie:

– wewnętrzna warstwa przylegająca do pasożyta traci budowę komórkową i ulega melanizacji,

– warstwa martwych, pigmentowanych komórek,

– warstwa utworzona przez spłaszczone hemocyty oraz ściana otoczki z luźno ułożonych hemo-cytów.

Melanina inicjuje procesy przylegania ciał obcych do hemocytów poprzez pobudzenie owadzich komórek do wydzielania lepkich białek. Białka te pobudzają osia-dłe hemocyty oraz plazmocyty do migracji i tworzenia skupisk wokół pasożytów. Melanina również izoluje i konserwuje pasożyta, dzięki czemu jest on neutralny dla organizmu. Końcowym efektem jest sekwestra-cja pasożytów, czyli ich wychwycenie, transport oraz unieszkodliwienie. Inkapsulacja może mieć charakter komórkowy lub humoralny. Wyróżnia się trzy typy inkapsulacji w zależności od składników otoczki:

– inkapsulacja komórkowa niemelanotyczna, pod-czas której w procesie powstawania otoczki biorą udział hemocyty,

– inkapsulacja komórkowa melanotyczna, w której oprócz hemocytów uczestniczy melanina odkła-dana w ścianie otoczki,

– inkapsulacja humoralna, w której wokół pasoży-tów powstaje melanotyczna otoczka nie zawiera-jąca hemocytów.

Mechanizm inkapsulacji jest inicjowany pod wpły-wem czynników zranienia (injury factors), uwalnianych przez uszkodzone i patologicznie zmienione komórki żywiciela. Inkapsulacja występuje u owadów bardzo czę-sto, hamuje wzrost i rozwój larw pasożytów, uniemoż-liwia opuszczenie osłonek jajowych, a także uszkadza dorosłe pasożyty co powoduje ich śmierć. Zamieranie spowodowane jest brakiem tlenu i substancji pokarmo-wych oraz nagromadzeniem się zbędnych produktów przemiany materii o działaniu toksycznym. Czasami pasożyty nie są odporne na działanie ciśnienia osmo-tycznego panującego wewnątrz kapsuły i w hemolimfie owada (szok osmotyczny) [31, 32, 41, 47, 52, 57, 79].

Dodatkowo układ odpornościowy owada, w obec-noś ci pasożytów i patogenów, uruchamia kaskadę reak cji, które regulują przebieg melanizacji i koagula-cji krwi. Ponadto reakcje odpornościowe związane są z produkcją reaktywnych form tlenu (RFT, ROS) i azotu (RFA), które niszczą komórki bakteryjne powodując stres oksydacyjny i nitrozacyjny [16, 52].

W odróżnieniu od kręgowców, owady nie posiadają przeciwciał oraz pamięci immunologicznej, ale ich reakcje komórkowe i humoralne pojawiają się szybko i w krótkim czasie likwidują patogeny i pasożyty. Taki system zapewniają owadom antysomy oraz polipeptydy o właściwościach bakteriobójczych (przeciwbakteryjne indukowane czynniki hemolimfy), które wzbudzają reakcje odpornościowe [9]. W szczególności rozpozna-nie zakażenia mikrobiologicznego jest kontrolowane przez białka PRP (pattern recognition proteins), które wiążą się cząsteczkami produkowanymi przez bakterie, nicienie i grzyby [15].


Drugim typem odporności wewnętrznej jest odpor-ność humoralna. Uwarunkowana jest ona obecnością w hemolimfie białek AMP niszczących patogeny. Główną funkcję w tym typie odporności pełni lizo-zym. Synteza tego związku ma miejsce w ciele tłusz-czowym skąd przechodzi do hemolimfy. Lizozym wraz z białkami hemolimfy (cekropiny, attacyny, diptery-cyny, defensyny) niszczy komórki bakteryjne. Główną funkcją lizozymu jest rozszczepianie wiązań chemicz-nych endo-β (1,4) w mukopeptydzie lub w mukopoli-sacharydzie oraz usuwanie mureiny (składnik ściany komórkowej) bakterii głównie Gram-dodatnich, zabi-tych uprzednio przez cekropiny. Lizozym i cekropiny oczyszczają krew owada z patogenów [9, 16, 21].

Lizozym występuje również w szkielecie zewnętrz-nym. Istnieje zależność pomiędzy stężeniem lizozymu w oskórku a sposobem życia lub budową ciała owada. Owady z twardym szkieletem zewnętrznym zawierają niewielką ilość lizozymu, z kolei te z miękką okrywą ciała i bytujące w środowisku obfitym w bakterie posia-dają wysokie stężenia lizozymu w oskórku (larwy Lepi-doptera, Coleoptera i Diptera).

Pojawienie się odporności humoralnej w postaci przeciwciał jest stymulowane przez obecność antyge-nów (nicieni, bakterii). Przeciwciała wytwarzane przez owady to: lizyny – rozpuszczanie, ablastyny – hamo-wanie rozwoju i namnażania się, lektyny (aglutyniny) – sklejanie niebezpiecznych patogenów. Ciało owada w obecności toksyn bakteryjnych wytwarza także anty-toksyny [31, 41, 47, 57].

Mechanizmy obronne zależą od stanu fizjologicz-nego owadów. Najefektywniejsze są u osobników wy- cho dzących z diapauzy zimowej. W okresie zimy w gle-bie dochodzi do naturalnej redukcji populacji owadów, przy życiu utrzymują się więc tylko osobniki najsilniej-sze i najlepiej przystosowane [79].

Nie wszystkie jednak gatunki owadów są w takim samym stopniu podatne na zarażenie przez nicienie oraz infekcje bakteryjne. S. glaseri uśmierca Popillia japonia i Cyclocephala borealis odpowiednio w ciągu ok. 3 i 5 dni, od momentu penetracji. Natomiast H. bacteriophora te same owady uśmierca odpowiednio w ciągu 3 i 4 dni. Im więcej czasu upływa od wniknię- cia nicieni do ciała owada tym śmiertelność żywicieli jest wyższa [47].

5. Mechanizmy odpornościowe nicieni entomopatogenicznych i mutualistycznych bakterii

Zjadliwość (wirulencja) patogenów jest uwarun-kowana szeregiem właściwości przełamywania barier odpornościowych owadów, zdolnością szybkiego roz mnażania się oraz kolonizacji tkanek zarażonego organizmu [31, 41, 47, 54, 57]. Ucieczka nicieni ento-

mopatogenicznych związanych z mutualistycznymi bakteriami, spod kontroli immunologicznej owada możliwa jest dzięki istnieniu różnych mechanizmów odpornościowych. Mechanizmy przełamywania odpor-ności owadów mogą polegać na:

a) uszkadzaniu struktur owada przez toksyny i enzymy histolityczne syntetyzowane przez ento-mopatogeny. Różne substancje chemiczne mogą hamować obronę przeciwzakaźną żywiciela i zwy-kle kończą się jego śmiercią.

b) uniewrażliwieniu się nicieni i bakterii na czyn-niki odpornościowe owadów. Wiele owadów nie posiada mechanizmów immunologicznych sku-tecznie kontrolujących patogeny. Powierzchniowa warstwa kutykuli nicieni (epikutykula) zawiera białko-kutykulinę, które w połączeniu z lipidami jest niewrażliwe na działanie układu odpornoś-ciowego żywiciela.

c) niszczeniu lub modyfikacji składowych odpor-ności komórkowej i humoralnej owadów. Ucieczka spod kontroli immunologicznej moż-liwa jest dzięki istnieniu oporu biernego i czyn-nego pasożytów i patogenów [16, 31, 41, 57].

Główną funkcją oporu biernego jest zahamowanie odpowiedzi immunologicznej owada skierowanej prze-ciw patogenom. Do oporu biernego zaliczymy m.in. mimikrę molekularną (upodobnienie powierzchnio-wych struktur patogena, będących markerami swoisto-ści immunologicznej, do struktur owada), kolonizację regionów ciała owada o niskiej reaktywności, rozwój w narządach oddalonych od obszarów o dużej liczbie hemocytów, masowa inwazja [21, 31, 32, 41]. Zahamo-wanie reakcji komórkowej możliwe jest również dzięki obecności enzymów i toksyn pasożyta [10]. Niektóre metabolity pasożytów hamują proces inkapsulacji (supresja odpowiedzi inkapsulacyjnej) w jamie ciała owada oraz niszczą hemocyty. Pasożyty po inkapsula-cji potrafią również przeżyć w organizmie owada, ale ich wzrost i rozwój jest zaburzony. W rzadkich przy-padkach pasożyty uwalniają się z kapsuł dzięki silnym ruchom ciała. Zmiana fazy wzrostu bakterii również osłabia odporność owada. Dymorfizm morfologiczny polega na przejściu z formy gładkiej w formę szorstką, co utrudnia aktywność fagocytarną komórek oraz hamuje bakteriobójcze właściwości hemolimfy owada.

Obrona czynna pasożytów polega na niszczeniu komórek fagocytujących, hamowaniu syntezy białek odpornościowych oraz hamowaniu aktywności oksy-dazy polifenolowej. W ten sposób nicienie i bakterie unikają fagocytozy, a bakterie stają się niewrażliwe na działanie enzymów lizosomalnych w fagosomie. Takie działanie jest możliwe dzięki syntezie agresyn, substancji hamujących działanie fagocytów. Sfago- cytowane patogeny są nawet zdolne do namnażania się wewnątrz fagocytów. Natomiast nicienie S. glaseri


unikają inkapsulacji w lawach Popillia japonica poprzez wykorzystanie białek SCP3a (surface coat protein), które niszczą hemocyty owada oraz uniemożliwiają hemocytom detekcję pasożytów. Przełamanie barier odporności humoralnej u owadów następuje pod wpły-wem egzoproteinaz wydzielanych przez bakterie fazy pierwotnej lub proteaz nicieni, które hamują reakcje odpornościowe. Proteinazy niszczą głównie cekropiny i attacyny. Opór czynny to również inhibicja chemotak-sji, fagocytozy, inkapsulacji oraz blokowanie aktywacji układu profenylooksydazy biorącej udział w odpor-ności komórkowej. Jednakże mechanizmy tych oddzia-ływań są jeszcze słabo poznane [16, 31, 41, 47, 54, 57].

Nicienie entomopatogeniczne (Steinernematidae oraz Heterorhabditidae) i związane z nimi symbiotyczne bakterie Xenorhabdus i Photorhabdus wykazują różnorodne adaptacje do przełamywania barier obron-nych swoich żywicieli. Hipoteza Czerwonej Królowej zakłada, iż każda zmiana zachodząca w jednym gatunku indukuje zmianę w innym [21]. Każdy gatunek pod-lega zatem presji innego. Potencjalni żywiciele (owady) doskonalą swoje mechanizmy przystosowawcze, uła-twiające przetrwanie i obronę przed potencjalnymi pasożytami i patogenami (nicieniami entomopatoge-nicznymi i bakteriami), przez co pasożyty i patogeny również doskonalą swoje mechanizmy przystosowaw-cze, ułatwiające zarażenie żywiciela i utrzymanie popu-lacji. Koewolucja różnych mechanizmów doskonalenia i przełamywania barier obronnych owadów, nicieni entomopatogenicznych i mutualistycznych bakterii umożliwia im przetrwanie [21, 66, 94].

6. Podsumowanie

Bakterie związane z nicieniami entomopatogenicz-nymi to interesująca grupa, zwłaszcza pod względem możliwości ich potencjalnego zastosowania jako bio- in sektycydy oraz jako organizmy modelowe do bada-nia zależności: mutualizm/symbioza, pasożytnictwo i patogeniczność. Szybkie uśmiercanie żywiciela – od momentu wniknięcia patogenów oraz wyeliminowa- nie szkodliwych dla środowiska insektycydów, spra-wiają, że powstaje coraz więcej prac dotyczących sym-biontów nicieni.

Wraz z pojawianiem się nowych szczepów szkod-ników odpornych na stosowane obecnie preparaty biobójcze, w tym również toksyny bakteryjne Bt pro-dukowane przez rośliny transgeniczne, należy szukać nowych środków zwalczających szkodniki. Bakterie izolowane z dzikich szczepów nicieni, wytwarzające nowe grupy toksyn, o dużym potencjale insektobój-czym, mogą przyczynić się do poprawy skuteczności kontrolowania liczebności populacji szkodliwych owa-dów w rolnictwie.

Piśmiennictwo

1. AbuHatab M., Selvan S., Gaugler R.: Role of proteases in pene-tration of insect gut by the entomopathogenic nematode Steinernema glaseri (Nematoda: Steinernematidae). J. Invertebr. Pathol. 66, 125–130 (1995)

2. Adams B.J., Fodor A., Klein M.G., Smith H.L., Stackenbrandt E., Stock S.P.: Biodiversity and systematics of nematode-bacterium entomopathogens. Biol. Contr. 37, 32–49 (2006)

3. Akhurst R.J, Boemare N.E.: A numerical taxonomic study of the genus Xenorhabdus (Enterobacteriaceae) and proposed elevation of the subspecies of X. nematophilus to species. J. Gen. Microbiol. 134, 1835–1845 (1988)

4. Baliadi Y., Kondo E., Yoshiga T.: The continual forming and con-tribution of infective juveniles produced via endotokia matricida of entomopathogenic nematodes in the family of Steinernema-tidae and Heterorhabditidae. IJAS, 10, 26–33 (2009)

5. Bednarek A., Kamionek M., Pezowicz E.: Zwalczanie pędraków Melolonthinae jako przykład integrowanej metody zwalczania szkodników w lasach. Przegląd Hodowlany, 60, 125–140 (2002)

6. Bednarek A.: Influence of the intensity of infecting insects with the Steinernema feltiae (Filipjev) nematode (Steinernematidae) on their death rate. Ann. Warsaw Agricult. Univ. SGGW – AR. Anim. Sc. 20, 63–67 (1986)

7. Boczek J.: Owady i ludzie. PWN, Warszawa, 1990, s. 235 8. Bode H. B.: Entomopathogenic bacteria as a source of secondary

metabolites. Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 224–230 (2009) 9. Boman H.G., Hultmark D.: Cell-free immunity in insects. Annu.

Rev. Microbiol. 41, 103–126 (1987)10. Bowen D., Rocheleau T.A., Blackburn M., Andreev O., Golu-

beva E., Bhartia R., Ffrench-Constant R.H.: Novel insecticidal toxins from the bacterium Photorhabdus luminescens. Science, 280, 2129–2132 (1998)

11. Brown I.M., Gaugler R.: Temperature and humidity influence emergence and survival of entomopathogenic nematodes. Nematologica, 43, 363–375 (1997)

12. Brown I.M., Shapiro-Ilan D.I., Gaugler R.R.: Entomopathogenic nematode infectivity enhancement using physical and chemical stressors. Biol. Contr. 39, 147–153 (2006)

13. Brzeski M., Sandner H.: Zarys nematologii, Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, 1974, s. 400.

14. Burnell A.M., Stock S.P.: Heterorhabditis, Steinernema and their bacterial symbionts-lethal pathogens of insects. Nematology, 2, 31–42 (2000)

15. Castillo J.C., Reynolds S.E., Eleftherianos I.: Insect immune responses to nematode parasites. Trends Parasitol. 27, 537–547 (2011)

16. Castillo J.C., Reynolds S.E., Eleftherianos I.: Insect immune responses to nematode parasites. Trends Parasitol. 27, 537–547 (2011)

17. Ciche T.A., Darby C., Ehlers R.-U., Forst S., Goodrich-Blair H.: Dangerous liaisons: The symbiosis of entomopathogenic nema-todes and bacteria. Biol. Contr. 38, 22–46 (2006)

18. Ciche T.A., Ensign J.C.: For the insect pathogen Photorhabdus luminescens, which end of nematode is out? Appl. Environ. Microbiol. 69, 1890–1897 (2003)

19. Ciche T.A., Kim K.S, Kaufmann-Daszczuk B., Nguyen K.C., Hall D.H.: Cell invasion and matricide during Photorhabdus luminescens transmission by Heterorhabditis bacteriophora nematodes. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2275–2287 (2008)

20. Ciche T.: The biology and genome of Heterorhabditis bacteriophora. WormBook, 2007, s. 7

21. Combes C.: Ekologia i ewolucja pasożytnictwa. Długotrwałe wzajemne oddziaływania. Wyd. Naukowe PWN. Warszawa, 1999, s. 628


22. Croll N.A. 1977. Pasożytnictwo i inne związki. Wyd. Naukowe PWN. Warszawa, ss. 194

23. da Silva O.S., Prado G.R., da Silva J.L.R., Silva C.E., da Costa M., Heermann R.: Oral toxicity of Photorhabdus luminescens and Xenorhabdus nematophila (Enterobacteriaceae) against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Parasitol. Res. 112, 2891–2896 (2013)

24. Ehlers R.U., Stoessel S., Wyss U.: The influence of phase variants of Xenorhabdus spp. and Escherichia coli (Enterobacteriaceae) on the propagation of entomopathogenic nematodes of the genera Steinernema and Heterorhabditis. Revue Nématol. 13, 417–424 (1990)

25. Ehlers R.U.: Current and future use of nematodes in biocon-trol: practice and commercial aspects with regard to regulatory policy issues. Biocontrol Sci. Tech. 6, 303–316 (1996)

26. Ehlers R.U.: Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 623–633 (2001)

27. Ffrench-Constant R.H., Eleftherianos I., Reynolds S.E.: A nema-tode symbiont sheds light on invertebrate immunity. Trends Parasitol. 23, 514–517 (2007)

28. Ffrench-Constant R.H., Bowen D.J.: Novel insecticidal toxins from nematode-symbiotic bacteria. Cell. Mol. Life Sci. 57, 828–833 (2000)

29. Gassmann A.J., Petzold-Maxwell J.L., Clifton E.H., Dunbar M.W., Hoffmann A.M., Ingber D.A., Keweshan S.: Field-evolved resi-stance by western corn rootworm to multiple Bacillus thuringiensis toxins in transgenic maize. PNAS. 111, 5141–5146 (2014)

30. Givaudan A., Baghdiguian S., Lanois A., Boemare N.: Swar-ming and swimming changes cocomitant with phase variation in Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 61, 1408–1413 (1995)

31. Gliński Z., Jarosz J., Zarys immunologii owadów. Wyd. Aka-demii Rolniczej w Lublinie, 1992, s. 149

32. Gliński Z., Kostro K., Luft-Deptuła D.: Owady i inne grupy stawonogów W: Gliński Z., Kostro K. [red.] Immunobiologia, PWRiL, Warszawa, 2004, 32–88, s. 340

33. Gouge D.H., Snyder J.L.: Temporal association of entomopa-thogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) and bacteria. J. Invertebr. Pathol. 91, 147–157 (2006)

34. Gulcu B., Hazir S., Kaya H.K.: Scavenger deterrent factor (SDF) from symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes. J. Invertebr. Pathol. 110, 326–333 (2012)

35. Guo L., Fating R.O. 3rd., Orr G.L., Schafer B.W., Strickland J.A., Sukhapinda K., Woodsworth A.T., Petell J.K.: Photorhabdus luminescens W-14 insecticidal activity consists of at least two similar but distinct proteins. Purification and characterization of toxin A and toxin B. J. Biol. Chem. 274, 9836–9842 (1999)

36. Han R.C., Ehlers R.U.: Pathogenicity, development, and repro-duction of Heterorhabditis bacteriophora and Steinernema carpocapsae under axenic in vivo conditions. J. Invertebr. Pathol. 75, 55–58 (2000)

37. Hu K., Webster J.M.: Antibiotic production in relation to bacte-rial growth and nematode development in Photorhabdus – Heterorhabditis infected Galleria mellonella larvae. FEMS Microbiol. Lett. 189, 219–223 (2000)

38. Hurlbert R.E., Xu J., Small C.L.: Colonial and cellular polymor-phism in Xenorhabdus luminescens. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1136–1143 (1989)

39. Jarosz J., Gliński Z.: Leksykon immunologii owadów. Wyd. Naukowe PWN, 1996, s. 164

40. Jarosz J.: Gut flora of Galleria mellonella suppressing ingested bacteria. J. Invertebr. Pathol. 34, 192–198 (1979)

41. Jarosz J.: Strategie obrony przeciwzakaźnej i sposoby ucieczki entomopatogenów spod kontroli immunologicznej owadów. Wiad. Parazytol. 42, 3–27 (1996)

42. Jaworska M.: Badania nad możliwością wykorzystania entomo-filnych nicieni do ograniczania populacji Cephalcia abietis (L.) (Hym., Pamhillidae). Pol. Pis. Ent. 62, 201–213 (1993)

43. Kikuta S., Kiuchi T., Aoki F., Nagata M.: Recovery of infective juveniles of the entomopathogenic nematode Steinernema carpocapsae via factors produced by insect cells and symbiotic bacteria. Nematol. 11, 611–618 (2009)

44. Kim S.K., Flores-Lara Y., Stock S.P.: Morphology and ultra-structure of the bacterial receptacle in Steinernema nematodes (Nematoda: Steinernematidae). J. Invertebr. Pathol. 110, 366–374 (2012)

45. Konecka E., Baranek J., Hrycak A., Kaznowski A.: Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains isolated from soil and water. The Sci. World J. DOI: 10.1100/2012/710501 (2012)

46. Konecka E., Kaznowski A., Baranek J.: Wykorzystanie bakterii Bacillus thuringiensis do produkcji bioinsektycydów. Post. Mikrobiol. 50, 303–311 (2011)

47. Koppenhöfer A.M., Grewal P.S., Fuzy E.M.: Differences in pene-tration routes and establishment rates of four entomopatho-genic nematode species into four white grub species. J. Invertebr. Pathol. 94, 184–195 (2007)

48. Koppenhöfer A.M., Wilson M., Brown I., Kaya H.K., Gaugler R.: iological control agents for white grubs (Coleoptera: Scara-baeidae) in anticipation of the establishment of the Japanese beetle in California. J. Econ. Entomol. 93, 71–81 (2000)

49. Kowalska J., Pruszyński S. [red.].: Metody i środki propono-wane do ochrony roślin. Zakład Upowszechniania Wydawnictw i Współpracy z Zagranicą, Poznań, 2007, s. 145

50. Kumari P., Kant S., Zaman S., Mahaparto G.K., Banerjee N., Sarin N.B.: A novel insecticidal GroEL protein from Xenorhabdus nematophila confers insect resistance in tobacco. Transgenic Res. 23, 99–107 (2014)

51. Lee M.M., Stock S.P.: Multilocus approach to assessing coevo-lutionary relationships between Steinernema nematodes (Nematoda: Steinernematidae) and their bacterial symbionts, Xenorhabdus spp. (γ-Proteobacteria, Enterobacteriaceae). Syst. Parasitol. 77, 1–12 (2010)

52. Lemaitre B., Hoffmann J.: The Host Defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697–743 (2007)

53. Lenteren J.C., Roskam M.M., Timmer R.: Commercial mass production and pricing of organisms for biological control of pests in Europe. Biol. Contr. 10, 143–149 (1997)

54. Lewis E.E., Campbell J., Griffn Ch., Kaya H., Peters A.: Beha-vioral ecology of entomopathogenic nematodes. Biol. Contr. 38, 66–79 (2006)

55. Lewis E.E., Clarke D.J.: Nematode parasites and entomopatho-gens. (w) Vega F., Kaya H.K. [red.], Insect Pathology, 2nd ed. Amsterdam, The Netherlands, 2012, s. 395–424

56. Lewis L.C., Raun E.S.: Laboratory and field evaluation of the DD-136 strain of Neoaplectana carpocapsae for control of the European corn borer, Ostrinia nubilalis. Iowa State J. Res. 52, 391–396 (1978)

57. Li X-Y., Cowles R.S., Cowles E.A., Gaugler R., Cox-Foster D.L.: Relationship between the successful infection by entomopatho-genic nematodes and the host immune response. Int. J. Parasitol. 37, 365–374 (2007)

58. Lipa J.J.: Zarys patologii owadów. PWRiL, Warszawa, 1967, s. 341

59. Malczewski A., Wędrychowicz H.: Fascynujący świat pasożytów – wstęp. Kosmos, 54, 1–2 (2005)

60. Malinowski H.: Odporność owadów na insektycydy. Mechani-zmy powstawania i możliwości przeciwdziałania. Wyd. „Wieś Jutra”, Warszawa, 2003, s. 211

61. Martens E.C., Heungens K., Goodrich-Blair H.: Early coloniza-tion events in the mutualistic association between Steinernema


carpocapsae nematodes and Xenorhabdus nematophila bacteria. J. Bacteriol. 185, 3147–3154 (2003)

62. Miranda V.A., Navarro P.D., Davidovitz G., Bronstein J., Stock S.P.: Effect of insect host age and diet on the fitness of the entomopathogenic nematode-bacteria mutualism. Symbiosis, 61, 145–153 (2013)

63. Monteiro C.M.O., Prata M.C.A., Furlong J., Faza A., Batista E.S.P., Dolinski C., Furlong J.: Heterorhabditis bacteriophora (Rhabditida: Heterorhabditidae) HP 88 for biological control of Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae): the effect of diffe-rent exposure times of engorged females to the nematodes. Vet. Parasitol. 185, 364–367 (2012)

64. Moyle P.L., Kaya H.K.: Susceptibility of pupae of two cocoon--forming Lepidopterous species to the entomogenous nemato-des Neoaplectana carpocapsae (Rhabditidae: Steinernematidae). J. Nematol. 13, 419–421 (1981)

65. Nielsen-LeRoux C., Gaudriault S., Ramarao N., Lereclus D., Givaudan A.: How the insect pathogen bacteria Bacillus thuringiensis and Xenorhabdus/Photorhabdus occupy their hosts. Curr. Opin. in Microbiology. 15, 220–231 (2012)

66. Niewiadomska K., Pojmańska T., Machnicka B., Czubaj A.: Zarys parazytologii ogólnej. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, 2001, s. 514

67. Poinar G.O.: Biology and taxonomy of Steinernematidae and Heterorhabditidae. Entomopathogenic nematodes in biological control. (w) Gaugler R., Kaya H. K. Entomopathogenic nema-tode in biological control. Boca Raton, Florida, CRC Press, 1990, s. 23–61

68. Poinar G.O.: The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoplectana sp. (Steinernematidae: Nema-toda). Nematologica, 12, 105–108 (1966)

69. Pojmańska T.: Pasożytnictwo, pasożyty i żywiciele. Kosmos, 54, 5–20 (2005)

70. Raja R.K., Sivaramakrishnan S., Hazir S.: Ecological characte-risation of Steinernema siamkayai (Rhabditida: Steinernemati-dae), a warm-adapted entomopathogenic nematode isolate from India. BioControl, 56, 789–798 (2011)

71. San-Blas E., Gowen S.R., Pembroke B.: Steinernema feltiae: ammonia triggers the emergence of their infective juveniles. Exp. Parasitol. 119, 180–185 (2008)

72. Sandner H., Stanuszek S.: Comparative research on the effecti-veness and production of Neoaplectana carpocapsae S. L. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 121, 209–226 (1971)

73. Sandner H.: Granice pasożytnictwa. Roczn. TNW, 50, 152–156 (1990)

74. Sandner H.: Historia entomonematologii w Polsce. Zesz. Problem. Post. Nauk Rol. 323, 151–161 (1986)

75. Sandner H.: Movement of invasive larvae of Heterorhabditis bacteriophora Poinar in soil. An. Warsaw Agr. Univ. SGGW – AR. Anim. Sci. 20, 45–47 (1986)

76. Sandner H.: Movement of invasive larvae of Steinernema feltiae (Filipjev) in soil. An. Warsaw Agr. Univ. SGGW – AR. Anim. Sci. 20, 41–44 (1986)

77. Sandner H.: Pasożyty w służbie człowieka. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, 1990, s. 168

78. Scheepmaker J.W.A.: Biological control of the mushroom sciarid Lycoriella auripila and the phorid Megaselia halterata by ento-mopathogenic nematodes. Ponsen and Looijen B.V., Wagenin-gen, 1999, s. 127

79. Seryczyńska H., Kamionek M.: Defense reactions of Galleria mellonella L. caterpillars under the influence of the parasite nematodes Neoaplectana carpocapsae Weiser. Bull. Acad. Pol. Sci. 20, 739–742 (1972)

80. Sharma S., Waterfield N., Bowen D., Rocheleau T., Holland L., James R., Ffrench-Constant R.: The lumicins: novel bacteriocins from Photorhabdus luminescens with similarity to the uropatho-genic-specific protein (USP) from urapathogenic Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 214, 241–249 (2002)

81. Shi H.X., Zeng H.M., Yang X.F., Liu Z., Qiu D.: An insectici-dal protein from Xenorhabdus ehlersii stimulates the immune response in Galleria mellonella. World J. Microbiol. Biotechnol. 29, 1705–1711 (2013)

82. Sicard M., Brugirard-Ricaud K., Pagès S., Lanois A., Boemare N.E., Brehélin M., Givaudan A.: Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473–6480 (2004)

83. Snyder H., Stock P., Kim S.-K., Flores-Lara Y., Forst S.: New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5338–5346 (2007)

84. Spiridonov S.E., Akhmedov E.N., Belostotskaya F.N.: Prolifera-tion of symbiotic bacteria in the intestinal vesicles of invasive larvae of Neoplectana spp. (Nematoda, Steinernematidae). Helminthologia, 28, 141–142 (1991)

85. Stock S.P., Hunt D.J.: Morphology and systematics of nematodes used in biocontrol. (w) Grewall P. S., Ehlers R. U., Shapiro-Ilian D.I. [red.] Nematodes as Biocontrol Agents. Wallingford, UK, CABI Publishing, 2005, s. 505

86. Stock S.P., Lee M.M., Flores-Lara Y.: The rectal glands of Heterorhabditis bacteriophora (Rhabditida: Heterorhabditidae) her-maphrodites and their role in symbiont transmission. J. Invertebr. Pathol. 110, 135–138 (2012)

87. Thaler J.O., Baghdiguian S., Boemare N.: Purification and cha-racterization of xenorhabdicin, a phage tail-like bacteriocin, from the lysogenic strain F1 of Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 61, 2049–2052 (1995)

88. Tomalak M.: Rejestracja biologicznych środków ochrony roślin w Europie – nowe perspektywy. Post. Ochr. Roślin. 47, 233–240 (2007)

89. Tomalak M.: Rolnictwo ekologiczne nowym wyzwaniem dla biologicznych metod ochrony roślin. Post. Ochr. Roślin. 45, 496–504 (2005)

90. Tomalak M.: Selekcja i mutageneza w genetycznym doskonale-niu nicieni owadobójczych dla celów biologicznego zwalczania szkodników. Zakład Biologicznych Metod i Kwarantanny. Insty-tut Ochrony Roślin. Poznań, 1998, s. 94

91. Wang Y., Campbell F.J., Gaugler R.: Infection of entomopatho-genic nematodes Steinernema glaseri and Heterorhabditis bacteriophora against Popillia japonica (Coleoptera: Scarabaeidae) larvae. J. Invertebr. Pathol. 66, 178–184 (1995)

92. Wang Y., Gaugler R.: Host and penetration site location by entomopathogenic nematodes against Japanese beetle larvae. J. Invertebr. Pathol., 72, 313–318 (1998)

93. Waterfield, N.R., Ciche T, Clarke D.: Photorhabdus and a host of hosts. Annu. Rev. Microbiol. 63, 557–574 (2009)

94. Wędrychowicz H.: Sposoby unikania skutków odpowiedzi immunologicznej żywiciela wykorzystywane przez pasożyty. Kosmos, 54, 39–48 (2005)

95. Williams E.C., Walters K.F.A.: Foliar application of the entomo-pathogenic nematode Steinernema feltiae against leafminers on vegetables. Biocontrol Sci. Technol. 10, 61–70 (2000)

96. Yang J., Zeng H.M., Lin H.F., Yang X.F., Liu Z., Guo L.H., Yuan J.J., Qiu D.W.: An insecticidal protein from Xenorhabdus budapestensis that results in prophenoloxidase activation in the wax moth, Galleria mellonella. J. Invertebr. Pathol. 110, 60–67 (2012)


* Autor korespondencyjny: Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski, ul. Jagiellońska 28, 40-032 Katowice; tel: (32) 20 09 359; e-mail: [email protected]

1. Historia odkrycia

W drugiej połowie ubiegłego stulecia badacze zwrócili szczególną uwagę na poszukiwanie antygenów wspólnych dla różnych gatunków bakterii, zarówno tych bezwzględnie patogennych jak i chorobotwór-czych warunkowo (oportunistycznych), w kontekście potencjalnego wykorzystania ich w diagnostyce i pro-filaktyce chorób zakaźnych. Szczególne zainteresowanie wzbudził, odkryty w 1963 roku przez Calvina Kunina w pałeczkach rodziny Enterobacteriaceae antygen wspólny – CA (Common Antigen), nazwany później na cześć odkrywcy antygenem Kunina, a obecnie ECA (Enterobacterial Common Antigen, wspólny entero-bakteryjny antygen). Kunin ujawnił jego obecność w czasie badań nad infekcjami układu moczowego powodowanymi przez różne szczepy Escherichia coli. Celem badań było wykrycie obecności przeciwciał anty-E. coli oraz badanie stopnia serologicznych reak-cji krzyżowych pomiędzy różnymi serotypami O E. coli. W czasie badania naukowiec wykorzystywał zdolność 145 szczepów reprezentujących większość znanych O serotypów E. coli do opłaszczania erytrocytów (RBC),

celem umożliwienia im aglutynacji zarówno z wykorzy-staniem surowicy homologicznej jak i heterologicznej. Nieoczekiwanie odkrył, że aglutynacja erytrocytów opłaszczonych wszystkimi badanymi serotypami E. coli miała miejsce nawet przy wykorzystaniu surowicy hete-rologicznej. Najwyższą krzyżową reaktywność wykazy-wały surowice odpornościowe E. coli O14, a także E. coli O56, O124 i O144. Krzyżowo reagujące przeciwciała można było usunąć z surowicy anty-E. coli O14 poprzez adsorpcję ekstraktem dowolnego szczepu E. coli, nato-miast nadal w tej surowicy pozostawały przeciwciała reagujące ze szczepem homologicznym [32]. Na uwagę zasługuje również fakt, że rok przed Kuninem, Bro-dhage z pałeczek Salmonella wyekstrahował za pomocą mocznika, wspólny antygen, który nazwał antygenem „C” (common) [13]. Antygen ten wykazywał reaktyw-ność z surowicami odpornościowymi uzyskanymi dla niespokrewnionych serologicznie pałeczek Salmonella oraz z surowicą anty-Shigella sonnei. Późniejsze bada-nia, z użyciem monospecyficznych surowic anty-ECA dowiodły tożsamość antygenu „C” z ECA, którego obecna nazwa oddaje jego szeroką specyficzność dla pałeczek rodziny Enterobacteriaceae.

ECA – WSPÓLNY ANTYGEN POWIERZCHNIOWYPAŁECZEK RODZINY ENTEROBACTERIACEAE

Katarzyna Kasperkiewicz1, Magdalena Noszczyńska1*, Anna Piszczek1

1 Katedra Mikrobiologii, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Śląski

Wpłynęło w grudniu 2014 r.

1. Historia odkrycia. 2. Występowanie. 3. Charakterystyka chemiczna. 4. Formy ECA. 5. Biosynteza i jej kontrola genetyczna. 6. Właściwości immunogenne. 7. Lokalizacja ECA w komórce bakteryjnej i sposoby jego detekcji. 8. Rola biologiczna. 9. Zastosowanie. 10. Podsumowanie

ECA – common surface antigen of the bacilli of the Enterobacteriaceae family

Abstract: Almost all the strains of bacteria belonging to the Enterobacteriaceae family share at least one common antigenic component, ECA, which is not present in other Gram-negative and Gram-positive bacteria. From the observations made with immunofluorescence and immunoferritin techniques, it has been concluded that ECA is localized in the outer leaflet of the outer membrane of Gram-negative enteric bacteria. ECA is a glycolipid consisting of linear trisaccharide repeating units composed of [→3)-α-D-Fucp4NAc-(1→4)-β-D-ManpNAcA-(1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→]. It occurs in three structural forms: ECAPG linked to phosphatidylglycerol, ECALPS anchored to LPS core region and ECACYC not expressed on the surface. ECA is believed to be connected to the LPS outer core. However, it should be emphasized that Yersinia enterocolitica serotype O:3 mutants defective in outer core synthesis were also ECA-immunogenic. The genes involved in ECA biosynthesis are located in the chromosomal wec gene cluster, from wecA to wecG and the ECA expressions is downregulated at host temperature. So far, ECA has been thoroughly analyzed at the structural and genetic level, however, its significance in vivo has been investigated in relatively few studies. ECA has been linked to pathogenesis in several species of bacteria, although this function seems to differ between the species. ECA has been shown to be involved in the flagellar assembly and motility in Serratia marcescens Also, the ECA-negative mutants of Salmonella enterica serovar Typhimurium proved to be significantly less virulent than the parental strain. ECA as a marker of Enterobacteriaceae family is a valuable indicator of water and food contaminations with enteric bacteria.

1. Discovery history. 2. Occurrence. 3. Chemical characterization. 4. Forms of ECA. 5. Genetics of ECA biosynthesis. 6. The immunogenic properties. 7. Localization of ECA in the bacterial cell and methods of its detection. 8. Biological significance. 9. Application. 10. Summary

Słowa kluczowe: ECA, Enterobacteriaceae, enterobakteryjny antygen wspólnyKey words: ECA, Enterobacteriaceae, enterobacterial common antigen

166 KATARZYNA KASPERKIEWICZ, MAGDALENA NOSZCZYŃSKA, ANNA PISZCZEK

2. Występowanie

Dalsze badania nad występowaniem ECA wyka-zały, że jest on obecny we wszystkich dzikich szczepach rodziny Enterobacteriaceae, podczas gdy inne Gram-ujemne oraz Gram-dodatnie bakterie go nie posiadają. Niemniej jednak znane są wyjątki, odbie- gające od tej reguły [30]. Nie udokumentowano obec-ności ECA u jednego szczepu Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, E. coli i Erwinia chrysanthemi oraz u poje-dynczych szczepów Morganella morganii i Providen cia rettgeri.

Badania z użyciem przeciwciała monoklonalnego swoistego dla ECA (mAb 898) zaowocowały wykryciem niewielkich ilości ECA w traktowanych wysoką tempe-raturą supernatantach Actinobacillus equuli i Actinobacillus suis. Wyniki te nie zostały jednak potwierdzone analizami chemicznymi, które wykazały brak charak-terystycznych składników ECA w obydwu gatunkach. Wykluczono także hipotezę, wykonując badania che-miczne lipopolisacharydów (LPS) tych szczepów, że reakcje krzyżowe z mAb 898, wynikają z istnienia ECA przyłączonego do lipopolisacharydu (tzw. ECALPS) [12].

Analiza chemiczna i serologiczna ECA wyizolowa-nego z Plesiomonas shigelloides należącego do rodziny Vibrionaceae, wykazała, że charakteryzuje się on iden-tycznym składem chemicznym i właściwościami sero-logicznymi jak ECA pochodzący z enterobakterii [9]. Ostatecznie, na podstawie przeprowadzonych analiz molekularnych genomu tej bakterii, przeniesiono ten gatunek do rodziny Enterobacteriaceae [41].

Wartość ECA, jako dodatkowego kryterium tak-sonomicznego ilustruje jego obecność w gatunkach Yersinia, a brak w Pasteurella haemolytica i Pasteurella multocida, co było podstawą eliminacji rodzaju Yersinia z rodzaju Pasteurella i przeniesienia do rodziny Enterobacteriaceae, jako nowy rodzaj [11].

Wart podkreślenia pozostaje również fakt obec ności ECA w Tatumella ptyseos i Xenorhabdus, ponieważ pałeczki tych dwóch rodzajów reprezentują nietypo-wych przedstawicieli Enterobacteriaceae [30].

Ilościowe badania porównawcze ECA prowadzone na ponad 184 szczepach ujawniły różnice w zawartości ECA, które wydają się być specyficznym ilościowym markerem mogącym posłużyć w diagnostyce różnych rodzajów i gatunków enterobakterii. Zróżnicowanie poziomu ECA w szczepach bakteryjnych można wyka-zać w teście zahamowania hemaglutynacji biernej. Ilość antygenu określano w umownych jednostkach inhibi-torowych przypadających na ekstrakt, który uzyski-wano z miligrama suchej masy bakteryjnej. Najwyższą zawartość ECA wykazywały pałeczki Shigella, Citrobacter i Enterobacter (powyżej 200 jednostek na mili-gram), o połowę niższą pałeczki rodzaju Escherichia, Klebsiella, Yersinia i Salmonella (około 100 jednostek

na miligram), najniższą zaś, bo 0.4 do 70 jednostek na miligram stwierdzono w szczepach z rodzaju Serratia, Proteus i Providencia [25].

3. Charakterystyka chemiczna

Odkrycie wspólnego antygenu pałeczek jelitowych zapoczątkowało badania, których celem było uzyskanie czystego preparatu ECA, a następnie określenie jego struktury chemicznej. Bardzo istotne znaczenie miały badania przeprowadzone w 1978 roku przez Männel i Mayer’a, którzy wyizolowali ECA ze szczepu Salmonella enterica sv. Montevideo SH94. Badany anty-gen uzyskano dzięki połączeniu dwóch różnych metod ekstrakcyjnych, opracowanych wcześniej w celu izolacji lipopolisacharydów, tj. metody Westphala (ekstrakcja fenolowo-wodna na gorąco) oraz metody Galanosa (ekstrakcja mieszaniną fenol: chloroform: eter naftowy). Analiza chemiczna uzyskanego materiału wykazała, że jest on liniowym heteropolimerem złożonym z dis-acharydowych powtarzających się jednostek, które składają się z N-acetylo-D-glukozaminy (GlcNAc) i kwasu N-acetylo-D-mannozaminouronowego (Man-NAcA) [39]. Odmienna struktura chemiczna ECA została natomiast przedstawiona przez Ługowskiego i Romanowską, którzy wyizolowali ECA ze szczepu Shigella sonnei 9773. Na podstawie przeprowadzonych badań strukturalnych wykazano, że antygen wspólny jest polimerem złożonym z trisacharydowych powta-rzających się jednostek cukrowych, które utworzone są z dwóch cząsteczek ManNAcA i jednej cząsteczki GlcNAc, której reszty były nieekwimolarnie O-acyty-lowane [36]. Stwierdzono także, obecność niewielkiej ilości kwasów tłuszczowych. W 1983 roku zapropo-nowana wcześniej struktura chemiczna ECA, została zweryfikowana. Za pomocą nowej wówczas techniki – spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), wykazano obecność trzeciego składnika anty-genu wspólnego, tj. N-acetylo-4-amino-D-fukozy (Fuc4NAc) [37]. Stąd, obecnie wiadomo, że ECA zbu-dowany jest z trisacharydowych powtarzających się jednostek o sekwencji: [→3)-α-D-Fucp4NAc-(1→4)-β-D-ManpNAcA-(1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→], które ule-gają polimeryzacji tworząc polisacharyd ECA o różnej długości łańcucha [14, 23].

4. Formy ECA

W obrębie pałeczek jelitowych stwierdzono wystę-powanie trzech form ECA, określanych jako ECAPG, ECALPS i ECACYC. Wszystkie formy ECA charaktery-zują się obecnością części polisacharydowej. Różnią się natomiast pod względem obecności części lipidowej

ECA – WSPÓLNY ANTYGEN POWIERZCHNIOWY PAŁECZEK RODZINY ENTEROBACTERIACEAE 167

lub jej brakiem, lokalizacji w komórce bakteryjnej oraz właś ciwościami immunogennymi (rys. 1) [14, 29].

ECAPG to najlepiej poznana forma, która występuje u wszystkich przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae. Stanowi około 0,2% suchej masy komórki bak-teryjnej. Część cukrowa antygenu związana jest kowa-lencyjnie za pomocą redukującego końca cząsteczki (GlcNAc) z resztą fosforanową L-fosfatydyloglicerolu (część lipidowa), do którego w pozycjach C-1 i C-2 za pomocą wiązania estrowego przyłączone są odpo-wiednie kwasy tłuszczowe [17, 23, 24, 28, 30]. Obec-ność komponentu lipidowego jest niezmiernie istotna, gdyż umożliwia zakotwiczenie ECA w obrębie błony zewnętrznej ściany komórkowej Enterobacteriaceae, dzięki czemu pełni on rolę antygenu powierzchnio-wego [9]. Jeżeli w wyniku traktowania fosfolipazą A2 zostanie odłączony jeden kwas tłuszczowy lub gdy na skutek działania fosfolipazy D, nastąpi całkowite usunięcie wszystkich kwasów tłuszczowych z L-fos-fatydyloglicerolu, wówczas ECA traci swoją zdolność do opłaszczania RBC, ale zachowuje antygenowość. Absolutne usunięcie kwasów tłuszczowych z molekuły ECA może następować także w przypadku działania

tzw. czynnika „Pseudomonas Factor” (PF). Czynnik ten produkowany jest przez Pseudomonas aeruginosa i wydaje się być egzoenzymem (lub mieszaniną egzo-enzymów) działającym w obrębie części lipidowej ECA, który uwalnia wszystkie kwasy tłuszczowe, podobnie jak typowe lipazy. Również w tym wypadku skutkuje to utratą zdolności ECA do opłaszczania erytrocytów i tym samym zanikiem reaktywności z przeciwciałami anty-ECA w testach hemaglutynacji biernej, nie wpływa jednak na łańcuch cukrowy, odpowiedzialny za właści-wości serologiczne antygenu wspólnego. Jak wykazano, już oddzielenie jednej reszty kwasu tłuszczowego skut-kuje utratą charakterystycznego obrazu ECA przypomi-nającego „skrzydła ptaka” w procesie immunoelektro-foretycznym, jak i zdolnością do opłaszczania krwinek czerwonych [28]. ECAPG nie wykazuje właściwości immunogennych, stąd nazywany jest także czasami „haptenowym” ECA, ponieważ nie stymuluje produk-cji specyficznych przeciwciał, jeżeli nie jest związany z odpowiednim nośnikiem białkowym [9, 26, 30].

ECALPS jest formą immunogenną, która występuje równolegle z ECAPG na powierzchni komórek bakte-ryjnych. Forma ta charakteryzuje się przyłączeniem

Rys. 1. Formy występowania ECA i ich lokalizacja w komórce bakteryjnej. Powtarzająca się jednostka:[→3)-α-D-Fucp4NAc-(1→4)-β-D-ManpNAcA-(1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→]


łańcucha węglowodanowego poprzez region rdze-niowy LPS do lipidu A [54]. Obecność ECALPS wyka-zano u pozbawionych łańcucha O-swoistego mutantów szorstkich (R) E. coli posiadających pełny region rdze-niowy LPS typu coli R1, R4 i K-12, a zatem zbudowany z rdzenia zewnętrznego i wewnętrznego. Nie stwier-dzono natomiast jego występowania u mutantów E. coli defektywnych w biosyntezie rdzenia zewnętrznego [30]. Dowiedziono, że jedynie kompletny region rdzeniowy LPS E. coli może służyć jako akceptor ECA. Ponadto, badania dotyczące innego przedstawiciela Enterobacteriaceae, tj. P. mirabilis potwierdziły, że ECALPS wystę-puje wyłącznie u szczepów, które posiadają pełny region rdzeniowy LPS. Mutanty tej bakterii pozbawione rdzenia zewnętrznego nie produkowały ECALPS [15]. Wyjątek stanowi Yersinia enterocolitica serotypu O:3, gdzie ECA przyłączony jest do wewnętrznego regionu rdzeniowego LPS, a dokładnie do jednej z dwóch reszt kwasu 3-deoksy-D-manno-oktulozonowego (Kdo) [46, 49, 50]. Za pomocą analiz chemicznych wykazano kowalencyjne wiązanie pomiędzy ECA a LPS z fazy II Shigella sonnei, a tym samym udowodniono istnienie ECALPS [18].

ECACYC to szczególna forma ECA, która nie wystę-puje na powierzchni komórki bakteryjnej, lecz zgro-madzona jest w przestrzeni peryplazmatycznej, zlo-kalizowanej między błoną wewnętrzną i zewnętrzną ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. Forma ta pozbawiona jest części lipidowej, co umożliwia jej rozpuszczalność w wodzie. Polisacharyd ECACYC, w przeciwieństwie do ECAPG nie zawiera fosfoglice-rydowego aglikonu, tworzy cykliczny węglowodan o masie 2,4 kDa w przypadku E. coli K-12 [16, 23]. Ana-liza strukturalna oczyszczonego preparatu cyklicznego ECA pochodzącego z E. coli K-12 wykazała, że składa się on z czterech trisacharydowych powtarzających się jednostek, zawierających od 0 do 4 grup O-ace-tylowych, które podobnie jak w przypadku ECAPG, przyłączone są w pozycji C-6 GlcNAc. Dla porówna-nia, ECACYC wyekstrahowany z S. sonnei fazy I zawiera od 4–6 trisacharydowych powtarzających się jedno-stek, a zatem stopień polimeryzacji molekuł cyklicz-nego ECA, pochodzącego z różnych Gram-ujemnych enterobakterii nie wydaje się być identyczny [23, 24]. Ponadto wykazano, że wiązanie glikozydowe znajdujące się pomiędzy ManNacA i GlcNAc może występować w więcej niż jednym stanie konformacyjnym. Cykliczna forma wspólnego enterobakteryjnego antygenu krysta-lizuje w dwóch charakterystycznych formach: jednej, przyjmującej całkowicie kwadratową strukturę i dru-giej, o kształcie nieznacznie pochylonego rombu [4]. Cykliczna forma ECA, została wykryta w ekstraktach komórkowych otrzymanych z S. sonnei fazy I, Yersinia pestis i P. shigelloides, natomiast nie stwierdzono jej obecności w ekstrakcie komórkowym P. aeruginosa

[4, 23]. Dostępne dane sugerują, iż ECACYC może wystę-pować u wszystkich przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae [24].

5. Biosynteza ECA i jej kontrola genetyczna

Synteza antygenu wspólnego odbywa się po cyto-plazmatycznej stronie błony wewnętrznej i przebiega w trzech etapach, z których każdy jest uzależniony od poprzedniego. Substratami w procesie biosyntezy ECA są odpowiednie aktywne formy cukrów. Dodawane są one sukcesywnie do endogennego lipidowego akceptora, jakim jest undekaprenylomonofosforan (Und-P) [6, 21].

Synteza ECA rozpoczyna się od utworzenia trisa-charydowej powtarzającej się jednostki. W pierwszym etapie następuje transfer GlcNAc-1-fosforanu z UDP--GlcNAc na nośnik lipidowy (undekaprenylomono-fosforan), w wyniku którego powstaje GlcNAc-P-P--undekaprenol, czyli tzw. lipid I, będący pierwszym lipidowym intermediatem. Proces ten katalizowany jest przez WecA, integralne białko błonowe, którego aktywność uzależniona jest od obecności jonów Mg2+ i zostaje zahamowana pod wpływem działania anty- biotyku – tunikamycyny [6, 33]. W drugim etapie, ManNAcA jest przenoszony z UDP-ManNAcA na powstały wcześniej lipid I, dając ManNAcA-lipid I, zwany także lipidem II. Ostatnim krokiem jest trans-fer Fuc4NAc z TDP-Fuc4NAc, co skutkuje powstaniem Fuc4NAc-lipid II (Fuc4NAc-ManNAcA-GlcNAc-PP--Und), czyli lipidu III. Fakt, iż biosynteza heteropo-lisacharydowego łańcucha ECA rozpoczyna się od utworzenia GlcNAc-P-P-undekaprenolu wydaje się potwierdzać, że GlcNAc jest końcowym redukującym aminocukrem. Geny odpowiedzialne za biosyntezę ECA w większości zlokalizowane są w obrębie klastra genów wec, dawniej zwanego rfe-rff. Oba wymienione klastry genów, tj. rfe i rff występują w obrębie chro-mosomu bakteryjnego, na 83 minucie w przypadku Salmonella i 85 minucie u E. coli. Sekwencje nukleoty-dowe klastra wec (14 kb) zawierają 12 otwartych ramek odczytu (tabela I) [6, 7, 21, 23, 40, 52, 54].

Utworzone molekuły lipidu III stanowią punkt wyjścia do syntezy polimeru ECA i są następnie prze-noszone do przestrzeni peryplazmatycznej z udzia-łem flipazy WzxE. W peryplazmie zachodzi proces polimeryzacji poszczególnych powtarzających się tri-sacharydowych jednostek ECA według mechanizmu tzw. „blokowej polimeryzacji”, który katalizowany jest przez produkt genu wzyE. Ponadto, w proces polime-ryzacji ECAPG zaangażowany jest także tzw. modulator długości łańcucha polisacharydowego, WzzECA, który odpowiada za uzyskanie polimeru złożonego z od 1 do 14 powtarzających się jednostek. Białko WzzECA w przy-padku E. coli K-12 kodowane jest przez gen O349.


Niewyjaśnionym pozostaje fakt, na jakiej drodze powstaje cykliczna forma ECA. Przypuszcza się, że cyklizacja może wymagać tworzenia wiązania O-gli-kozydowego, będącego wynikiem transferu reduku-jącego końca GlcNAc z undekaprenylopirofosforanu wiążącego linearny łańcuch cukrowy, na nieredukujący koniec Fuc4NAc tego samego łańcucha. Nie wiadomo również, jak dochodzi do transferu łańcuchów poli-sacharydowych na fosfoglicerydowy aglikon, tworze-nia ECAPG oraz jego późniejszej translokacji do błony zewnętrznej [7, 21, 23, 24].

W wyniku przeprowadzonych badań wykazano, że za przyłączenie grup O-acetylowych w pozycji C-6 GlcNAc w ECAPG i ECACYC odpowiada O-acetylotrans-feraza będąca wewnątrzbłonowym białkiem, które kodowane jest przez gen wecH. Nie są jednak znane szczegóły dotyczące reakcji katalizowanej przez WecH i nie wiadomo także, na jakim etapie składania łańcu-cha polisacharydowego ECA może zachodzić proces O-acetylacji za pośrednictwem tego enzymu. Wydaje się jednak, że rolę donora podstawników O-acetylo-wych w tym procesie pełni acetylo-CoA, a sama reakcja zachodzi podczas składania lipidu II po cytoplazma-tycznej stronie błony wewnętrznej, przed translokacją z udziałem WzxE w poprzek błony wewnętrznej. Nie uzyskano jednak do tej pory żadnych danych ekspe-rymentalnych, które mogłyby potwierdzić powyższe spekulacje [24].

W biosyntezę ECA zaangażowane są również geny należące do klastra wba, odpowiadające za powstawanie enzymów niezbędnych do syntezy łańcuchów O-swo-istych LPS. Mutacje genów występujących w obrębie klastra wba prowadzą do zahamowania syntezy jedno-stek cukrowych O-antygenu, skutkuje to utworzeniem lipopolisacharydu zbudowanego wyłącznie z lipidu A i rdzenia, co umożliwia powstanie ECALPS. Biosynteza ECALPS wymaga także prawidłowego funkcjonowania

genów odpowiedzialnych za powstawanie komplet-nego rdzenia LPS (klaster genów waa) oraz genu waaL, który koduje O-translokazę (WaaL) przenoszącą ECA na rdzeń LPS. Modulacja długości łańcucha ECAPG z udziałem WzzECA jest niezależna od działania WaaL [30]. Nieoczekiwanie wykazano u Y. enterocolitica sero-typu O:3 obecność zarówno łańcucha O-swoistego jak i ECALPS przyłączonych do tej samej molekuły LPS. Niewyjaśnionym pozostaje fakt, czy komórka bakte-ryjna syntetyzuje wszystkie cząsteczki LPS zawierające ECA i O-antygen, czy też produkowane są molekuły posiadające albo ECA albo antygen O-swoisty [44]. W przypadku Salmonella enterica sv. Typhimurium do biosyntezy ECA oprócz genów wec, niezbędne jest także działanie wspomnianych genów wba, które związane są z regionem his (his-linked wba region). Dobrym przykładem jest gen rmlA, kodujący enzym: TDP-glu-kozo-pyrofosforylazę. Katalizuje on powstawanie TDP--glukozy, będącej prekursorem TDP-Fuc4Nac, donora reszty Fuc4NAc, która uczestniczy w biosyntezie ECA [35]. Pomimo opisanego powyżej procesu biosyntezy ECA, nie został on jednak jak dotąd wyczerpująco poznany.

6. Właściwości immunogenne

Wśród bakterii rodziny Enterobacteriaceae, wyróż-nia się szczepy ECA-immunogenne i ECA-nieimmu-nogenne [30]. Pewne światło na immunogenność ECA rzuciła seria badań, w których materiałem wyjściowym były mutanty R. Dzięki wykonanym doświadczeniom, wykazano, że wysoce immunogenny szczep E. coli O14:K7, uważany za szczep gładki (syntetyzujący LPS zbudowany z lipidu A, pełnego regionu rdzeniowego i łańcucha O-swoistego), jest w rzeczywis tości mutantem szorstkim. Skutkiem tego przypuszczano, że produkcja

wecA Synteza GlcNAc-transferazy biorącej udział w tworzeniu Lipidu IwecB Synteza UDP-GlcNAc-2-epimerazy uczestniczącej w syntezie UDP-ManNAcAwecC Synteza UDP-ManNAc-dehydrogenazy biorącej udział w syntezie UDP-ManNAcAwecG Synteza ManNAcA-transferazy biorącej udział w tworzeniu Lipidu IIrmlBECA Synteza TDP-glukozooksydoreduktazy biorącej udział w tworzeniu dTDP-4-keto-6-deoksyglukozyrmlAECA Synteza TDP-glukozopirofosforylazy przekształcającej glukozo-1-fosforan w dTDP-glukozęwecD Synteza acetylotransferazy przekształcającej TDP-Fuc4NH2 w TDP-Fuc4NAcwecE Synteza transaminazy przekształcającej TDP-4-keto-4,6-dideoksy-glukozę w TDP-Fuc4NH2

wecF Synteza Fuc4NAc-transferazy przenoszącej Fuc4NAc na Lipid II; tworzenie Lipidu IIIwzzE Regulacja długości łańcuchawzy Polimeryzacja ECAwzxE Translokacja ECA

Tabela IFunkcje klastra genów wec [6, 40, 43, 54]

Gen Funkcja genetyczna


LPS pozbawionego łańcucha O-swoistego jest warun-kiem koniecznym dla ujawnienia się immunogen-ności antygenu Kunina. Stwierdzono także, że szcze-pienie zwierząt doświadczalnych zarówno żywymi jak i martwymi komórkami bakterii form gładkich, nie indukuje produkcji przeciwciał anty-ECA [27]. Prze-łomowym badaniem okazała się ekstrakcja surowych preparatów ECA 85% etanolem, dzięki której wyka-zano różnice pomiędzy ECAPG a ECALPS. W przy-padku szczepów ECA-nieimmunogennych (gładkich) otrzymano całkowite oddzielenie frakcji nierozpusz-czalnej w etanolu zawierającej LPS od rozpuszczalnej frakcji ECAPG. Z kolei szczepy ECA-immunogenne (szorstkie) obejmowały frakcję rozpuszczalną ECAPG, a także frakcję nierozpuszczalną zawierającą LPS i ECA, którym okazał się być ECALPS, warunkujący ich immu-nogenność [30, 31]. Ważnym krokiem w zrozumieniu immunogenności ECA było odkrycie, że niektóre mutanty szorstkie R E. coli i Shigella charakteryzowały się właściwościami ECA-immunogennymi, podobnie jak E. coli O14:K7. Zawiesiny tych mutantów, po zabiciu wysoką temperaturą były immunogenne, a większość ich ECA była nierozpuszczalna w etanolu. Właściwości te były jednak ograniczone do pewnych typów rdzeni LPS, oznaczanych jako R1, R4 i K-12. Immunogenność ECA zależy od chemotypu LPS mutantów szorstkich oraz od sposobu przygotowania zawiesiny bakteryjnej, którą szczepi się zwierzęta doświadczalne (ogrzewanie zawiesiny w różnej temperaturze, działanie czynnikami chemicznymi). Badając właściwości immunogenne szczepu E. coli O14:K7 i mutantów E. coli o typie części rdzeniowej R1, stwierdzono, że szczepy te stymulują wytwarzanie przeciwciał anty-ECA, jeśli wprowadzono je w postaci supernatantu hodowli lub ogrzewanych zawiesin. Szczepionki z innych szczepów, sporządzone w analogiczny sposób, zawierały nieimmunogenny antygen ECA o tej samej swoistości serologicznej. Te wyjątkowe cechy pierwszej z grup wymienionych szcze-pów oraz fakt, że alkalizacja preparatu ECA zwiększała jego powinowactwo do powierzchni krwinek czerwo-nych nasunęło wniosek, że determinanta antygenowa ECA jest albo częścią LPS albo tworzy z nią silnie zwią-zany kompleks [19]. W tym drugim przypadku silne powiązanie z lipopolisacharydem mogłoby tłumaczyć fakt, iż immunogenność ECA nie obniża się w czasie ogrzewania [27]. Immunogenność ECAPG jest zacho-wana kiedy to frakcja etanolo-rozpuszczalna i frakcja etanolo-nierozpuszczalnego LPS są oddzielnie wstrzyk-nięte temu samemu zwierzęciu [30]. Jednak z drugiej strony ten sam ECAPG podany razem z LPS, traci cha-rakter immunogenu. Zjawisko to nazwane zostało „immunosupresją związaną z antygenem”. Podobny wpływ na właściwości immunogenne ECA wywiera także lipid A, kardiolipina, Triton X-100, Tween-20 i gangliozydy [45]. Supernatant kultury P. aeruginosa

zawiera wspomniany wcześniej czynnik PF, który modyfikuje resztę lipidową ECAPG. Inkubacja ECAPG z tym czynnikiem powoduje zniszczenie jego immu-nogenności, podczas gdy na immunogenność ECALPS nie wywiera on żadnego wpływu [51]. Ze względu na małą masę molekularną, ECA może być immunogenny tylko wtedy gdy jest związany kowalencyjnie z nośni-kiem: z LPS w przypadku ECALPS lub z białkami w przy-padku ECAPG [30]. ECAPG zasocjowany z proteinami jest zdolny do indukcji przeciwciał jeśli jest wstrzyk-nięty dożylnie królikom [38]. Pomimo tego, że ECALPS produkowany był tylko przez mutanty R typu coli R1, R4 i K-12 syntetyzujące pełny region rdzeniowy, to jego obecność wykazano u mutantów szorstkich Y. enterocolitica O:3 pozbawionych rdzenia zewnętrz-nego. Dowiedziono, iż ECA w badanych mutantach R Y. enterocolitica O:3 przyłączony był do wewnętrznego regionu rdzeniowego LPS. Ponadto udowodniono, że ekspresja ECA w badanych mutantach zależy od tem-peratury i była efektywniejsza w 22°C niż w 37°C [44, 46, 48, 49, 50].

Obecność przeciwciał anty-ECA klasy IgG zaob-serwowano również u zdrowych, dorosłych ludzi. Tak wysoka częstość występowania tych przeciwciał jest zapewne uwarunkowana ciągłym kontaktem organi-zmu człowieka z przedstawicielami rodziny Enterobacteriaceae zasiedlającymi przewód pokarmowy. Prze ciwciała swoiste dla ECA wykrywano najczęściej i w najwyższym mianie w przypadku osób chorujących na zapalenie stawów [53].

7. Lokalizacja ECA w komórce bakteryjnej i sposoby jego detekcji

Związany z komórką bakteryjną ECA charakteryzo-wał się dobrą reaktywnością z monoswoistą surowicą, co wykazano w teście biernej hemaglutynacji, a także w innych technikach serologicznych tj.: bierna hemo-liza, zahamowanie biernej hemaglutynacji lub biernej hemolizy oraz immunoprecypitacja. Fakt ten prze-mawiał za obecnością tego antygenu na powierzchni bakterii, co potwierdziły wyniki uzyskane przez wielu badaczy [30]. W 1980 roku, Rinno i wsp. przeprowa-dzili badania nad rozmieszczeniem ECA w komórkach mutantów R E. coli, stosując technikę immunofluore-scencji i frakcję immunoglobulin G znakowanych fer-rytyną. Okazało się, że ECA-immunogenne szczepy E. coli (F470, F2387) znakowały się silniej niż szczepy ECA-nieimmunogenne (F614). Mutanty ECA-ujemne (F1283, F1327) nie reagowały z IgG znakowanymi fer-rytyną. Komórki szczepu F470 wykazywały wysoką fluorescencję na całej swojej powierzchni, podczas gdy na powierzchni komórek szczepu E. coli F614 obserwowano tylko nieliczne skupiska fluorescen-


cyjne. W przypadku szczepów E. coli ECA-ujemnych nie zaobserwowano żadnej fluorescencji. Otrzymane wyniki wskazywały na lokalizację ECA w membra-nie zewnętrznej, a także sugerowały zdecydowanie lepszą ekspozycję ECA w szczepach ECA-immuno-gennych (zawierających oprócz ECAPG, także ECALPS) niż w szczepach ECA-nieimmunogennych (zawiera-jących tylko ECAPG) [55]. Badania, techniką „whole mount” z użyciem znakowanych złotem lub ferrytyną przeciwciał drugorzędowych nad rozmieszczeniem ECA (ECAPG, ECALPS) na powierzchni bakterii podjął w 1986 roku Acker i wsp. Dwa lata później, badacze ci poszukiwali lokalizacji ECA w membranie lub cyto-plazmie komórki, stosując technikę mikroskopii elek-tronowej z użyciem znakowanych złotem przeciwciał drugorzędowych [1].

Otrzymane rezultaty badań nad topologią ECA w komórce bakteryjnej można podsumować w nastę-pujący sposób:1) ECA jest składnikiem błony zewnętrznej wszystkich

jak dotąd zbadanych pałeczek rodziny Enterobacteriaceae [2].

2) Komórki szczepów, które oprócz ECAPG zawierają dodatkowo ECALPS, wykazują gęste, regularne zna-kowanie ferrytyną lub złotem [2].

3) Komórki szczepów, które zawierają tylko ECAPG cha-rakteryzują się punktowym znakowaniem mniejszej gęstości [2].

4) Pozbawione otoczki szczepy E. coli wykazują wyraź-nie lepszą gęstość znakowania [2].

5) W formach S pałeczek Y. enterocolitica O:3, np. szczepie Ye75S, ECAPG jest zakotwiczony w mem-branie zewnętrznej i całkowicie przykryty przez łań-cuchy O-antygenu. Wcześniejsze badania (techniką SDS/PAGE) przeprowadzone dla LPS tego szczepu wykazały, że kiedy szczep ten hodowano w tempe-raturze 40°C, następował znaczący wzrost liczby niepodstawionych przez O-antygen odcinków rdze-nia. Rezultaty te pozostawały w zgodzie z faktem, że całkowite znakowanie było obserwowane na mikro-grafach, tylko wtedy, gdy komórki hodowane były w 40°C, podczas, gdy w tych hodowanych w 22°C nie obserwowano znakowania ferrytyną. Na podsta-wie tych wyników wywnioskowano, że w komórkach Ye75S hodowanych w 22°C O-antygen całkowicie przykrywał ECA, natomiast w komórkach hodo-wanych w 40°C, kiedy wzrastał poziom LPS typu szorstkiego, ECA był znacznie lepiej dostępny dla przeciwciał. Przedstawione powyżej wyniki kore-spondowały z rezultatami otrzymanymi dla mutanta Ye75R z niekompletnym regionem rdzeniowym, w przypadku którego zaobserwowano gęste znako-wanie ferrytyną. Rezultaty te wyjaśniały brak aglu-tynacji bakterii form S z surowicami anty-ECA, podczas gdy, miało to miejsce dla mutantów R [3].

6) Badania, z użyciem dwóch rożnych przeciwciał monoklonalnych (jednego przeciwko ECA i dru-giego przeciwko antygenowi K1 E. coli) techniką podwójnego znakowania i obserwacji w mikrosko-pie elektronowym wykazały, że znakowane złotem ECA znajdowało się w bliskim sąsiedztwie błony zewnętrznej, natomiast znakowanie specyficzne dla antygenu K1 obserwowano znacznie dalej od brzegu błony zewnętrznej, co sugeruje, że ECA nie zawsze dociera do najbardziej zewnętrznych warstw osłon komórki [1]. Przedstawione rezultaty badań nad topologią ECA

w komórce bakteryjnej mogą tłumaczyć złożony pro-blem ECA – immunogenności. ECA kowalencyjnie przyłączony do rdzenia LPS typu R czyli ECALPS jest wysoce immunogenny i zarazem dobrze eksponowany na powierzchni bakterii. Ekspozycja ECAPG w formach S bakterii oraz mutantach R jest znacznie słabsza, dlatego też taka forma ECA charakteryzuje się niską immunogennością lub nawet jej brakiem, w przypadku immunizacji królików zabitymi ogrzewaniem komór-kami bakteryjnymi [30].

8. Rola biologiczna

Niewiele wiadomo o znaczeniu ECA dla komórki bakteryjnej. Liczni przedstawiciele rodziny Enterobacteriaceae należą do mikroorganizmów patogennych dla człowieka, zwierząt i roślin, dlatego też dopatrywano się udziału ECA w zjadliwości tych bakterii. Szczepy S. enterica sv. Typhimurium zawierające ECA są 10 razy bardziej wirulentne niż szczepy ECA-ujemne, ponadto są bardziej oporne na działanie soli kwasów żółcio-wych po doustnej infekcji myszy [30, 52]. Sugeruje się także, że proces chorobowy u genetycznie podatnych osobników cierpiących na reumatoidalne zapalenie stawów może być potęgowany przez ECA. Hipoteza ta nie została jednak jak dotąd poparta badaniami eks-perymentalnymi [5]. Wykazano także, że ECA warun-kuje oporność szczepu E. coli O157:H7 na kwasy orga-niczne i tym samym umożliwia przeżycie tych bakterii w obrębie przewodu pokarmowego gospodarza [8, 4, 17]. Przypuszcza się, że ECA, podobnie jak LPS, może pełnić rolę powierzchniowo-aktywnego składnika, który ułatwia poruszanie się E. coli K-12 ruchem swarming na agarze miękkim, za sprawą obniżania napię-cia powierzchniowego [22]. Dowiedziono także, że zakłócenie drogi biosyntezy ECA może powodować zaburzenia w zdolnościach poruszania się komórek Serratia marcescens i to zarówno w odniesieniu do ruchu swarming, jak i swimming. Ten pierwszy jest skoordynowanym przemieszczaniem się ściśle związa-nej grupy bakterii w podłożu stałym lub półpłynnym, podczas gdy ruch typu swimming to chemotaktyczna


translokacja pojedynczych komórek bakterii w środo-wisku płynnym. Ponadto, sugeruje się, że ECA pełni istotną rolę w integralności i/lub stabilności osłony komórkowej pałeczek Enterobacteriaceae [14]. Obda-rzony ładunkiem ujemnym antygen wspólny, podob-nie jak region Kdo lipopolisacharydu, może odgrywać znaczącą rolę w wiązaniu kationów do powierzchni komórki [30]. Wydaje się także prawdopodobnym, że wpływa na bilans wapnia w komórce bakteryjnej, gdyż jak wykazano, ECA pochodzący z Salmonella enterica sv. Montevideo wiąże jony Ca2+ w ilości prawie dziesię-ciokrotnie wyższej aniżeli jony Mg2+ [8].

Wiedza na temat funkcji jaką pełni ECACYC jest dosyć nikła. Peryplazmatyczna lokalizacja i cykliczna struktura tej formy antygenu są podobne do tych, które cechują osmoregulacyjne peryplazmatyczne glukany, syntetyzowane przez wiele Gram-ujemnych Proteobacteria. Nie mniej jednak, synteza ECACYC nie wydaje się być związana z procesami osmoregulacyjnymi [24]. Wykazano natomiast oddziaływanie ECACYC z lek-tyną wiążącą mannozę (MBL) [47]. MBL jest ważnym czynnikiem odporności wrodzonej, biorącym udział w zwalczaniu infekcji przez wzmaganie fagocytozy, lizę mikroorganizmów lub modulację odpowiedzi gospo-darza na wzorce molekularne związane z patogenem (PAMP) [56]. Sugeruje to udział ECACYC w indukcji reakcji zapalnych gospodarza.

Podsumowując, należy zwrócić uwagę na to, iż pomimo pewnego związku występowania ECA z właś-ciwościami patogennymi bakterii, funkcja antygenu wspólnego wydaje się być zróżnicowana w zależności od gatunku. Chociaż ECA jest obecny u wielu bakterii, każdy gatunek mógł wykształcić unikalne, właściwe sobie drogi wykorzystania tego składnika, co sprzyja przeżyciu poszczególnych gatunków w niszach jakie zajmują [17].

9. Zastosowanie

ECA, jako składnik charakterystyczny dla przed-stawicieli Enterobacteriaceae znajduje zastosowanie w diag nostyce. Pałeczki jelitowe należące do tej rodziny, jak np. gatunki z rodzajów Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Salmonella czy Shigella często stanowią zanieczyszczenie wyrobów spożywczych i farma-ceutycznych, powodując w efekcie poważne zatrucia pokarmowe. Dlatego, tak ważna jest kontrola zaka-żeń tymi bakteriami wyżej wymienionych produktów. Ważną metodą identyfikacji tych bakterii są techniki immunochemiczne z zastosowaniem specyficznego dla ECA przeciwciała monoklonalnego [34]. Technika ELISA z zastosowaniem komercyjnego przeciwciała monoklonalnego mAb G2a 898, skierowanego swoiście przeciwko ECA, umożliwia identyfikację enterobak-

terii w wodzie pitnej [20]. Wspólny enterobakteryjny antygen pozwala także na wykrywanie pałeczek Enterobacteiaceae z zastosowaniem metod molekularnych. W tym celu zaprojektowano oligonukleotydowe star-tery dla opartej na reakcji PCR detekcji klastra genów wec, który odpowiada za biosyntezę ECA. Spośród trzech zaprojektowanych starterów: wecA, wecE i wecF, primer wecA był specyficzny dla E. coli, podczas gdy, primery wecE i wecF umożliwiały detekcję większości gatunków należących do rodziny Enterobacteriaceae. Przeprowadzanie reakcji PCR z użyciem wymienionych wyżej starterów pozwala na specyficzną identyfikację istotnych enterobakteryjnych patogenów jak: E. coli O157:H7, Shigella sp., Salmonella sp. i Yersinia sp. we krwi, moczu, jak i w wodzie pitnej [10].

10. Podsumowanie

Wspólny enterobakteryjny antygen (ECA) obecny jest prawie u wszystkich przedstawicieli rodziny Enterobacteriaceae, stanowiąc ich swoisty tatuaż. Jego powszechna obecność u enterobakterii zaowoco-wała wykorzystaniem go w licznych, szybkich testach z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych specy-ficznych dla ECA, pozwalających określić jakość wody pitnej czy żywności. Poza tym, jej czystość można oce-niać również stosując metodę PCR z wykorzystaniem oligonukloetydowych primerów flankujących klaster genów wec zawiadujących biosyntezą ECA. Ten aspekt praktyczny antygenu ECA wypływa z osiągnięć badań podstawowych dotyczących jego natury, prowadzonych głównie na pałeczkach E. coli i Salmonella. Badania te wyjaśniły budowę chemiczną ECA i jego strukturę. Antygen wspólny występuje w trzech strukturalnych formach: ECACYC, ECAPG i ECALPS. ECAPG kotwiczy w błonie zewnętrznej ściany komórkowej za pomocą L-fosfatydyloglicerolu. ECALPS związane jest z oligosa-charydowym rdzeniem lipopolisacharydu, który przez lipid A kotwiczy ECALPS w błonie zewnętrznej. ECACYC jest cyklicznym polimerem, pozbawionym części lipi-dowej, zlokalizowanym w przestrzeni peryplazmatycz-nej ściany komórkowej. Tylko forma ECALPS wywołuje w makroorganizmie powstawanie swoistych przeciw-ciał skierowanych przeciwko jego części wielocukro-wej. Niemniej jednak wykazano, że mutanty szorst-kie Y. enterocolitica serotypu O:3 pozbawione rdzenia zewnętrznego, były również ECA-immunogenne. Pomimo unikalnego występowania ECA w rodzinie Enterobacteriaceae jego biologiczna rola nie jest dobrze udokumentowana. Sugerowano, że ECA odgrywał rolę w patogenności bakterii poprzez wykazanie, że ECA--dodatnie mutanty S. enterica sv. Typhimurium były 10 razy bardziej wirulentne niż szczepy ECA-ujemne. Wskazywano również na ochronną funkcję ECA


w przeżywaniu bakterii E. coli O157:H7 w warunkach stresu środowiskowego. Uważa się, że najprawdopodob-niej rola biologiczna ECA jest zróżnicowana w zależ-ności od gatunku bakterii.

Piśmiennictwo

1. Acker G.: Immunoelectron microscopy of surface antigens (polysaccharides) of Gram-negative bacteria using pre- and post-embedding techniques. Method Microbiol. 20, 147–174 (1988)

2. Acker G., Schmidt G., Mayer H.: Accessibility of Enterobacterial Common Antigen to antibodies in Encapsulated and Non-cap-sulated S and R Forms of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 128, 1577–1583 (1982)

3. Acker G., Knapp W., Wartenberg K., Mayer H.: Localization of Enterobacterial Common Antigen in Yersinia enterocolitica by the Immunoferritin Technique. J. Bacteriol. 147, 602–611 (1981)

4. Andersson A., Ahl Ǻ., Eklund E., Widmalm G., Mäler L.: Dyna-mics in the cyclic Enterobacterial common antigen as studied by 13C NMR relaxation. J. Biomol. NMR. 31, 311–320 (2005)

5. Aoki S., Yoshiwa K., Yokoyama T., Nonogaki T., Iwasaki S., Mitsui T., Niwa S.: Role of enteric bacteria in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: evidence for antibodies to enterobacterial common antigens in rheumatoid sera and synovial fluids. Ann. Rheum. Dis. 55, 363–369 (1996)

6. Barr K., Rick D.: Biosynthesis of Enterobacterial Common Anti-gen in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 262, 7142–7150 (1987)

7. Barr K., Klena J., Rick D.: The Modality of Enterobacterial Com-mon Antigen Polysaccharide Chain Lenghts Is Regulated by o349 by wec Gene Cluster of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 181, 6564–6568 (1999)

8. Barua S., Yamashino T., Hasegawa T., Yokoyama K., Torii K., Ohta M.: Involvement of surface polysaccharides in the orga-nic acid resistance of Shiga Toxin-producing Escherichia coli O157:H7. Mol. Microbiol. 43, 629–640 (2002)

9. Basu S., Kuhn H.M., Neszmelyi A., Himmelspach K., Mayer H.: Chemical characterization of enterobacterial common antigen isolated from Plesiomonas shigelloides ATTC 14029. Eur. J. Biochem. 162, 75–81 (1987)

10. Bayrdelle P., Zafarullah M.: Development of oligonucleotide pri-mers for the specific PCR based detection of the most frequent Enterobacteriaceae species DNA using wec gene templates. Can. J. Microbiol. 48, 113–122 (2002)

11. Bercovier H., Mollaret K.H.: genus XIV. Yersinia (w) Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, red. N.R. Krieg, J.G. Holt, Williams and Wilkins, Baltimore, London, 1984, s. 498–506.

12. Böttger E.C., Jürs M., Barret T., Wachsmuth K., Metzger S., Bitter-Suermann D.: Qualitative and quantitative Determination of Enterobacterial Common Antigen (ECA) with Monoclonal Antibodies: Expression of ECA by Two Actinobacillus Species. J. Clin. Microbiol. 25, 377–382 (1987)

13. Brodhage H. Harnstoff-Extrakte aus gramnegativen Bakterien in der indirekten Hämaglutinationsrektion. I. Harnstoff-Extrakte aus S. typhi, paratyphi B, cholerae suis und Shig. sonnei. Z. Hyg. 148, 94–104 (1961)

14. Castelli M.E., Véscovi E.G.: The Rcs Signal Transduction Path-way Is Triggered by Enterobacterial Common Antigen Struc-ture Alterations in Serratia marcescens. J. Bacteriol. 193, 63–74 (2011)

15. Duda K.A., Duda K.T., Beczała A., Kasperkiewicz K., Radziejew-ska-Lebrecht J., Skurnik M.: ECA-immunogenicity of Proteus mirabilis strains. Arch. Immunol. Ther. Exp. 57, 147–151 (2009)

16. Erbel P.J.A., Seidel R., Macintosh S.E., Gentile L.N., Amor J.C., Kahn R.A., Prestegard J.H., McIntosh L.P., Gardner K.H.: Cyc-lic enterobacterial common antigen: Potential contaminant of bacterially expressed protein preparations. J. Biomol. NMR. 29, 199–204 (2004)

17. Gilbreath J.J., Dodds J.C., Rick P.D., Soloski M.J., Merrell D.S., Metcalf E.S.: Enterobacterial Common Antigen Mutants of Salmonella enterica serovar Typhimurium Establish a Persistent Infection and Provide Protection against Subsequent Lethal Challenges. Infect. Immun. 80, 441–450 (2012)

18. Gozdziewicz T.K., Lugowski C., Lukasiewicz J.: First evidence for a linkage between Enterobacterial Common Antigen and lipopolysaccharide in Shigella sonnei phase II ECALPS. J. Biol. Chem. 289, 2745–2754 (2014)

19. Hammarström S., Carlsson H.E., Perlmann P., Svensson S.: Immunochemistry of the Common Antigen of Enterobacteriaceae (Kunin). J. Exp. Med. 134, 565–576 (1971)

20. Hübner I., Steinmetz I., Obst U., Giebel D., Bitter-Suermann D.: Rapid Determination of Members of the Family of Enterobacteriaceae in Drinking Water by an Immunological Assay Using a Monoclonal Antibody against Enterobacterial Common Anti-gen. Appl. Env. Microbiol. 58, 3187–3191 (1992)

21. Hung M., Rangarajan E., Munger C., Nadeau G., Sulea T., Matte A.: Crystal Structure of TDP-Fucosamine Acetyltrans-ferase (WecD) from Escherichia coli, an Enzyme Requires for Enterobacterial Common Antigen Synthesis. J. Bacteriol. 188, 5606–5617 (2006)

22. Inoue T., Shingaki R., Hirose S., Waki K., Mori H., Fukui K.: Genome-Wide Screening of Genes Required for Swarming Motility in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 189, 950–957 (2007)

23. Kajimura J., Rahman A., Rick P.D.: Assembly of Cyclic Entero-bacterial Common Antigen in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 187, 6917–6927 (2005)

24. Kajimura J., Rahman A., Hsu J., Evans M.R., Gardner K.H., Rick P.D.: O Acetylation of the Enterobacterial Common Antigen Polysaccharide Is Catalyzed by the Product of the yiaH Gene of Escherichia coli K-12. J. Microbiol. 188, 7542–7550 (2006)

25. Kałużewski S., Czech Z.: Występowanie i zawartość antygenu Kunina (CAE) w pałeczkach Enterobacteriaceae oraz innych bakteriach Gram-ujemnych. Med. Dośw. Mikrobiol. 28, 109–119 (1976)

26. Kiss P., Rinno J., Schmidt G., Mayer H.: Structural studies on the Immunogenic Form of the Enterobacterial Common Antigen. Eur. J. Biochem. 88, 211– 218 (1978)

27. Kotełko K: Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych i jej antygenowe heteropolimery. Post. Mikrobiol. 15, 29–49 (1976)

28. Kuhn H.M., Neter E., Mayer H.: Modification of the Lipid Moiety of the Enterobacterial Common Antigen by the “Pseudomonas Factor”. Infect. Immun. 40, 696–700 (1983)

29. Kuhn H.M., Basu S., Mayer H.: Comparison of enterobacterial common antigen from different species by serological techni-ques. Eur. J. Biochem. 162, 69–74 (1987)

30. Kuhn H.M., Meier-Dieter U., Mayer H.: ECA, the enterobacte-rial common antigen. FEMS Microbiol. Rev. 54, 195–222 (1988)

31. Kuhn H.M., Meier U., Mayer H.: ECA-das gemeinsame Antigen der Enterobacteriaceae – Stiefkind der Mikrobiologie. Forum Mikrobiol. 7, 274–285 (1984)

32. Kunin C.M.: Separation, characterization, and biological signi-ficance of a common antigen in Enterobacteriaceae. J. Exp. Med. 118, 565–586 (1963)

33. Lehrer J., Vigeant K.A., Tatar L.D., Valvano M.A.: Functional Characterization and Membrane Topology of Escherichia coli WecA, a Sugar-Phosphate Transferase Initiating the Biosynthe-sis of Enterobacterial Common Antigen and O-Antigen Lipo-polysaccharide. J. Bacteriol. 189, 2618–2628 (2007)


34. Levasseur S., Husson M., Leitz R., Merlin F., Laurent F., Peladan F., Drocourt J., Leclerc H., Hoegaerden M.: Rapid detection of the Family Enterobacteriaceae by a Monoclonal Antibody. Appl. Env. Microbiol. 58, 1524–1529 (1992)

35. Lew H.C., Mäkelä H., Kuhn H.M., Mayer H., Nikaido H.: Bio-synthesis of Enterobacterial Common Antigen Requires dTDP glucose Pyrophosphorylase Determined by a Salmonella typhimurium rfb Gene and Salmonella montevideo rfe Gene. J. Microbiol. 168, 715–721 (1986)

36. Ługowski C., Romanowska E.: Enterobacterial Common Anti-gen: Isolation from Shigella sonnei, Purification and Immuno-chemical Characterization. Eur. J. Biochem. 91, 89–97 (1978)

37. Ługowski C., Romanowska E., Kenne L., Lindberg B.: Identi-fication of trisaccharide repeating unit in the enterobacterial common antigen. Carbohydr. Res. 118, 173–181 (1983)

38. Ługowski C., Kułakowska M., Romanowska E.: Enterobacte-rial common antigen-tetanus toxoid conjugate as immunogen. Infect. Immun. 42, 1086–1091 (1983)

39. Männel D., Mayer H.: Isolation and Chemical Characterization of the Enterobacterial Common Antigen. Eur. J. Biochem. 86, 361–370 (1978)

40. Marolda C.L., Tatar L.D., Alaimo C., Aebi C., Valvano M.A.: Interplay of the Wzx Translocase and the Corresponding Poly-merase and Chain Length Regulator Proteins in Translocation and Periplasmic Assembly of Lipopolysaccharide O Antigen. J. Bacteriol. 188, 5124–5135 (2006)

41. Martinez-Murcia A.J., Benlloch S., Collins M.D.: Phylogenetic Interrelationships of Members of the Genera Aeromonas and Plesiomonas as Determined by 16S Ribosomal DNA Sequen-cing: Lack of Congruence with Results of DNA-DNA Hybridi-zations. IJSEM. 42, 412–421 (1992)

42. Mayer H., Schmidt G.: Chemistry and biology of the enterobac-terial common antigen (ECA). Curr. Top. Microbiol. Immunol. 85, 99–153 (1979)

43. Meier U., Mayer H.: Genetic location of genes encoding ente-robacterial common antigen. J. Bacteriol. 163, 756–762 (1985)

44. Muszyński A., Rabsztyn K., Knapska K., Duda K.A., Duda--Grychtoł K.T., Kasperkiewicz K., Radziejewska-Lebrecht J., Holst O., Skurnik M.: Enterobacterial common antigen and O-specific polysaccharide coexist in the lipopolysaccharide of Yersinia enterocolitica serotype O:3. Microbiology, 159, 1782–1793 (2013)

45. Neter E., Whang H.Y.: The common antigen of Gram-nega-tive bacteria (w) Cellular Antigens, red. A. Nowotny, Springer, Heidelberg, New York, 1972, s. 14–21

46. Noszczyńska M., Kasperkiewicz K., Duda K.A., Podhoro-decka J., Rabsztyn K., Gwizdała K., Świerzko A. St., Radziejew-ska-Lebrecht J., Holst O., Skurnik M.: Serological characteriza-tion of the enterobacterial common antigen substitution of the lipopolysaccharide of Yersinia enterocolitica O:3. Microbiology, 161, 219–227 (2015)

47. Paunova-Krasteva T.S., Pavlova V.A., De Castro C., Ivanova R.M., Molinaro A., Nikolova E.B., Stoitsova S.R.: Cyclic enterobacte-rial common antigens from Escherichia coli O157 as microbe--associated molecular patterns. Can. J. Microbiol. 60, 173–176 (2014)

48. Rabsztyn K., Kasperkiewicz K., Duda K.A., Li C., Łukasik M., Radziejewska-Lebrecht J., Skurnik M.: Characterization of Anti--ECA Antibodies in Rabbit Antiserum Against Rough Yersinia enterocolitica O:3. Biochemistry (Moscow), 76, 1016–1025 (2011)

49. Radziejewska-Lebrecht J., Kasperkiewicz K., Skurnik M., Brade L., Steinmetz I., Świerzko A.S., Muszyński A.: ECA-Anti-bodies in Antisera Against R Mutants of Yersinia enterocolitica O:3. Adv. Exp. Med. Biol. 529, 215–218 (2003)

50. Radziejewska-Lebrecht J., Skurnik M., Shaskov A.S., Brade L., Różalski A., Bartodziejska B., Mayer H.: Immunochemical stu-dies on R mutants of Yersinia enterocolitica O:3. Act. Biol. Pol. 45, 1011–1019 (1998)

51. Ramia S., Neter E., Brenner J.: Production of Enterobacterial Common Antigen as an aid to Classification of Newly Identi-fied Species of the Families Enterobacteriaceae and Vibrionaceae. Inter. J. System. Bacteriol. 32, 395–398 (1982)

52. Ramos-Morales F., Prieto A.I., Beuzón C.R., Holden D.W., Casadesús J.: Role for Salmonella enterica Enterobacterial Com-mon Antigen in Bile Resistance and Virulence. J. Bacteriol. 185, 5328–5332 (2003)

53. Rastawicki W.: Humoralna odpowiedź na wybrane antygeny pałeczek Yersinia enterocolitica i Yersinia pseudotuberculosis w przebiegu jersiniozy u ludzi. III. Występowanie i poziom przeciwciał dla antygenu wspólnego pałeczek Enterobacteriaceae (ECA). Med. Dosw. Mikrobiol. 59, 93–102 (2007)

54. Rick P.D., Mayer H., Neumeyer B.A., Wolski S., Bitter-Suer-mann D.: Biosynthesis of Enterobacterial Common Antigen. J. Bacteriol. 162, 494–503 (1985)

55. Rinno J., Golecki J.R., Mayer H.: Localization of enterobacterial common antigen: Immunogenic and nonimmunogenic entero-bacterial common antigen-containing Escherichia coli. J. Bacteriol. 141, 814–821 (1980)

56. Turner M.W.: The role of mannose-binding lectin in health and disease. Mol. Immunol. 40, 423–429 (2003)


* Autor korespondencyjny: Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny; ul. Oczki 3, 02-007 Warszawa; tel. 22 628 08 22; e-mail: [email protected]

1. Wstęp

Jonofory karboksylowe to duża grupa naturalnych substancji o zróżnicowanej aktywności biologicznej. Wytwarzane są między innymi przez różne gatunki pro-mieniowców. W 1951 roku wyizolowano dwa związki: kwas lasalowy z gatunku Streptomyces lasaliensis i nige-rycynę z gatunku promieniowców S. hygroscopicus [5, 83]. W 1967 roku odkryto monenzynę produkowaną przez S. cinnamonensis [31], a w 1974 – salinomycynę wytwarzaną przez S. albus [62]. Od tego czasu opi-sano już ponad 50 gatunków drobnoustrojów (między innymi bakterii z rodzajów: Streptomyces, Actinomadura, Enterococcus, Bacillus) produkujących różne jono-fory karboksylowe i ponad 120 struktur chemicznych tych związków [15, 90]. Terminy jonofory i antybio-tyki przenoszące jony zostały użyte po raz pierwszy w 1967 roku przez Pressmana i wsp. [77], którzy opisali mechanizm działania walinomycyny, (będącej natural-nym jonoforem cyklicznym), polegający na zdolności do wybiórczego wiązania w kompleks kationów potasu i ich transportu przez błony lipidowe. Jonofory mogą być klasyfikowane według różnych kryteriów, np. pochodzenia (naturalne i syntetyczne), budowy che-micznej (np. cykliczne, niecykliczne, karboksylowe, cyklopeptydy) czy sposobu transportowania jonów (przenośnikowe i tworzące kanały – nazywane pseudo-jonoforami) i ich rodzaju (jony jedno- lub dwuwartoś-ciowe) [13, 19, 89].

Do naturalnych jonoforów typu przenośnikowego należą niecykliczne jonofory karboksylowe, nazywane także antybiotykami polieterowymi, np. kalcymycyna, salinomycyna, kwas lasalowy, monenzyna, jonomycyna czy nigerycyna. Cząsteczki tych związków mają budowę niecykliczną, jednak dzięki obecności grupy karbo- ksylowej na jednym końcu i grup hydroksylowych na drugim mogą się tworzyć wiązania wodorowe wewnątrz cząsteczki i powstaje pseudocykliczna struktura, sta-bilizowana przez te wiązania. Eterowe atomy tlenu są skierowane do wnętrza cząsteczki, powstaje wnęka o charakterze hydrofilowym, w której kompleksowany jest kation [19, 37]. Zależnie od wartościowości trans-portowanych kationów wyróżnia się polietery jedno-wartościowe, które mogą transportować tylko kationy jednowartościowe (np. monenzyna A) lub zarówno kationy jedno- jak i dwuwartościowe (np. kwas lasa-lowy) [90] (Rys. 1).

2. Właściwości biologiczne jonoforów karboksylowych i ich zastosowanie

Polieterowe antybiotyki jonoforowe wykazują sze-roką aktywność biologiczną.

Mechanizm ich działania związany jest ze zdolnoś-cią do kompleksowania i transportowania kationów przez błony komórek, zarówno prokariotycznych jak i eukariotycznych [76, 89, 90]. Jonofory obniżają barierę

PRZECIWDROBNOUSTROJOWE WŁAŚCIWOŚCINATURALNYCH JONOFORÓW KARBOKSYLOWYCH

ICH POCHODNYCH

Joanna Stefańska1*

1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny

Wpłynęło w styczniu 2015 r.

1. Wstęp. 2. Właściwości biologiczne jonoforów karboksylowych i ich zastosowanie. 3. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa naturalnych jonoforów karboksylowych i ich pochodnych. 4. Podsumowanie

Antimicrobial properties of natural carboxylic ionophores and their derivatives

Abstract: Polyether ionophore antibiotics are a large group of natural substances, produced by various species of Streptomyces. These agents possess the ability to transport metal cations across lipid membranes, interfere with natural ion transport systems in cells and exhibit a variety of biological properties (antibacterial, antiparasitic, antiinflammatory or antiacancer). Several ionophores (e.g. lasalocid, monensin, narasin, salinomycin) are commercially applied as coccidiostatics in veterinary. The purpose of this report is to present an overview of antimicrobial activities of selected ionofores – lasalocid, monensin and salinomycin, and their derivatives.

1. Introduction. 2. Biological properties of carboxylic ionophores and their application. 3. Antimicrobial activity of natural carboxylic ionophores and their derivatives. 4. Summary

Słowa kluczowe: aktywność przeciwbakteryjna, antybiotyki jonoforowe, kokcydiostatyki, kompleksowanie metaliKey words: antibacterial activity, carboxylic ionophores, coccidiostatics, metal complexation

176 JOANNA STEFAŃSKA

energetyczną niezbędną do transportu jonów przez błony lipidowe, które stanowią naturalną barierę dla związków jonowych i katalizują wymianę kation-pro-ton. Kation metalu jest kompleksowany w hydrofilo-wej wnęce jonoforu, w ten sposób zostaje odizolowany od środowiska. Powstały kompleks jest elektrycznie obojętny i rozpuszczalny w środowisku hydrofobo-wym, dzięki czemu może przejść przez warstwę lipi-dową. Po drugiej stronie błony kation jest uwalniany a jonofor wyłapuje proton i taka obojętna cząsteczka jest transportowana na zewnątrz komórki, gdzie proton zostaje oddysocjowany, a jonofor może kompleksować następny kation. Proces taki doprowadza do zaburze-nia równowagi sodowo-potasowej i wzrostu ciśnie-nia osmotycznego we wnętrzu komórki, co prowadzi w końcu do jej śmierci [13, 15, 37, 86].

Jonofory karboksylowe są dobrze wchłaniane po podaniu doustnym i ich toksyczność dla ssaków jest wysoka [6]. Wykazują liczne działania szkodliwe dla komórek. Monenzyna powoduje np. zmniejszenie wydzielania substancji odpowiedzialnych za tworze-

nie zewnętrznych struktur komórkowych, takich jak proteoglikany, kolagen, fibronektyna [51], blokuje wewnątrzkomórkowy transport białek na poziomie aparatu Golgiego, czy osłabia procesy endocytozy, czyli transportu dużych cząstek przez błony komórkowe [62, 65]. Toksycz ność jonoforów związana jest z ich mecha-nizmem działania, czyli zaburzaniem prawidłowego gradientu stężeń jonów prowadzącego do uszkodzeń mitochondriów, w efekcie braku energii niezbędnej do procesów komórkowych i martwicy mięśni [17, 48, 69].

W przypadku monenzyny zaobserwowano efekt toksyczny dla komórek sercowych na skutek zaburzenia prawidłowego transportu jonów sodu przez błony. Efek-tem tego może być tworzenie pęcherzyków na błonie miocytów i ich obrzęk [65, 82]. Toksyczność jonoforów dla różnych zwierząt jest zróżnicowana. Na przykład dawka LD50 monenzyny dla koni wynosi 2–3 mg/kg masy ciała, salinomycyny – 0,6 mg/kg m.c., a kwasu lasalowego ponad 20 mg/kg m.c. Obserwowane objawy zatrucia to np. jadłowstręt, tachykardia, duszność i spa-dek ciśnienia krwi [24, 32, 70].

Rys. 1. Struktura chemiczna wybranych antybiotyków jonoforowych

PRZECIWDROBNOUSTROJOWE WŁAŚCIWOŚCI NATURALNYCH JONOFORÓW KARBOKSYLOWYCH ICH POCHODNYCH 177

Jonofory karboksylowe wykazują silne właściwości cytotoksyczne, dlatego badacze zainteresowali się potencjalnym działaniem przeciwnowotworowym nie których substancji z tej grupy [44, 80]. Badania in vitro nige-rycyny potwierdzają jej silne działanie na komórki raka Ehrlicha przebiegającego z wodobrzuszem [59]. Jonomycyna zarówno w badaniach in vitro jak i in vivo wykazywała działanie hamujące wzrost komórek raka pęcherza moczowego i synergistyczne działanie z cis--platyną na komórki raka nerki [64, 71]. Wykazano również silne hamujące działanie monenzyny na linie komórkowe chłoniaka ludzkiego [74]. W ostatnich latach dużo uwagi badacze poświęcili salinomycynie jako potencjalnej substancji o aktywności przeciw-nowotworowej. Gupta i wsp. [28] w swoich badaniach wykazali 100-krotnie wyższą zdolność salinomycyny do zabijania ludzkich macierzystych komórek rakowych w porównaniu z powszechnie stosowanym chemio-terapeutykiem – piklitakselem. Badania prowadzone na Uniwersytecie w Heidelbergu wykazały, że salino-mycyna indukuje apoptozę w komórkach rakowych różnego pochodzenia [21]. Także nowo syntetyzowane pochodne antybiotyków jonoforowych są badane pod kątem ich aktywności przeciwnowotworowej [37, 41].

Ze względu na silną aktywność przeciw pasożytom z rodzaju Eimeria, wywołującym kokcydiozy u ptaków, niektóre z antybiotyków jonoforowych znalazły najwięk-sze zastosowanie jako kokcydiostatyki w hodowli drobiu [79]. Ponieważ kokcydioza dotyczy w jednakowym stop-niu zarówno ptactwa dzikiego, jak i domowego, dość łatwo może się rozprzestrzeniać i dla bardziej wrażli-wych gatunków jest wysoce śmiertelna. Wprowadzenie monenzyny jako pierwszego kokcydiosatyku w latach siedemdziesiątych XX wieku przyczyniło się do lepszej kontroli choroby i poprawy poziomu zdrowia w prze-mysłowej hodowli drobiu. W krajach Unii Europejskiej jest dostępnych kilka komercyjnych preparatów kokcy-diostatytków zawierających jonofory, np. monenzynę (preparat Rumensin firmy Elanco), kwas lasalowy (pre-parat Avatec firmy Zoetis), narazynę (preparat Mon-teban firmy Elanco) czy salinomycynę (preparat Kok-cisan firmy Krka) [7, 49, 80]. Ich stosowanie podlega ścisłej kontroli, Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) ocenia również brak ich szkodli-wego działania, zarówno dla zwierząt, konsumentów jak i środowiska.

Antybiotyki jonoforowe działają korzystnie na mikroflorę przewodu pokarmowego zwierząt (np. bydła) poprzez hamowanie nadmiernego namnażania bak-terii Gram-dodatnich. Dzięki temu zwiększa się liczba bakterii Gram-ujemnych, których działanie powoduje w układzie pokarmowym wzrost stężenia kwasu pro-pionowego (a zmniejszenie stężenia kwasu octowego i masłowego), a to wpływa na lepsze wchłanianie składników pokarmowych. Dlatego też np. monenzyna

(u bydła) czy salinomycyna (u świń) były stosowane jako antybiotykowe niehormonalne stymulatory wzro-stu zwierząt w hodowli przemysłowej [6]. W Polsce od 2006 roku takie zabiegi są oficjalnie zakazane, anty-biotyki mogą być u zwierząt stosowane jedynie lecz-niczo lub dodawane do pasz leczniczych.

Jonofory naturalne jak i syntetyczne są również wykorzystywane w produkcji elektrod jonoselektyw-nych [22].

3. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa naturalnych jonoforów karboksylowych oraz ich pochodnych

Naturalne jonofory karboksylowe wykazują zróż ni-co waną aktywność przeciwbakteryjną, głównie wobec bakterii Gram-dodatnich [49, 58], przeciwprątkową i przeciwpierwotniakową [49, 80]. Udowodniono także działanie przeciwwirusowe kilku substancji z tej grupy [36, 81].

Wyizolowano i scharakteryzowano pod względem chemicznym kilkadziesiąt antybiotyków polieterowych produkowanych przez różne gatunki promieniowców, jednak tylko nieliczne zostały poddane bardziej szcze-gółowym badaniom biologicznym, w tym na aktyw-ność przeciwdrobnoustrojową. Przykładowe jonofory karboksylowe, ich producentów i właściwości podano w Tabeli I, a poniżej opisano wyniki badań aktywności mikrobiologicznej niektórych związków z tej grupy.

Kwas lasalowy, podobnie jak większość jonoforów wykazuje wyraźne działanie przeciwdrobnoustrojowe wobec bakterii Gram-dodatnich, nie jest natomiast aktywny wobec bakterii Gram-ujemnych i grzybów z rodzaju Candida [16, 34].

Z przeprowadzonych badań własnych wynika, że war tości najmniejszego stężenia kwasu lasalowego ha- mującego wzrost szczepów wzorcowych drobnoustro-jów z rodzajów: Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus czy Micrococcus wynosiły od 2 do 8 µg/ml [34, 36, 38]. Przebadane nowe kompleksy kwasu lasalowego z ami-nami (alifatycznymi, aromatycznymi czy alifatyczno-ar o matycznymi) wykazywały również aktywność prze- ciwbakteryjną, chociaż w większości przypadków na podobnym lub nieco niższym poziomie w porów- naniu do związku wyjściowego (wartości MIC od 2 do 32 µg/ml [38, 41]. Kwas lasalowy i jego połączenie z alliloaminą działały ponadto na kliniczne szczepy Staphylococcus aureus, zarówno metycylinowrażliwe jak i metycylinooporne izolowane z różnych materiałów od pacjentów hospitalizowanych [36]. Badania mikro-biologiczne pokazały, że kompleksowanie kwasu lasa-lowego z aktywnie biologicznymi aminami nie pozwo-liło na uzyskanie działania synergistycznego obydwu związków, ani zwiększenia aktywności w porównaniu z substancją wyjściową.


Inna pochodna, 1-naftylometylo ester kwasu lasa-lowego okazał się związkiem o bardzo słabym działa-niu na bakterie Gram-dodatnie i podobnie jak związek wyjściowy był nieaktywny wobec pałeczek Gram-ujem-nych Escherichia coli i P. aeruginosa (MIC > 256 µg/ml) i grzybów z rodzaju Candida [39].

W kilku ośrodkach wykazano również dość silne działanie kwasu lasalowego na bakterie beztlenowe z rodzajów Clostridium, Bacteroides i Peptococcus. W przypadku klinicznych izolatów B. fragilis, opornych na antybiotyki β-laktamowe uzyskane wartości MIC wynosiły od 0,78 do 25 µg/ml [61, 88]. Kwas lasalowy w badaniach in vitro wykazywał również aktywność wobec bakterii produkujących kwas mlekowy z rodza-jów Butyrivibrio, Eubacterium i Lactobacillus [10].

Kwas lasalowy jak i większość jonoforów karboksy-lowych nie działa przeciwgrzybiczo, jednak badania na szczurach wykazały, że hamuje wzrost grzybów Pneumocistis jirovecii (wcześniej P. carinii, klasyfikowanych do pasożytów) poprzez 90% zmniejszenie liczby cyst i trofozoiów u zakażonych szczurów [9, 73].

Monenzyna ze względu na swoje liczne właściwości biologiczne jest jednym z najczęściej badanych anty-biotyków jonoforowych. Posiada wyraźną aktywność przeciwdrobnoustrojową wobec bakterii Gram-dodat-nich, a jak potwierdzają różne badania nie działa na bakterie Gram-ujemne i grzyby. Z badań własnych

wynika, że wartości MIC monenzyny wobec szczepów wzorcowych z rodzajów Staphylococcus, Micrococcus i Bacillus wynosiły od 1 do 4 µg/ml, a dla Enterococcus hirae – 12,5 µg/ml [55]. Monenzyna wykazywała rów-nież silne działanie na kliniczne szczepy z rodzaju Staphylococus, w tym MSSA i MRSA oraz MRSE a wartości MIC wynosiły od 1 do 4 µg/ml [56]. Specyficzne kom-pleksy monenzyny z niektórymi kationami dwuwar-tościowymi (kobaltu czy manganu), w których kation nie jest związany we wnęce hydrofilowej wykazywały działanie na bakterie Gram-dodatnie z rodzaju Bacillus i Micrococcus, natomiast nie działały wobec bakterii Gram-ujemnych, takich jak Salmonella czy Escherichia [14]. Badano również aktywność monenzyny wobec beztlenowców i w przypadku izolatow klinicznych z rodzajów Clostridium uzyskano wartości MIC od 1,56 do 6,25 µg/ml, Eubacterium – MIC od 0,78 do 1,56 µg/ml a dla Peptostreptococcus – MIC 0,78 µg/ml. Niewrażliwe okazały się kliniczne izolaty B. fragilis i bakerie Gram-ujemne Veillonella spp. (MIC>100 µg/ml) [88]. Monenzyna w badaniach in vitro wykazywała także wyraźne działanie na zarodźce Plasmodium falciparum, silniejsze w porównaniu z lekiem przeciwmalarycznym – chlorochiną [1].

Ponieważ ciężkie zakażenia związane z biofilmem bakteryjnym powstającym na materiałach medycznych, czy przyrządach diagnostycznych, stanowią poważny

Antybiotyk CP-120509 Actinomadura roseorufa [12] Działanie na bakterie Gram-dodatnie i krętki Brachyspira (Serpulina) hyodysenteriae, także kokcydiostatyczne wobec Eimeria cervulina [12, 80]Antybiotyk CP-78545 Streptomyces griseus [11] Działanie przeciwbakteryjne wobec S. aureus., S. pyogenes, Mycoplasma bovis, Treponema hyodysenteriae (aktualnie Brachyspira hyodysenteriae), działanie kokcydiostatyczne in vitro wobec Eimeria tenella [11]Antybiotyk K-41 Streptomyces hygroscopicus [85] Działanie przeciwbakteryjne, przeciwmalaryczne, także na szczepy Plasmodium falciparum oporne na leki [72]Antybiotyk X-14885A Streptomyces. chartreusis [91] Zdolność do kompleksowania kationów dwuwartościowych, działanie przeciwbakteryjne (S. aureus, B. subtilis, Treponema hyodysenteriae – aktualnie Brachyspira hyodysenteriae) [91]Indanomycyna Streptomyces antibioticus [52] Działanie przeciwbakteryjne, promotor wzrostu u przeżuwaczy [52]Jonomycyna Streptomyces conglobatus [53] Wybiórcze kompleksowanie kationów dwuwartościowych [25, 53], działanie przeciwbakteryjne i przeciwnowotworowe [64, 71]Kalcymycyna Streptomyces. chartreusis [23] Zdolność do kompleksowania kationów dwuwartościowych, głównie wapnia, działanie przeciwbakteryjne (na bakterie Gram-dodatnie) [29]Laidlomycyna Streptomyces eurocidicus [50] Działanie na bakterie Gram-dodatnie i mykoplazmy, wysoka toksyczność (LD50 dla myszy – podanie dootrzewnowe 5 mg/kg; podanie podskórne 2,5 mg/kg) [50, 92]Maduramycyna Actinomadura rubra (aktualnie Działanie przeciwbakteryjne i kokcydiostatyczne Nonomuraea rubra) [20] (preparat Cygro-Alpharma, stosowany u drobiu) [20, 80]Narazyna Streptomyces aureofaciens [4] Kokcydiostatyk stosowany w paszach leczniczych dla drobiu – Monteban (Elanco), działanie przeciwbakteryjne[18]Semduramycyna Actinomadura roseorufa [87] Silne działanie kokcydiostatyczne, preparat Avax (Phibro) stosowany u drobiu [78]

Tabela IPrzykłady naturalnych jonoforów karboksylowych i ich aktywność

Nazwa Drobnoustrój wytwarzający Aktywność


problem terapeutyczny, podjęto również badania nad wpływem niektórych jonoforów na jego tworzenie i przeżywalność. Na przykład w przypadku szczepów komensalnych i izolatów klinicznych C. perfringens wykazano silne działanie monenzyny na komórki planktonowe, a uzyskane wartości MIC wynosiły od 0,015 do 2 µg/ml. Hamowała ona również w ok. 50% żywotność komórek bakteryjnych w biofilmie [8]. Badania własne potwierdziły wyraźny hamujący wpływ monenzyny w stężeniu 4 µg/ml (2 × MIC dla komórek planktonowych) na tworzenie biofilmu przez kliniczne metycylinooporne szczepy S. epidermidis.

Badacze podejmują również próby modyfikacji monenzyny w różnych kierunkach, tak aby powstały cząsteczki o potencjalnie lepszych właściwościach biolo-gicznych. Na przykład estryfikacja monenzyny wpływa na zmianę jej właściwości fizykochemicznych. Karbok-sylowe estry monenzyny w badaniach na bakteriach Gram-dodatnich wykazywały aktywność nieco słabszą od wyjściowego związku (MIC od 6,25 do 100 µg/ml). Ester zawierający dodatkowo ugrupowanie morfoliny w przeciwieństwie do monenzyny, działał, chociaż dość słabo, na grzyby drożdżopodobne z rodzaju Candida, co jest wynikiem obecności w cząsteczce właśnie tego ugrupowania [43]. Badania wielkocząsteczkowych estrów – dimerów czy trimerów monenzyny, kwasu lasa-lowego i obydwu tych substancji wykazały, że posiadają one aktywność przeciwbakteryjną. Zwiększenie masy cząsteczek wpłynęło jednak na zmniejszenie aktyw-ności w porównaniu ze związkami wyjściowymi [34]. Acylowe pochodne monenzyny w badaniach in vitro wykazywały słabsze działanie wobec bakterii tlenowych jak i beztlenowych, natomiast eter benzylowy, który ze względu na silnie lipofilny podstawnik prawdopodob-nie lepiej rozpuszcza się w błonach lipidowych, działał silniej w porównaniu z monenzyną [66].

Monenzyna należy do jonoforów kompleksujących tylko kationy jednowartościowe, a nowe amidy monen-zyny mają zdolność kompleksowania również katio-nów dwuwartościowych. Badania mikrobiologiczne pokazały, że podobnie jak monenzyna jej amidowe pochodne są również aktywne wobec bakterii Gram--dodatnich [54, 57]. Najlepszą aktywność wykazał amid N-fenylowy, a uzyskane wartości MIC wobec szczepów wzorcowych z rodzajów Staphylococcus, Micrococcus i Bacillus wynosiły od 6,25 do 12,5 µg/ml, jedynie szczep Enterococcus hirae był oporny (MIC > 400 µg/ml) [55]. Amid ten działał nieco słabiej od monenzyny na metycylinooporne kliniczne szczepy S. aureus i S. epidermidis (MIC 6,25–25 µg/l), ale był bardziej aktywny w porównaniu z estrami [56]. Powstały również makro-cykliczne laktony monenzyny, które w badaniach na bakteriach beztlenowych wykazały jednak słabszą aktywność, a uzyskane wartości MIC tych związków wobec szczepów Peptostreptococcus anaerobius wyno-

siły od 25 do 50 µg/ml, podczas gdy MIC niemodyfi-kowanej monenzyny wynosiło nieco ponad 1 µg/ml [68]. Inna pochodna, 26-fenyloamino monenzyna wykazywała bardzo silną aktywność wobec zróżnico-wanego spektrum bakterii, w tym gronkowców, pacior-kowców, enterokoków, mykobakterii czy mykoplazm oraz beztlenowców z rodzaju Clostridium, a uzyskane wartości MIC wynosiły od 0,2 do 6,25 µg/ml i były porównywalne lub nawet niższe od war tości uzyska-nych dla kontrolnych chemioterapeutyków. Pochodna ta wykazywała w badaniach wyższą zdolność do trans-portu kationów Na+, co prawdopodobnie zdecydowanie zwiększyło jej aktywność przeciwdrobnoustrojową [84].

Interesującą grupę pochodnych monenzyny stano-wią uretany, które wykazują lepszą aktywność przeciw-drobnoustrojową, a także przeciwpasożytniczą i prze-ciwmalaryczną w porównaniu z monenzyną. Uretan N-fenylowy okazał się pochodną bardziej aktywną od związku wyjściowego, a uzyskane wartość MIC wobec szczepów wzorcowych bakterii Gram-dodatnich (Staphylococcus spp., Micrococcus spp., Bacillus spp., Enterococcus spp.) wynosiły od 0,25 do 4 µg/ml. Wykazał on też silne działanie na kliniczne metycylinooporne szczepy S. aureus i S. epidermidis (MIC od 0,5 do 1 µg/ml) i niewielką aktywność wobec grzybów z rodzaju Candida (MIC 100 µg/ml). Wpływ na taką aktywność czą-steczki przypuszczalnie ma obecność wolnej karbo-nylowej grupy uretanowej [40]. Badania złożonych uretanów monenzyny zawierających dwie cząsteczki połączone różnymi łącznikami, zawierającymi ugrupo-wania alkilowe lub arylowe pokazały wyraźną zależność aktywności od budowy. W tym wypadku aktywność zależała głównie od rodzaju podstawnika w części uretanowej cząsteczki. Pochodne zawierające krótszy łańcuch alkilowy (12-węglowy) wykazywały aktywność wobec ziarenkowców Gram-dodatnich, podczas gdy pochodne z dłuższym łańcuchem (np. 18-węglowym) w podstawniku były praktycznie nieaktywne [42].

Z prac poświęconych aktywności przeciwwiruso-wej monenzyny wynika, że wykazywała ona hamujący wpływ na procesy replikacji wirusów pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej (z rodziny Rhabdoviridae) oraz wirusa Sindbis (z rodziny Togaviridae) [81]. W grupach badawczych Johnsona [47] oraz Ghosh-Choudhury [26] stwierdzono zdolność monenzyny do blokowania późnych etapów postranslacyjnego przetwarzania gli-koprotein wirusów Herpes simplex (1 i 2).

Z innych badań wynika, że monenzyna wpływa na zmniejszenie syntezy DNA, skutecznie hamuje replika-cję i powoduje zmniejszenie liczby powstających wczes-nych antygenów mysiego wirusa polio, a także hamuje wnikanie cząstek wirusa Semliki Forest do komórek docelowych [46, 60].

Nigerycyna to jeden z najwcześniej wyizolowanych jonoforów karboksylowych, ma właściwości i strukturę


podobną do monenzyny i najsilniej kompleksuje kationy potasu, ma też zdolność do selektywnego kom-pleksowania jonów ołowiu [30]. Jej działanie przeciw-bakteryjne związane jest z modyfikowaniem transportu kationów potasu przez błony biologiczne [33]. Podob-nie jak większość naturalnych związków z tej grupy działa na bakterie Gram-dodatnie, w tym także beztle-nowce B. fragilis (wartości MIC od 0,39 do 12,5 µg/ml) i Clostridium spp. (MIC < 0,049 do 0,195 µg/ml), nato-miast nie wykazuje działania na bakterie Gram-ujemne, zarówno tlenowe (np. E. coli czy K. pneumonie) jak i beztlenowe (Veillonella spp., Fusobacterium spp.) [88]. W kilku ośrodkach badano także aktywność przeciw-wirusową nigerycyny. Grabley i wsp. [27], potwierdzili hamujący wpływ nigerycyny i jej pochodnej – nigerici-nolu na wirusy Herpes simplex, a Nakamura i wsp. [67] wykazali w badaniach in vitro hamowanie replikacji wirusa HIV-1 w zakażonych limfocytach T i mono-cytach przez niektóre jonofory karboksylowe, w tym nigerycynę, salinomycynę i kwas lasalowy.

Salinomycyna należy do antybiotyków jonoforo-wych o bardzo szerokim spektrum właściwości biolo-gicznych i stanowi obiekt zainteresowania badaczy na całym świecie. W ostatnich latach w różnych ośrod-kach prowadzone są szerokie badania właściwości przeciwnowotworowych salinomycyny [45]. Oprócz właściwości kokcydiostatycznych salinomycyna ma także sine działanie przeciwbakteryjne i jak w przy-padku kwasu lasalowego czy monenzyny jest ono skie-rowane na bakterie Gram-dodatnie. Z licznych badań wynika, że wykazuje silne działanie przeciwgronkow-cowe. W badaniach z udziałem szczepów wzorcowych S. aureus i S. epidermidis jak i metycylinowrażliwych i metycylinoopornych izolatów klinicznych S. aureus, uzyskiwane wartości MIC wynosiły od 1 do 4 µg/ml, a dla metycylinoopornych szczepów S. epidermidis – od 8 do 16 µg/ml [2, 35, 37]. Podejmowane są również próby modyfikacji cząsteczki salinomycymy w różnych kierunkach. Na przykład pochodne amidowe zawiera-jące w łańcuchach alkilowych atom siarki, tlenu czy azotu wykazywały działanie wobec lekoopornych szpi-talnych szczepów gronkowców, jednak słabsze niż nie-modyfikowana salinomycyna, a wartości MIC wynosiły od 32 do 64 µg/ml [2].

Pochodne estrowe salinomycyny wykazują zróż-nicowaną aktywność przeciwbakteryjną, najsilniejsze działanie, porównywalne z niemodyfikowaną salinomy-cyną uzyskano w przypadku estru trifluoroetylowego (MIC od 0,5 do 4 µg/ml), działał on także w niewielkim stopniu na grzyby z rodzaju Candida. Na aktywność tej pochodnej prawdopodobny wpływ miała obecność ato-mów fluoru w cząsteczce. W równolegle prowadzonych badaniach pochodna ta wykazała również bardzo silne działanie cytotoksyczne na lekooporne komórki rakowe [3]. Stwierdzono też hamujący wpływ salinomycyny na

tworzenie biofilmu przez różne izolaty beztlenowców C. perfringens [8] oraz szczepy S. epidermidis izolowane z krwi [badania własne].

4. Podsumowanie

Antybiotyki polieterowe stanowią bardzo ciekawą grupę substancji o szerokim spektrum aktywności bio-logicznej, w tym przeciwbakteryjnej, przeciwpierwot-niakowej i przeciwwirusowej a także przeciwzapalnej i przeciwnowotworowej. Od wielu lat niektóre z tych związków np. monenzyna czy kwas lasalowy, stosowane są w rolnictwie, głównie w hodowli drobiu, ponieważ posiadają silne działanie kokcydiostatyczne. Cały pro-ces działania jonoforów, czyli kompleksowanie kationów metali i ich transport z jednego środowiska wodnego do drugiego przez błony lipidowe powoduje zmianę ciśnie-nia osmotycznego we wnętrzu komórki bakteryjnej, zaburzenia równowagi sodowo-potasowej i w efekcie prowadzi do jej śmierci. Działanie przeciwbakteryjne jonoforów ze względu na wielkość cząsteczki skierowane jest głównie przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, zarówno tlenowym jak i beztlenowym. Liczne bada-nia wykazały aktywność przeciwgronkowcową kwasu lasalowego, monenzyny czy salinomycyny, również wobec metycylinoopornych szczepów klinicznych gron-kowców, zarówno S. aureus jak i S. epidermidis, także posiadających zdolność tworzenia biofilmu. Aktywność przeciwbakteryjną wykazują także różne, nowo syntety-zowane pochodne antybiotyków jonoforowych.

W ostatnich latach badaczy zainteresowała także aktywność przeciwnowotworowa niektórych jonofo-rów, np. salinomycyny. Wykazano, że zarówno komórki macierzyste niektórych nowotworów jak i komórki lekooporne są wrażliwe na działanie salinomycyny. Wszystko to skłania badaczy do poszukiwania nowych modyfikacji naturalnych antybiotyków jonoforowych, które prowadziłyby do optymalizacji potencjalnych właściwości farmakologicznych i zmniejszenia toksycz-ności związków.

Piśmiennictwo

1. Adovelande J., Schrével J.: Carboxylic ionophores in malaria chemotherapy: the effects of monensin and nigericin on Plasmodium falciparum in vitro and Plasmodium vinckei petteri in vivo. Life Sci. 59, PL309-PL315 (1996)

2. Antoszczak M., Maj E., Stefańska J., Wietrzyk J., Janczak J., Brzezinski B., Huczyński A.: Synthesis, antiproliferative and antibacterial activity of new amides of salinomycin. Bioorg. Med. Chem. Lett. 24, 1724–1729 (2014)

3. Antoszczak M., Popiel K., Stefańska J., Wietrzyk J., Maj E., Janczak J., Michalska G., Brzezinski B., Huczyński A.: Synthesis, cytotoxicity and antibacterial activity of new esters of polyether antibiotic – salinomycin. Eur. J. Med. Chem. 76, 435–444 (2014)


4. Berg DH., Hamill R.L.: The isolation and characterization of narasin, a new polyether antibiotic. J. Antibiot. 31, 1–6 (1978)

5. Berger J., Rachlin A.I., Scott W.E., Sternbach L.H., Gold-berg M.W. The isolation of three new crystalline antibiotics from Streptomyces. J. Am. Chem. Soc. 73, 5295–5298 (1951)

6. Butaye P., Devriese L.A., Haesebrouck F.: Antimicrobial growth promoters used in animal feed: effects of less well known anti-biotics on Gram-positive bacteria. Clin. Microbiol. Rev. 16, 175–188 (2003)

7. Callaway T.R., Edrington T.S., Rychlik J.L., Genovese K.J., Poole T.L., Jung Y.S., Bischoff K.M., Anderson R.C., Nisbet D.J.: Ionophores their use as ruminant growth promotants and impact on food safety. Curr. Issues Intest. Microbiol. 4, 43–51 (2003)

8. Charlebois A., Jacques M., Archmbault M.: Biofilm formation of Clostridium perfringens and its exposure to low-dose anti-microbials. Front. Microbiol. 5: 183 (2014)

9. Cirioni O., Giacometti A., Barchiesi F., Scalise G.: Invitro acti-vity of lytic peptides, inhibitors of ion transport systems and ionophorous antibiotics against Pneumocystis carinii. J. Antimicrob. Chemother. 42, 141–145 (1998)

10. Dennis S.M., Nagaraja T.G., Bartley E.E.: Effects of lasalocid or monensin on lactate-producing or – using rumen bacteria. J. Anim. Sci. 52, 418–426 (1981)

11. Dirlam J.P., Belton A.M., Chang S-P., Cullen W.P., Huang L.H., Kojima Y., Maeda H., Nismyama S., Oscarson J.R., Sakakibara T., Tone J., Yamada M., Schulte G.K.: CP-78,545, a new monocar-boxylic acid ionophore antibiotic related to zincophorin and produced by a Streptomyces. J. Antibiot. 42, 1213–1220 (1989)

12. Dirlam J.P., Bordner J., Chang S.P., Grizzuti A., Nelson T.H., Tynan E.J., Whipple E.B.: The isolation and structure of CP-120,509, a new polyether antibiotic related to semduramicin and produced by mutants of Actinomadura roseorufa. J. Antibiot. 45, 1544–1548 (1992)

13. Dobler M. Natural cation-binding agents (w) Comprehensive Supramolecular Chemistry: Molecular recognition: Receptors for ration guests, red. G.W. Gokel, Pergamon, New York, USA, 2004, s. 267–313

14. Dorkov P., Pantcheva I.N., Sheldrick W.S., Mayer-Figge H., Petrova R., Mitewa M.: Synthesis, structure and antimicrobial activity of manganese(II) and cobalt(II) complexes of the poly-ether ionophore antibiotic sodium Monens in A. J. Inorg. Biochem. 102, 26–32 (2008)

15. Dutton C.J., Bank B.J., Cooper C.B.: Polyether ionophores. Nat. Prod. Rep. 12, 165–181 (1995)

16. Edrington T.S., Callaway T.R., Varey P.D, Jung Y.S., Bischoff K.M., Elder R.O., Anderson R.C,. Kutter E, Brabban A.D., Nisbet D.J.: Effects of the antibiotic ionophores monensin, lasalocid, laidlo-mycin propionate and bambermycin on Salmonella and E. coli O157:H7 in vitro. J. Appl. Microbiol. 94, 207–213 (2003)

17. Elsasser T.H.: Potential interactions of ionophore drugs with divalent cations and their function in the animal body. J. Anim Sci. 59, 845–853 (1984)

18. Fard R.M.N., Heuzenroeder M.W., Barton M.D.: Antimicrobial and heavy metal resistance in commensal enterococci isolated from pigs. Vet. Microbiol. 148, 276–282 (2011)

19. Ferdani R, Gokel G.W.: Ionophores. (w) Encyclopedia of supramolecular chemistry. red. J.L. Atwood, J.W. Steed, Marcel Dekker Inc., 2004, s. 760–766

20. Fleck W.F., Strauss D.G., Meyer J., Porstendorfer G.: Ferman-tation, isolation and biological activity of maduramycin: a new antibiotic from Actinomadura rubra. Z Allg. Mikrobiol. 18, 389–398 (1978)

21. Fuchs D., Heinold A., Opelz G., Daniel V., Naujokat C.: Salino-mycin induces apoptosis and overcomes apoptosis resistance in human cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 743–749 (2009)

22. Gabrielli C., Hemery P., Letellier P., Masure M., Perrot H., Rahmi M-I., Turmine M.: Investigation of ion-selective electro-des with neutral ionophores.and ionic sites by EIS. II. Applica-tion to K+ detection. J. Electroanal. Chem. 570, 291–304 (2004)

23. Gale R.M., Higgens C.E, Hoehn M.M.: US Patent, 3923823 (1975)

24. Galitzer S.J., Oehme F.W.: A literature review on the toxicity of lasalocid, a polyether antibiotic. Vet. Hum. Toxicol. 26, 322–326 (1984)

25. Gao Z., Li Y., Cooksey J.P., Snaddon T.N., Schunk S., Viseux E.M., McAteer S.M., Kocienski P.J.: A synthesis of an ionomycin cal-cium complex, Angewandte ChemieInternational Edition, 48, 5022–5025 (2009)

26. Ghosh-Choudhury N., Graham A., Ghosh, H.P.: Herpes sim-plex virus type 2 glycoprotein biogenesis: effect of monensin on glycoprotein maturation, intracellular transport and virus infectivity. J. Gen. Virol. 68, 1939–1949 (1987)

27. Grabley S, Hammann P., Klein R., Seibert G., Winkler I., Kröger A., Ditzel F.: Secondary metabolites by chemical scree-ning 17. Nigericinol derivatives: synthesis, biological activities, and modeling studies. J. Med. Chem. 35, 939–944 (1992)

28. Gupta P.B., Onder T.T., Jiang G., Tao K., Kuperwasser C., Weinberg R.A., Lander E.S.: Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell, 138, 645–659 (2009)

29. Guyot J., Jeminet G., Prudhomme M., Sancelme M., Meiniel R.: Interaction of the calcium ionophore A.23187 (calcimycin) with Bacillus cereus and Escherichia coli. Lett. Appl. Microbiol. 16, 192–195 (1993)

30. Hamidinia S.A., Tan B., Erdahl W.L., Chapman C.J., Taylor R.W., Pfeiffer D.R.: The ionophore nigericin transports Pb2+ with high activity and selectivity: a comparison to monensin and ionomycin. Biochemistry, 43, 15956–15965 (2004)

31. Haney Jr. M.E., Hoehn M.M.: Monensin, a new biologically active compound. I. Discovery and isolation. Antimicrob. Agents Chemother. 1, 349–352 (1967)

32. Hanson L.J., Eisenbeis H.G., Givens S.V.: Toxic effect of lasalocid in horses. Am. J. Vet. Res. 42, 456–461 (1981)

33. Harold, F. M., Baarda, J.R.: Effects of nigericin and monactin on cation permeability of Streptococcus faecalis and metabolic capacities of potassium-depleted cells. J. Bacteriol. 95, 816–823 (1968)

34. Huczyński A., Domańska A., Paluch I., Stefańska J., Brzezin-ski B.: Synthesis of new semi-synthetic dipodands and tripo-dands from naturally occuring polyether ionophores. Tet. Lett. 49, 5572–5575 (2008)

35. Huczyński A., Janczak J., Antoszczak M., Stefańska J., Brzezin-ski B.: X-ray, FT-IR, NMR and PM5 structural studies and anti-bacterial activity of unexpectedly stable salinomycin-benzotria-zole intermediate ester. J. Mol. Str. 1022, 197–203 (2012)

36. Huczyński A., Janczak J., Rutkowski J., Łowicki D., Pietruczuk A., Stefańska J., Brzezinski B., Bartl F.: Lasalocid acid as a lipophilic carrier ionophore for allylamine: spectroscopic, crystallographic and microbiological investigation. J. Mol. Str. 936, 92–98 (2009)

37. Huczyński A., Janczak J., Stefańska J., Antoszczak M., Brzezin-ski B.: Synthesis and antimicrobial activity of amide derivatives of polyether antibiotic-salinomycin. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4697–4702 (2012)

38. Huczyński A., Janczak J., Stefańska J., Rutkowski J., Brzezinski B.: X-ray, spectroscopic and antibacterial activity studies of the 1:1 complex of lasalocid acid with 1,1,3,3-tetramethylguanidine. J. Mol. Str. 977, 51–55 (2010)

39. Huczyński A., Paluch I., Ratajczak-Sitarz M., Katrusiak A., Stefańska J., Brzezinski B, Bartl F.: Spectroscopic studies, cry-stal structures and antimicrobial activities of a new lasalocid 1-naphthylmethyl ester. J. Mol. Str. 891, 481–490 (2008)


40. Huczyński A., Ratajczak-Sitarz M., Stefańska J., Kartusiak A., Brzezinski B., Bartl F.: Reinvestigation of the structure of monensin A phenylurethane sodium salt based on X-ray cry-stallographic and spectroscopic studies, and its activity aga-inst hospital strains of methicillin-resistant S. epidermidis and S. aureus. J. Antibiot. 64, 249–256 (2011)

41. Huczyński A., Rutkowski J., Wietrzyk J. Stefańska J., Maj E., Ratajczak-Sitarz M., Kartusiak A., Brzezinski B., Bartl F.: X-ray crystallographic, FT-IR and NMR studies as well as anticancer and antibacterial activity of the salt formed between ionophore antibiotic Lasalocid acid and amines. J. Mol. Str. 1032, 69–77 (2013)

42. Huczyński A., Stefańska J., Piśmienny M., Brzezinski, B.: Spec-troscopic, semiempirical studies and antibacterial activity of new urethane derivatives of natural polyether antibiotic – Monensin A. J. Mol. Struct. 1034, 198–206 (2013)

43. Huczyński A., Stefańska J., Przybylski P., Brzezinski B., Bartl F.: Synthesis and antimicrobial properties of Monensin A esters. Bioorg. Med. Chem. Lett. 18, 2585–2589 (2008)

44. Huczyński A.: Polyether ionophores – promising bioactive mole-cules for cancer therapy. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 7002–7010 (2012)

45. Huczyński A.: Salinomycin – a new cancer drug candidate. Chem. Biol. Drug Des. 79, 235–238 (2012)

46. Iacoangeli A., Melucci-Vigo G., Risuleo G.: The ionophore monensin inhibits mouse polyomavirus DNA replication and destabilizes viral early mRNAs. Biochimie, 82, 35–39 (2000).

47. Johnson D.C., Spea P.G.: Monensin inhibits the processing of herpes simplex virus glycoproteins, their transport to the cell surface, and the egress of virions from infected cells. J. Virol. 43, 1102–1112 (1982)

48. Kart A., Bilgili A.: Ionophore antibiotics: toxicity, mode of action and neurotoxic aspect of carboxylic ionophores. J. Anim. Vet. Adv. 7, 478–751 (2008)

49. Kevin D.A. II, Meujo D.A.F., Hamann M.T.: Polyether ionopho-res: broad spectrum and promising biologically active molecules for the control of drug-resistant bacteria and parasites. Expert Opin. Drug. Discov. 4, 109–146 (2009)

50. Kitame F., Utsushikawa K., Kohama T.: Laidlomycin, a new antimycoplasmal polyether antibiotic. J. Antibiot. 27, 884–888 (1974)

51. Ledger P.W., Uchida N., Tanzer M.L.: Immunocytochemical lacalization of procollagen and fibronectin in human fibro blasts: effect of the monovalent ionophore, monensin. J. Cell Biol. 87, 663–671 (1980)

52. Liu C. M., Hermann T. E., Liu M.: X-14547A, a new ionopho-rous antibiotic produced by Streptomyces antibioticus NRRL 8167. Discovery, fermentation, biological properties and taxo-nomy of the producing culture. J. Antibiot. 32, 95–99 (1979)

53. Liu C.M., Hermann T.E.: Characterization of ionomycin as a cal-ciumionophore. J. Biol. Chem. 253, 5892–5894 (1978)

54. Łowicki D. Huczyński A., Stefańska J., Brzezinski B.: Spectro-scopic semi-empirical and antimicrobial studies of a new amide of monensin A with 4-aminobenzo-15-crown-5 and its com-plexes with Na+ cation at 1:1 and 1:2 ratios. Tetrahedron, 67, 1468–1478 (2011)

55. Łowicki D., Huczyński A., Ratajczak-Sitarz M., Kartusiak A., Stefańska J., Brzezinski B.: Structural and antimicrobial studies of a new N-phenylamide of Monensin A complex with sodium chloride. J. Mol. Str., 923, 53–59 (2009)

56. Łowicki D., Huczyński A., Stefańska J. Brzezinski B.: Structural characterization and antibacterial activity against clinical isola-tes of Staphylococcus of N-phenylamide of monensin A and its 1:1 complexes with monovalent cations. Eur. J. Med. Chem. 45, 4050–4057 (2010)

57. Łowicki D., Huczyński A., Stefańska J., B. Brzezinski: Synthesis, structural and antimicrobial studies of a new N-allylamide of monensin A and its complexes with monovalent metal cations. Tetrahedron 65, 7730–7740 (2009)

58. Łowicki D., Huczyński A.: Structure and antimicrobial proper-ties of monenin A and its derivatives: summary of the achieve-ments. BioMed. Res. Int. DOI: 10.1155/2013/742149 (2013)

59. Margolis L.B., Novikova I.Y., Rozovskaya I.A., Skulachev V.P.: K+/H+-antiporter nigericin arrests DNA synthesis in Ehrlich ascites carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 6626–6629 (1989)

60. Marsh M., Wellsteed J., Kern, Harms E, Helenius A.: Monensin inhibits Semliki Forest virus penetration into culture cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5297–5301 (1982)

61. Martel A., Devriese L.A., Cauwerts K., De Gussem K., Deco-stere A., Haesebrouck A.: Susceptibility of Clostridium perfringens strains from broiler chickens to antibiotics and anticocci-dials. Avian Pathol. 33, 3–7 (2004)

62. Merior M., Sly W.S.: The role of intermediate vesicles in the adsorptive endocytosis and transport of ligand to lysosome by human fibroblasts. J. Cell Biol. 96, 644–650 (1983)

63. Mitani M., T. Yamanishi T., Miyazaki Y.: Salinomycin: a new monovalent cation ionophore. Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1231–1236, (1975)

64. Miyake H., Hara I., Yamanaka K., Arakawa S., Kamidono S.: Calcium ionophore, ionomycin inhibits growth of human blad-der cancer cells both in vitro and in vivo with alteration of Bcl-2 and Bax expression levels. J. Urol. 162, 916–921 (1999)

65. Mollenhauer H.H., Morre D.J. Rowe L.D.: Alteration of intracel-lular traffic by monensin; mechanism, specificity and relation-ship to toxicity. Biochim. Biophys. Acta, 1031, 225–246 (1990)

66. Nagatsu A., Takahashi T., Isomura M., Nagai S., Ueda T. Mura-kami N., Sakakibara J., Hatano K.: Studies on chemical modi-fication of monensin. V. Synthesis, sodium ion permeability, antibacterial activity, and crystal structure of 7-O-(4-substituted benzyl)monensins. Chem. Pharm. Bull. 42, 2269–2275 (1994)

67. Nakamura M., Kunimoto S., Takahashi Y., Naganawa H., Sakaue M., Inoue S., Ohno T., Takauchi T.: Inhibitory effects of polyethers on human immunodeficiency virus replication. Antimicrob. Agents Chemother. 36, 492–494 (1992)

68. Nakamura A., Nagai S. Ueda S. Murakami N. Sakakibara J., Shibuya H., Kitagawa I.: Studies on the chemical modification of monensin. III. Synthesis and sodium ion transport activity of macrocyclic monensylamino acid-1,29-lactones. Chem. Pharm. Bull. 39, 1726–1730 (1991)

69. Novilla M.N.: The veterinary importance of the toxic syndrome induced by ionophore. Vet. Hum. Toxicol. 34, 66–70 (1992)

70. Oehme F.W., Pickrel J.A.: An analysis of chronic oral toxicity of polyether ionophore antibiotics in animals. Vet. Hum. Toxicol. 41, 251–257 (1999)

71. Okamoto M., Hara I. Miyake H., Hara S., Gotoh A., Arakawa S., Kamidono S.: Synergistic antitumor effect of ionomycin and cisplatin against renal cell carcinoma in vitro and in vivo. Urology 57, 188–192 (2001)

72. Otoguro K., Ishiyama A., Ui H., Kobayashi M., Manabe C., Yan G., Takahashi Y., Tanaka H., Yamada H., Omura S.: In vitro and in vivo antimalarial activities of the monoglycoside poly-ether antibiotic, K-41 against drug resistant strains of Plasmo-dia. J. Antibiot. 55, 832–834 (2002)

73. Oz H.S., Hughes W.T., Rehg J.E. Efficacy of lasalocid against murine Pneumocystis carinii pneumonitis. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 191–192 (1997)

74. Park W.H., Seol J.G., Kim E.S., Kang W.K., Im Y.H., Jung C.W., Kim B.K., Lee Y.Y.: Monensin-mediated growth inhibition in human lymphoma cells through cell cycle arrest and apoptosis. Br. J. Haematol. 119, 400–407 (2002)


75. Pressman B. C.: Biological applications of ionophores. Annu. Rev. Biochem. 45, 501–530 (1976)

76. Pressman B.C., Fahim M.: Pharmacology and toxicology of the monovalent carboxylic ionophores. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 22, 465–490 (1982)

77. Pressman B.C., Harris E.J., Jagger W.S., Johnson J.H.: Antibio-tic-mediated transport of alkali ions across lipid barriers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58, 1949–1956 (1967)

78. Ricketts A. P., Glazer E. A., Migaki T. T., Olson J. A.: Anticocci-dial efficacy of semduramicin in battery studies with laboratory isolates of coccidian. Poult. Sci. 71, 98–103 (1992)

79. Russel J.B: A proposed mechanism of monensin action in inhi-biting ruminal bacterial growth: effects on ion flux and proton-motive force. J. Anim. Sci. 64, 1519–1525 (1987)

80. Rutkowski J., Brzezinski B.: Structures and properties of natu-ralny occyrring polyether antibiotics. BioMed. Res. Int. 2013: Article ID 162513 (2013)

81. Schlegel R, Willingham M., Pastan I.: Monensin blocks endo cy-tosis of vesicular stomatitis virus. Bioch. Biophys. Res. Commun. 102, 992–998 (1981)

82. Shier W.T., DuBourdieu D.J.: Sodium- and calcium-dependent steps in the mechanism of neonatal rat cardiac myocyte killing by ionophores. I. The sodium-carrying ionophore, monensin. Toxicol. Appl. Pharmacol. 116, 38–46 (1992)

83. Steinrauf L.K., Pinkerton M., Chamberlin J.W. 1968. The structure of nigericin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 33, 29–31 (1968)

84. Tanaka R., Nagatsu A., Mizukami H., Ogihara Y., Sakakibara J.: Studies on Chemical modification of monensin IX. Synthesis of 26-substituted monensins and their Na1 ion transport activity. Chem. Pharm. Bull. 49, 711–715 (2001)

85. Tsuji N., Nagashima K., Kobayashi M., Wakisaka Y., Kawa-mura Y.: Two new antibiotics, A218 and K41 isolation and cha-racterization. J. Antibiot. 29, 10–14 (1976)

86. Tsukube H., Takagi K., Higashiyama T., Iwachido T, Hayama N.: Biomimetic membrane transport: interesting ionophore func-tions of naturally occurring polyether antibiotics toward unu-sual metal cations and amino acid ester salt. Inorg. Chem. 33, 2984–2987 (1994)

87. Tynan E.J., Nelson T.H., Davies R.A., Wernau W.C.: The pro-duction of semduramicin by direct fermentation. J. Antibiot. 45, 813–815 (1992)

88. Watanabe K., Watanabe J., Kuramitsu S., Maruyama H.M.: Com-parison of the activity of ionophores with Rother antibacteril agents against anaerobes. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 519–525 (1981)

89. Westley J.W.: Notation and classification (w) Polyether antibiotics: naturally occurring acid ionophores, red. J.W. Westley, vol. 1. Biology, Marcel Dekker, Inc., New York, 1982, s. 1–20

90. Westley J.W.: Chemical transformations of polyether antibiotics. (w) Polyether antibiotics: naturally occurring acid ionophores, red. J.W. Westley, vol. 2. Chemistry, Marcel Dekker, Inc., New York, USA, 1983, s. 51–87

91. Westley J.W., Liu C. M., Blount J.F.: Isolation and characteri-zation of a novel polyether antibiotic of the pyrrolether class, antibiotic X-14885A. J. Antibiot. 36, 1275–1278 (1983)

92. Yoo J.C., Kim J.H., Ha J.W., Park N.S., Sohng J.K., Park S.C., Kim M.S., Seong C.N.: Production and biological activity of laidlomycin, anti-MRSA/VRE antibiotic from Streptomyces sp. CS684. J. Microbiol. 45, 6–10 (2007)


* Autor korespondencyjny: Pracownia Gastroimmunologii, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki, Banacha 12/16, 90-237 Łódź; tel: (42) 635 45 41; e-mail: [email protected]

MIKROFLORA MIODU JAKO ŹRÓDŁO SPOR C. BOTULINUMI PRZYCZYNA ROZWOJU BOTULIZMU NIEMOWLĄT

– ROZWAŻANIA NA TEMAT ZASADNOŚCI OCZYSZCZANIA MIODUW KONTEKŚCIE OBOWIĄZUJĄCEGO PRAWA

Karolina Rudnicka1*, Paulina Kwiatkowska1, Adrian Gajewski1, Magdalena Chmiela1

1 Pracownia Gastroimmunologii, Katedra Immunologii i Biologii Infekcyjnej,Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Uniwersytet Łódzki

Wpłynęło w lipcu 2012 r.

1. Wstęp. 2. Fizykochemiczne i przeciwdrobnoustrojowe właściwości miodu. 3. Mikroflora miodu. 4. Środowiskowe rezerwuary C. botulinum. 5. Proces wytwarzania miodu i drogi transmisji spor C. botulinum. 6. Metody oczyszczania miodu i ich wpływ na czystość mikrobiologiczną. 7. Miód jako czynnik ryzyka rozwoju botulizmu niemowląt. 8. Aspekty prawne. 9. Wytyczne dotyczące oznakowania miodu. 10. Zalecenia w sprawie ograniczenia zapadalności na botulizm niemowląt. 11. Podsumowanie

Honey as a reservoir of C. botulinum and a risk factor for infant botulism

Abstract: Honey is a natural, sweet substance produced by honey bees Apis millifera. In spite of its antimicrobial properties, honey may contain certain microbes, most of which are harmless to humans. However, the presence of Clostridium botulinum in honey is considered a risk factor for infant botulism development. Infant botulism is a toxicoinfection occurring in infants under the age of one year, after C. botulinum spores consumption. This disease is extremely rare, however, in recent years there has been an increase in the number of infant botulism cases. According to CDC (Centres for Disease Control and Prevention) infant botulism constitutes 76% of all botulism cases and more than half occurs as a consequence of honey consumption. C. botulinum is easily transmitted from soil to blossom, pollen, surface of honey bees and then to honey. The Polish legal system states that any integral components cannot be excluded from honey during processing. However, it is impossible to eliminate the spores from honey without deactivating its enzymes or removing pollen. The EU together with CDC recommend that infants under one year of age should not be fed with honey. They obligate the companies to provide the consumer with the information about the risk of honey consumption by infants. In Poland, infant botulism is not registered, is underestimated and may be misdiagnosed as a sudden infant death syndrome. The producers of honey are not obligated to label honey with the proper information about the microbiological risk of its consumption by infants.

1. Introduction. 2. Physico-chemical and antimicrobial properties of honey. 3. Microbiology of honey. 4. Environmental reservoirs of C. botulinum. 5. Production of honey and its contamination routes with C. botulinum. 6. Methods of purification and their impact on microbiological safety of honey. 7. Honey as a risk factor for the infant botulism development. 8. Legal notes. 9. Labeling of honey. 10. Recommendations on the safety of honey consumption by infants. 11. Summary

Słowa kluczowe: botulizm niemowląt, Clostridium botulinum, mikroflora miodu, miódKey words: infant botulism, Clostridium botulinum, microorganisms in honey, honey

1. Wstęp

Zgodnie z definicją Komisji Europejskiej, przyjętą w drodze rozporządzenia przez ustawodawcę krajo-wego, miód jest „naturalnie słodką substancją produ-kowaną przez pszczoły Apis mellifera z nektaru roślin lub wydzielin żywych części roślin lub z wydzielin owa-dów wysysających żywe części roślin, zbieranych przez pszczoły i przerabianych przez łączenie specyficznych substancji z pszczół, składanych, odwodnionych, gro-madzonych i pozostawianych w plastrach miodu do dojrzewania” [21, 24–25]. Każdy z powyższych oraz dalsze etapy obróbki miodu są narażone na kontakt z mikroorganizmami obecnymi w środowisku [28, 42, 58]. Ponadto, drobnoustroje wchodzące w skład mikro-flory układu pokarmowego pszczół mogą przedosta-wać się do miodu, zarówno podczas zbierania nektaru czy pyłku jak i dostarczania ich do ula. Właściwości

przeciwbakteryjne miodu, sprawiają, że część drobno-ustrojów jest eliminowana już na etapie odwadniania i dojrzewania miodu, natomiast wzrost innych jest wyłącznie zahamowany [42].

Bakterie zdolne do tworzenia przetrwalników są szczególnie oporne na odwodnienie, wysokie stęże-nie cukrów i właściwości przeciwbakteryjne miodu [2]. Drobnoustroje zaliczane do rodzaju Clostridium i Bacillus są odpowiednio, beztlenowymi i tlenowymi pałeczkami (d. laseczkami) przetrwalnikujacymi sze-roko rozpowszechnionymi w środowisku naturalnym. Spory bakteryjne, wraz z ziemią mogą przedostawać się na powierzchnię roślin oraz pszczół i w ten sposób trafiają do ula, a następnie do miodu [50, 58]. W skła-dzie mikroflory miodu dominują drobnoustroje środo-wiskowe, nieszkodliwe dla człowieka [28, 42]. Z uwagi na właści wości miodu, drobnoustroje w nim zawarte nie nam nażają się, a stopień kontaminacji mikrobiolo-

MIKROFLORA MIODU JAKO ŹRÓDŁO SPOR C. BOTULINUM I PRZYCZYNA ROZWOJU BOTULIZMU NIEMOWLĄT 185

gicznej w przeliczeniu na gram produktu, jest zazwy-czaj niewielki [48]. Potencjalnie chorobotwórczym gatunkiem wykrywanym w miodzie jest pałeczka woskowa Bacillus cereus będąca przyczyną zatruć i zakażeń pokarmowych. Jednak w miodzie germina-cja i wytwarzanie toksyn są całkowicie zahamowane, a dawka B. cereus niezbędna do wywołania objawów wynosi co najmniej kilka do kilkunastu tysięcy spor i znacznie przekracza ilości wykrywane w miodzie [60]. Obok relatywnie niegroźnej pałeczki woskowej, w skład mikroflory miodu wchodzą przetrwalniki Clostridium.

Pałeczka (d. laseczka) jadu kiełbasianego, Clostridium botulinum, jest przetrwalnikującą, Gram-dodat-nią bakterią beztlenową, szeroko rozpowszechnioną w środowisku naturalnym [46]. Bakterie te są źród-łem toksyny botulinowej (BoNT) odpowiedzialnej za objawy zatrucia występujące u ludzi i zwierząt. Na podstawie różnic we właściwościach antygenowych BoNT wyodrębniono siedem serotypów C. botulinum (A-G). Natomiast zróżnicowanie w zakresie cech biochemicznych i optymalnych warunków wzrostu pozwoliły na wyodrębnienie czterech grup fenoty-powych (Tab. I). Szczepy zaliczane do grupy I i II są najczęstszą przyczyną chorób ludzi, natomiast szczepy należące do grupy III, wywołują choroby zwierząt. Ponadto C. butyricum i C. baratii, produkujące odpo-wiednio BoNT typu E i F, również mogą być przyczyną botulizmu. Ponadto istnieją tzw. szczepy mozaikowe produkujące dwa typy toksyn jednocześnie. Zidentyfi-kowano dotychczas następujące fenotypy mozaikowe: AB, Ab, Af, Ba, Bf. Duże litery w nazwie oznaczają toksynę dominującą, a małe tę produkowaną na niskim

poziomie (49–50). W zależności od drogi jaką toksyna lub spory bakteryjne trafiają do organizmu, serotypu toksyny, a nawet wieku pacjenta, choroba wywoływana przez C. botulinum może przyjmować różną postać. Amerykańskie Centrum ds. Zwalczania i Zapobiegania Chorób – CDC (Centres for Disease Control and Prevention), wyróżnia cztery typy botulizmu: botulizm pokar-mowy (foodborn botulism), botulizm przyranny (wound botulism), botulizm niemowląt (infant botulism) oraz tzw. inne, niezwykle rzadko występujące typy botu-

lizmu, nie mieszczące się we wcześniej wymienionych definicjach (Tab. II). Definicje przypadków chorób zakaźnych przygotowane przez Zakład Epidemiologii Narodowego Instytutu Zdrowia na potrzeby nadzoru epidemiologicznego definiują powyższe jednostki cho-robowe w oparciu o objawy [14–15, 55].

Najczęściej występującą formą botulizmu jest postać pokarmowa (klasyczna), której objawy wywołane są spożyciem pokarmu zawierającego toksynę botulinową. BoNT wchłaniana w jelitach, wiąże się z komórkami nerwowymi powodując w niedługim czasie (średnio po upływie 18–36 godz.) objawy symetrycznego i zstę-pującego paraliżu obwodowego. Pierwszymi sympto-mami są nudności, wymioty i zaparcia. W kolejnym etapie rozwija się porażenie nerwów czaszkowych, opadanie powiek i zaburzenia widzenia. Diagnostyka botulizmu klasycznego opiera się głównie na objawach i jest potwierdzana w badaniu laboratoryjnym stolca, surowicy, wymiocin lub resztek jedzenia, w kierunku toksyny botulinowej. Dla skutecznej immunoterapii, niezbędne jest określenie typu toksyny botulinowej, ponieważ podstawą leczenia jest podanie, obok końskiej

Serotyp BoNT* A, B, F B, E, F C, D GOptymalna temperatura wzrostu 35–40°C 18–25°C 40°C 37°CWłaściwości proteolityczne + – –/+ +Produkcja lipazy + + + –

Tabela ICharakterystyka grup I–IV Clostridium botulinum [50]

* toksyna botulinowa

CechaGrupa

I II III IV

Tabela IIRodzaje botulizmu wg Definicji CDC [14–15]

* toksyna botulinowa

Typ botulizmu Patogeneza, drogi zakażenia/zatruciaPokarmowy spożycie pokarmu zawierającego neurotoksynę BoNT*Przyranny zanieczyszczenie rany sporami; rozwój C. botulinum; wydzielanie BoNT w miejscu zranieniaNiemowlęcy spożycie pokarmu zawierającego spory C. botulinum, dotyczy niemowląt poniżej 12 miesiąca życia; tymczasowa kolonizacja przewodu pokarmoweg o; uwalnianie BoNT do światła jelita; toksykoinfekcjaDorosłych patogeneza i objawy jak w botulizmie niemowląt; dotyczy dorosłych i dzieci powyżej 12 miesiąca życiaInny jatrogenny, inhalacyjny, toksykoinfekcja dorosłych o etiologii C. botulinum

186 KAROLINA RUDNICKA, PAULINA KWIATKOWSKA, ADRIAN GAJEWSKI, MAGDALENA CHMIELA

surowicy przeciwbotulinowej, ludzkiej swoistej immu-noglobuliny przeciwbotulinowej. Botulizm jest chorobą występującą sporadycznie [14, 17, 46]. Według danych CDC w Stanach Zjednoczonych od 1973 r. notuje się średnio 24 przypadki botulizmu pokarmowego, 3 przy-padki botulizmu przyrannego oraz aż 71 przypadków botulizmu niemowlęcego [13–14].

Botulizm niemowlęcy, to choroba o charakterze tok-sykoinfekcji, występująca u dzieci poniżej 1 roku życia, po spożyciu miodu zanieczyszczonego przetrwalnikami pałeczki jadu kiełbasianego [11, 16, 29, 51]. Liczba spor, która zagraża życiu niemowlęcia, jest nieszkodliwa dla osób dorosłych, posiadających w pełni wykształconą mikroflorę jelit, która chroni przed kolonizacją C. botulinum [63]. Aby zrozumieć, w jaki sposób przetrwalniki trafiają do miodu i w nim przeżywają, należy prześledzić proces jego wytwarzania i obróbki, rozpatrzeć poten-cjalne drogi jego kontaminacji oraz poznać zakres właś-ciwości przeciwbakteryjnych miodu i jego mikroflorę.

2. Fizykochemiczne i przeciwdrobnoustrojowe właściwości miodu

Do głównych składników miodu należą woda i węg-lowodany. Cukry stanowią 95–99% suchej masy miodu, a w ich składzie dominują łatwo przyswajalne mono-sacharydy t.j.: fruktoza (38,2%), glukoza (31,3%) oraz disacharydy (maltoza, sacharoza i izomaltoza) [58, 31]. Pszczoły dostarczają nektar kwiatowy do komórek pla-stra, gdzie jest on poddawany koncentracji (odwadnia-nie) i dojrzewaniu [42]. W tym czasie miód traci od 25 do 70% pierwotnej zawartości wody. Kwasy organiczne stanowią jedynie 0,57% miodu, jednak mają znaczący wpływ na właściwości organoleptyczne. Składniki mineralne to zaledwie 0,17% miodu, przy czym potas jest wśród nich pierwiastkiem dominującym. Ponadto w miodzie wykrywa się śladowe ilości wapnia, miedzi, żelaza, magnezu i fosforu, a także witamin: C, B, B2, B6 oraz enzymów i fitozwiązków odpowiadających za właściwości antybakteryjne [8, 58, 36]. Spektrum przeciwdrobnoustrojowe miodów europejskich jest szerokie i obejmuje zarówno bakterie Gram-ujemne, Gram-dodatnie jak i grzyby (Tab. III).

Za właściwości przeciwbakteryjne miodu odpowiada kilka czynników, m.in.: wysoka zawartość cukrów, niskie pH, obecność nadtlenku wodoru i fitozwiązków [8, 31, 58]. Wysoka gęstość miodu jest wynikiem niskiego współczynnika aktyw ności wody (aw) czyli wartości cząstkowego ciśnienia pary wodnej zawartej w produk-cie spożywczym do standardowego ciśnienia cząstko-wego wody destylowanej w danej temperaturze. Średnia wartość aw dla miodu waha się od 0,56 do 0,62, podczas gdy wzrost większości bakterii jest całkowicie zahamo-wany przy aw wynoszącej 0,94–0,99. Do kiełkowania

zarodników grzybów z rodzaju Candida może docho-dzić w miodach o aktywności wody przekraczającej 0,7 stąd drobnoustroje te stanowią częstą przyczynę psucia miodu [8, 67]. Średnie pH miodu wynosi od 3,2 do 4,5. Jednak wiele gatunków chorobotwórczych drobnoustrojów (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Streptococcus pyogenes) znosi kwaśne pH i nie jest ono czynnikiem ograniczającym ich rozwój [26–27]. Obecność nadtlenku wodoru w miodzie jest wynikiem aktyw ności enzymatycznej oksydazy gluko-zowej pochodzącej ze ślinianek pszczelich. Nektar kwia-towy w głównej mierze składa się z wielocukrów. Po jego dostarczeniu do ula, robotnice przeżuwają nektar i przy użyciu oksydazy glukozowej katalizują reakcję rozkładu glukozy do kwasu glukuronowego z wydziele-niem nadtlenku wodoru [58, 36]. Aktywność nadtlenku wodoru wzrasta wraz z rozcieńczeniem miodu a jego aktywność przeciwdrobnoustrojowa jest skierowana głównie przeciw grzybom [58]. Wykazano, że nasile-nie aktywności przeciwbakteryjnej miodu jest w dużej mierze zależne od gatunku rośliny, z której pochodzi nektar [28]. To fitozwiązki zawarte w miodzie deter-minują dodatkowe właściwości przeciwbakteryjne, niezależne od nadtlenku wodoru. Są to substancje pochodzenia roślinnego o udokumentowanych właś-ci wościach antyoksydacyjnych, przeciwdrobnoustro-jowych i antyproliferacyjnych. Miód jest źródłem sze-rokiej gamy fitozwiązków tj. polifenole, flawonoidy, terpeny czy kwasy fenolowe. Ich zawartość w miodzie w głównej mierze zależy od klimatu i szerokości geo-graficznej (klimatu). Obecność i aktywność fitozwiąz-ków wykazano dla większości naturalnych rodzajów miodów europejskich. Miodem o szczególnym działa-niu przeciwdrobnoustrojowym jest tzw. miód manuka [2]. Substancją aktywną odpowiedzialną za właściwości przeciwdrobno ustrojowe tego miodu jest metyloglio-ksal, związek pochodzący z dihydrooksyacetonu zawar-

Acinetobacter sp. [57] Aspergillus niger [10]Aeromonas hydrophila [57] Candida sp. [36]Clostridium jejuni [57] Penicillum chrysogenum [10]Escherichia coli [58] Zygosaccharomyces rouxii [31]Helicobacter pylori [49] Zygosaccharomyces melis [31]Plesiomonas shigelloides [58] Saccharomyces cerevisiae [31]Pseudomonas sp. [57] Zygosaccharomyces baillii [31]Salmonella Typhi [58]Shigella boydi [57]Staphylococcus aureus [57]Vibrio cholerae [58]Yersinia enterocolitica [57]

Tabela IIISpektrum aktywności przeciwdrobnoustrojowej

miodów europejskich

Bakterie Grzyby


tego w nektarze roślin z gatunku Leptospermum sp. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe miodu manuka wykazano względem bakterii takich jak Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aureginosa, Enterococcus faecalis i wielu innych, nawet wielolekoopornych patogenów człowieka. Stąd miody te znalazły zastoso-wanie w leczeniu trudno gojących się ran [69]. W prze-ciwieństwie do nadtlenku wodoru enzymy pochodzenia tkankowego nie obniżają aktywności przeciwdrobno-ustrojowej zależnej od fitozwiązków, a promieniowanie gamma stosowane podczas sterylizacji miodu do celów medycznych nie obniża ich skuteczności [36].

Sugeruje się, że lecznicze właściwości miodu nie ograniczają się wyłącznie do aktywności przeciwbakte-ryjnej. Badania in vitro, z użyciem ludzkich leukocytów krwi obwodowej, hodowanych w obecności różnych stę-żeń miodu, dowiodły, iż wykazuje on silne właściwości immunomodulujące, szczególnie w zakresie pobudzania leukocytów do proliferacji i fagocytozy oraz wydziela-nia interleukiny (IL)-1, IL-6 i czynnika martwicy guzów TNF-α (tumor necrosis factor), a także właściwości anty-proliferacyjne, które mogą w przysz łości znaleźć zasto-sowanie w leczeniu nowotworów [1].

3. Mikroflora miodu

Pomimo udokumentowanych właściwości anty-bakteryjnych, miód nie jest produktem wolnym od mikroorganizmów [4, 42, 44, 48, 50, 57–60]. Udowod-niono, że repertuar drobnoustrojów zawartych w mio-dzie jest ściśle związany ze składem mikroflory układu pokarmowego pszczół, bliskością pól uprawnych i gospodarstw rolnych oraz z warunkami higienicz-nymi w jakich przeprowadzana jest wstępna obróbka miodu [50]. Badania genetyczne nad mikroflorą układu pokarmowego pszczół miodnych wykazały obecność kilkunastu rodzajów drobnoustrojów m.in. Bifidobacterium, Enterobacter, Saccharibacter, Shigella, Escherichia, Paralactobacillus. Wykazano również, że większy stopień zróżnicowania gatunkowego mikroflory, chroni pszczoły przed inwazją bakterii patogennych [42]. Działanie przeciwbakteryjne sprawia, że większość drobnoustrojów trafiających do miodu ginie. Przeży-wają tylko te gatunki, które są szczególnie oporne na niesprzyjające warunki środowiska. Stąd w mikroflorze miodu dominują tlenowe i beztlenowe bakterie prze-trwalnikujące oraz grzyby [31, 42, 67] (Tab. IV). Ogólna liczba drobnoustrojów przypadająca na 1 g miodu waha się od zera do kilku tysięcy [48]. Właściwości przeciw-bakteryjne sprawiają, że drobnoustroje nie namnażają się w miodzie, stąd duży stopień zanieczyszczeń mikro-biologicznych świadczy o świeżej kontaminacji [31]. Obecność pleśni z rodzajów Rhizopus sp., Curvularia

sp. i Aspergillus sp. wskazuje na brak zachowania odpo-wiednich warunków higienicznych podczas zbierania i obróbki miodu [67]. Ruiz-Argueso i wsp. w prób-kach dojrzewającego miodu wykryli obecność bakterii z rodzaju: Gluconobacter, Lactobacillus i Zymomonas oraz grzybów z gatunku Saccharomyces melis, Torulopsis magnoliae, T. apicola oraz T. stellata [60].

Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi w sprawie szczegółowych wymagań w zakresie, jako-ści handlowej produktów spożywczych, przedstawia kryteria jakościowe dotyczące miodu, jednak nie obej-mują one wytycznych dotyczących czystości mikro-biologicznej [19, 21]. Wymagania w zakresie, jakości miodu są również ujęte w Dzienniku Ustaw Wspólnoty Europejskiej, w którym poruszane są wyłącznie normy fizykochemiczne, z pominięciem kryteriów czystości mikrobiologicznej [18].

Jak podaje Komitet Naukowy ds. Oznaczeń Wete-rynaryjnych o Znaczeniu dla Zdrowia Publicznego (Scientific Committee on Veterinary Measures Relating to Public Health) (przyp. tłum.) powołany przez Komi-sję Europejską, pałeczki C. botulinum i inne szczepy Clostridium produkujące toksynę botulinową są jedy-nymi potencjalnie chorobotwórczymi drobnoustrojami wykrywanymi w miodzie [27, 32, 34–35, 37]. Badania z użyciem techniki PCR przeprowadzone na 190 prób-kach miodu, wykazały obecność spor C. botulinum w 20 (11%) przebadanych próbkach [51]. Natomiast badania przesiewowe dwóch tysięcy próbek miodu pochodzących z różnych krajów świata wykazały obec-ność spor C. botulinum w 5% miodów [27, 61]. Średnia prewalencja przetrwalników w miodzie, oszacowana na

Bacillus cereus [2, 67] Aspergillus candidus [59]Bacillus sp [8, 42] Aspergillus flavus [59]Clostridium botulinum [2, 44, Aspergillus fumigates [59]50, 61, 66]Gluconobacter sp. [59] Aspergillus niger [59]Lactobacillus sp. [2, 42] Candida sp. [67]Micrococcus sp. [60] Curvularia sp. [67]Zymomonas sp. [60] Fusarium sp. [59] Geotrichum sp. [59] Libertella sp. [67] Mucor sp. [67] Pappularia sp. [67] Penicillium sp. [2, 67] Rhizopus sp. [2, 67] Saccharomyces sp. [2, 67] Trichoderma sp. [2, 67] Torulopsis sp. [2, 67]

Tabela IVDrobnoustroje izolowane z różnych gatunków miodów

Bakterie Grzyby


podstawie kilkunastu badań, waha się od 4% do 20% [53]. Przy czym obecność przetrwalników pałeczki jadu kiełbasianego wykazano dotychczas w miodach pocho-dzących z Argentyny, Australii, Kuby, Finlandii, Francji, Włoch, Hiszpanii i Węgier, a ich liczba wahała się od 18 do 60 spor/kg miodu [44, 66].

4. Środowiskowe rezerwuary C. botulinum

Udokumentowanymi, naturalnymi rezerwuarami spor C. botulinum są gleba, piasek, słono- i słodko-wodne osady denne a nawet kurz domowy [27, 39, 46, 50]. C. botulinum wyizolowano z 20% próbek gleby, pobranych na terenie Finlandii oraz z ponad połowy próbek piasku pochodzących z wybrzeży Alaski i 41% próbek ziemi zebranych na terenie Danii [2, 4]. Wraz z ziemią przetrwalniki przedostają się nie tylko na powierzchnię warzyw bulwiastych, ryb i mięs, ale tra-fiają również na powierzchnię kwiatów, owadów, pyłku oraz do nektaru (Tab. V).

5. Proces wytwarzania miodu i drogi transmisji spor C. botulinum

Miód powstaje z nektaru roślin kwiatowych, zbie-ranego i przetwarzanego przez pszczoły miodne. Pro-ces wytwarzania miodu rozpoczyna się od momentu zbierania nektaru oraz pyłku, przy czym tylko nektar

stanowi materiał wyjściowy do produkcji miodu [9]. Jest on pobierany z kwiatu i przenoszony do ula w prze-wodzie pokarmowym pszczoły. W ulu, nektar jest prze-kazywany robotnicom, które poddają go obróbce enzy-matycznej. Następnie jest gromadzony w woskowych komórkach plastrów i poddawany dehydratacji, tracąc przy tym ok. 60% wody. Kiedy duże ilości nektaru tra-fiają do ula, robotnice przyspieszają proces parowania poprzez intensywne ruchy skrzydeł: z jednej strony usprawniające wentylację ula, z drugiej zaś zwiększające prawdopodobieństwo przeniesienia drobnoustrojów ze skrzydeł do miodu [58]. Po kilku dniach, proces doj-rzewania jest zakończony, a pszczoły zamykają światło komórki wypełnionej miodem warstwą wosku i propo-lisu. Pszczelarz odzyskuje miód poprzez wirowanie ram z plastrami wosku w specjalnych wirówkach (ekstrakto-rach). Każdy z etapów tworzenia miodu jest narażony na zanieczyszczenie przetrwalnikami (Rys. 1).

Źródła zakażenia miodu, można podzielić na pier-wotne i wtórne. Do tych pierwszych zalicza się ziemię, pyłek, nektar oraz mikroflorę pszczół. Do wtórnych źródeł kontaminacji miodu należy cukier stosowany jako karma dla pszczół (substytut miodu) oraz cały ciąg technologiczny obróbki miodu, od momentu wyjęcia ram z plastrami do konfekcjonowania miodu [50, 66].

Nevas i wsp. zbadali drogi transmisji spor C. botulinum z ziemi do miodu, pszczół, i pyłku. Analiza ta wykazała, że najwięcej przetrwalników zawierał wosk (30%) oraz miód (24%), przy czym w miodzie pod-danym wstępnej obróbce (wirowaniu) wykrywano kil-

Gleba piasek rzeczny E 6% Alaska [2] piasek nadmorski A, E 31,5% Polska [33] osady oceaniczne E 48% Alaska [2] ziemia A, B, E, F 34% Finlandia [50] kurz domowy B n.b. Finlandia [52] woda oceaniczna E 57% Alaska [2]Rośliny szparagi n.b. n.b Włochy [70] ziemniaki n.b. n.b. USA [64] marchew B 8,6% Francja [62] pyłek kwiatowy B 4% Finlandia [70]Mięso i ryby surowa wieprzowina A, B, C 0–14% Wielka Brytania [26] wędliny A 2% Kanada [26] łosoś E 5% Alaska [2] bieługa E 2% Alaska [2] mrożona flądra E 10% Ocean Atlantycki [26] karp solony E 63% Morze Kaspijskie [26] ryby i owoce morza C, D 8% Japonia [26]

Tabela VRezerwuary i źródła spor C. botulinum

n.b.– nie badano

Rezerwuar Serotyp Odsetek zakażo-nych próbek Kraj Literatura


kanaście razy mniej przetrwalników (3%), niż w mio-dzie nie przetworzonym [51]. Drobnoustroje z układu pokarmowego pszczół mogą trafiać do nektaru jesz-cze przed jego dostarczeniem do ula lub podczas jego wstępnej obróbki przeprowadzanej przez robotnice [50]. Wykazano, że prewalencja C. botulinum w pyłku jest dwukrotnie niższa, niż w przetworzonym przez robotnice propolisie, co wskazuje na udział pszczół w transmisji spor [51]. Nakano i wsp., udowodnili, że przetrwalniki C. botulinum znajdujące się w pyłku lub szczątkach martwych pszczół, w warunkach bez-tlenowych mogą podlegać germinacji do form wege-tatywnych [47]. Jednak z uwagi na szybkie usuwanie martwych owadów z ula, ten czynnik ryzyka transmi-sji jest uznawany przez niektórych autorów za margi-nalny [42]. Z drugiej strony, uwzględniając fakt czę-stego występowania kanibalizmu w społecznościach pszczelich, przetrwalniki mogą równie dobrze trafiać do układu pokarmowego robotnic i rozprzestrzeniać się po całej kolonii [51]. Badania mikrobiologiczne cukru stosowanego, jako pożywienie dla pszczół, wykazały obecność spor C. botulinum w 5% próbek [28, 47]. Nevas i wsp., wykazali również wpływ warunków sanitarnych panujących podczas ekstrakcji miodu oraz bli-skości pól uprawnych i gospodarstw rolnych na stopień jego zanieczyszczenia sporami C. botulinum [51].

6. Metody oczyszczania oraz ich wpływ na czystość mikrobiologiczną miodu

Wstępna obróbka i odzyskiwanie miodu z natural-nej lub sztucznej węzy (ramki) polega na zastosowaniu jednego z procesów: wirowania, prasowania lub ocie-

kania grawitacyjnego. Oczyszczanie i dalsza obróbka miodu może sprowadzać się do: filtracji, dekantyzacji, pasteryzacji (opcjonalnie), dojrzewania, konfekcjono-wania i przechowywania [26].

Żaden z powyższych etapów nie eliminuje bakterii przetrwalnikujących tj. Clostridium i Bacillus. Zastoso-wanie metody wirowania, umożliwia usunięcie części spor mniej jednak w ten sposób pozbawia się go cennego składnika, jakim jest pyłek. Co ważne w świetle prawa pyłek stanowi integralną i nieodłączną część miodu. Jego usunięcie uniemożliwia zastosowanie terminu „miód” przez jego producenta [38]. Po wirowaniu prze-prowadza się dekantyzację polegającą na kilkudniowej inkubacji miodu w temperaturze 25°C. Bąbelki powie-trza, wosk i inne nieczystości (z wyłączeniem pyłku i przetrwalników) osadzają się na dnie lub gromadzą na powierzchni zbiornika, skąd mogą być usunięte. Kolejne etapy są przeprowadzane niezwykle rzadko i polegają na oczyszczaniu miodu na drodze przesączania lub filtrowania. Metoda przesączania polega na podgrza-niu miodu do temp. 30–35°C i filtrowaniu przez filtr o średnicy por 150 µm. Proces ten prowadzi do usunię-cia propolisu i fragmentów owadów, ale nie pozbawia go przetrwalników bakteryjnych ani pyłku. Filtracja miodu jest również poprzedzona jego podgrzaniem do 60°C. Miód jest następnie przepuszczany przez filtry cera-miczne o średnicy porów mniejszych niż 50 µm. W ten sposób jest on pozbawiony większości zanieczyszczeń włącznie z pyłkiem, ale za wyjątkiem spor bakteryjnych. Wraz z usuwaniem większych cząstek istnieje możliwość eliminacji części spor, jednak w celu całkowitego pozba-wienia miodu przetrwalników C. botulinum, w procesie filtracji należałoby zastosować filtry o średnicy 0,5 µm, co doprowadziłoby do usunięcia jego integralnych

Rys. 1. Przypuszczalne drogi kontaminacji miodu sporami C. botulinum. Objaśnienia w tekście


składników np. pyłku. Większość miodów dostępnych w Europie nie jest poddawana filtracji [38, 54].

Kolejny etap, tzw. dojrzewanie miodu, trwa dwa tygodnie i zachodzi w temperaturze 15°C [60]. Osta-tecznie miód jest zlewany do odpowiednich zbiorników i w szczególnych przypadkach poddawany pasteryzacji [2]. Wysoka temperatura może prowadzić do karme-lizacji i degradacji substancji aktywnych, a z drugiej strony obniża liczbę grzybów, zapobiegając fermentacji i opóźniając procesy krystalizacji. Komisja Europejska zaleca stosowanie temperatury 77°C, w czasie 2 minut, a następnie szybkie schładzanie do temperatury 54°C lub 30 minutowe ogrzewanie miodu, w temp. 60–71°C [2, 27]. Pamiętając, że inaktywacja przetrwalników C. botulinum jest możliwa po 6 godzinach gotowania w temp. 100°C lub 3 min. w 121°C (botulinum cook), zastosowanie zaleceń Komisji Europejskiej nie wpływa na obniżenie liczby spor tych bakterii w miodzie [61].

7. Miód, jako czynnik ryzyka rozwoju botulizmu niemowlęcego

Botulizm niemowlęcy, inaczej nazywany toksyko-infekcją niemowląt lub jelitową toksemią niemowlęcą można rozpatrywać, jako kolonizację jelita przez spory C. botulinum (zakażenie) z równoczesną produkcją tok-syny botulinowej (toksemia) [3, 11, 15, 35]. Przetrwal-niki C. botulinum lub znacznie rzadziej C. butyricum lub C. baratii, wraz z pokarmem trafiają do żołądka i jelit, gdzie przekształcają się w komórki wegeta-tywne, produkujące neurotoksynę botulinową [7, 32, 34, 41]. BoNT jest wchłaniania i transportowana za pośrednictwem układu krwionośnego do połączeń nerwowo-mięśniowych, z którymi trwale się wiąże blokując uwalnianie acetylocholiny z zakończeń ner-wów ruchowych [35, 39]. Okres inkubacji od spożycia skażonego pokarmu do pierwszych objawów, wynosi średnio od dwóch do czterech tygodni. Objawy typowe dla botulizmu niemowląt to kilkudniowe zaparcia (min. trzy dni bez wypróżniania) poprzedzające pojawienie się takich symptomów jak brak apetytu, senność, osła-bienie odruchu ssania [43, 46]. Botulizm niemowlęcy występuje najczęściej u dzieci od 3 do 20 tygodnia życia (średnio w 13 tyg.) [63]. Niemowlęta, z uwagi na brak w pełni wykształconej mikroflory naturalnej jelit oraz niedojrzałe komórki układu immunologicznego, są szczególnie podatne na zasiedlenie jelit przez przy-padkowo połknięte spory C. botulinum [12, 43, 68].

Pierwszy potwierdzony laboratoryjnie przypadek botulizmu niemowlęcego odnotowano w Stanach Zjed-noczonych, w 1976 roku, po spożyciu miodu zakażo-nego sporami C. botulinum [16]. Serotypami odpowie-dzialnymi za większość toksykoinfekcji występujących u niemowląt są toksyny A, B i E oraz typy mozaikowe

Ba i Bf [5, 34, 37, 41]. Botulizm niemowlęcy występuje niezwykle rzadko, lecz w skali globalnej jest najczęściej występującą postacią botulizmu. W 2010 r., w Stanach Zjednoczonych stanowił 76% wszystkich rejestrowanych przez CDC przypadków chorób o etiologii C. botulinum [13–14]. W latach 1976–2007, w skali globalnej odno-towano ponad 3000 przypadków botulizmu niemow-lęcego, z czego 2419 zarejestrowano w Stanach Zjed-noczonych [13]. Występowanie botulizmu niemowląt nie ogranicza się do Stanów Zjednoczonych i zostało odnotowane na wszystkich kontynentach z wyłącze-niem Afryki. Wysoką zapadalność notuje się również w Argentynie, Australii, we Włoszech oraz Kanadzie i Japonii. W latach 1978–2007, z czternastu krajów Europy spłynęły 73 zgłoszenia botulizmu niemowlęcego [6, 40, 56]. Miód jest jedynym potwierdzonym i moż-liwym do uniknięcia rezerwuarem spor C. botulinum i przyczyną ponad połowy przypadków botulizmu nie-mowlęcego [4, 26–27, 33–35, 50–51, 53, 61].

8. Aspekty prawne

Ustawodawca europejski w Rozporządzeniu Rady Wspólnoty Europejskiej o jednolitej wspólnej organi-zacji rynku wprowadził obowiązującą także w Polsce definicję miodu przywołaną w niniejszym opraco-waniu [25]. Z kolei kryteria dotyczące jakości miodu nie uwzględniające norm dotyczących zanieczyszczeń mikrobiologicznych ustalono mocą Rozporządzenia Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi w sprawie szczegóło-wych wymagań w zakresie jakości handlowej miodu [21]. Z dniem 1 stycznia 2003 roku przestała obowiązy-wać Polska Norma dla miodu PN-88/A-77626. Ponie-waż jednocześnie nie unieważniono jej wytycznych, norma jest dalej uznawana jednakże na zasadzie dobro-wolności. Aktem wiążącym pozostaje wyżej wymie-nione Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi zgodnie z którym miód wprowadzany na rynek Polski musi spełniać stosowne kryteria w zakresie wła-ściwości organoleptycznych i jakościowych. Do tych pierwszych należą: barwa, konsystencja, smak i zapach, zaś jakość handlową wyznacza m.in. kryterium natural-nych składników, w szczególności aktywnych enzymów, tj. miód spełnia wspomniane wymagania, jeżeli jego naturalne enzymy nie zostały częściowo lub całkowicie zniszczone, np. przez ogrzewanie. Ponadto miód nie może być pozbawiony żadnego integralnego składnika (pyłku, propolisu, etc.), chyba że jest to niezbędne w celu usunięcia substancji obcych, np. w drodze fil-tracji, przy czym ustawodawca krajowy nie narzuca na producenta obowiązku informowania o wpływie pro-cesu oczyszczania na skład miodu [21].

Szczegółowe wymagania, jakie powinny spełniać środki spożywcze specjalnego przeznaczenia żywienio-


wego, w tym w szczególności produkty spożywcze dla niemowląt, określa Rozporządzenie Ministra Zdrowia w sprawie środków spożywczych specjalnego przezna-czenia żywieniowego [20]. Z załącznika nr 4 do tego Roz- porządzenia wynika, iż w przypadku, gdy w składzie takich preparatów znajduje się miód, powinien on być poddany obróbce w celu usunięcia z niego przetrwalni-ków C. botulinum. Jak wcześniej wspomniano obróbka miodu w takim celu polegać może na zastosowaniu wysokiej temperatury (121°C, 3 min.) lub filtracji z użyciem filtrów bakteriologicznych. Pierwszy proces istotnie wpły- wa na właściwości organoleptyczne (karmelizacja), a także prowadzi do całkowitej dez aktywacji enzymów natural-nie występujących w miodzie. Drugi zaś pozbawia go integralnych jego składników tj. pyłku i propolisu [26].

Z uwagi na przywołane powyżej kryteria ujęte w Rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi można zaryzykować postawienie tezy, że oczyszczanie miodu z zanieczyszczeń mikrobiologicznych (w tym spor C. botulinum) nie jest pożądane z komercyjnego punktu widzenia, ponieważ ostateczny produkt nie spełniałby definicji miodu. Produkty żywieniowe prze-znaczone dla niemowląt mogą zawierać wyłącznie miód pozbawiony C. botulinum, jednak każdy ze sposobów umożliwiający zniszczenie lub usunięcie przetrwalni-ków tej bakterii doprowadzi do drastycznego obniżenia jego właściwości odżywczych, immunomodulujących i przeciwbakteryjnych. W kontekście ryzyka rozwoju botulizmu niemowlęcego, szczególnie istotne wydaje się informowanie zarówno matek jak i lekarzy o czyn-nikach ryzyka rozwoju botulizmu niemowlęcego oraz wprowadzenie odpowiedniego oznakowania miodu informującego o zagrożeniu, jakim jest stosowanie miodu u niemowląt poniżej 1 roku życia.

9. Wytyczne dotyczące oznakowania miodu

Przepisy krajowe odnoszące się do oznakowania miodu ujęte są w ustawie o bezpieczeństwie żyw ności i żywienia [22]. Zgodnie z art. 45 wyżej wymienio-nej ustawy, oznakowanie środka spożywczego obej-muje wszelkie informacje w postaci napisów i innych oznaczeń, w tym znaki towarowe, nazwy handlowe, elementy graficzne i symbole, dotyczące środka spo-żywczego, umieszczone na opakowaniu, etykiecie, obwolucie, ulotce lub zawieszce. Odpowiedzialność za bezpieczeństwo produkowanej i wprowadzanej do obrotu żywności ponosi przedsiębiorca zgodnie z art. 17 tej ustawy. Kto nie przestrzega wymagań w zakresie znakowania środków spożywczych podlega karze pie-niężnej. Zgodnie z Rozporządzeniem w sprawie znako-wania środków spożywczych etykieta miodu powinna zawierać: pełną nazwę produktu, dane identyfikacyjne pszczelarza, warunki przechowywania, masę netto, datę rozlewu i numer partii produkcyjnej, miejsce pocho-dzenia oraz normę lub akt prawny, z którym zgodne są kryteria jakościowe miodu (Tab. VI) [23].

Etykieta nie może przypisywać działania lub właści-wości, których miód nie posiada oraz nie może suge-rować, że dany miód ma szczególne właściwości, jeżeli mają je podobne miody. Ponadto, nie może zawierać informacji, miód zapobiega chorobom lub je leczy, a nawet odwoływać się do takich właściwości oraz nie może zawierać takich określeń jak „zdrowy”, „bez-pieczny” itp. [65].

W latach 1995–2001 Inspekcja Handlowa przepro-wadziła kontrolę miodu znajdującego się w obrocie handlowym. Jej celem było zbadanie jakości miodu krajowego i importowanego pod względem zgodności

Tabela VISugerowane elementy oznakowania miodu [23]

Oznakowanie Komentarz

Nazwa produktu pełna nazwa rodzaju i odmiany miodu może być zastąpiona wyrazem „miód” o ile nie dotyczy miodu przefiltrowanego, miodu sekcyjnego, miodu z plastrami i miodu piekarniczego w przypadku których zamiast określenia „miód” należy użyć terminu „miód wyłącznie do dalszego przerobu”Dane identyfikacyjne pszczelarza z uwzględnieniem imienia i nazwiska właściciela oraz adresu pasiekiTermin przydatności w przypadku miodu należącego do produktów trwałych oznacza termin „najlepiej spożyć przed...” czyli minimalną trwałość produktu lub czas. Data minimalnej trwałości dla miodu wynosi 36 miesiąceWarunki przechowywania temp. 4–20 °C, chronić przed światłemMasa netto podawana w kgData rozlewu i numer partii produkcyjnej data rozlewu może być jednocześnie numerem partii umieszczonym na etykiecie lub nakrętcePochodzenie kraj pochodzenia albo w przypadku, gdy miód pochodzi z więcej niż jednego kraju odpowiednią informację o krajach pochodzeniaDodatkowe informacje (opcjonalnie) podanie nazwy gatunkowej rośliny z której pochodzi miód (gdy miód pochodzi w całości lub prawie w całości z tego źródła i ma właściwe dla tego pochodzenia właściwości)


z wymaganiami normy PN-88/A-77626 oraz sprawdzenie prawidłowości oznakowania opakowań jed-nostkowych. Kontrola wykazała, że w 2001 r. nastą-piło znaczne pogorszenie jakości miodu, bowiem 38% zbadanych próbek nie spełniało kryteriów normy. W 2001 r. brak istotnych dla konsumenta informacji wymaganych przez normę stwierdzono w 21% spraw-dzonych miodów [65].

Zgodnie z art. 14 Rozporządzenia Parlamentu Euro-pejskiego i Rady Europejskiej z dnia 28 stycznia 2002 żywność znajdująca się w obrocie nie może być nie-bezpieczna dla zdrowia i życia człowieka [18]. Według założenia Komisji Europejskiej stwierdzającego, że miód należy do produktów zagrażających niemowlę-tom do pierwszego roku życia, zasadnym wydaje się, iż stosowana informacja powinna być zamieszczana na etykiecie miodu.

10. Zalecenia w sprawie ograniczenia zapadalności na botulizm niemowlęcy

Miód jest jedynym produktem spożywczym stano-wiącym naturalny rezerwuar spor C. botulinum, dlatego Agencje CDC i WHO, a za nimi American Academy of Pediatrics i National Honey Board, zalecają aby nie podawać miodu niemowlętom poniżej 12 miesiąca życia, u których może dojść do rozwoju botulizmu nie-mowlęcego [26–27, 35, 40, 53]. W krajach Unii Euro-pejskiej obowiązuje opinia Komitetu Naukowego ds. Kryteriów Weterynaryjnych o Znaczeniu dla Zdrowia Publicznego na temat Miodu i Zagrożeń Mikrobiolo-gicznych. Zgodnie z tym dokumentem dzieciom poni-żej pierwszego roku życia nie powinno się podawać miodu. Ponadto Komisja Europejska obliguje produ-centów miodu do zamieszczania informacji mówiącej o zagrożeniu, jakie niesie za sobą włączenie miodu do diety niemowlęcia [2, 56]. Aby decyzje Komisji Euro-pejskiej były prawomocne w całej Unii Europejskiej, muszą być wydane w formie rozporządzenia, natomiast dokument dotyczący oznakowania miodu ma charak-ter doradczy i nie został wprowadzony do polskiego ustawodawstwa.

11. Podsumowanie

Miód wykazuje naturalne właściwości przeciw-drobnoustrojowe względem bakterii Gram-ujemnych, Gram-dodatnich oraz grzybów [8, 31, 58]. Wysoka zawartość cukrów, obecność nadtlenku wodoru oraz zawartość wody poniżej 20% działa głównie grzybobój-czo i w mniejszym stopniu bakteriobójczo. Fitozwiązki wywodzące się od roślin, z których pozyskiwany był nektar, odpowiadają za aktywność przeciwbakteryjną

miodu [28]. Pomimo działania przeciwdrobnoustro-jowego, pewne gatunki mikroorganizmów mogą przetrwać w miodzie. Należą do nich głównie drob-noustroje przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus i Clostridium oraz liczne bakterie środowiskowe, pochodzące z gleby, powierzchni roślin oraz mikroflory układu pokarmowego pszczół miodnych [50]. Pleśnie pojawia-jące się w miodzie, są przejawem niskich warunków sanitarnych podczas jego obróbki i są odpowiedzialne za jego psucie [67]. Clostridium botulinum jest jedy-nym potencjalnie szkodliwym dla człowieka drobno-ustrojem izolowanym z miodu [53]. Miód zawierający spory C. botulinum jest szczególnie niebezpieczny dla niemowląt poniżej 1 r.ż, które nie dysponują w pełni wykształconą florą jelitową [35]. Nawet niewielkie ilości spor pałeczki jadu kiełbasianego mogą wywołać objawy botulizmu niemowlęcego, choroby zbliżonej pod wzglę-dem przebiegu do syndromu nagłej śmierci niemow-ląt (SIDS) [30, 43, 45]. Ponad połowa przypadków botulizmu niemowlęcego jest efektem spożycia miodu zawierającego spory C. botulinum [61]. Z uwagi na brak właściwej diagnostyki oraz pośmiertne klasyfikowanie przyczyny śmierci niemowląt, jako SIDS rzeczywista liczba przypadków botulizmu niemowlęcego jest nie-doszacowana. Znakowanie miodów produkowanych w Polsce nie jest obligatoryjne, a świadomość społe-czeństwa i lekarzy pediatrów niewielka. Państwowy Zakład Higieny nie prowadzi rejestru przypadków botulizmu niemowlęcego, pomimo wprowadzenia tej jednostki na listę definicji chorób zakaźnych. Prawdo-podobnie rejestru nie prowadzi się z uwagi na fakt, iż przypadki te nie są właściwie diagnozowane [17, 55]. Istnieje duże zagrożenie, że brak wiedzy na temat ist-nienia choroby, jaką jest botulizm niemowląt, prowadzi do błędnej diagnozy i klasyfikowania tych przypadków do tzw. syndromu nagłej śmierci niemowląt. Polska należy do krajów o najwyższej zapadalności na botu-lizm pokarmowy w Europie, a miód jest często stoso-wany, jako dodatek do domowych potraw dla dzieci stąd występowanie botulizmu niemowląt wydaje się wysoce prawdopodobne.

Aby miód spełniał kryteria, jakości handlowej, pod-czas procesu jego pozyskiwania, dojrzewania, konfek-cjonowania lub oczyszczania, nie może być pozbawiany żadnego integralnego składnika [18, 22–23]. Z uwagi na fakt, iż obecnie stosowane procedury oczyszczania miodu, prowadzą do usunięcia nie tylko spor bakte-ryjnych, ale i enzymów, pyłku czy propolisu – elimi-nacja przetrwalników C. botulinum bez wpływu, na jakość miodu jest w praktyce niemożliwa. Ponadto normy europejskie i krajowe nie wyznaczają kryteriów mikrobiologicznych dla miodu. Inne kraje UE oraz Stany Zjednoczone nie narzucają obowiązku eliminacji spor C. botulinum z produktów żywnościowych prze-znaczonych dla niemowląt, ale na producentów takiej


żywności oraz producentów miodu narzucają obowią-zek informowania o zagrożeniu, jakim jest spożywa-nie miodu i produktów go zawierających przez dzieci poniżej 1 roku życia.

Piśmiennictwo

1. Abuharfeil N., Al-Oran R., Abo-Shehada M.: The effect of bee honey on the proliferative activity of human B-and T-lympho-cytes and the activity of phagocytes. Food Agric. Immunol. 11, 169–77 (1999)

2. Advisory Committee on the Microbiological Safety of Food (ACMSF). Ad Hoc Group on Infant Botulism. Report on mini-mally processed infant weaning foods and the risk of infant botu-lism 2005, http://www.food.gov.uk/multimedia/pdfs/infantbotu-lism report.pdf (28 czerwca 2012)

3. Arnon S.S.: Botulism as an Intestinal Toxemia (w) Infections of the Gastrointestinal Tract, red. M.J. Blaser, P.D. Smith, J.I. Ravdin, H. B. Greenberg, R.L. Guerrant, Raven Press, New York, 1995, s. 257–271

4. Arnon S.S., Midura T.F., Damus K., Thompson B., Wood R.M., Chin J.: Honey and other environmental risk factors for infant botulism. J. Pediatrics, 94, 331–336 (1979)

5. Aureli P., Fenicia L., Pasolini B., Ginafranceschi M., McCroskey L.M., Hatheway C.L.: Two cases of type E infant botulism in Italy caused by neurotoxigenic Clostridium butyricum. J. Infect. Dis. 54, 207–211 (1986)

6. Aureli P., Franciosa G., Fenicia L.: Infant botulism and honey in Europe: a commentary. Pediatric Infect. Dis. J. 21, 866–868 (2002)

7. Barash J.R., Tang T.W.H., Arnon S.S.: First case of infant botu-lism caused by Clostridium barati cype F in California. J. Clin. Microbiol. 43, 4280–4282 (2005)

8. Bogdanov S.: Characterisation of antimicrobial substances in honey. Lebensm. Wiss. Technol. 17, 74–76 (1984)

9. Bogdanov S., Jurendic T., Sieber R., Gallmann P.: Honey for Nutrition and Health: A Review. J. Amer. College of Nutrition, 27, 677–689 (2008)

10. Brady N.F., Molan P.C., Harfoot C.G.: The sensitivity of der-matophytes to the antimicrobial activity of manuka honey and other honey. Pharm Sci. 2, 1–3 (1997)

11. Brook I.: Anaerobic infections in children. Adv. Experiment. Med. Biology, 697, 1117–1152 (2011)

12. Burr D.H., Sugiyama H.: Susceptibility to enteric botulinum colonization of antibiotic-treated adult mice. Infect. Immun. 36, 103–106 (1982)

13. CDC. CDICUPHS (Centres for Disease Control and Preven-tion-Case Definition for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance). M.M. Weekly Rep. 46, NN-10 1997, http://ftp.cdc.gov/pub/ publications/mmwr/rr/rr4610.pdf (28 czerwca 2012)

14. CDC. Botulism. (Centres for Disease Control and Develop-ment) Botulism: Epidemiological Overview for Clinicians. 2012, http://www.bt. cdc.gov/agent/botulism/clinicians/epidemiology.asp (28 czerwca 2012)

15. CDC. Case Definitions, Botulism (Clostridium botulinum) 2011, http://www.cdc.gov/osels/ph_surveillance/nndss/casedef/botu-lism_current.htm (28 czerwca 2012)

16. Cox N., Hinkle R.: Infant Botulism. Amer. Family Physician, 65, 1388–1392 (2002)

17. Czerwiński M., Czarkowski M.P., Kondej B.: Zatrucia jadem kiełbasianym w Polsce w 2009 roku. Przeg. Epidemiol. 65, 251–254 (2011)

18. Dz. U WE L 31 z 01.02.2002 rozporządzenie (WE) NR 178/2002 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 28 stycznia 2002 r. usta-nawiające ogólne zasady i wymagania prawa żywnościowego, powołujące Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności oraz ustanawiające procedury w zakresie bezpieczeństwa żywności, http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=D-D:15:06:32002R0178:PL:PDF (21 stycznia 2014)

19. Dz.U. z 2001 r. Nr 5 poz. 44. Ustawa z dnia 21 grudnia 2000 r. o ja- kości handlowej artykułów rolno-spożywczych, http://isap.sejm.gov.pl/DetailsServlet?id=WDU20010050044 (21 stycznia 2014)

20. Dz. U. z 2010 r. Nr 136 poz. 914. Obwieszczenie Marszałka Sejmu Rzeczypospolitej Polskiej z dnia 29 czerwca 2010 r. w sprawie ogłoszenia jednolitego tekstu ustawy o bezpieczeństwie żyw-ności i żywienia, http://isap.sejm.gov.pl/DetailsServlet?id= WDU20101360914 (21 stycznia 2014)

21. Dz. U. z 2003 r. Nr 181, poz. 1773. Rozporządzenie Ministra Rol-nictwa i Rozwoju Wsi z dnia 3 października 2003 r. w sprawie szczegółowych wymagań w zakresie jakości handlowej miodu 2003, http://isap.sejm.gov.pl/DetailsServlet?id=WDU20031811 773 (21 stycznia 2014)

22. Dz. U. z 2006 Nr 171, poz. 1225. Ustawa z dnia 25 sierpnia 2006 r. o bezpieczeństwie żywności i żywienia, http://isap.sejm.gov.pl/DetailsServlet?id=WDU20061711225 (21 stycznia 2014)

23. Dz. U. z 2007 Nr 137, poz. 966. Rozporządzenie Ministra Rolnic-twa i Rozwoju Wsi z dnia 10 lipca 2007 r. w sprawie znakowania środków spożywczych, http://isap.sejm.gov.pl/DetailsServlet? id=WDU20071370966 (21 stycznia 2014)

24. Dz. Urz. UE z 16 listopada 2007 roku, nr L 299/1. Rozporzą-dzenie Rady (WE) nr 1234/2007 z dnia 22 października 2007 r. ustanawiające wspólną organizację rynków rolnych oraz prze-pisy szczegółowe dotyczące niektórych produktów rolnych („rozporządzenie o jednolitej wspólnej organizacji rynku”, http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L: 2007:299:0001:0149:PL:PDF (21 stycznia 2014)

25. Dz. Urz. UE z dn. 16 listopada 2007 roku, nr L 299/1 ust. 1, cz. VIII, zał. III Rozporządzenie Rady (WE) nr 1234/2007 z dnia 22 października 2007 r. ustanawiające wspólną organizację ryn-ków rolnych oraz przepisy szczegółowe dotyczące niektórych produktów rolnych („rozporządzenie o jednolitej wspólnej orga-nizacji rynku”, http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2007:299:0001:0149:PL:PDF (21 stycznia 2014)

26. ESR-Institute of Environmental Science & Research Limited. Risk Profile: Clostridium botulinum in Honey, http://esr.cri.nz/ (28 czerwca 2012)

27. European Commission. Opinion of the Scientific Committee on Veterinary Measures relating to Public Health on Honey and Microbiological Hazards, http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scv/out53_en.pdf (28 czerwca 2012)

28. Evans J.D., Schwarz R. S.: Bees brought to their knees: microbes affecting honey bee health. Trends Microbiol. 19, 614–620 (2011)

29. Fenicia L., Anniballi F.: Infant botulism. Ann. Ist Super Sanità. 45, 134–146 (2009)

30. Francisco A.M., Arnon S.S.: Clinical mimics of infant botulism. Pediatrics, 119, 826–828 (2007)

31. Gomes S., Dias L.G., Moreira L.L., Rodrigues P., Estevinho L.: Physicochemical, microbiological and antimicrobial properties of commercial honeys from Portugal. Food and Chemical Toxicology, 48, 544–548 (2010)

32. Hall J.D., McCroskey L.M., Pincomb B.J., Hatheway C.L.: Isola-tion of an organism resembling Clostridium baratii which pro-duces a type F botulinal toxin from an infant with botulism. J. Clin. Microbiol. 21, 654–655 (1985)

33. Hauschild A.H.W., Hilsheimer R., Weiss K.F., Burke R.B.: Clostridium botulinum in honey, syrups and dry infant cereals: a research note. J. Food Protection, 51, 892–894 (1998)


34. Hoarau G., Pelloux I., Gayot A., Wroblewski I., Popoff M.-R., Mazuet C., Maurin M., Croizé J.: Two cases of type A infant botulism in Grenoble, France: no honey for infants. Europ. J. Pediatrics, 171, 589–591 (2012)

35. Infant Botulism Treatment and Prevention Program. California Department of Health Services. 2012, http://www.infantbotu-lism.org (28 czerwca 2012)

36. Irish J., Blair S., Carter D.A.: The antimicrobial activity of honey derived from Australian flora. PLoS ONE, 6, e18229 (2011)

37. Johnson E.A., Tepp W.H., Bradshaw M., Gilbert R.J., Cook P.E., McIntosh E.D.G.: Characterization of Clostridium botulinum strains associated with a infant botulism case in the United Kingdom. J. Clini. Microbiol. 43, 2602–2607 (2005)

38. Kędzia B.: Botulizm i miód, cz. I. Pasieka, 6. 2008, http://www.pasieka24.pl/wszystkie-nr-pasieki/47-pasieka-72008/442-botulizm-i-miod-cz-i.html (28 czerwca 2012)

39. Kizerwetter-Świda M., Binek M.: Zatrucie jadem kiełbasianym – problem wciąż aktualny. Post. Mikrobiol. 49, 75–85 (2010)

40. Koepke R., Sobel J., Arnon S.S.: Global Occurrence of Infant Botulism, 1976–2006. Pediatrics, 122, 73–82 (2008)

41. Lúquez C., Dykes J.K., Yu P.A., Raphael B.H., Maslanka S.E: First report worldwide of an infant botulism case due to Clostridium botulinum type E. J. Clin. Microbiol. 48, 326–328 (2009)

42. Mattila H.R., Rios D., Walker-Sperling V.E.W., Roeselers G., Newton I.L.G.: Characterisation of the active microbiotas associa-ted with honey bees reveals healthier and broader communities when colonies are genetically diverse. PloS ONE, 7, e32962 (2012)

43. Midura T.F.: Update: Infant Botulism. Clin. Microbiol. Rev. 9, 119–125 (1996)

44. Midura T.F., Snowden S., Wood R.M., Arnon S.S.: Isolation of Clostridium botulinum from honey. J. Clin. Microbiol. 9, 282–283 (1979)

45. Mitchell W.G., Tseng-Ong L.: Catastrophic Presentation of infant botulism may obscure or delay diagnosis. Pediatrics, 116, 436–438 (2005)

46. Moniuszko A., Czupryna P., Pancewicz S.A., Kondrusik M., Gry-gorczuk S., Zajkowska J.M.: Botulizm – nadal aktualny problem epidemiologiczny i kliniczny. Pol. Merk. Lek. 27, 58–61 (2009)

47. Nakano H., Kizaki H., Sakaguchi G.: Multiplication of Clostridium botulinum in dead honey-bees and bee pupae, a likely source on heavy contamination of honey. Intern. J. Food Microbiol. 21, 247–252 (1994)

48. National Honey Board Fact Sheet. Microorganisms in Honey. 2012, http://honey.com (28 czerwca 2012).

49. Ndip R.N., Malange Takang A.E., Echakachi C.M., Malongue A., Akoachere J-F T.K., Ndip L.M., Luma H.N.: Invitro antimicro-bial activity of selected honeys on clinical isolates of Helicobacter pylori. Afr. Health Sci. 7, 228–232 (2007)

50. Nevas M, Lindstrom M, Horman A, Keto-Timonen R, Kor-keala H.: Contamination routes of Clostriodium botulinum in the honey production environment. Environmen. Microbiol. 8, 1085–1094 (2006)

51. Nevas M., Hielm S., Lindström M., Koivulehto K., Horn H., Korkeala H.: High prevalence of Clostridium botulinum types A and B in honey samples detected by polymerase chain reaction. Int. J. Food Microbiol. 72, 45–52 (2002)

52. Nevas M., Lindstrom M., Virtanen A., Hielm S., Kuusi M., Arnon S.S., Vuori E., Korkeala H.: Infant botulism acquired from household dust presenting as sudden infant death syn-drome. J. Clin. Microbiol. 43, 511–513 (2005)

53. Nevas M.: Clostridium botulinum in honey production with respect to infant botulism. Department of Food and Environ-

mental Hygiene, University of Helsinki. Helsinki, Finland 2006, http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/ela/elint/vk/nevas/clostrid.pdf (28 czerwca 2012)

54. Niedźwiecki A.: Pszczelarstwo ekologiczne w krajach UE (na przykładzie Niemiec). Pasieka, nr 1, 2003, http://www.pasieka.pszczoly.pl/index.php?artplik=2003_01_01p_ekologiczne.html& grkat=z_pasieka_w_swiat&s=vjufile (28 czerwca 2012)

55. NIZP-PZH. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwo-wego Zakładu Higieny Definicje przypadków chorób zakaźnych na potrzeby nadzoru epidemiologicznego. Zakład Epidemio logii NIZP-PZH. Wersja robocza(2) 2012, http://www.pzh.gov.pl/ oldpage/epimeld/inne/Def_PL2_Rob_2.pdf (28 czerwca 2012)

56. O’Brien S.: Case of infant botulism in the United Kingdom. Eurosurveillance, 5, 2001, http://www.eurosurveillance.org/View Article.aspx?ArticleId=1703 (28 czerwca 2012)

57. Obaseiki-Ebor E.E., Afonja T.C.: In vitro evaluation of the anti-candidiasis activity of honey distillate (HY-1) compared with that of antimycotic agents. J. Pharm. Pharmacol. 36, 283–284 (1984)

58. Olaitan P.B., Adeleke O.E., Ola I.O.: Honey: a reservoir for micro-organisms and an inhibitory agent for microbs. Afr. Health Sci. 7, 159–165 (2007)

59. Popa M., Vica M., Axinte R., Glevitzki M., Varvara S.: Study concerning the honey qualities in Transylvania region. Ann. Univ. Apulensis Ser. Oeconomica, 11, 1034–1040 (2009)

60. Ruiz-Argueso T., Rodriguez-Navarro A.: Microbiology of Ripe-ning Honey. Appl. Microbiol. 30, 893–896 (1975)

61. Sanford M.T., Atkinson E., Ellis, J.: Infant Botulism and Honey. Entomology and Nematology Department. ENY-128 2009, http://edis.ifas.ufl.edu/aa142 (28 czerwca 2012)

62. Sevenier V., Delannoy S., Andre S., Fach P., Remize F.: Preva-lence of Clostridium botulinum and thermophilic heat-resistant spores in raw carrots and green beans used in French canning industry. Int. J. Food Microbiol. 155, 263–268 (2012)

63. Smith G.E., Hinde F., Westmoreland D., Berry P.R., Gilbert R.J.: Infantile botulism. Arch. Dis. Child. 64, 871–872 (1989)

64. Solomon H.M., Rhodehamel E.J., Kautter D.A.: Growth and toxin production by Clostridium botulinum on sliced raw pota-toes in a modified atmosphere with and without sulfite. J. Food Protocols, 61, 126–128 (1998)

65. Szczęsna T.: Problemy z jakością miodu na rynku krajowym. Pasieka, nr 3 2003, http://www.pasieka.pszczoly.pl/index.php?s= vjufile&grkat=produkty_pasieczne&artplik=2003_03_01jakosc_ miodu.html (28 czerwca 2012)

66. Tanzi M.G., Gabay M.P.: Mini Review. Association between honey consumption and infant botulism. Pharmacotherapy, 22, 1479–1483 (2002)

67. Tchoumboue J., Awah-Ndukum J., Fonteh F.A., Dongock N.D., Pinta J., Mvondo Z.A.: Physico-chemical and microbiological characteristics of honey from the sudano-guinean zone of West Cameroon. Afr. J. Biotechnol. 6, 908–913 (2006)

68. Trethon A., Budai J., Herendi A., Szabo V., Geczy M.: Botulism in infancy. Orvosi. Hetilap. 136, 1497–1499 (1995)

69. Willix D.J., Molan P.C., Harfoot C.J.: A comparison of the sensi-tivity of wound infecting species of bacteria to the antibacterial activity of manuka honey and other honey. J. Appl. Bacteriol. 73, 388–394 (1992)

70. Zanon P., Pattis P., Pittsscheider W., Roscia G., De Giorgi G., Sacco G., Votter K., Stockner I., De Giorgi F., Wiedermann C.J.: Two cases of foodborne botulism with home-preserved aspa-ragus. Anasthesiol Intensivmed Notfallmed Schmerzther, 41, 156–159 (2006)


* Autor korespondencyjny: Zakład Chemii Analitycznej i Metalurgii Chemicznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska, Wybrzeże S. Wyspiańskiego 27, 50-370 Wrocław; Tel. 71 320 38 07; e-mail: [email protected]

1. Wprowadzenie

Sterylizacja, nazywana również wyjaławianiem, jest metodą niszczenia wszystkich form mikroorganizmów, zarówno wegetatywnych, jak i przetrwalnych. Istnieje wiele tradycyjnych sposobów sterylizacji: wilgotnym ciepłem [38], suchym gorącym powietrzem [2], parą wodną pod ciśnieniem w autoklawie [4], z użyciem formaldehydu [17] czy tlenku etylenu [29]. Metody te opierają się na inaktywacji mikroorganizmów w wyniku spowolnienia ich metabolizmu bądź zniszczenia ich materiału genetycznego [30].

Sterylizacja plazmowa, w przeciwieństwie do kon-wencjonalnych metod, wykorzystuje synergiczny efekt oddziaływania zarówno promieniowania UV, jak i czą-stek reaktywnych, elektronów i jonów, na mikroorga-nizmy. Do wyjaławiania np. instrumentów metalowych czy narzędzi wykonanych z materiałów termowrażli-wych najczęściej jest wykorzystywana niskotempera-turowa plazma, wytwarzana w warunkach ciśnienia atmosferycznego. Taki rodzaj plazmy cechuje brak rów-nowagi termodynamicznej, co jest niezbędne w proce-sie wyjaławiania materiałów, na których stwierdzono obecność drobnoustrojów.

W procesie sterylizacji wykorzystuje się bakteriobój-cze właściwości różnego rodzaju wyładowań (bariero-

wych, koronowych, jarzeniowych czy mikrofalowych), a co jest z tym związane emisję reaktywnych cząstek, rodników, jonów czy fotonów, które w nieodwracalny sposób uszkadzają funkcje życiowe mikroorganizmów [5, 18, 35, 44]. Jest to podstawa procesu sterylizacji plaz mowej.

2. Plazma jako czynnik sterylizujący

Plazma jest to zjonizowany, reaktywny gaz, bardzo często określany mianem „czwartego stanu skupienia materii”. Plazma najczęściej powstaje w warunkach ciśnienia atmosferycznego i jest generowana z różnych gazów m.in. szlachetnych (hel, argon) oraz reaktywnych (nadtlenek wodoru, tlen, azot) [9, 40].

Właściwości sterylizujące plazmy są określone przez reakcje pomiędzy tlenem, azotem, a także parą wodną, w wyniku czego tworzą się reaktywne formy tlenu i azotu (np. nadtlenek wodoru, rodniki OH, OH2, NO tlen singletowy, ozon, kwas peroksoazotowy, aniony ponadtlenkowe), o bardzo silnym działaniu dezaktywu-jącym mikroorganizmy wraz z ich formami przetrwal-nymi [3, 16, 26, 39, 43]. Dodatkowo podczas generowa-nia plazmy powstaje promieniowanie m.in. w zakresie UV, które też może mieć udział w procesach sterylizacji.

STERYLIZACJA ZA POMOCĄNISKOTEMPERATUROWEJ PLAZMY, GENEROWANEJ

W WARUNKACH CIŚNIENIA ATMOSFERYCZNEGO

Anna Dzimitrowicz1*, Piotr Jamróz1, Piotr Nowak2

1 Zakład Chemii Analitycznej i Metalurgii Chemicznej, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska2 Zakład Chemii Fizycznej i Kwantowej, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska

Wpłynęło w lutym 2014 r.

1. Wprowadzenie. 2. Plazma jako czynnik sterylizujący. 3. Rodzaje źródeł plazmowych. 4. Mechanizm procesu sterylizacji. 5. Kontrola procesu. 6. Zastosowania. 7. Podsumowanie

Sterilization by low-temperature atmospheric-pressure plasma

Abstract: Plasma is an ionized and reactive gas, which is used for sterilization of many kinds of microorganisms (e.g. bacteria, fungi), which reside on the surface of materials (e.g. medical instruments). Plasma sterilization allows to obtain absolute microbiological purity. Plasma can be generated by dielectric barrier discharge, glow discharge (including corona discharge, plasma jets or microjets) and microwave induced plasma. This article summarises literature review on plasma sterilization methods of microorganisms by low-temperature plasma generated under the atmospheric pressure.

1. Introduction. 2. Plasma as a sterilizing agent. 3. Types of plasma sources. 4. Mechanism of plasma sterilization. 5. Process control. 6. Applications of plasma sterilization. 7. Summary

Słowa kluczowe: mikroorganizmy, plazma, sterylizacja Key words: microorganisms, plasma, sterilization

P U B L I K A C J E M E T O D Y C Z N E I S T A N D A R D Y

196 ANNA DZIMITROWICZ, PIOTR JAMRÓZ, PIOTR NOWAK

Istnieje wiele sposobów klasyfikacji plazmy, ze względu na [9, 40]:

• Temperaturę–plazmazimnaigorąca;• Ciśnienie – plazma niskociśnieniowa, atmosfe-

ryczna oraz wysokociśnieniowa;• Składgazuplazmotwórczegoużytegodojejgene-

rowania – plazma jednoskładnikowa lub wielo-składnikowa.

Do wyjaławiania drobnoustrojów patogennych z powierzchni narzędzi medycznych, jak również z materia-łów termolabilnych, najczęściej jest stosowana plaz ma niskotemperaturowa (tzw. zimna plazma) [23, 28], generowana w warunkach ciśnienia atmosferycznego [3, 30, 35], jednakże zdarzają się przypadki wyjaławia-nia materiałów z zastosowaniem zimnej plazmy, gene-rowanej w warunkach obniżonego ciśnienia [31].

Ze względu na wspomnianą możliwość wyjaławia-nia substancji termolabilnych (tkanki, komórki, skóra, włókna, guma), proces z reguły przebiega w tempera-turze poniżej 50°C [3, 30, 35].

3. Rodzaje źródeł plazmowych

Sterylizacja za pomocą zimnej plazmy jest jedną z najbardziej efektywnych metod dezaktywacji drob-noustrojów patogennych. Wysoką wydajność procesu wyjaławiania uzyskuje się stosując jako źródła plaz-mowe: wyładowania barierowe [19, 24, 25], wyłado-wania jarzeniowe [7, 27], w tym dżety plazmowe [21, 30, 42], wyładowania koronowe [20, 22], a także wyła-dowania mikrofalowe [13, 15].

3.1. Wyładowania barierowe

Wyładowanie barierowe (DBD – dielectric barier discharge) zwane także cichym wyładowaniem, jest jednym z najczęściej stosowanych źródeł plazmowych. Proces sterylizacji mikroorganizmów pod wpływem wyładowań barierowych zachodzi pomiędzy alumi-niowymi elektrodami. Na jedną z elektrod nanoszony jest dielektryk, np. kwarc w formacie 100 × 1 mm, aby ochronić powstałe wyładowanie przed szybkim wyga-szeniem, na drugą zaś szkło w formacie 100 × 2 mm [24]. Układ elektrod wyładowczych jest zasilany przez generator wysokiego napięcia, o częstotliwości w zakre-sie od kilku Hz do kilkunastu MHz (najczęściej 100 Hz) [19, 24, 25]. W przestrzeni pomiędzy elektrodami gene-rowana jest plazma, najczęściej nietermiczna i nierów-nowagowa [19, 24, 25].

Materiał przeznaczony do sterylizacji umieszcza się bezpośrednio na elektrodzie z izolatorem. Aby mogło zostać zainicjowane wyładowanie barierowe temperatura gazu nośnego może być równa tempe-raturze pokojowej (25°C) [24], w warunkach ciśnie-

nia atmosferycznego bądź niższego niż atmosferyczne [19, 24, 25].

Z powodu niskich wartości natężenia prądu, wyła-dowania barierowe stosowane są do generowania zimnej plazmy, która jest używana do wyjaławiania instrumentów medycznych z drobnoustrojów choro-botwórczych. Jako przykład można wyróżnić zastoso-wanie wyładowania barierowego do procesu sterylizacji substancji wrażliwych na temperaturę, skażonych bak-teriami z rodzaju Escherichia coli, za pomocą powstałej w takich warunkach zimnej plazmy [24, 25].

Doświadczalnie wyznaczono, że największą wydaj-ność procesu uzyskuje się, jeżeli układ zostanie zasi-lony prądem o częstotliwości 100 Hz, a minimalny czas sterylizacji mikroorganizmów będzie wynosił 5 minut [24]. Jest to związane z koniecznością rozpadu ściany komórkowej mikroorganizmów oraz dezaktywacją ich materiału genetycznego, co następuje po określonym czasie ekspozycji na plazmowy czynnik sterylizujący [19, 24, 25].

3.2. Wyładowania jarzeniowe

Wyładowanie jarzeniowe pod ciśnieniem atmosfe-rycznym (APGD – atmospheric pressure glow discharge) jest wyładowaniem, które powstaje w gazach przy zasto-sowaniu wysokiego napięcia stałego lub pulsacyjnego, do 2 kV. Aby za pomocą wyładowania jarzeniowego wytworzyć plazmę, należy zastosować określone para-metry procesu tj.:

• Strumieńprzepływugazuplazmotwórczegopowi-nien mieścić się w zakresie od 0,5 do 2 dm3/min [8];

•Mocwyładowaniadookoło150W[12,26].W trakcie inicjacji wyładowania jarzeniowego pow-

stają charakterystyczne strefy różniące się intensyw-nością promieniowania, w przestrzeni pomiędzy katodą a anodą.

Aby inaktywować mikroorganizmy za pomocą wy- ładowania jarzeniowego, należy utworzyć specjalny układ, który będzie zawierał wysokonapięciowy gene-rator prądu stałego lub wysokiej częstotliwości, parę elektrod metalicznych, a także regulator przepływu gazów plazmotwórczych (najczęściej hel, argon, neon) [1, 45]. Należy jednak pamiętać, że gazy szlachetne nie są reaktywne i z tego względu do układu należy dostar-czyć inny reaktywny gaz, najczęściej tlen i/lub azot, aby uzyskać zamierzone efekty sterylizacji w stosunkowo krótkim czasie. Dla bakterii z rodzaju Staphylococcus aureus czas wyjaławiania wynosi około 5 minut, zaś dla bakterii z rodzaju E. coli zaledwie 1 minutę [1].

Cechą charakterystyczną sterylizacji z użyciem wyładowań jarzeniowych jest brak możliwości kontroli temperatury czy skuteczności procesu. O prawidło-wości jej przeprowadzania świadczyć mogą jedynie zmiany w morfologii komórki mikroorganizmów, iden-

STERYLIZACJA ZA POMOCĄ NISKOTEMPERATUROWEJ PLAZMY, GENEROWANEJ 197

tyfikowane zniszczeniem materiału genetycznego oraz aparatu do biosyntezy białek [1, 45].

Do specyficznych rodzajów wyładowań jarzenio-wych zaliczamy także dżety, w tym mikrodżety plaz-mowe (plasma jet, plasma microjet) oraz wyładowania koronowe.

Dżety plazmowe (atmospheric pressure plasma jets) najczęściej przyjmują kształt stożka plazmowego. Jeżeli wymiary dżetu są mniejsze niż 1 mm, dżet klasyfi-kowany jest jako mikrodżet plazmowy. Plazma, która niezmiennie odgrywa rolę czynnika sterylizu jącego, jest generowana w przestrzeni za wyładowaniem, najczęściej w warunkach ciśnienia atmosferycznego [20, 21, 42].

Elementem aparatury do sterylizacji z udziałem dże-tów plazmowych jest ceramiczna tuba o wymiarach ok. 1,5 × 3,1 × 200 mm, która jest połączona z generatorem prądu o wysokiej częstotliwości (ok. 30 kHz) [21]. Tem-peraturę procesu dobiera się w zależności od rodzaju mikroorganizmu, który jest dezaktywowany. W przy-padku bakterii z rodzaju S. aureus temperatura procesu wyjaławiania wynosi 35°C, zaś czas procesu sterylizacji jest dość krótki i wynosi 120 s [21]. Materiał przezna-czony do wyjaławiania jest preparowany na specjalnych, szklanych płytkach i mieszczonych w odległości 1 mm od źródła plazmy. W celu sprawdzenia wydajności pro-cesu, materiał mikrobiologiczny poddaje się inkuba-cji w temperaturze 37°C, przez okres 36 godzin [21]. Jeżeli po inkubacji we wspomnianych warunkach nie wytworzone zostaną nowe kolonie mikroorganizmów to znaczy, że proces sterylizacji za pomocą plazmy, wygenerowanej w wyniku wyładowania jarzeniowego przebiegł w sposób prawidłowy [20, 21, 42].

Wyładowania koronowe (corona discharge) są także klasyfikowane jako wyładowania jarzeniowe, genero-wane przy ciśnieniu zbliżonym do atmosferycznego oraz przy zastosowaniu wysokiego napięcia. Wyładowa-nia koronowe powstają w łatwiejszy sposób na elektro-dach charakteryzujących się zakrzywioną powierzchnią części wyładowczej, co jest spowodowane większą szyb-kością inicjacji wyładowania [40].

Proces wyjaławiania materiałów pod wpływem wyła-dowań koronowych zachodzi w temperaturze poniżej 50°C [20], pod ciśnieniem atmosferycznym [22]. Układ sterylizacyjny składa się z palnika plaz mowego, elek-trody wyładowczej, źródła napięcia, miejsca wprowa-dzania gazu plazmowego oraz płytki, na którą umiesz-cza się poddawany wyjałowieniu materiał. Odległość pomiędzy sterylizowanym materiałem a elektrodą, na której zachodzi wyładowanie koronowe wynosi ok. 20 mm [30], zaś natężenia strumienia przepływu gazu plazmotwórczego około 40 dm3/min [20].

Aby przeprowadzić inaktywację bakterii z rodzaju E. coli lub jednokomórkowych grzybów z gatunku Saccharomycces cerevisiae należy umieścić mikroorganizmy na odpowiednio przygotowanym podłożu mikrobiolo-

gicznym, o wymiarach 20 × 100 mm [20] i wprowadzić do układu, który generuje plazmę [1, 8, 12, 13, 15, 22, 45]. Czas sterylizacji plazmowej, wykorzystującej wyła-dowanie koronowe wynosi od 0–5 s i zależy od miana bakterii jakie chcemy uzyskać po procesie wyjaławia-nia. Kolejno przeprowadza się kontrolę prawidłowość sterylizacji przez inkubację w temperaturze optymalnej dla danego szczepu mikroorganizmu (np. dla pałeczki okrężnicy temperatura wynosi 37°C) [30]. Jeżeli po inkubacji, przez czas minimum 15 godzin, nie pojawiły się kolonie bakterii, to sterylizacja została przeprowa-dzona w sposób prawidłowy. Oceny dokonuje się na podstawie obserwacji wizualnej, z wykorzystaniem mikroskopii optycznej [20, 22].

3.3. Wyładowania mikrofalowe

Plazma mikrofalowa jest zimną plazmą niskotem-peraturową. Jej składnikami są głównie swobodne elek-trony, cząsteczki dwuatomowe, atomy oraz jednododat-nie jony. Moc dostarczana do generatorów zwykle mieści się w zakresie od 200 do 1000 W [37].

Do wytworzenia promieniowania mikrofalowego wykorzystuje się magnetron. Generatorem magne-tronowym jest najczęściej dwuelektrodowa lampa elektronowa dużej mocy. Wytworzone w niej promie-niowanie mikrofalowe kierowane jest do falowodu za pomocą zaworu ferrytowego, który uniemożliwia emi-sję promieniowania z komory wyładowczej. W plazmie mikrofalowej wykorzystuje się promieniowanie o czę-stotliwości 2,45 GHz [6].

Plazma mikrofalowa powstaje w wyniku oddzia-ływania promieniowania mikrofalowego na gaz plaz-motwórczy (np. argon, hel) w rezonatorze, nazywaną również wnęką mikrofalową. Wnęka ta gwarantuje skuteczne wykorzystanie energii mikrofal oraz chroni przed wydostaniem się ich do otoczenia, co ma zasad-nicze znaczenie dla bezpieczeństwa procesu, ponieważ mikrofale są szkodliwe dla organizmu człowieka. Do zainicjowania wyładowania potrzebne są np. elektrony wybite z metalu w mikrofalowym polu elektromagne-tycznym lub iskra. Rozpędzone w tym polu elektrony zderzają się z atomami gazu inicjując ich jonizacje, która w dalszych etapach postępuje łańcuchowo [43].

Wyładowania mikrofalowe prowadzą do powstania plazmy niskotemperaturowej, która jest stosowana do inaktywacji bakterii (np. Bacillus subtilis, Geobacillus stearothermophilus) oraz grzybów pleśniowych (np. Aspergillus brasiliensis czy Alternaria alternata). Moc generatora promieniowania mikrofalowego wynosi ok. 400 W, zaś natężenie strumienia przepływu gazu plazmotwórczego (np. argon) od 0,1 do 20 dm3/min. Homogeniczny materiał, którego wymiary nie powinny przekraczać 10 × 10 cm, umieszcza się w odległości około 12 cm od źródła plazmy, a następnie poddaje


się procesowi wyjaławiania. Czas ekspozycji nie powi-nien być krótszy niż 180 s, ze względu na możliwość pozostania aktywnych kolonii bakterii, natomiast wy- dłużanie czasu powyżej 300 s jest nieekonomiczne. Inaktywacja mikroorganizmów zachodzi w wyniku zniszczenia ich materiału genetycznego przez strumień aktywnych cząstek generowanych w plazmie [34].

Zaletą sterylizacji z użyciem niskotemperaturowej plazmy mikrofalowej jest brak toksycznych produktów ubocznych, a także łatwość wykonania, szybkość pro-cesu oraz wysoka skuteczność wyjaławiania [34].

W tabeli I przedstawiono rodzaje źródeł plazmo-wych, optymalne warunki ich działania, wpływ na inak-tywację różnych mikroorganizmów oraz skuteczność procesu sterylizacji plazmowej.

4. Mechanizm procesu sterylizacji za pomocą plazmy

Pod wpływem naświetlania promieniowaniem UV, powstającego w plazmie, następuje rozpad materiału genetycznego komórki. W konsekwencji mikroorga-nizm pozbawiony jest możliwości naprawy powstałych

uszkodzeń tj. rozpad kwasów nukleinowych, enzymów czy białek strukturalnych. Kluczową fazą degradacji komórkijestatakwolnychrodników(np.OH•,NO•),które utleniają związki organiczne, budujące mikroor-ganizmy. Produktami wspomnianych reakcji chemicz-nych są proste związki organiczne, a ostatecznie woda i dwutlenek węgla [26].

Istotny wpływ na wydajność procesu sterylizacji ma koncentracja cząstek reaktywnych w gazie wyładow-czym. Skutecznym sposobem zwiększenia stężenia cząstek reaktywnych, przejawiającym się wzrostem efektywności wyjaławiania, jest dodatek do gazu plaz-motwórczego azotu bądź tlenu, które zdolne są do two-rzenia wolnych rodników [26].

5. Kontrola procesu

W przypadku procesu sterylizacji bardzo ważnym etapem jest kontrola skuteczności i kompletności wyja-ławiania. Znaczenie tego faktu jest bezdyskusyjne, ponieważ nie jest dopuszczalne stosowanie narzędzi chirurgicznych czy dentystycznych, bez pewności, że

Wyładowania barierowe Ciśnienie: atmosferyczne Escherichia coli 5 min – 100% Odległość między elektrodą a wyjaławianym materiałem: 30–50 mm Strumień natężenia przepływu gazu plazmotwórczego: 40 dm3/min Czas procesu: 5 min Temperatura: 25°CDżety plazmowe Ciśnienie: atmosferyczne Staphylococcus aureus 120 s –100% Odległość między elektrodą a wyjaławianym materiałem: 1 mm Strumień natężenia przepływu gazu plazmotwórczego: 0.3 dm3/min Czas procesu: 120 s Temperatura: 35°CWyładowania koronowe Ciśnienie: atmosferyczne Escherichia coli 1 s – 88% Odległość między elektrodą Saccharomyces cerevisiae 5 s – 100% a wyjaławianym materiałem: 20 mm Strumień natężenia przepływu gazu plazmotwórczego: 40 dm3/s Czas procesu: 0–5 s Temperatura: 50°CWyładowania mikrofalowe Ciśnienie: atmosferyczne Bacillus subtilis 300 s – 100% Odległość między elektrodą Geobacillus a wyjaławianym materiałem: 120 mm stearothermophilus Strumień natężenia przepływu gazu Aspergillus brasiliensis plazmotwórczego: 0.1–20 dm3/min Alternaria alternata Czas procesu: 40 min Temperatura: 80°C

Tabela IRodzaje źródeł plazmowych stosowanych do sterylizacji mikroorganizmów [19, 20, 21, 22, 24, 30, 34, 40]

Rodzaj źródłaplazmowego Optymalne warunki procesu Rodzaj inaktywowanych

mikroorganizmów

Czas i wydajność sterylizacjiz zastosowawaniem odpo-

wiedniego źródła plazmowego

STERYLIZACJA ZA POMOCĄ NISKOTEMPERATUROWEJ PLAZMY, GENEROWANEJ 199

nie zawierają one żadnych biologicznych zanieczysz-czeń. Stosowane są dwa rodzaje kontroli procesu stery-lizacji: kontrola wewnętrzna oraz kontrola zewnętrzna. Do zadań kontroli wewnętrznej, przeprowadzanej przez operatora procesu, zalicza się m.in. sprawdzenie parametrów procesu sterylizacji tj. temperatury, czasu, ciśnienia (kontrola fizyczna) [39], a także obserwacja zmiany zabarwienia specjalnych wskaźników m.in. jednoparametrowych, wieloparametrowych i zintegro-wanych (kontrola chemiczna) [39]. W zakres tej kon-troli wchodzą również metody wizualnej identyfikacji ewentualnie powstających nowych kolonii mikroorga-nizmów. Z kolei kontrolę zewnętrzną przeprowadzają uprawnione instytucje, a w tym Państwowa Inspekcja Sanitarna, która najczęściej dokonuje tylko kontroli biologicznej.

6. Zastosowania procesu

Metody sterylizacji plazmowej możemy zastosować do wyjaławiania szerokiej grupy przedmiotów, narzędzi i materiałów, a w tym termolabilnych, nieodpornych na działanie wysokiej temperatury. W praktyce metody sterylizacji plazmowej jest wykorzystywana do:

•Wprzypadkuwyjaławiania narzędzi chirurgicz-nych oraz dentystycznych stosowane są nowocze-sne technologie sterylizacji z wykorzystaniem pla-zmy niskotemperaturowej. Metoda daje pewność co do skuteczności procesu oraz jego bezpieczeń-stwa użycia, co wraz z istotnym ograniczeniem korozji narzędzi i akcesoriów medycznych, niską temperaturą procesu (ok. 50°C) oraz krótkim cza-sem procesu sterylizacji (do 75 minut) stanowi ogromną zaletę procesu. Wadą procesu jest nie-wielka efektywność wyjaławiania sprzętu porowa-tego [39, 41].

•Przyśpieszaniagojeniasięran,leczeniaschorzeńdziąseł, neutralizowania przykrego zapachu ciała, dezynfekcja ran itp. Wykorzystanie plazmy do celów medycznych jest możliwe ze względu na niską temperaturę plazmowego czynnika stery-lizującego (zbliżoną do temperatury ciała ludz-kiego) oraz powstawanie substancji o właściwo-ściach odkażających, w wyniku reakcji pomiędzy tlenem, azotem oraz parą wodną [45, 46].

•Sterylizacjaplazmowamożetakżebyćużywanadosanitaryzacji żywności, gdyż nie powoduje denatu-racji białek oraz zmian właściwości organoleptycz-nych poddawanego wyjaławianiu materiału. Jest to technologia ekologiczna. W przysz łości może zostać zastosowana do przygotowania zapasów pożywienia, przeznaczonych do długotrwałego przechowywania w misjach wojskowych, mor-skich lub kosmicznych [11, 33].

•Metodysterylizacjiplazmowejmożnatakżestoso-wać do oczyszczania wody słodkiej z zanieczysz-czeń biologicznych, co jest coraz powszechniej wykorzystywane do uzdatniania wody przezna-czonej do celów gospodarskich i spożywczych [14, 16, 23].

7. Podsumowanie

Metoda sterylizacji z zastosowaniem zimnej plazmy, generowanej w warunkach ciśnienia atmosferycznego jest powszechnie stosowana do nieodwracalnego nisz-czenia mikroorganizmów, zarówno w postaci form wegetatywnych jak i przetrwalnych.

Ze względu na stosunkową łatwość generowania strumienia plazmy z wykorzystaniem różnych źródeł, niewielki koszt aparatury i jej montażu w warunkach użycia, wyjątkowo wysoką skuteczność wyjaławia- nia, a także brak szkodliwych produktów ubocznych oraz niskie koszty eksploatacyjne, metoda sterylizacji plaz mowej jest coraz częściej stosowaną metodą, głów-nie w medycynie, inżynierii środowiska oraz w techno-logii żywności.

Istotnym ograniczeniem wszystkich metod steryli-zacji plazmowej jest ich niewielka użyteczność do wyja-ławiania materiałów porowatych (np. pumeks, celuloza, tkaniny itp.). należy jednak mieć nadzieję, że dyna-miczny rozwój badań podstawowych i aplikacyjnych nad metodami sterylizacji plazmowej umożliwi szybkie wykorzystanie ich w znacznie szerszym zakresie.

Piśmiennictwo

1. Akitsu T., Ohkawa H., Tsuji M., Kimura H., Kogoma M.: Plasma sterilization using glow discharge at atmospheric pressure. Surf. Coat. Tech. 193, 29–34 (2005)

2. Alavi S., Raji S., Ghorbani A.: Effects of steam and dry-heat ste-rilization on bending pro perties of NiTi wires. Orthod. Waves, 68, 123–128 (2009)

3. Basaran P., Basaran-Akgul N., Oksuz L.: Elimination of Aspergillus parasiticus from nut surface with low pressure cold plasma (LPCP) treatment. Food Microb. 25, 626–632 (2008

4. Beaudet J., Weyers A., Solakyildirim K., Yang B., Takieddin M., Mousa S., Zhang F., Linhardt R.: Impact of Autoclave Steri-lization on the Activity and Structure of Formulated Heparin. J. Pharm. Sci. 100, 3396–3404 (2011)

5. Benterrouche L., Sahli S., Rebiai S., Benhamouda A., Sebihi F. Z.: Inactivation of E. coli bacteria by atmospheric dielectric barrier discharge. Inter. J. Nanotech. 10, 543–552 (2013)

6. Cortazar O. D., Komppula J., Tarvainen O., Megia-Macias A., Vizcaino-De-Julian A., Koivisto H.: Experimental study of hydro-gen plasma breakdown in a 2.45 GHz microwave discharge. Plasma Sources Sci. T. 22, 1–9 (2013)

7. Cvelbar U., Vujosevic D., Vratnica Z., Mozetic M.: The influence of substrate material on bacteria sterilization in an oxygen pla-sma glow discharge. J. Phys. D: Appl. Phys. 39, 3487–3493 (2006)


8. Czylkowski D., Hrycak B., Jasiński M., Dors M., Miezrczyk J.: Atmospheric pressure microwave microplasmas microorganism deactivation. Surf. Coat. Tech. 294, 114–119 (2013)

9. Fridman A.: Plasma Chemistry, Cambridge Univ. Pres, New York, 2008

10. Fridman G., Friedman G., Gustol A., Shekhter A.B., Vasi-lets V.N., Fridman A.: Applied plasma medicine. Plasma Process. Polym. 5, 503–533 (2008)

11. Guillard V., Mauricio-Iglesias M. Gontarg N.: Effect of novel food processing methods on packaging: structure, composition and migration properties. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 50, 969–988 (2010)

12. Hahnel M., Von Woedtke T., Weltmann K-D.: Influence of the air humidity on the reduction of Bacillus spores in a defined environment at atmospheric pressure using a dielectric barrier surface discharge. Plasma Process. Polym. 7, 244–249 (2010)

13. Hayashi N., Nakashima T. Yonesu A.: Sterilization of medical equipment using air torch plasma produced by microwave discharge. IEEE T. Plasma Sci. 39, 2976–2977 (2011)

14. Hong Y.C., Park H.J., Lee B.J., Kang W.S., Uhm H.S.: Plasma for-mation using a capillary discharge in water and its applications to the sterilization of E. coli. Phys. Plasmas, 17, 1–6 (2010)

15. Hueso J.L., Rico V.J., Frias J.E. Cotrino J., Gonzalez-Elipe A.R.: Ar + NO microwave plasmas for Escherichia coli sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 41, 2–4 (2008)

16. Jamroz P., Greda K., Pohl P., Zyrnicki W.: Atmospheric pres-sure glow discharges generated in contact with flowing liquid cathode: production of active species and application in waste water purification processes. Plasma Chem. Plasma Process. 34, 25–37 (2014)

17. Kanemitsu K., Kaku M. i wsp.: Validation of low-temperature steam with formaldehyde sterilization for endoscopes, using validation devices. Gastrointestinal Endosc. 62, 928–932 (2005)

18. Kikuchi Y., Miyamae M., Nagata M., Fukomoto N.: Effects of environmental humidity and temperature on sterilization effi-ciency of dielectric barrier discharge plasmas in atmospheric pressure air. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 1–4 (2011)

19. Kowasaki T., Hoteksu S., Morisaki H., Sato K., Baba H., Umeda S., Nakagawa Y., Wakamatsu S., Sakai M.: Basic study on generation and sterilization of sheet type plasma jet-like DBD under atmospheric pressure. Int. J. PEST. 7, 26–30 (2013)

20. Kuwahara T., Kuroki T., Yoshida K., Saeki N., Okubo M.: Deve-lopment of sterilization device using air nonthermal plasma jet induced by atmospheric pressure corona discharge. Thin Solid Films, 523, 2–5 (2012)

21. Liu X., Hong F., Guo Y., Zhang J.: Sterilization of Staphylococcus aureus by an Atmospheric Non-Thermal Plasma Jet. Plasma Sci. Technol. 15, 439–442 (2013).

22. Masaoka S.: Plasma sterilization of polyethylene terephthalate bottles by pulsed corona discharge at atmospheric pressure. Biocontrol Sci. 12, 59–63 (2007)

23. McCombs G.B., Darby M.L.: New discoveries and directions for medical, dental and dental hygiene research: low temperature atmospheric pressure plasma. Intern. J. Dent. Hygiene, 8, 10–15 (2010)

24. Miao H., Yun G.: The effect of air plasma on sterilization of Escherichia coli in dielectric barrier discharge. Plasma Sci. Technol. 14, 735–740 (2012)

25. Miao H., Yun G.: The sterilization of Escherichia coli by die-lectric-barrier discharge plasma at atmospheric pressure. Appl. Surf. Sci. 257, 7065–7070 (2011)

26. Moisan M., Barbeau J., Crevier M., Pelletier J., Philip N., Saoudi B.: Plasma sterilization. Methods and mechanism. Pure Appl. Chem. 74, 349–358 (2002)

27. Montie T. C., Kelly-Wintenberg K., Reece Roth J.: An overview of research using the one atmosphere uniform glow discharge plasma (OAUGDP) for sterilization of surfaces and materials. IEEE T. Plasma Sci. 28, 41–50 (2000)

28. Morris A.D., McCombs G. B., Akan T., Hynes W., Laroussi M., Tolle S. L.: Cold plasma technology: bactericidal effects on Geobacillus stearothermophillus and Bacillus cereus microorganism. J. Dent. Hygiene, 83, 55–61 (2009)

29. Moser B., Rieder J.: High-Speed Ambient Air Monitoring of Ethylene Oxide in Sterilization Units. J. Occup. Environ. Hyg. 9, 143–145 (2012)

30. Philip N., Saoudi B., Crevier M., Moisan M., Barbeau J., Pelle-tier J.: The respective roles of UV photons and oxygen atoms in plasma sterilization at reduced gas pressure: the case of N2-O2 mixtures. IEEE T. Plasma Sci. 30, 1429–1436 (2002)

31. Rossi F., Kylian O., Hasiwa M., Gilliland D.: Low pressure pla-sma discharges for the sterilization and decontamination of surfaces. New J. Phys. 11, 1–34 (2009)

32. Ryan T.P., Stalder H.R., Woloszko J.: Overview of plasma techno-logy used in medicine. Proc. SPIE, 8584, doi:10.1117/12.2007309 (2013)

33. Sastry S.K., Jun S., Somarat R., Samaranayake C., Yousef A., Panoli R.B.: Heating and sterilization technology for long dura-tion space missions: Transport processes in a reusable package. Ann. NY. Acad. Sci. 1161, 562–569 (2009)

34. Sato T., Fujioka K., Ramasamy R., Urayama T., Fujii S.: Steriliza-tion efficacy of a coaxial microwave plasma flow at atmospheric pressure. IEEE Trans. Ind. Appl. 42, 399–404 (2006)

35. Shahidi S., Ghoranneviss M.: Sterilization of Cotton Fabrics Using Plasma Treatment Plasma Sci. Technol. 15, 1031–1033 (2013)

36. Shimizu S., Barczyk S., Rottberg P., Shimizu T., Klaempfl T., Zimmermann J.L., Linsmeier C., Weber P., Morfill G.E., Tho-mas H.M.: Cold atmospheric plasma – A new technology for spacecraft component decontamination. Plan. Space Sci. 90, 60–71 (2014)

37. Shimizu T., Morfill G.E i wsp.: Characterization of microwave plasma torch for decontamination. Plasma Process. Polym. 5, 577–582 (2008)

38. Shintani H.: Validation study and routine control monitoring of moist heat sterilization procedures. Biocontrol Sci. 17, 57–67 (2012)

39. Sokól-Leszczyńska B., Sztark E., Leszczyński P., Młynarczyk G., Wróblewska M.: Przygotowanie instrumentarium medycznego do zabiegów chirurgicznych. Cześć II – sterylizacja i reproceso-wanie. Post. Mikrobiol. 51, 315–321 (2012)

40. Stryczewska H.: Technologie plazmowe w energetyce i inży-nierii środowiska, Wyd. Politechniki Lubelskiej, Lublin, 2009, str. 26–60

41. Sung S., Huh J., Yun M., Myung B., Jeong C., Jeon Y.: Steriliza-tion effect of atmospheric pressure non-thermal air plasma on dental instruments. J. Adv. Prosthodont. 5, 2–8 (2013)

42. Uhm H., Choi E., Cho G.: Sterilization of microbes by using various plasma jets. J. Korean Phys. Soc. 60, 897–902 (2012)

43. Wang C. H., Wu Y., Li G. F.: A multi-wire-to-cylindrical type packed-based plasma reactor for the inactivation of M. aureginosa. J. Electrostat. 66, 71–78 (2008)

44. Williams S., Popovic S., Gupta M.: Microwave plasma generation and filtered transport of O2. Plasma Sources Sci. T. 18, 1–6 (2009)

45. Yang L., Chen J., Gao J.: Low temperature argon plasma sterili-zation effect on Pseudomonas aureginosa and its mechanisms. J. Electrostat. 67, 646–651 (2009)

46. Yang L., Chen J., Gao J., Guo Y.: Plasma sterilization using the RF glow discharge. Appl. Surf. Sci. 255, 8960–8964 (2009)

W dniu 28 listopada 2015 roku w Auli Kryształowej SGGW w Warszawie odbędzie się 16. konferencja z cyklu „Biologia molekularna w diagnostyce chorób zakaźnych i biotechnologii” DIAGMOL 2015. Tegoroczna konfe-rencja będzie poświęcona prof. dr. hab. Władysławowi Kunickiemu-Goldfingerowi, w 20. rocznicę śmierci. Program pierwszej sesji konferencji wypełnią wspo-mnienia o życiu i dokonaniach Profesora, wygłoszone przez jego współpracowników, uczniów i kolegów.

Pracownicy Zakładu Genetyki Bakterii,Instytutu Mikrobiologii, Wydziału Biologii,

Uniwersytetu Warszawskiego.Prof. dr hab. Władysław Kunicki-Goldfinger

K O M U N I K A T Y I I N F O R M A C J E

Sprostowanie

Na prośbę Pani M. Wesserling Redakcja PM informuje, iż praca pt. „Regulacja bakte-ryjnych systemów restrykcyjno-modyfikacyjnych (R-M) typu II” (Post. Mikrobiol. 2015, 54, (1), 5–9) została wykonana w ramach grantu NCN N N301 724140 kierowanego przez Panią dr hab. I. Mruk z Katedry Mikrobiologii Uniwersytetu Gdańskiego. Afiliacja ww. pracy ulega uzupełnieniu o Uniwersytet Gdański, Katedra Mikrobiologii.

SPIS TREŚCI

A. K. M a r c h e w k a, A. M a j e w s k a, G. M ł y n a r c z y k – Działalność ruchu antyszczepionkowego, rola środków masowego komunikowania oraz wpływ poglądów religijnych na postawę wobec szczepień ochronnych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95M. K i z e r w e t t e r - Ś w i d a, D. C h r o b a k - C h m i e l, M. R z e w u s k a, M. B i n e k – Staphylococcus pseudintermedius – trudno rozpoznawalny patogen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103M. P a w l i k, T. P ł o c i n i c z a k, Z. P i o t r o w s k a - S e g e t – Bakterie endofityczne i ich znaczenie w mikrobiologii środowiskowej, medycynie i przemyśle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115K. B. M u s k a l s k a, B. S z y m c z a k – Postępy badań nad bakteriami rodzaju Listeria 123B. To k a r z - D e p t u ł a, J. Ś l i w a - D o m i n i a k, M. A d a m i a k, W. D e p t u ł a – Probiotyki a wybrane schorzenia u ludzi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133A. W y s z y ń s k a, P. K o b i e r e c k a, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Bakterie kwasu mlekowego (LAB) jako wektory do konstrukcji szczepionek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141K. K u c h a r s k a, D. K u c h a r s k i, B. Z a j d e l – Bakterie Xenorhabdus i Photorhabdus, nicienie entomopatogeniczne i owady – funkcjonowanie w złożonym układzie symbiont – pasożyt – żywiciel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154K. K a s p e r k i e w i c z, M. N o s z c z y ń s k a, A. P i s z c z e k – ECA – wspólny antygen powierzchniowy pałeczek rodziny Enterobacteriaceae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165J. S t e f a ń s k a – Przeciwdrobnoustrojowe właściwości naturalnych jonoforów karboksylowych ich pochodnych . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175K. R u d n i c k a, P. K w i a t k o w s k a, A. G a j e w s k i, M. C h m i e l a – Mikroflora miodu jako źródło spor C. botulinum i przyczyna rozwoju botulizmu niemowląt – rozważania na temat zasadności oczyszczania miodu w kontekście obowiązującego prawa . . . . . . . . . . . . . . . 184PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDYA. D z i m i t r o w i c z, P. J a m r ó z, P. N o w a k – Sterylizacja za pomocą niskotemperaturowej plazmy, generowanej w warunkach ciśnienia atmosferycznego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195KOMUNIKATY I INFORMACJE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

CONTENTS

A. K. M a r c h e w k a, A. M a j e w s k a, G. M ł y n a r c z y k – The activity of antivaccine movement, role of the mass media and influence of religious beliefs on the attitude towards immunization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95M. K i z e r w e t t e r - Ś w i d a, D. C h r o b a k - C h m i e l, M. R z e w u s k a, M. B i n e k – Staphylococcus pseudintermedius – a pathogen difficult to identify . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103M. P a w l i k, T. P ł o c i n i c z a k, Z. P i o t r o w s k a - S e g e t – Endophytic bacteria and their role in environmental microbiology, medicine and industry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115K. B. M u s k a l s k a, B. S z y m c z a k – Progress in research on the genus Listeria . . . . . . . . . . 123B. To k a r z - D e p t u ł a, J. Ś l i w a - D o m i n i a k, M. A d a m i a k, W. D e p t u ł a – Probiotics and the selected diseases in humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133A. W y s z y ń s k a, P. K o b i e r e c k a, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – LAB (lactic acid bacteria) as live vectors for the development of safe mucosal vaccines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141K. K u c h a r s k a, D. K u c h a r s k i, B. Z a j d e l – Bacteria Xenorhabdus and Photorhabdus, entomopathogenic nematodes and insects – their role in the complex symbiont-parasite- -host relationship . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154K. K a s p e r k i e w i c z, M. N o s z c z y ń s k a, A. P i s z c z e k – ECA – common surface antigen of the bacilli of the Enterobacteriaceae family . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165J. S t e f a ń s k a – Antimicrobial properties of natural carboxylic ionophores and their derivatives 175K. R u d n i c k a, P. K w i a t k o w s k a, A. G a j e w s k i, M. C h m i e l a – Honey as a reservoir of C. botulinum and a risk factor for infant botulism . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184METHODS AND STANDARDSA. D z i m i t r o w i c z, P. J a m r ó z, P. N o w a k – Sterilization by low-temperature atmospheric-pressure plasma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195NEW REPORTS AND INFORMATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

· 2017-03-02 · Index Copernicus ICV = 9,65 (2013) Impact Factor ISI = 0,271 (2013) Punktacja...

Documents

Transcript of · 2017-03-02 · Index Copernicus ICV = 9,65 (2013) Impact Factor ISI = 0,271 (2013) Punktacja...