1979 tom 25 nr 3 - rcin.org.plrcin.org.pl/Content/27288/WA488_23953_P939_T25-z3-PB.pdf · LEOKADIA...

POLSKIEm m

TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

POSTBAH 25(1) 285-464 (1979)

PAŃSTWOWE

WYDAWNICTWO

NAUKOWE

1979 tom 25 nr 3PL ISSN 0032—-5422

http://rcin.org.pl

WSKAZÓWKI DLA AUTORÓW

Kwartalnik „Postępy Biochemii” publikuje artykuły monograficzne omawiające wąskie tematy oraz artykuły przeglądowe referujące szersze zagadnienia z biochemii i nauk pokrewnych. Artykuły pierwszego typu winny obejmować syntetyczny przegląd postępu wiedzy w omawianej dziedzinie opracowany na podstawie piśmiennictwa z kilku ostatnich lat, a artykuły drugiego typu jedynie piśmiennictwo z ostatniego roku lub dwu lat. Kwartalnik publikuje także krótkie noty informujące o nowych i ważniejszych osiągnięciach biochemii. Przekazanie artykułu do Redakcji jest równoznaczne z oświadczeniem, że nadesłana praca nie była i nie będzie publikowana w innym czasopiśmie, jeżeli zostanie ogłoszona w „Postępach Biochemii”. Autorzy artykułu odpowiadają za prawidłowość i ścisłość podanych informacji. Autorów obowiązuje korekta autorska. Koszty zmian tekstu w korekcie (poza poprawieniem błędów drukarskich) ponoszą autorzy. Artykuły honoruje się według obowiązujących stawek. Autorzy otrzymują bezpłatnie 25 odbitek swego artykułu; zamówienia na dodatkowe odbitki (płatne) należy zgłosić pisemnie odsyłając pracę po korekcie autorskiej.

Redakcja prosi autorów o przestrzeganie następujących wskazówek:Forma maszynopisu: maszynopis pracy i wszelkie załączniki należy nadsyłać

w dwu egzemplarzach. Maszynopis powinien być napisany jednostronnie, z podwójną interlinią., z marginesem ok. 4 cm po lewej i ok. 1 cm po prawej stronie; nie może zawierać więcej niż 60 znaków w jednym wierszu nie więcej niż 30 wierszy na stronie zgodnie z Normą Polską.

Układ maszynopisu: strona okładkowa nienumerowana zawiera imiona i nazwisko(a) autora(ów), adres(y) Zakładu(ów) w języku polskim i angielskim, w których pracują autorzy, adres pocztowy, na który autorzy życzą sobie otrzymywać korespondencję, adres prywatny, telefon miejsca pracy, tytuł artykułu (w języku polskim i angielskim), oraz — w prawym dolnym rogu — liczbę stron, liczbę rycin, wzorów i tabel oraz skrót tytułu (nie więcej niż 25 znaków drukarskich).

Strona tytułowa (1) imiona (w pełnym brzmieniu) i nazwisko(a) autora(ów), tytui pracy w języku polskim i angielskim, rzeczowy spis treści w języku polskim i angielskim, tytuł naukowy autora(ów) i jego (ich) miejsce(a) pracy, wykaz skrótów stosowanych w pracy.

Strona 2 i następne obejmują tekst pracy do spisu piśmiennictwa włącznie, tabele, spis rycin, wzorów oraz tytuły i objaśnienia do rycin na stronach końcowych.

Dla przejrzystości tekstu obowiązuje podział artykułu na rozdziały i podrozdziały, których tytuły rzeczowo winny informować o przedstawianych treściach. Rzeczowy spis treści publikujemy bezpośrednio po tytule pracy. Rozdziały numerujemy liczbami rzymskimi, a podrozdziały odpowiednią rzymską i arabską (np. 1-1.). Tytułów podrozdziałów nie wydzielonych z tekstu nie trzeba numerować. W tekście nie należy stosować żadnych podkreśleń ani rozstrzelonego druku. Ewentualne sugestie autorskie co do charakteru czcionki drukarskiej należy zaznaczyć ołówkiem na marginesie maszynopisu. W przypadku umieszczenia w tekście liter alfabetu greckiego należy na marginesie wpisać ołówkiem ich fonetyczne brzmienie. Tabele i ryciny numerujemy cyframi arabsKimi a wzory rzymskimi. W tekście nie należy umieszczać żadnych tablic, rycin czy wzorców, lecz w żądanym miejscu pozostawić wolny wiersz i zaznaczyć: Tabela 1, Ryc. 1, Wzór I itp. Numerację wzoru w tekście należy podawać po nazwie związku np. kwas glutaminowy (I).

Redakcja prosi autorów o zwrócenie szczególnej uwagi na poprawność językową tekstu a także na ścisłość i jasność sformułowań, unikanie gwary laboratoryjnej oraz o niewprowadzanie do tekstu tworzonych doraźnie skrótów, nawet jeśli niektóre z nich bywają używane w pracach obcojęzycznych.

http://rcin.org.pl

POLSKIE TOWARZYSTWO BIOCHEMICZNE

PostępyBiochemiiKWARTALNIK 1979 tom 25 zeszyt 3

Wydane z pomocą finansową Postbah 25(3)Polskiej Akademii Nauk 2 8 5 —464 (1979)

Państwowe W ydawnictwo Naukowe

http://rcin.org.pl

RADA REDAKCYJNA

Przewodniczący: K. Zakrzewski (W arszawa)Zastępca: W. Ardelt (Warszawa)Członkowie: S. Angielski (Gdańsk), M. Bagdasarian (Warszawa), M. Chorąży (Gliwice), W. Drabikowski (Warszawa), M. Fikus (Warszawa), J. Gre- gorczyk (Szczecin), B. Grzelakowska-Sztabert (Warszawa), D. Hulanicka (Warszawa), W. Jachymczyk (Warszawa), J. Kwiatkowska (Wrocław),S. Lewak (Warszawa), W. Mejbaum-Katzenellenbogen (Wrocław), A. Le- gocki (Poznań), A. Morawiecki (Wrocław), J. Pawełkiewicz (Poznań), K. Raczyńska-Bojanowska (Warszawa), Z. Zielińska (Warszawa)

REDAKTOR NACZELNY Z.. Zielińska

ZASTĘPCA REDAKTORA NACZELNEGOD. Hulanicka

SEKRETARZ REDAKCJI M. Balińska

CZŁONKOWIE REDAKCJI: B. Czartoryska (Warszawa), E. Czuryło (Warszawa), J. Skangiel-Kramska (Warszawa), J. Zborowski (Warszawa)

Adres RedakcjiPolskie Towarzystwo Biochemiczne ul. Freta 16, 00-227 Warszawa

PA Ń STW O W E W Y D A W N IC TW O N A U K O W E — W A R SZ A W A 1S79

N ak ład 2.330 O ddano d o sk ła d a n ia 27.IV.79

A rk . w y d . 14,25, ark . druk . 11,25 P o d p isa n o do d ruk u w s ierp n iu 1979 r.

P ap . druk . sa t. k l. IV, 70 g, 70X100 D ruk u k o ń czo n o w e w r ze śn iu 1979 r.

Zam . nr 593/79 C ena z ł 20,—

D ru k arn ia im . R e w o lu c ji P a źd z ier n ik o w e j, W arszaw a

http://rcin.org.pl

Post. BiOChem., 25, 287—350 (1979). V

LEOKADIA KŁYSZEJKO-STEFANOW ICZ *)

Niejednorodność i specyficzność białek niehistonowych

H eterogeneity and Specificity of Nonhistone Protein

Spis treści

I. Zarys metod otrzymywania białek NHCII. Niejednorodność oraz specyficzność molekularna i metaboliczna białek NHCIII. Powinowactwo białek NHC do DNAIII-l. Chromatografia powinowactwa na immobilizowanycb DNAIII-2. Chromatografia powinowactwa na immobilizowanych histonachIII-3. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości roztworów sacharozy czy metrizamiduIII-4. Technika sączenia przez filtry nitrocelulozoweIII-5. Poza-chromosomalne białka z powinowactwem do DNAIV. Specyficzność immunochemiczna białek NHCV. Białka NHC w tkankach nowotworowych V-1. Specyficzność molekularna i metaboliczna V-2. Specyficzność immunochemicznaVI. Białka NHC enzymatyczne i strukturalne

Contents

I. General methods of NHC protein isolationII. Heterogeneity and molecular and metabolic specificity of NHC proteinsIII. Affinity of NHC proteins for DNAIII-l. Affinity chromatography on immobilized DNA III-2. Affinity chromatography on immobilized histones III-3. Ultracentrifugation in saccharose or metrizamide density gradient III-4. Nitrocellulose filter techniqueIII-5. Extra-chromosomal proteins with affinity for DNAIV. Immunospecificity of NHC proteinsV. NHC proteins in cancerous tissues V-1. Molecular and metabolic specificity V-2. ImmunospecificityVI. Enzymic and structural NHC proteins

Wykaz stosowanych skrótów: białko NHC = NHCP***) — białko niehistonowe chromatyny (nonhistone chromatin protein ); białko UP — NHCP luźno związane z DNA;

*) Prof. dr, Zakład Biochemii, Instytut Biochemii i Biofizyki, Uniwersytet Łódzki, Banacha 12/16, 90-237 Łódź.

**) Referat sympozjalny wygłoszony 8 września 1978 r. podczas XVI Zjazdu Polskiego Towarzystwa Biochemicznego w Łodzi.

***) Oba skróty stosowane są jako równorzędne w całej pracy.

http://rcin.org.pl

288 L. K Ł Y S Z E jęO -S T E F A N O W IC Z [2]

białko NP — NHCP silnie związane z DNA; białko HP — histon; UC — pozostałość chromatyny po wyekstrahowaniu białek UP; HC — pozostałość chromatyny po w yekstrahowaniu białek UP i HP; NC — pozostałość chromatyny" po wyekstrahowaniu białek UP, HP i NP; HMG — grupa NHCP o wysokiej ruchliwości w PAGE (high mobility group), ekstrahowanych z chromatyny najczęściej 0,35M roztworem NaCl, a nie strącających się po dodaniu TCA, tj. w 2% roztworze kwasu trójchloro- octowego; LMG — grupa NHCP o niskiej ruchliwości w PAGE (Iow mobility group), wytrącających się z ekstraktu chromatyny w 0,35M roztworze NaCl w obecności 2fl/o stężenia TCA; DBP — białko wiążące się z DNA (DNA binding protein); TNP — nowotworowe (tumorowe) NHCP (tumor nonhistone protein); AP-NH — białko kwaśne o silnym powinowactwie do DNA i do nukleohistonu (acidic protein with high af- jinity jor DNA anĄ nucleohistone); Hap 2 — NHCP eluowane 50mM buforem fosforanowym jako komponent drugi podczas frakcjonowania chromatyny na HPT; HPT — hydroksyapatyt; PAGE — elektroforeza w żelu poliakryloamidowym (poly- acrylamide gel electrophoresis)4, IF — ogniskowanie izoelektryczne (isoelectric focus- ing); Gua*Cl — chlorowodorek guanidyny; 3'M DAB— doustny karcynogen zawierający 10®/o oleju kukurydzy (Mazola) i 0,06% N,N-dwumetylo-p-/m -tolylazo/aniliny rozpuszczonej w Mazola; DMH — 1,2-dwumetylohydrazyna; m.cz. — masa cząsteczkowa; AT — sekwencja DNA bogata w pary adenina — tymina; C0t — wyrażenie oceniające reakcję reasocjacji i powtarzalność sekwencji DNA; iloczyn z w yjściowego stężenia roztworu DNA zdenaturowanego (mole nukleotydów w 1 litrze) i czasu reasocjacji wyrażonego w sekundach. Sekwencje powtarzające się reasocjują przy niskich wartościach Cot; DFP — dwuizopropylofluorofosforan; PMSF — fenylometylo- sulfonylofluorek.

Zagadnienie niejednorodności i specyficzności białek niehistonow ych v (białka NHC = NHCP) stało się przedm iotem niniejszego re fe ra tu z tego

względu, że te dwie ich właściwości rep rezen tu ją jednocześnie dwa główne wym agania staw iane cząsteczkom kandydującym na stanow isko regulatorów genowych.

Pod koniec lat sześćdziesiątych okazało się, że tym dwu nieodzownym w arunkom nie odpowiadają w pełni h istony — perm anentne represory genowe, doskonale zakonserwowane w procesie ewolucji m olekularnej (1—3). Jednocześnie obserwowano powszechnie precyzyjną regulację funkcji genów (4, 4a). Nic więc dziwnego, że rozpoczęło się gorączkowe poszukiwanie innych kandydatów na omawiane stanowisko, ze zrozum iałych względów wśród kom ponentów chrom atyny. Uwaga badaczy skoncentrow ała się na białkach chrom osom alnych innych niż histony, tj. na białkach niehistonowych.

Wobec szeregu niedaw nych krajow ych przeglądów, dotyczących białek NHC (5— 11) oraz organizacji i funkcjonow ania genomu Eucaryota (12— 16), a rtyku ł niniejszy ograniczy się do przedstaw ienia tylko niek tórych danych, bądź m niej eksponowanych w zacytow anych publikacjach, bądź nowszych, zwłaszcza w zakresie specyficzności m olekularnej jak i m etabolicznej białek NHC, i to w cyklu kom órkowym oraz w różnicowaniu, z pełnym pominięciem ich udziału w swoistości transk rypcji narządowej i tkankow ej.

http://rcin.org.pl

[3] B IA Ł K A N IEH ISTO N O W E 289

I. Zarys metod otrzymywania białek NHC

Obecność w jądrach kom órkowych białek nierozpuszczalnych w rozcieńczonych roztworach kwasów m ineralnych, jak histony, a więc białek NHC, zostało zasygnalizowane już pod koniec XIX stulecia przez L i - l i e n f i e l d a (17). Jednak białka niehistonow e c h r o m o s o m a l n e zostały uzyskane po raz pierw szy dopiero przez M i r s k y ’ e g o i P o i l i s t e r a (18) w 1946 r. Były to istotnie białka dezoksyrybonukleopro- tein niestrącalne z dezoksyrybonukleohistonem w 0,14M roztworze NaCl. Technika ta niem al 20 lat później została w ykorzystana w laboratorium W a n g a (19, 20) z Buffalo, dostarczając jedynie łatw iej ekstrahow anych białek NHC.

Generalnie wyizolowanie i scharakteryzow anie białek niehistonowych za pomocą m etod konw encjonalnych było zadaniem bardzo trudnym do spełnienia ze względu na ich nierozpuszczalność w wodnych zbuforowa- nych roztworach o fizjologicznych w artościach siły jonowej i pH, a także silną tendencję do agregacji.

Nic więc dziwnego, że pod koniec lat sześćdziesiątych, dosłownemu „wybuchowi” zainteresowania dla białek NHC, zaczęło towarzyszyć poszukiwanie coraz to nowych technik m ających ułatw ić ich solubilizację i wym ontowanie z kom pleksu chrom atynow ego (21). W arto odnotować wprowadzenie w tym celu dezoksycholanu sodu (22)r siarczanu dodecylu sodu, (SDS) (23, 26), wysokich stężeń mocznika (24, 25), chlorku guanidyny (Gua*Cl) (27, 28), chlorku cezu (26) kwasu mrówkowego (29), czy wreszcie fenolu (30), zwłaszcza zbuforowanego (31), dla wydzielenia pew nej frakcji białek niehistonowych, tzw. fenolorozpuszczalnych fosfoprotein.

Od doświadczeń w laboratorium J o h n s a (32) w Londynie przedm iotem badań jest również frakcja białek NHC łatw iejsza do wydzielenia, bo rozpuszczalna w 0,35M roztworze NaCl, tzw. białka HMG (high mobil- i ty group).

Obecnie stosowane, metody izolowania białek niehistonowych dają się ująć w 2 grupy, w których sta rtu je się bądź z chrom atyny, bądź z jąder kom órkowych bez nukleoplazm y (Ryc. 1).

W obu nieodzowne jest zdysocjowanie kom pleksu chrom atynowego, najczęściej w środowisku wysokich stężeń soli oraz mocznika lub Gua*Cl (33) z tym, że ta dysocjacja w pierwszej grupie m etod dotyczy chrom aty n y już odhistonowanej, a w drugiej całości chrom atyny. W obu seriach uzyskanie białek niehistonow ych poprzedzają e tapy usunięcia DNA na drodze ultraw irow ania (24, 35— 37), traw ienia DNazą (38, 39), strącenia chlorkiem lantanu (40), filtracji żelowej na Bio-Gel A-50m (44—46) czy Sepharose 4B (27), chrom atografii na hydroksyapatycie (wraz z rozfrak- cjonowaniem białek) (47—49) lub za pomocą układu polimerów deks tra n — glikol polietylenowy (41—43), zaś w drugiej grupie m etod —

http://rcin.org.pl

290 L. K Ł Y SZ EJK O -ST E FA N O W IC Z [4]

Jądra komórkowe lub tkanka (ty lk o g rasica !) 1

V^'►nukleoplazma

]a,dra komórkoweI l h n i ! H ( 7 n n l a 7 m i i l

Rye. 1. Zestawienie ważniejszych metod izolowania białek NHC.D y so c ja c ja c h ro m a ty n y : 2—3M N aC l ±5—8M m o czn ik (lub 4M G ua ■ Cl) ± S D S (33). U su n ię c ie h i- sto n ó w : 0,1—0,5M HC1 lu b H 2S 0 4 (33); 2M N aC l — 5M m o czn ik — 50mM b u for b u rsz ty n ia n o w y (pH 5,0) (34). U su n ię c ie D N A : u ltra w ir o w a n ie (24, 35—37); tr a w ie n ie D N azą (38,39); s tr ą ce n ie LaClj (40); o d w ir o w a n ie z d so cjo w a n ej i so n if ik o w a n e j ch r o m a ty n y w u k ła d z ie d e k str a n — g lik o l p o lie ty le n o w y (41—43); f iltr a c ja na że lu B io -G el A-50m (44—46) lu b S ep h a ro se 4B (27); c h r o m a to g ra fia na h y d r o k sy a p a ty c ie (w ty m o d d z ie le n ie od h is to n ó w i fr a k c jo n o w a n ie N H C P) (47—49); u s u n ięc ie d e z o k sy n u k leo h is to n u (20, 33). O d d zie len ie N H C P od h is to n ó w : na k a t io n ita c h , np. A m b e r lite CG—50 (36), B io -R e x 70 (37, 50), C M -S ep h ad ex (27), C M -celu loza (38), S p -S e p h a d ex (28, 45) lu b na a n io n ita ch , np . Q A E -S ep h ad ex (24, 28, 51), D EA E — c e lu lo za (52)

Ryc. 2. Ogólny podział białek NHC

usunięcia histonów, najczęściej w w yniku w ym iany jonowej na kationitach (27, 28, 36— 38, 45, 50) lub anionitach (24, 28, 51, 52), a naw et oddzielenia dezoksyrybonukleohistonu (20, 33).

Istnieją również m etody izolowania pew nych frakcji białek NHC, np. fosfoprotein (53, 54) czy białek HMG (32).

W ydaje się, że na podstawie k ry terium rozpuszczalności białka niehistonowe można podzielić na 3 grupy, tj. luźno, silnie i bardzo silnie związane z DNA; ostatnie reprezentu ją sobą, tzw. białka niehistonowe resztkowe (Ryc. 2).

http://rcin.org.pl

[5] B IA Ł K A N IE H IST O N O W E 291

Ryc. 3. Zestawienie frakcjonowania dostarczającego białek NHC luźno związanych z DNA (UP), a ponadto histonów (HP) i białek NHC silnie związanych z DNA (NP) w wyniku ultrawirowania (34) bądź chromatografii na hydroksyapatycie (55)

Ryc. 4. Profile densytometryczne (PAGE—SDS) białek NHC luźno—(UP) i silnie związanych z DNA (NP) z 2 tkanek kurczęcia (55)

http://rcin.org.pl


Przykładem takiego rozdziału białek niehistonow ych może być technika frakcjonow ania chrom atyny (Ryc. 3) opracowana w laboratorium H n i 1 i c y najp ierw w Houston (34), a następnie w Nashville (55).

Selektyw na ekstrakcja chrom atyny serią roztworów buforow ych zaw ierających mocznik (5M), a w późniejszych etapach również wysokie stężenia soli (2M NaCl), w wyniku wielogodzinnego ultraw irow ania dostarcza w 3 supernatan tach białek chrom atyny (UP, HP i NP), a w 3 osadach (UC, HC i NC) — kompleksów DNA z niew yekstrahow anym i białkami. Poza histonam i (HP) w supernatancie pierwszym otrzym uje się główną pulę białek NHC, tj. luźno związanych z DNA, tzw. białek UP (ok. 90% całości białek, ulegających fosforylacji in vivo i in vitro), a następnie niewielki odsetek (ok. 9— 10%) białek silnie związanych z DNA, tj. białek NP. Białka niehistonowe bardzo silnie związane z DNA, tzw. białka resztkowe obecne są w ilości poniżej 1%.

Po usunięciu białek UP pozostałe frakcje można rów nież uzyskać w toku chrom atografii na hydroksyapatycie (55).

II. Niejednorodność oraz specyficzność molekularna i metabolicznabiałek NHC

Całość białek niehistonowych, czy ich frakcje to jeszcze gąszcz komponentów (Ryc. 4), które można chociaż częściowo rozszyfrować w toku elektroforezy w żelu poliakryloam idowym z SDS (przesiew łańcuchów polipeptydowych wg ich mas cząsteczkowych) jednokierunkow ej (56— 59) lub dw ukierunkow ej (60— 62), ogniskowania izoelektrycznego (63, 64) (IF; sito cząsteczek białkowych wg ich ładunków elektrycznych), czy kom binacji tych 2 technik (49, 65—68), naw et z wprzęgnięciem autoradio- grafii (69). '

Dzięki zastosowaniu tych m etod patrzym y dziś na białka niehistonowe jako na duży zbiór indyw idualnych łańcuchów polipeptydow ych lub ich zespołów, w sum arycznej liczbie od kilkudziesięciu (55, 70) do kilkuset (69), a naw et ponad 500 kom ponentów (71). Stanowią one przeważnie od 50 do około 150% całości DNA w chrom atynie (72, 73), ale w chrom a- tynie gruczołów jądrow ych pstrąga — tylko 5% (74). Cechuje je szeroki w achlarz mas cząsteczkowych (od ok. 5 000 do ponad 150 000) (55, 70), punktów izoelektrycznych (3,7—9,0) (70) i stosunków am inokwasów kwaśnych do zasadowych (0,8—4,0) (70, 75, 76). Białka te często zaw ierają tryp to fan (do ok. 1%) (76), a także am inokw asy ulegające post-syntetycznym m odyfikacjom w postaci grup fosforanow ych (8, 77, 78), acety- lowych (78— 80), m etylow ych (78), tiolowych (81— 83), czy polim erów AD P-rybozy (84— 85). W arto odnotować, że w laboratorium B u s c h a (86, 87) wyizolowano pierwsze białko NHC w postaci glikoproteiny, z łań cuchem 15 reszt N-acetyloglukozoaminy.

Najwyższym obecnie wyrazem szeroko zakrojonej niejednorodności

http://rcin.org.pl


białek niehistonow ych może być wręcz szokująca publikacja sygnalna Heleny F l e i s c h e r - L a m b r o p o u l o s (71), o sum arycznej ilości około 1200 białek NHC w tkance neuronalnej i glejowej mózgu szczura, z zapowiedzią dalszego, zapewne gigantycznego przeglądu ich właściwości fizykochemicznych.

W w yniku preparatyw nego ogniskowania izoelektrycznego w aparacie V alm eta (88) białek NHC w yekstrahow anych po tzw. I (6M mocznik — 0,35M Gua*Cl) i II dysocjacji (6M mocznik — 3M NaCl), otrzym ano w sumie z tkanki neuronalnej i glejowej po 25 frakcji o punktach izoelektrycznych w zakresie pH 3,5— 10,5 (Ryc. 5).

Ctkanka neuronalna, 25 — frakcji, pH 3,5-10,5 tkanka glejowa, 25 — frakcji, pM 3,7-9,9

Ryc. 5. Diagram frakcji uzyskanych w wyniku preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (88) białek NHC z I i II ekstraktu tkanki neuronalnej i glejowej mózgu szczura (71)L ic zb y p od ry cin ą ilu stru ją p u n k ty iz o e le k tr y cz n e u z y sk a n y c h fr a k c ji b ia łk o w y ch ; po s tr o n ie a ty lk o d an e d o ty czą ce tk a n k i n eu ro n a ln ej , po stro n ie b ty lk o dan e d o ty czą ce tk a n k i g le jo w e j.

Każda z otrzym anych frakcji została zanalizowana w toku m ikro- elektroforezy w żelu poliakryloam idowym (1— 2 n-g białka na 1 żel) prowadzonej w kapilarach o pojemności IO m-1. Rozdział m ikroelektroforetycz- ny 15 frakcji uzyskanych po I dysocjacji dostarczył 330 kom ponentów NHCP z tkanki neuronalnej i 405 — z tkanki glejowej (Ryc. 6), demonstru jąc nie tylko w ybitną niejednorodność białek NHC, ale również ich specyficzność m olekularną w 2 tkankach tego samego narządu, tj. mózgu szczura. Obok szeregu pasm wspólnych stw ierdza się bezsprzeczne różnice ilościowe, a co najw ażniejsze jakościowe w profilach densytom etrycznych białek NHC obu tkanek.

Szokujące są również niedaw ne w yniki chemicznej i elektroforetycznej analizy białek 2 typów z chrom atyny (z rozbitej mechanicznie), tj. eu- i heterochrom atyny (89, 90), rozdzielonych w toku ultraw irow ania (990 000xg) w gradiencie stężenia glicerolu (91). Od badań F r e n s t e r a (92) wiadomo, że te 2 typy chrom atyny, odmienne pod względem u ltra -

http://rcin.org.pl


O

I ekstrakcja6M mocznik - 0,35 M G ua-C l

--------- tkanka neuronalna (N ) , 330 komponentów--------- tkanka glejowa (G ), 405 komponentów

Ryc. 6. Profile absorbcji w 600 nm (PAGE-SDS, mikro elektroforeza) 15 frakcji uzyskanych w wyniku preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego białek NHC I ekstraktu tkanki neuronalnej i glejowej mózgu szczura (71)

s tru k tu ry i funkcji, cechuje praw ie jednakow a ilość histonów, a odmienna, na korzyść euchrom atyny, zawartość białek NHC. W doświadczeniach M o n t a g n y i wsp. (90) wręcz odwrotnie: 1,5-krotnie wyższa ilość hi-

http://rcin.org.pl


stonów w heterochrom atynie przy braku różnic w zawartości białek NHC (Tab. 1). Rozfrakcjonowanie chrom atyny budzi jednak zaufanie z uwagi na 7— 9-krotnie wyższą aktywność m atrycow ą euchrom atyny niż heterochrom atyny (90, 91). Ponadto w euchrom atynie brak zupełnie białek NHC silnie związanych z DNA, białek luźno związanych jest 4-krotnie więcej, a tzw. resztkowych 2-krotnie mniej niż w heterochrom atynie.

Tabela 1Charakterystyka chemiczna eu- i heterochromatyny

wątroby szczura (89, 90)

Składnik lub frakcja

NHCPEuchromatyna Heterochroma-

tyna

Białko/DNA 2,43 ±0,10 1,81 ±0,04Histon/DNA 0,94 ±0,03 1,43 ±0,04NHCP/DNA 0,77 ±0,02 0,74 ±0,02

([¿g białka/mg DNA)0,35M—NHCP 460 ± 21 123 ±152,OM—NHCP — 34±72, OM—resztko

we NHCP 310 ± 12 579 ±29

W śród białek luźno związanych z DNA dom inują, zarówno w eu- i heterochrom atynie, polipeptydy o masie 12 000, 35 000 i 54 000, jednakże polipeptyd o masie około 18 000 — unikalny jest dla euchrom atyny, podobnie jak i grupa 6 polipeptydów, w zakresie 58 000—90 000, praktycznie nieobecna w heterochrom atynie (Ryc. 7). Tę grupę odnajduje się zapewne

----------- Euchromatyna----------- Heterochromatijna

Ryc. 7. Profile densytometryczne 3 frakcji białek NHC eu- i heterochromatyny w ątroby szczura (90)

http://rcin.org.pl

100 000 50 000 25000

Ryc. 8. Zestawienie profili densytometrycznych (PAGE—SDS) białek NHC 3 tkanek szczura (a i b, bufor glicynowy) oraz wątroby 3 gatunków (c, bufor fosforanowy) (98), a także ich ogólnej charakterystyki {99)(O m yłk ow o za k res pH p u n k tó w iz o e lek tr y cz n y c h za m ia st 5,4—6,6 p od an o ja k o 5,4—0,6)

[296]http://rcin.org.pl


wśród białek silnie związanych z DNA. W populacji białek NHC resztkowych — 2 polipeptydy, o masie wyższej od 200 000, w ystępują w heterochrom atynie w ilości 5-krotnie wyższej niż w euchrom atynie. Zauważa się też zm iany jakościowe: rozdwojony szczyt białka o masie około 35 000 przy pojedynczym w heterochrom atynie, a odwrotną sytuację w przypadku kom ponentu o masie około 20 000.

Z uw agi na ostatnie artyku ły (93, 94), wskazujące na niebezpieczeństwo proteolizy w ocenie niejednorodności i specyficzności m olekularnej białek NHC, ograniczę się w przedstaw ieniu tego zagadnienia do zacytowania tylko niektórych publikacji, bądź dotyczących białek NHC izolowanych wobec m iarodajnych inhibitorów proteazy histonowej, bądź ba rdziej kluczowych. Oczywiście będą to wyniki badań poprzedzających p ra cę F l e i s c h e r - L a m b r o p o u l o s (71), a więc przeprowadzonych za pomocą konw encjonalnej analizy elektroforetycznej w żelu poliakryloamidowym z SDS (54, 57—59) lub z mocznikiem w środowisku kwaśnym (95).

Od 1970 r. szkoła B o n n e r a (96) w Pasadenie lansuje teorię tzw. lim itowanej niejednorodności, a od 1972 r. — również lim itowanej specyficzności białek NHC (29, 97). Rycina 8 ilustru je zestawienie densytogram ów białek NHC 3 tkanek szczura (wątroba, nerka, mózg) oraz w ątroby 3 gatunków (szczur, kot i kurczę) (98, 99).

A utorzy w yróżniają 10 grup frakcji, oznaczonych literam i greckimi (od a do q), wśród których w yodrębniają w zakresie mas cząsteczkowych od 10 000 do 81 000 4 klasy (A—D) kom ponentów częściowo scharakteryzow anych pod względem punktów izoelektrycznych (pH 3,7—8,0), wartości stosunków sum y aminokwasów kw aśnych do zasadowych (1,1— 2,7), a także zawartości lizyny (4,2— 13,3 mol°/o). Kom ponenty klasy A i D reprezentują sobą raczej indyw idualne białka, tj. 0 i £, odpowiednio. To ostatnie, z uwagi na wysoką zawartość aminokwasów kwaśnych (27,8 mol°/o) jak i zasadowych (19,9 moP/o) oraz masę cząsteczkową (28 000) zdaje się należeć do białek HMG (32).

W załączonych densytogram ach (Ryc. 8) dom inuje 10—20 w ybitn iejszych komponentów, k tóre stanow ią około 50—75% całości (100), obok 20— 40 słabiej reprezentowanych. Profile desyntom etryczne są analogiczne w obszarze niskocząsteczkowych frakcji ( ^ 40 000); w rejonie średnich mas cząsteczkowych (40 000— 100 000) obserw uje się pewną specyficzność tkankow ą i gatunkow ą, najbardziej eksponowaną w przypadku mózgu, k tó ry cechuje się unikalnym wzorem obrazu elektroforetycznego, z dominacją wysokocząsteczkowych białek NHC (29).

W śród wyznawców om awianej ograniczonej niejednorodności, a także specyficzności tkankow ej i gatunkow ej białek NHC, i to zarówno molekularnej jak i m etabolicznej, wym ienić należy przynajm niej profesorów: P a u l a w Glasgow (48, 101), T s a n e v a w Sofii (102— 104), B u s c h a

http://rcin.org.pl

298 L. K Ł Y SZ EJK O -ST E FA N O W IC Z [1 2 ]

w Houston (61, 105) oraz H o l o u b k a w Galveston (106— 108) i ich współpracowników.

Odnosi się wrażenie, że przeciwko tej koncepcji lim itowanej n iejednorodności i specyficzności białek NHC w ystępują P l a t z i K l e i n - s m i t h (109), zarzucając, że w przypadku prac z laboratorium B o n n e r a (29, 96, 97) została ona oparta na wynikach: 1) badania białek NHC z tkanek zamrożonych, w k tórych dochodzi do zubożenia ilości frakcji wysokocząsteczkowych, 2) porów nania kom ponentów silniej reprezentowanych, z pominięciem niejednorodności i specyficzności być może zlokalizowanej w białkach w ystępujących w m ałych ilościach, oraz 3) analizy elektroforetycznej pełnej puli białek NHC, bez etapów ich oczyszczania i zatężenia, k tóre ujaw niają frakcje n iew ykryw alne w operowaniu całością.

Z wym ienionych przyczyn au torzy porównali profile densytom etryczne tylko pewnego gatunku NHC, tj. fosfoprotein jądrow ych (53), w tym znakowanych in vivo radioaktyw nym ortosforanem , a otrzym anych m.in. z jąder kom órkowych 3 świeżych tkanek szczurów (wątroba, nerki, mózg), dowodząc wyższego rzędu specyficzności m olekularnej, a zwłaszcza m etabolicznej (Ryc. 9).

Odm ienne wzory ufosforylow ania białek NHC w doświadczeniach P l a t z a i K l e i n s m i t h a (109), zwłaszcza w zestaw ieniu tkanki

Ryc. 9. Zestawienie profili densytometrycznych (PAGE—SDS) fosfoproteidów z 3 tkanek szczura oraz włączania w nié [32P] ortofosforanu in vivo (wątroba i nerka) oraz in vitro (mózg) (109)

http://rcin.org.pl


mózgowej z w ątrobą czy nerką, nie budzą zastrzeżeń, ponieważ dotyczą frakcji wolnej od zanieczyszczeń kwasami nukleinowym i, które w przypadku mocnego związania z białkami, a przez to wspólnej wędrówki

Nr frakc ji

Ryc. 10. Profile elektroforetyczne (PAGE—SDS) białek NHC syntetyzowanych w 2 fazach cyklu komórkowego HeLa S3 (121)

Nr frakc ji

Ryc. 11. Profile elektroforetyczne (PAGE—SDS) białek NHC z mioblastów (Yaffe L.6)inkubowanych z [y—WP] ATP w okresie 4 stadiów miogenezy: I ( • ---------• ) , 3—4dni; II (O---------O), 6. dzień; III (▲---------▲), 7. dzień; IV (A---------A), 9- dzień (117)

http://rcin.org.pl


w żelu poliakryloamidowym , mogą stać się przyczyną poważnych błędów w ocenie ilości włączonego radioaktyw nego fosforanu (110).

Wręcz dram atyczne zmiany w ew nątrzjądrow ego stężenia poszczególnych białek NHC, ich fosforylacji oraz szybkości syntezy obserwowano podczas rozwoju organizmów (111— 113), podczas różnicowania i proliferacji komórek (114— 118), a nawet w kom órkach znajdujących się w różnych fazach cyklu komórkowego (119— 121). W arto zacytować różnice w włączaniu l-[3H] tryptofanu w białka NHC kom órek HeLa w okresie mitozy i fazy S (Ryc. 10), a także radioaktyw nego fosforanu z [?’-32p]ATP podczas 4 stadiów miogenezy (Ryc. 11).

W rozstrzygnięciu zagadnienia m olekularnej specyficzności białek NHC (specyficzności obrazu elektroforetycznego w żelu poliakryloam idowym), a badanej za pomocą powszechnie stosow anych metod, pomocne są niedaw ne w yniki precyzyjnych doświadczeń badaczy japońskich (122). Dotyczyły one zachowania się w żelu poliakryloam idow ym (59) białek chrom osomalnych 5 różnych tkanek (wątroba, nerki, śledziona, grasica i mózg) szczurów praw idłow ych oraz nosicieli guza (mięsak Rhodamine), a także tkanki samego nowotworu. W szystkie roztw ory zaw ierały 1 mM DFP, inhibitor aktyw ności proteazy chrom atynow ej w pH 7,5, a także 4,5 i 10,0 (123).

Zawartość białek NHC w badanych tkankach szczura, praw idłow ych i mięsaka, zmieniała się następująco: m ięsak (5,1) mózg (3,6) ^ w ątroba

Ryc. 12. Profile desytometryczne (PAGE—SDS) białek chromosomalnych różnych tkanek szczura prawidłowych i mięsaka (Rhodamine); 3 grupy mas cząsteczkowych: I (> 100 000), II (40 000—100 000) i III (30 000-^10 000) (122)

http://rcin.org.pl


(3,3) nerki (1,6) śledziona (1,1) ^ grasica (1,0); liczby w nawiasach podają wartości względne. Rozwój mięsaka obniża ilość białek NHC w tkankach nosicieli guza, zwłaszcza w wątrobie, co dotyczy głównie frakcji o masie 52 000, a także 6 kom ponentów w regionie 30 000 i 40 000. W elektroferogram ach dawało się w yodrębnić około 50 pasm, podczas gdy na profilach densytom etrycznych — tylko 35 (Ryc. 12).

Porów nanie densytogram ów pozwala zauważyć identyczność w obrazie histonów nukleosom alnych, niewielką odmienność w histonie poza- nukleosom alnym , tj. H I, a znaczną — w białkach NHC. W śród nich, dla przejrzystości, wyodrębniono na podstawie mas cząsteczkowych 3 grupy, tj. I ( > 100 000), II (40 000— 100 000) oraz grupę III (30 000—40 000) i oznaczono literam i alfabetu większe kom ponenty w grupie II i III. Można łatwo zaobserwować zmianę zawartości białek NHC w poszczególnych 3 grupach idąc od tkanki do tkanki, a także pewne prawidłowości: dominację grupy II, jako całości, oraz jej większych kom ponentów, tj. IIA (71 000), IIB (64 000), IID (52 000), IIE (48 000) i IIF (43 000), a ponadto najw iększą zmienność w ogólnej zawartości białek NHC, jak i w profilach densytom etrycznych w grupie III (wątroba > mózg > mięsak ^ ^ śledziona ^ nerki > grasica). Zdaniem autorów tkankowo specyficzne białka* NHC są zlokalizowane w regionie 30 000—40 000, a białka IIC (54 000) i IIIE (34 000) są specyficzne dla tkanki nowotworowej.

W ścisłym związku z zagadnieniem specyficzności m olekularnej białek NHC pozostaje od kilku lat wciąż jeszcze kontrow ersyjna spraw a udziału białek kurczliw ych w struk turze i funkcji jądra komórkowego oraz jego komponentów, głównie chrom atyny.

W 1975 r. w laboratorium B o n n e r a (124) wykazano, że w densytogram ach (PAGE-SDS) białek NHC chrom atyny w ątroby szczura niem al połowę ogólnej puli stanowi kilkanaście (12— 18) polipeptydów, wśród k tórych znajdują się kom ponenty białek kurczliw ych, tj. 2 dominujące, jak miozyna (ok. 220 000) i ak tyna (ok. 45 000), 3 m niej w ybitne (tubulina — 50 000, a- i (5- tropom iozyna — 32 000 i 34 000), a także przypuszczalne produkty straw ionej miozyny (68 000, 65 000 i 24 000). Białka k u rczliwe reprezentow ały około 38°/o białek niehistonow ych chrom atyny izolowanej z pełnego hom ogenatu w ątroby bądź z jąder komórkowych, a w ykazującej odpowiednio 8 i 4°/o zanieczyszczenia białkam i cytoplazm atycz- nymi (metoda izolowania chrom atyny w obecności znakowanych izotopo- wo białek cytoplazmy) (125). Podobne obserwacje, tj. że pewne białka NHC m ają szybkość wędrówki zbliżoną do białek mięśniowych, znalazły się również w publikacji C o m i n g s a i H a r r i s a (126) z 1975 r. W rok później ci sami autorzy (127) wycofali się jednak z tego stanowiska w wyniku bardzo w nikliw ych badań porównawczych nad zachowaniem się elektroforetycznym w żelu poliakryloam idowym białek miofibryli, a także białek cytoplazmy, nukleoplazm y oraz białek niehistonow ych chrom atyny, otrzym ywanej z pełnych lizatów kom órkowych bądź z bardzo

2 P o s tę p y B io c h em ii http://rcin.org.pl


czystych jąder kom órkowych w ątroby myszy, przy użyciu — jak zawsze w doświadczeniach Comingsa (126, 127, 130) — inhibitorów proteaz (10-4M C dS 04, 10-3M N aH S 03, l^g/cm s inhibitora sojowego trypsyn ty , pH 7,0). Oni w ypow iadają się autory tatyw nie, że aktyna, miozyna, tubulina i tro- pomiozyna, jeżeli w ogóle są obecne w chrom atynie, stanow ią tylko bardzo niew ielki odsetek ( < 2%) białek NHC. (Kom ponenty w ędrujące w pozycjach a- i P- tropom iozyny w ydają się odpowiadać białkom sprzężonym z HnRNA). W iększy udział białek kurczliw ych wśród NHCP zdarza się tylko w tedy, gdy chrom atynę otrzym uje się z surow ych homogenatów tkanki zamiast z czystych jąder komórkowych.

Białka kurczliwe zostały w ykryte ponad wszelką wątpliwość w ją drach kom órkowych Physarum polycephalum (114, 128, 129). Jednak ten organizm, w przeciw ieństwie do większości Eucaryota, cechuje się mitozą w ew nątrzjądrow ą i aktyna, miozyna, tubulina oraz tropom iozyna są częścią w ew nątrzjądrow ego wrzeciona kariokinetycznego. Znacznym zmianom w morfologii i aktyw ności jąder kom órkowych u Physarum polycephalum towarzyszą zmiany w ilości w ew nątrzjądrow ej aktyny. L e S t o - u r g e o n (114) oraz C o m i n g s i O k a d a (130) rozw ażają możliwość udziału ak tyny w procesie kondensacji charakterystycznej dla heterochro- m atyny.

Sprawa uczestnictwa białek kurczliw ych w struk tu rze chrom atyny n a dal nie jest definityw nie rozstrzygnięta. Miozyna, aktyna, tropom iozyna i białko przypom inające podjednostkę C tropom iozyny zostały w ykryte w cytoplazm atycznej i jądrow ej frakcji fibroblastów (131, 132), miozyna i ak tyna — we wrzecionie m itotycznym (133), a ak tyna — we włóknach biegnących od kinetoforów (centromerów) do biegunów tego wrzeciona (134). Wychodząc z założenia, że białka struk tu ra lne chrom atyny muszą oddziaływać z DNA, C o r e e s i A v i l a (135) badali in terakcję białek kurczliw ych z DNA za pomocą techniki filtrów nitrocelulozowych. Dowiedli oni silnego powinowactwa miozyny i troponiny, a słabszego tro pomiozyny wobec DNA i braku wiązania z nim aktyny. B iałka kurczliw e preferow ały bardziej DNA jednołańcuchow y (zdenaturow any) niż podwójnie łańcuchowy, czy RNA, a wśród natyw nych — DNA eukariotyczny (fibroblasty chomika syryjskiego) od DNA faga.

W czasie indukow anej przez aktynom ycynę D m asowej kondensacji chrom atyny u Amoeba proteus (136) dochodzi do silniejszego związania ak tyny w jądrach kom órkowych w porów naniu z kontrolnym i jądram i interfazow ym i (stężenie ak tyny takie samo w jądrze i cytoplazmie). F ak t ten przem aw ia raczej za udziałem ak tyny w kondensacji chrom atyny podczas mitozy, niż za jej przemieszczeniem z cytoplazm y do jądra tylko na skutek przepuszczalności osłonki jądrow ej (136).

http://rcin.org.pl


III. Powinowactwo białek NHC do DNA

Dom inującą cechą białek zaangażowanych w s tru k tu rę chrom atyny i regulow anie czynności genów winna być zdolność do odwracalnego w iązania się z określonym i sekwencjam i nukleotydow ym i DNA. Istnienie ta kich białek zostało udokum entow ane pod koniec lat sześćdziesiątych dla Procaryota (137— 139). Regulatory genowe typu represor operonu Lac w E. coli (137, 138), czy genu Cx bakteriofaga X (139) okazały się białkam i allosterycznym i, które rozpoznają i wiążą się z właściwym i odcinkami DNA, a w ystępują w bardzo m ałych ilościach (mniej niż 100 kopii na kom órkę) (140).

W łaściwości specyficznego powinowactwa do DNA poszukuje się rów nież w cząsteczkach kandydujących na stanowisko regulatorów genowych u Eucaryota, m.in. w białkach NHC. W ykorzystyw ane są w tym celu następujące m etody zaczerpnięte g łów nie.z system ów mikrobiologicznych: 1) chrom atografia powinowactwa biologicznego na kolum nach z un ieru chomionymi DNA lub histonami, 2) w irowanie w gradiencie gęstości roztw orów sacharozy czy m etrizam idu, 3) sączenie na filtrach nitrocelulozowych.

W szystkie one generalnie dowodzą, że tylko niewielki odsetek białek NHC cechuje się specyficznością gatunkow ą wiązania z DNA. Niemal we wszystkich tych technikach stosuje się nie tylko DNA różnego pochodzenia, tj. gatunkowo homo- i heterologiczne oraz o różnej konform acji (podwójnie i pojedynczo łańcuchowe), ale również DNA o różnym składzie zasad (np.: typu AT) czy odm iennej częstotliwości pow tarzanych sekwencji.

Unieruchom ienie na hydroksyapatycie natyw nej chrom atyny i kolejne oddysocjowywanie jej białek zbuforowanym i roztw oram i (pH 7, 5), zawierającym i w zrastające stężenia NaCl (do 2M) oraz mocznika lub Gua*Cl (do 5M), dostarczyło ostatnio, w ram ach jednoetapowego postępowania, szeregu frakcji białek NHC o selektyw nym powinowactwie do rodzimego DNA (140a).

III-l. Chromatografia powinowactwa na immobilizowanych DNA

Chrom atografia powinowactwa na adsorbentach zawierających polinukleotydow e ligandy datu je się od 1968 r., kiedy to L i t m a n (141) opisała pomyślne oczyszczenie m ikrokokalnej polim erazy DNA na kolum nie zawierającej DNA unieruchom iony na celulozie.

W tym samym roku niezależnie A l b e r t s (142) oraz G i l h a m (143) wprowadzili pojedynczo lub podwójnie łańcuchowe DNA przym ocowane do inertnej celulozowej m atrycy i zaproponowali nowe m etody dla przygotowania adsorbentów zaw ierających głównie oligonukleotydy

2* http://rcin.org.pl


lub mocno zdegradowane DNA, związane z różnym i nierozpuszczalnym i nośnikami.

Najczęściej stosowanym wielkocząsteczkowym nośnikiem molekuł DNA jest celuloza (141, 144), żel poliakryloam idow y (145), Sephadex G-200 z odstępnikiem (ligandem) w postaci karbodiim idu (146), agaroza (147, 148) czy am inoetylosefaroza 4B (140).

Najwcześniejsze doświadczenia w tym zakresie należą do K l e i n - s m i t h a i wsp., którzy zastosowali technikę chrom atografii na DNA- celulozie całości białek NHC (144), a także ich ufosforylow anej frakcji, tj. fosfoprotein jądrow ych (149). W ykazano, że w w arunkach fizjologicznej siły jonowej (0,14M NaCl) tylko 0,01% całości białek NHC w ątroby szczura wiąże się specyficznie z DNA homologicznego gatunku, a nie w ykazuje żadnego powinowactwa do DNA łososia, czy bakterii. Odsetek ten zwiększył się do l°/o (149) w przypadku chrom atografii na DNA-celulozie fosfoprotein jądrowych uzyskanych z pominięciem fenolu. W toku elektroforezy w żelu poliakryloam idowym fosfoproteiny w ątroby szczura, wiążące się specyficznie z DNA szczura, reprezentow ały sobą niejednorodną populację ufosforylow anych białek o m asach cząsteczkowych w zakresie od 30 000 do 70 000. W iązały się one słabiej z DNA grasicy cielęcia i sperm y łososia, a bardzo słabo z DNA E. coli czy C. per- fringens.

Rozdział chrom atograficzny na serii kolum n celulozowych z DNA he- terologicżnym (DNA E. colhi) i homologicznym (DNA w ątroby szczura) pozwolił rozdzielić białka NHC w ątroby szczura (46) na 3 grupy, tj. 1) b iałka, które w ogóle nie wiążą się z DNA, 2) białka wiążące się niespecyficznie z DNA (np. z DNA E. coli) oraz 3) białka o wybiórczym powinowactwie do DNA homologicznego gatunkow o i tkankowo.

Chrom atografia powinowactwa na DNA związanym kowalencyjnie z am inoetylosepharozą 4B (140), zapewniła rozfrakcjonow anie białek NHC pod względem ich powinowactwa do specyficznych sekwencji DNA. W doświadczeniach A l l f r e y ’ a i wsp. (116, 140), uznaw anych powszechnie za ,,najelegantsze”, użyto 6 typów kolum n z DNA ó różnej częstotliwości sekwencji a więc o 3 różnych wartościach C0t, tj. wysokiej (225—40 000), pośredniej (6— 225) i niskiej (<C 6), a ponadto w postaci łańcucha pojedynczego (zdenaturow anej) oraz podwójnego (renaturow a- nej). Białka NHC wym yw ane z tych 6 typów DNA w zrastającym i stężeniam i soli (NaCl), naw et z udziałem związków denaturu jących (mocznik i chlorek guanidyny) w końcowych etapach, charakteryzow ały się odm iennym obrazem elektroforetycznym w żelu poliakryloam idowym . W yniki te sugerują, że białka NHC rozpoznają nie tylko fizyczny stan DNA, ale rów nież jego sekwencje nukleotydowe. Właściwość tę dem onstrują n iedaw ne rozległe doświadczenia B l i i t h m a n n a i wsp. (148, 150) dotyczące rozdziału na DNA-agarozie 4 frakcji (NH1, NH2, NH3 i NH4) uzyskanych w toku chrom atografii na hydroksyapatycie całości białek NHC

http://rcin.org.pl


limfocytów wołu (151). Frakcje te w sumie stanow iły wagowo 20% DNA, reprezentow ały sobą 55°/o (NH1), 20°/o (NH2), 10% (NH3) i 15% (NH4) białek NHC, a także wykazywały odmienne powinowactwo do dwu- (151) i jednołańcuchowego DNA (150), związanego z agarozą. Na tych kolum nach dostarczały one kom ponentów o odm iennym, a jednocześnie m niej niejednorodnym profilu densytom etrycznym w żelu poliakryloam idowym (Ryc. 13). W arto odnotować, że omawianą chrom atografię na hydroksy-

Ryc. 13. Wyniki badania niejednorodności i specyficzności 2 białek NHC limfocytów wołu, tj. NH3(NHCP3) oraz NH4(NHCP4), wyeluowanych z HPT (151). a) Chromatografia powinowactwa tych białek na DNA-agarozie. b) Analiza elektroforetyczna (PAGE—SDS) ich frakcji nie związanych z DNA-agarozą oraz wymytych z kolumny za pomocą 0,30, 0,60 i 1,0M roztworów NaCl (150)

http://rcin.org.pl


apatycie według T i s e l i u s a i wsp. (152) prowadzono w tem peraturze 4°C dzięki zastąpieniu w eluentach, soli sodowych lepiej rozpuszczalnymi fosforanem potasowym (pH 7,5) oraz chlorkiem potasowym.

Porównawcza analiza elektroforetyczna w żelu poliakryloam idowym4 frakcji NHCP otrzym anych z dwu tkanek wołu w ykazała pewne różnice ilościowe w profilach densytom etrycznych, zwłaszcza w odniesieniu do frakcji NH4, a właściwie jej kom ponentu o m asie 30 000, stanowiącego aż 45°/o białka NH4 w lim focytach a praw ie nieobecnego w białku NHC wątroby. K om ponent ten, tzw. białko NH 30 000 z lim focytów wołu, udało się B l i i t h m a n n o w i (148) oczyścić do jednorodności, tj. 1 łańcucha polipeptydowego. Zaw ierał on 25,3% aminokwasów kwaśnych, 18,3% aminokwasów zasadowych (w tym 10,3% Lys oraz N-końcową Arg) i ty lko ślady (0,17%) fosforu alkalilabilnego. Pod względem m asy cząsteczkowej przypom inał białka grupy HMG (32), A24 (153), czy UP1, tj. białko NHC grasicy cielęcia, rozw ijające heliks DNA (154), różnił się jednak od nich składem aminokwasowym i resztą N-końcową.

1II-2. Chromatografia powinowactwa na immobilizowanych histonach

W ystępowanie histonów i białek NHC w chrom atynie stw arza możliwość ich wzajem nego bezpośredniego oddziaływania ze sobą. W 1968 r. W a n g i J o h n s (155) w ykazali po raz pierwszy, że histony i białka NHC strącają się w specyficzny sposób, kiedy są zmieszane ze sobą. In te rakcje histon-NHCP znacznie pobudzały stopień ufosforylow ania białek NHC przy czym histon HI stym ulował ten proces najsilniej, a histon H2B — najsłabiej (156).

W ostatnich latach zastosowano do rozdziału białek NHC technikę chrom atografii powinowactwa biologicznego z afinantem w postaci histonu nierozfrakcjonowanego albo indyw idualnych frakcji histonowych czy polilizyny, związanych kowalencyjnie z agarozą (157), sefarozą (158) czy Affi-Gel 10 (159).

Na szczególną uwagę zasługują niedaw ne doświadczenia K l e i n - s m i t h a (158), znanego ze swych prac nad fosforylacją białek NHC (77), a przeprowadzone we współpracy z N o o d ć n e m (160), k tó ry już od 1973 r. przestrzega przed niebezpieczeństwem proteolizy w badaniach białek NHC. W szystkie roztw ory zaw ierały 0,1 mM PMSF, co podkreśla się niem al przy każdej czynności.

A utorzy podali technikę chrom atografii ufosforylow anych in vitro [MP]białek NHC w ątroby wołu na 2 homologicznych gatunkow o frakcjach histonowych, tj. HI i H2B, immobilizowanych na Sepharose 4B (aktyw ow anej CNBr). S trąceniu kompleksu histon-N H CP zapobiega się w niej przez wprowadzenie radioaktyw nych białek NHC nie bezpośrednio na

http://rcin.org.pl

[21] B IA Ł K A NIEH ISTO NO W E 307

histonosefarozę, ale przez wypełnienie kolum ny uprzednio przygotowaną mieszaniną radioaktyw nych białek NHC z histonosefarozą w obecności 2M NaCl i 4M mocznika, z następnym stopniowym obniżeniem stężenia soli w toku gradientow ej dializy. K olejna elucja kolum ny histono-sefa- roza-NHCP roztworam i o w zrastających stężeniach soli dostarczyła kilku wysoce pow tarzalnych szczytów radioaktyw ności, nie obserwowanych w przypadku kolum n kontrolnych z sefarozy samej lub z cytochromem c). Kolum ny z histonem H2B wiązały więcej znakowanych białek NHC niż z histonem H I, z odm iennymi profilam i elucji w obu przypadkach.

Doświadczenia dowodzą specyficzności oddziaływania białek NHC z histonem HI i H2B, co praw da w stopniu lim itowanym , w w yniku następujących danych: 1) Nie zaobserwowano żadnego wiązania białek NHC z album iną surowicy ani cytochromem c. 2) Różne profile elucji białek NHC z kolum n zawierających histon HI lub H2B wskazują na różnice w interakcji tych 2 histonów z ufosforylowanym i białkami NHC. 3) Pew ne białka NHC wiążą się wybiórczo tylko z jednym z 2 typów unieruchomionych histonów. 4) Chrom atografia białek NHC tylko na tym samym typie kolum ny histonowej, dostarczała szczytów w ym yw anych roztworam i o dokładnie tym samym stężeniu NaCl.

Znaczenie podjętych prac nad białkam i niehistonow ym i o w ybitnym powinowactwie do histonów jest tym większe, że jeden z mechanizmów odwrócenia represji genowej może wciągać ich wiązanie do zasadowych chromosomowych polipeptydów — efektyw nych inhibitorów transkrypcji.

Powinowactwo histonów do DNA zmienia się w cyklu kom órkowym(121). Są one silniej związane z DNA podczas mitozy niż fazy S i za ten fak t wydają się ponosić odpowiedzialność białka NHC, odmienne w obu fazach cyklu. Ekstrahowalność histonu za pomocą 0,25M roztw oru dezoksycholanu sodu (pH 8,0) była wyższa z chrom atyny rekonstruow anej, zawierającej białko NHC z fazy S niż w przypadku chrom atyny rekonstruow anej z udziałem białek NHC z kom órek w czasie mitozy.

Powinowactwo białek NHC do DNA było efektyw niejsze w obecności histonów w m ieszaninie rekonsty tucyjnej (161). Około 50% białek NHC nie wiązało się z DNA w 5M roztworze mocznika w doświadczeniach G a d s k i e g o i C h a e ’ a (162), co tłum aczono przypuszczeniem, że pewne białka NHC mogą wymagać histonów do reasocjacji.

Sugeruje się, że białka NHC mogą modyfikować aktyw ność genów podczas cyklu komórkowego poprzez pośredniczenie w wiązaniu histonów do DNA (121).

III-3. Ultrawirowanie w gradiencie gęstości roztworów sacharozy czy metrizamidu

W laboratorium A 11 f r e y ’ a (54) opracowano technikę tworzenia kompleksów wzbogaconej w fosfor (ok. 1%) frakcji białek NHC w ątroby i śledziony szczura z DNA różnego pochodzenia (DNA w ątroby szczura,

http://rcin.org.pl

308 L. K Ł Y SZ E JK O -ST E FA N O W IC Z [22]

myszy, grasicy cielęcia, pneumokoków), w toku gradientow ej dializy według klasycznej m etody B e k h o r a i wsp. (25), stosowanej do badania rekonstrukcji chrom atyny. Uzyskane próbki były frakcjonow ane podczas u ltra w irowania w gradiencie gęstości roztworów sacharozy (5— 25%).

Zademonstrowano, że 13°/o fosfoprotein jądrowych, reprezen tu jących sobą około 1,5% całości białek jądrow ych w ątroby szczura, wiązało się specyficznie z homologicznym gatunkow o DNA. Zdolność wiązania fosfoprotein z DNA spadał w kom pleksach zaw ierających DNA z coraz to odleglejszych gatunków , idąc od DNA w ątroby do DNA pneumokoków. Białka odzyskane z połączeń fosfoproteidów z homologicznym DNA w ykazywały niem al ten sam stopień niejednorodności, co fosfoproteidy w yjściowe. M aksym alne wiązanie zachodziło w 0,01M roztworze NaCl.

W odróżnieniu od wiążących się z DNA om awianych fosfoprotein (54), tzw. białko AP-NH (acidic protein with high a ffin ity for DNA and nucieohistone) (163, 164), zarówno wyjściowe jak i odzyskane z kompleksu z DNA, zawierało w obrazie elektroforetycznym głównie kom ponenty niskocząsteczkowe. Stanowiło ono około 10% całości białek NHC (1,5— 3,0% białek jądrowych) w ątroby szczura i strącało się z dezoksyrybonukleohistonem, kiedy roztw ór chrom atyny w układzie 2M NaCl — 5M mocznik — lOmM Tris*HCl (pH 8,0) był dializowany wobec 13 objętości wody destylowanej. Od histonów i DNA dawało się oddzielić w toku chrom otografii na hydroksyapatycie. Cechowało się ono 11-krotnie niższą ilością fosforu ,0,08%) niż fosfoproteiny (54) i optym alnym wiązaniem do DNA w w arunkach fizjologicznej siły jonowej. Specyficzność jego powinowactwa do DNA nie była absolutna: 46% białka A P—NH wiązało się

Nr frakc ji

Ryc. 14. Wyniki ultrawirowania w gradiencie stężenia sacharozy (5—20%) rekonstytuowanych in vitro kompleksów [125J] białka NP wątrobiaka Novikoffa z DNA homo- i heterologicznym gatunkowo (165)

http://rcin.org.pl


z DNA grasicy cielęcia, ale odsetek ten zmniejszał się w przypadku DNA ewolucyjnie odległych (ok. 21% z DNA sperm y łososia: 32,8% z DNA Flavobacterium meningosepticum). Zdaniem P a t e l a i T h o m a s a (163) białka wiążące się z DNA, które spełniają rolę raczej struk tu ra lną niż specyficznych regulatorów , nie mogą wykazywać absolutnej specyficzności wiązania z DNA.

Rycina 14 ilustru je wyniki (165) ultraw irow ania w gradiencie gęstości sacharozy, rekonstruow anych in vitro, kompleksów [125J] białka NP w ątro- biaka Novikoffa z DNA gatunkowo homologicznym (DNA w ątroby szczura) oraz heterologicznym (DNA erytrocytów kurczęcia). Widoczna jest selektywność powinowactwa do DNA homologicznego białka NP (ok. 10% całości NHCP), uznawanego za silnie związane z DNA (Ryc. 2 i 3) oraz tkankow o specyficzne (Ryc. 4).

R i c k w o o d i wsp. (166) badali in terakcję białek NHC z DNA poprzez ultraw irow anie kompleksów w gradiencie stężenia m etrizam idu, inertnego, niejonowego składnika organicznego, tj. 2-(3-acetamido-5-N- m etylo-acetamido-2,4,6-tri-jodobenzam ido)-2-dezoksy-D-glukozy, rozpuszczalnego w wodzie w postaci gęstych roztworów o niskiej lepkości (167). Główną zaletą tej m etody jest możliwość wyizolowania kompleksów nukleoproteinow ych wolnych od niesprzężonych ze sobą białek i kw asów nukleinowych. A utorzy udowodnili wybiórcze powinowactwo do homologicznego DNA tzw. białka Hap 2 (NHCP eluowane 50mM buforem fosforanow ym w toku chrom atografii zdysocjowanej chrom atyny na hydroksyapatycie) z kom órek myszy, M2, transform ow anych wirusem Friend. W środowisku 0,14M roztw oru NaCl kompleks białka Hap 2 z homologicznym DNA pojaw iał się w paśmie o gęstości 1,21 g/cm3, a z DNA heterologicznym (E. coli) — jako m niejszy i niejednorodny szczyt w paśmie 1,18 g/cm3. Zdaniem autorów białko Hap 2 oddziaływuje ze specyficznymi sekwencjam i polinukleotydowym i DNA. Obecność RNA ham uje tworzenie stabilnego kom pleksu między DNA i białkiem Hap 2.

III-4. Technika sączenia przez filtry nitrocelulozowe

W prowadzona w 1968 r. przez R i g g s a i wsp. (138) dla pom iaru in terakcji represora operonu Lac z DNA, technika ta opiera się na spostrzeżeniu, że podwójny łańcuch DNA jest zatrzym yw any na filtrze tylko w postaci kompleksu z białkiem. Oczywiście zdolność zatrzym yw ania się DNA na filtrach zależy nie tylko od in terakcji białek z DNA, ale również od innych param etrów , m.in. od: 1) stanu fizycznego białek i DNA (ich natyw ności; czasu przechowywania naw et w roztworze Tris*HCl, pH 7,5, 2°C; m asy cząsteczkowej DNA), 2) rozmieszczenia białek wśród cząstek DNA, 3) zdolności różnych białek do zatrzym yw ania się na filtrach (168).

http://rcin.org.pl

310 L. K ŁY SZEJK O -STEFA N O W IC Z [24]

Przy zachowaniu dużej ostrożności, tj. przestrzeganiu m aksym alnej natyw ności DNA i białek oraz możliwie identycznych w arunków doświadczeń można uzyskać wiarygodne i ciekawe w yniki (168). W doświadczeniach z zastosowaniem sączenia przez filtry nitrocelulozowe badano na jczęściej oddziaływanie pewnych frakcji białek NHC, reprezentujących sobą m ieszaninę kilku lub wielu polipeptydów, w ykazując ich specyficzne powinowactwo do DNA homologicznych (46, 163, 168, 169), pojedynczo łańcuchowych (168, 170), bogatych w sekwencje AT (169, 170) oraz pow tarzające się sekwencje (116, 140, 169). U m a n s k i j i wsp. (168) badali in terakcję różnych preparatów białek NHC, luźno i silnie związanych z DNA, w ątroby szczura i grasicy cielęcia z DNA homologicznym i heterologicznym (Hyc. 15).

0 2 4 6 8 10 DNA nieinakowany/^C-DN A

Ryc. 15. Zestawienie niektórych wyników badania (techniką filtrów nitrocelulozowych) współzawodnictwa homologicznych ( • ---------• ) i heterologicznych (O--------- O)DNA, natywnych (a i b) oraz zdenaturowanych (c i d), z homologicznym [14C] DNAo białko NHC grasicy szczura w nieobecności (a i c) oraz obecności (b i d) 5M mocznika (168)

http://rcin.org.pl


W grę wchodziło współzawodnictwo nieznakowanych DNA homologicznych lub heterologicznych, przy tym natyw nych (górne diagramy) i zdenaturow anych (dolne diagramy), z natyw nym homologicznym [14C]DNA, w nieobecności (lewe diagram y) i obecności mocznika (prawe diagram y). W tych próbach badano zdolność zwiększających się ilości nieznakowanych DNA do współzawodnictwa z określoną ilością radioaktyw nego homologicznego podwójnie łańcuchowego DNA o miejsca wiążące na określonej ilości białka. Im niższe stężenie kom petycyjnego DNA było wym agane do osiągnięcia 50% współzawodnictwa, tym wyższe było powinowactwo tego DNA do białka.

A utorzy wykazali, że mocznik destabilizuje heliks DNA i ułatw ia interakcję białka NHC z kom petycyjnym DNA. Oddziaływanie białek z współzawodniczącym DNA natyw nym , homologicznym i heterologicznym, jest iden tyczne w nieobecności mocznika, ale w obecności mocznika in terakcja z DNA homologicznym jest w yraźnie silniejsza niż z heterologicznym.

Ogólnie zdenaturow ane DNA są bardziej efektyw ne w odziaływaniu z białkiem niż natyw ne. DNA zdenaturow ane homologiczne współzawodniczą silniej o białko NHC niż zdenaturow ane heterologiczne. Oczywiście specyficzna interakcja nie dotyczy całości białek NHC. Białka NHC głównej puli oddziaływują z DNA niespecyficznie, a nieliczne — specyficznie z natyw nym homologicznym DNA w obecności mocznika. Specyficzną in terakcję białek NHC z homologicznym, zdenaturow anym DNA obserw uje się w nieobecności i w obecności mocznika.

W przeciw ieństwie do dotychczasowych doświadczeń, w których badano in terakcję z DNA białek NHC stanow iących populację kilku lub wielu peptydów, ostatnie publikacje B l i i t h m a n n a (171, 148, 172) dotyczą powinowactwa do DNA 3 indyw idualnych białek NHC z kom órek

-praw idłow ych i nowotworowych, a mianowicie: białka NH 30 000 z lim focytów wołu (148, 171), a także 2 białek o masie 20 000 i 23 000, wyizolow anych ze szpiczaka m yszy MOPC (172). Z doświadczeń wynikało silniejsze oddziaływanie tych białek z pojedynczo łańcuchowym DNA, a w przypadku podwójnie łańcuchowego — z sekw encjam i nukleotydowym i bogatym i w pary AT (regiony term olabilne). Ponadto białka te wykazywały większe powinowactwo do sekw encji pow tarzających się z wyższą częstotliwością (C0t <C 100} w porów naniu z unikalnym i (C„t > 100) oraz nieroz- frakcjonow anym DNA.

Niejednorodne frakcje białek NHC badane przez A l l f r e y ’ a i wsp. (116, 140) wiązały się wybiórczo do DNA o wysokiej częstotliwości pow tarzających się sekwencji (C0t <C 6), a w doświadczeniach pod k ierun kiem B o n n e r a (169) — do DNA ze średnią częstotliwością powtórzeń.

W ybiórcze oddziaływanie pewnych białek NHC z pow tarzającym i się sekw encjam i DNA jest zgodne z generalnym i modelami regulacji funkcji genom u (176— 178, 13), w k tó rych zakłada się, że pow tarzające się sek

http://rcin.org.pl


wencje DNA spełniają rolę regulatorow ą, służąc jako miejsce wiązania regulatorow ych cząsteczek.

Zgodnie z wyliczeniam i B luthm anna kom ponent NH 30 000, stanow iący 45% frakcji NH4, w ystępuje w ilości 10® (148), a białka nowotworowe, reprezentujące tylko 10°/o tej frakcji — w ilości 10* cząsteczek w jądrze kom órkowym (172). W artości te, zwłaszcza liczba 106 cząsteczek NH 30 000 (148) przypom inają wyliczenia dla białek HMG (173) i przem aw iają raczej za ich rolą s truk tu ra lną niż regulatorow ą. Jednak białko NH 30 000 nie zostało w ykryte w chrom atynie w ątroby (151), a doświadczenia nad tra n skrypcją rekonstruow anych hybrydów , zaw ierających wym iennie komponenty chrom atynow e lim focytów i wątroby, sugerow ały odpowiedzialność tego białka za specyficzność m atrycow ą chrom atyny limfocytów (148, 151).

Na filtrach nitrocelulozowych białko NH 30 000 wykazywało wyższe powinowactwo do DNA lim focytów niż do DNA z E. coli. W środowisku 0,2M roztw oru NaCl wiązało ono około 30°/o DNA lim focytów (jak wy- dedukowano z krzyw ych nasycenia dla nadm iaru białka oraz DNA o różnych m asach cząsteczkowych, każde miejsce wiążące liczyło 1700 par nukleotydów). W brew poglądom, że interakcje białek HMG są niespecyficzne z uwagi na sekwencje zasad (174, 175), w ydaje się, że białko NH 30 000 ma odrębne m iejsca in terakcji na cząsteczce DNA (148). B l i i t h m a n n (171) spekuluje, że białko to jest zaangażowane w regulację funkcji genów poprzez wpływ na s tru k tu rę chrom atyny, tj. na konform ację aktyw nych genów.

III-5. Poza-chromosomalne białka z powinowactwem do DNA

Od 1973 r., tj. od znanej publikacji V a u g h a n a i C o m i n g s a (179) lansuje się teorię, że białka regulujące funkcje DNA w inny wiązać się z nim odwracalnie i być w stanie równowagi dynam icznej między tzw. rozpuszczalną porcją kom órki (zapewne cyto- i nukleoplazm ą), a jej struk tu ram i w postaci chromosomów, czy chrom atyny, odbywając stałą wędrówkę między jądrem i cytoplazmą.

Punktem wyjścia tej hipotezy stały się doświadczenia nad hybrydyzacją kom órek (180, 181), czy transp lan tac ją jąder kom órkowych (182), które zadem onstrowały ważną rolę czynników cytoplazm atycznych w u trzym aniu charakterystycznej zróżnicowanej aktyw ności komórki, a także szybką wymiar.ę między nukleo- i cytoplazmą.

Wychodząc z tego założenia V a u g h a n i C o m i n g s (179) zamiast chrom atyny, jako źródła białek NHC wiążących się z DNA, ale opornych na ekstrakcję, sięgnęli po cytosol, a także nukleoplazm ę w ątroby i nerek chomika chińskiego oraz kom órek linii V-79, w celu wydzielenia

http://rcin.org.pl


łatwo rozpuszczalnych białek o powinowactwie do DNA (homo- i heterologicznego). Okazało się, że 1,4% całości białek cytoplazm atycznych z 3 typów tkanek chomika chińskiego było w iązanych z DNA homologicznym oraz grasicy cielęcia (podwójnie łańcuchowym), a tylko 0,3% z pojedynczo łańcuchowym DNA z Micrococcus lysodeikticus. Chrom atografia powinowactwa na kolum nach DNA-poliakryloam id (145) udowodniła wyższy odsetek białek wiążących się z DNA w nukleoplazmie niż w cytoplazmie.

Białka te, podobnie jak niektóre dobrze scharakteryzow ane regulatory genowe u Procaryota (137, 139) cechowały się powinowactwem do specyficznych sekwencji DNA, ale m iały wyższą masę cząsteczkową ( ^ 65 000) w porów naniu z 40 000 (137), czy 20 000 (139), co nie wydawało się au torom pozbawione sensu biologicznego. U Eucaryota, różniących się generalnie od Procaryota wyższą zawartością DNA, może być w ym agany znacznie dłuższy odcinek łańcucha DNA, a także większa cząsteczka białka w celu osiągnięcia genowo specyficznego sprzężenia w stopniu porów nyw alnym do system ów prokariotycznych.

Badane białka uzyskane z cytoplazm y nie okazywały jednak żadnego w pływ u na proces transkrypcji zarówno DNA jak i chrom atyny. Być może tego rodzaju właściwość winna być badana w system ie z homologiczną polim erazą DNA albo w system ach syntezy indyw idualnych produktów genowych (hemoglobiny, mioglobiny, album iny itp.).

W doświadczeniach C o n n e r a i C o m i n g s a (157) z 1978 r. z cytoplazm y i nukleoplazm y wydzielono białka o specyficznym powinowactw ie do histonów, w ykorzystując w tym celu technikę chrom atografii powinowactwa biologicznego na immobilizowanych histonach. W ekstrakcie jąder kom órkowych (0,15M NaCl) dominował polipeptyd o masie 25 000i stosunku aminokwasów kwaśnych do zasadowych rów nym 1,58, oznaczony na elektroferogram ie jako J 2, k tóry wybiórczo wiązał się z histonami.

Nukleoplazma i cytoplazma kom órek w ątrobiaka Novikoffa stała się w laboratorium B o n n e r a (183) źródłem rozpuszczalnych białek o powinowactwie do DNA homologicznego (DNA szczura) i heterologicznego (E. coli) immobilizowanych na celulozie. W w arunkach 0,05M roztw oru NaCl oraz serii kolumn celulozowych zaw ierających DNA E. coli lub wątroby szczura, z całości białek rozpuszczalnych w ątrobiaka Novikoffa au torzy w yodrębnili 3 klasy, a mianowicie: białek wiążących się z DNA 1) odwracalnie i niespecyficznie (6—8%), tj. z heterologicznym i homologicznym DNA, 2) odwracalnie i specyficznie (1— 1,5% całości białek rozpuszczalnych) z 7— 17-krotnie wyższym powinowactwem do DNA homologicznego niż heterologicznego oraz 3) specyficznie i nieodwracalnie (1— 1,5% całości białek rozpuszczalnych), tzn. nie dających się oddzielić od DNA na kolumnie, naw et 4M roztworem NaCl, a jedynie przy pomocy dezoksyrybonukleazy.

http://rcin.org.pl


Analiza elektroforetyczna w żelu poliakryloam idowym z SDS i ogniskowanie izoelektryczne frakcji białkowych uzyskanych z kolum ny zadem onstrow ały duże podobieństwo większych kęm ponentów w białkach wiążących się z DNA homo- i heterologicznym (3— 5 głównych pasm w zakresie 35 000— 40 000 i kilka m niejszych o wyższej masie cząsteczkowej).

Zgodnie z inform acjam i P a t e l a i T h o m a s a (163) około 22% całości białek nukleoplazm y wiązało się z DNA, przy czym ilość białek nukleoplazm y z powinowactwem do DNA była 11-krotnie wyższa niż w cytoplazmie.

Należy zaznaczyć, że autorzy w swoich doświadczeniach nad białkam i wiążącymi się z DNA nie operowali białkam i jodowanymi, unikając u tleniania białek chloram iną T przed procedurą znakowania jodem, co mogłoby zmodyfikować to wiązanie; znakowanie białek in vitro za pomocą 125J lub 131J zwiększa specyficzną radioaktyw ność ponad 10 000-krotnie niż w znakowaniu in vivo. Było ono w ykorzystane przez autorów tylko w analizie elektroforetycznej z SDS oraz w ogniskowaniu izoelektrycznym białek.

Około 10°/o całości białek cytoplazm y m ikroplazmodiów śluzowca Physarum polycephalum (szczep M3CVII) wiązało się z DNA grasicy cielęcia immobilizowanym na celulozie, przy czym 5,4°/o przyłączało się do DNA natywnego, a 4,4°/o do DNA zdeneturow anego (185). Białka te reprezentow ały sobą populację kilkuset polipeptydow ych łańcuchów o m asie cząsteczkowej w zakresie od 22 000 do 200 000, a wśród nich 30—40 frakcji białkowych wiązało radioaktyw ny fosforan w ilości 0,07 do 0,13%.

M a g u n (184) zadem onstrował w ystępowanie w cytosolu fosfoprotein, które m ają powinowactwo do DNA, potw ierdzając poprzednie swoje sugestie (185), że w cytoplazmie może zachodzić fosforylacja pew nych białek niehistonowych przed ich inkorporacją w jądro komórkowe.

Tylko niewielkie różnice w obrazie elektroforetycznym w 5— 6% żelu poliakryloam idowym z SDS zostały stw ierdzone w przypadku białek wiążących się z DNA grasicy cielęcej immobilizowanymi na celulozie, a pochodzącymi z całości kom órek ludzkich fibroblastów WI38 (z płuca płodu) praw idłow ych i transform ow anych wirusem SV40 (186). W tych ostatnich obserwowało się wzrost zawartości 2 kom ponentów (P6b i P6a)o masie 47 000 i 90 000. Białka te nie w ydają się być charakterystyczne dla procesu transform acji wywołanej przez w irus SV40, ponieważ w zwiększonych ilościach w ystępują one także w kom órkach HeLa, (w porów naniu z fibroblastam i ludzkimi WI38), oraz w kom órkach indukow anego chemicznie w ątrobiaka szczura (187), w porów naniu z w ątrobam i prawidłowym i.

W laboratorium H a r r i s a (188) w Oksfordzie, znanego ze swoich prac nad hybrydam i kom órkowymi (189), zastosowano kolum ny agaro-

http://rcin.org.pl


zowe (147) i celulozowe (141) z pojedynczo (147) i podwójnie (141) łańcuchowymi DNA grasicy cielęcia oraz z kom órek puchlinowych u myszy, w celu wydzielania białek wiążących się z DNA z całości komórek, a także z całości jąder kom órkowych pochodzących z praw idłow ych linii kom órkowych ludzkich (HeLa i Daudi), m ysich (Ag i AgHT), jak również z h y brydów kom órkowych (człowiek — mysz; klony P x, P 3, P 4) OR i Cl2, zawierające odpowiednio 2, 10, 12, 14 i 22 ludzkie chromosomy), a ponadto ze złośliwych guzów u myszy (Ehrlich, SEWA, MSWBS). W yeluowano2 grupy białek wiążących się z DNA, tj. luźniej (elucja 0,14M NaCl) i mocniej (elucja 2M NaCl). Stanow iły one w sumie 10% całości białek kom órkowych i 25% całości białek jądrow ych. Białka wiążące się z DNA, a pochodzące z różnych źródeł okazały się niejednorodne (60 i 100 kom ponentów) w toku jednokierunkow ej (59) i dw ukierunkow ej (60) elek troforezy w żelu poliakryloam idowym z SDS, a przede wszystkim niem al identyczne pod względem ruchliwości elektroforetycznych. Tylko mała frakcja wiązała się specyficznie z DNA tego samego gatunku. Z uwagi na wspólność podwójnie helikalnej s tru k tu ry DNA we wszystkich gatun kach, autorzy sugerują istnienie poważnych ograniczeń w zmienności s truk tu ra lnej białek wiążących się z DNA i konserw atywność ewolucyjną s tru k tu ry większości białek wchodzących w inetrakcję z DNA (nie tylko histonów, ale również białek NHC). Zdaniem ich fak t ten jest m olekularną podstawą w ew nątrzkom órkowej zgodności hybrydów kom órkowych pochodzących z różnych gatunków zw ierzętych (zgodności białek kom órek z różnych gatunków , które łącząc się, tworzą zdolne do życia m iędzygatunkowe hybrydy komórkowe).

A utorzy potwierdzili poprzednie obserwacje (190, 191), że zdenaturo- w any DNA ma wyższą zdolność wiązania białek (90%) niż natyw ny (6,7%). To powinowactwo do pojedynczo łańcuchowej cząsteczki DNA może być zgodne z teoretycznym i sugestiam i, że cząsteczki DNA podczas replikacji i transkrypcji w ystępują w postaci jednołańcuchowej.

Białka wiążące się z DNA izoluje się ostatnio metodą chrom atografii powinowactwa na DNA-celulozie z płynów ustrojow ych, jak surowica ludzka prawidłowa (192, 193) i patologiczna (194). Około 1,5% całości białek prawidłowej surowicy wiążących się z DNA reprezentu je sobą wysoce niejednorodną grupę, która w ędruje w regionie a- i (3-globulin, a w toku elektroforezy z SDS dostarcza ponad 20 pasm. W śród nich dom inują 2 większe frakcje DBP (DNA binding protein), tj. DBP1 (126 000) i DBP2 (86 000), które zostały wydzielone i scharakteryzow ane jako glikoproteiny o charakterze kwasowym.

W śród białek wiążących się z DNA, w tym do DNA zdenaturow anego, znajdują się tzw. białka rozplatające heliks DNA (,,unwinding proteins”) stw ierzone już na początku lat siedem dziesiątych u Procaryota, w łączając bakteriofagi (195, 196).

Białka tego typu zostały również znalezione i scharakteryzow ane w sy

http://rcin.org.pl


stem ach eukariotycznych, bardziej prym ityw nych (197, 198), jak i w tk an kach ssaków, w tym grasicy cielęcia (199— 201), czy regenerującej w ątrobie (202). Były one wydzielone z całkow itych lizatów komórkowych (197, 198), lub z cytosolu (202), a także chrom atyny (202).

Białka te ogólnie cechuje: 1) wybiórcze wiązanie z pojedynczo łańcuchowym DNA, 2) rozkręcanie podwójnego heliksu DNA oraz 3) in terakcja z polim erazam i DNA, prowadząca do stym ulacji lub zaham owania syntezy DNA. Sugerowany udział tych białek w m echanizm ach replikacji DNA, i to zarówno w inicjacji jak i elongacji tego procesu, jest przyczyną wzmożonego nimi zainteresow ania (202).

Zastosowanie do pewnej frakcji (AP—NH) białek niehistonowych w ątroby szczura chrom atografii powinowactwa na pojedynczo łańcuchowym DNA z grasicy cielęcia, unieruchom ionym na agarozie, pozwoliło T h o m a s o w i i P a t e l o w i (201) wydzielić kom ponent o preferencyjnym powinowactwie do zdenaturow anego DNA. Białko to o masie około 20 000, stanowiło m niej niż 5% całości A P—NH. Technika sączenia na filtrach nitrocelulozowych z zastosowaniem różnych DNA (faga T7, w ątroby szczura i grasicy cielęcia) udowodniła b rak gatunkow o specyficznej in terakcji tego białka z DNA i preferencyjne wiązanie z re gionami AT. Białko to ułatw iało denaturację poli[d(A—T)*d(A—T)], czego wyrazem był 40% wzrost efektu hiperchrom owego. Zjawisko to daje się wytłum aczyć stym ulacją przez kom ponent białkowy przejścia heliks — kłębek dla syntetycznego DNA.

IV. Specyficzność immunochemiczna białek NHC

W yjątkowa czułość i selektywność in terakcji an tygen—przeciwciało stała się przyczyną wprowadzenia w latach siedem dziesiątych metod serologicznych do badania s tru k tu ry i funkcji chrom atyny, a w szczególności do badania właściwości i lokalizacji jej białkowych kom ponentów.

Techniką z wyboru okazała się m ikrom etoda wiązania dopełniacza według W a s s e r m a n a i L e v i n e ’ a (203). W 1970 r. S t o l l a r i W a r d (204) zastosowali ją po raz pierwszy do reakcji serologicznych z histonam i (stosunkowo słabym i imm unogenam i z uwagi na małą masę cząsteczkową i niską zawartość aminokwasów arom atycznych), a w rok później C h y t i l i S p e l s b e r g (205) — do badania właściwości im- m unochem icznych białek niehistonow ych (Ryc. 16).

W słynnym doświadczeniu w ykazali oni, że odhistonowana chrom atyna jajowodu niedojrzałych kurcząt, k tórym w strzykiw ano przez 15 dni po5 mg dw uetylostilbestrolu, wyw oływ ała produkcję i pojaw ienie się w surowicy królika tkankow o specyficznych przeciwciał, jakie wiązały silnie dopełniacz w obecności an tygenu w postaci pełnej lub odhistonowanej chrom atyny jajowodu, a tylko w nieznacznym stopniu — w obecności chro-

http://rcin.org.pl


m atyny z innych tkanek tego kurczęcia (wątroba, serce, śledziona). Wyniki te wskazyw ały na głębokie różnice w determ inantach antygenow ych odhistonow anych chrom atyn pochodzących z badanych tkanek, sugerując wysoką chemiczną i konform acyjną specyficzność białek NHC odpowiedzialnych za to zjawisko. Histony ani DNA nie w iązały dopełniacza w w arunkach doświadczenia ilustrow anego na rycinie 16.

A n tyg e n (f jg DNA)

Ryc. 16. Krzywe wiązania dopełniacza przez wzrastające ilości kompleksów DNA— NHCP z jajowodu i innych narządów kurczęcia w obecności przeciwsurowicy królika (rozcieńczenie 1:400). Odhistonowana chromatyna jajowodu użyta do immunizacji królika (205)

Immunologiczna specyficzność tkankow a białek NHC ssaków (szczur, cielę), a także tkanek nowotworowych w zestawieniu z prawidłowym i, została potwierdzona w rozległych badaniach prowadzonych od 1972 r. w laboratorium H n i 1 i c y, w Houston (34, 206—213) oraz w Nashville (55, 214—220), a także przez innych autorów (np. 221—223).

Z a r d i i wsp. (221) posługiwali się w charakterze imm unogenu pełną chrom atyną, a badacze japońscy (223) — białkiem niehistonowym wydzielonym w edług m etody W a n g a (20). W przeprowadzonych przez tych autorów reakcjach wiązania dopełniacza antygenem była bądź chrom atyna (221), bądź białko NHC pełne (221, 223) bądź też jego frakcje uzyskane w toku chrom atografii na hydroksyapatycie (223).

G rupie H n i 1 i c y (34, 55, 206— 220), w yw ołującej im m unizację k rólików głównie za pomocą odhistonowanej chrom atyny, udało się zlokalizować imm unochem iczną specyficzność w kompleksie białko NP—DNA, dzięki eksperym entom z rekonstruow anym i chrom atynam i (34, 208, 212) oraz z frakcjam i (UC, HC i NC, por. ryc. 3), uzyskanym i w w yniku selektyw nej ekstrakcji chrom atyny (213).

A utorzy wykazali, że dysocjacja chrom atyny w zbuforowanym układzie

3 P o s tę p y B io c h e m ii http://rcin.org.pl


2M NaCl-5M mocznik, a także jej rekonstrukcja nie niszczą właściwości antygenow ych. Fakt ten pozwolił na w ym ianę poszczególnych komponentów chrom atyny używ anej do w ytw orzenia specyficznych przeciwciał (np. w ątrobiaka Novikoffa) ze składnikam i chrom atyny immunologicznie nieaktyw nej w danym doświadczeniu (np. w ątroby praw idłowej szczura). Ponadto stało się możliwe zbadanie im m unoreaktyw ności frakcji chrom atyny (213), reprezentujących sobą pozostałość po selektyw nym usunięciu białek NHC luźno związanych z DNA (UP), histonów (HP) oraz białek NP (silnie związanych z DNA) (Ryc. 17). Okazało się, że uzyskane frakcje chrom atynow e w ątrobiaka Novikoffa wiążą dopełniacz w obecności przeciwsurowicy (przeciwko odhistonowanej chrom atynie w ątrobiaka) tak długo, jak długo białko NP pozostaje sprzężone z DNA (gatunkowo homologicznym).

A n tyg e n (jug DNA)

Ryc. 17. Krzywe wiązania dopełniacza przez preparaty chromatyny w obecności przeciwciał przeciwko odhistonowanej chromatynie wątrobiaka Novikoffa. C h rom atyn a w ą tro b ia k a n a ty w n a ( • —• ), p o zb aw ion a b ia łek U P ( ■ —■ ), b ia łek U P i h isto n ów (A —▲), a ta k że b ia łek U P , h is to n ó w i b ia łek N P (A —A ). C h rom atyn a w ą tr o b y szfczura (O-O) (213).

Reakcja wiązania dopełniacza nie m iała miejsca w przypadku użycia jako antygenu natyw nej i rekonstruow anej chrom atyny w ątroby szczura (213), a naw et hybrydu chrom atynow ego zawierającego białka NP z w ątroby, a wszystko inne (UP, H P i NC) — z w ątrobiaka (212). W doświadczeniach H n i l i c y i wsp. (216) kompleks białek NP z DNA, po tra

http://rcin.org.pl

[33] B IA ŁK A NIEH ISTO NO W E 31?

wieniu DNazą lub trypsyną, tracił immunogenność; nie wykazywały jej również ani sam DNA, ani samo białko NP. Białko NP (bez DNA), użyte jako immunogen, w ytw arzało przeciwciała, które wiązały dopełniacz tylko w obecności antygenu w postaci białka NP, ale nie w obecności chrom atyny. Ponadto przeciwciała wyprodukow ane w surowicy królika wobec białka NP z jednej tkank i dawały reakcje krzyżowe z białkam i NP z innych tkanek, a więc nie wykazyw ały istotnie żadnej specyficzności tkan kowej. W ywnioskowano, że chrom atyna wyższych kręgowców zawiera gatunki białek niehistonowych, które mogą tworzyć wysoce tkankowo specyficzne kompleksy tylko z DNA z tego samego gatunku, a nie z DNA heterologicznym .

M niemanie, że DNA jako elek troujem ny polim er może wpływać na konform ację białkowego niehistonowego polim eru zostało odrzucone przez doświadczenia przeprowadzone z kom pleksam i białek NHC z różnym i polianionami, jak heterologiczny DNA, RNA drożdży, siarczan dekstranu, sulfonian polietylenu czy poliglutam inian (207, por. poz. 5).

Imm unochem iczna specyficzność białek NHC zmienia się w procesie różnicowania tkanek, np. jajowodu niedojrzałych kurcząt stym ulowanego do rozwoju dw uetylostilbestrolem w ciągu 15 dni (224). W obecności przeciwciał wyprodukow anych przeciwko odhistonowanej chrom atynie z całkowicie zróżnicowanego jajowodu, tj. po 15 dniach podawania horm onu, chrom atyna z jajowodu niedojrzałych kurcząt nie była im m unoreaktyw na. Ta aktywność immunologiczna w zrastała jednak w m iarę rozwoju stym ulowanego estrogenem , osiągając pełne wiązanie dopełniacza w przypadku chrom atyny izolowanej z całkowicie zróżnicowanych jajowodów. Natom iast w procesie erytropoezy krw inek jądrzastych kur (219, 220), dojrzew aniu retikulocytów , komórek aktyw nie syntetyzujących globinę w przeciw ieństwie do dojrzałych erytrocytów , towarzyszy spadek ak tyw ności immunologicznej chrom atyny, prawdopodobnie w wyniku zmiany jej konform acji. Odhistonowanie, czy w prowadzenie do środowiska po- lianionów zwiększa im m unoreaktyw ność skondensow anej uprzednio chrom atyny dojrzałych erytrocytów do poziomu obserwowanego w przypadku znacznie luźniejszej chrom atyny retikulocytów .

Za odmienną im m unoreaktyw ność obu typów chrom atyn okazały się odpowiedzialne immunochemicznie odm ienne białka NHC bardzo silnie związane z DNA (zapewne resztkowe NHC), zawierające białko an tygenowe. Doświadczenia z traw ieniem DNaząl i m ikrokokalną nukleazą chrom atyny kom órek erytroidalnych pozwoliły zlokalizować m ateriał antygenow y w wysokocząsteczkowej frakcji polinukleosom alnej, sugerując jego udział w wyższego rzędu struk tu rze chrom atyny.

http://rcin.org.pl

320 L. K Ł Y SZ EJK O -ST E FA N O W IC Z r 34]

V. Białka NHC w tkankach nowotworowych

V -l. Specyficzność molekularna i metaboliczna

Zrozumiałe zainteresow anie budzi rola białek niehistonow ych w procesie transform acji nowotworowej, k tóry cechuje anorm alna ekspresja inform acji zaw artej w genomie oraz nieograniczona zdolność do mitoz.

Od lat porów nyw ane są wzory m olekularne białek NHC w różnego typu nowotworach i praw idłowych tkankach kontrolnych. Ze względu na wspom nianą już publikację T s a n e y a i wsp. (93), naw ołującą do m aksym alnej ostrożności w in terpretow aniu obrazów elektroforetycznych białek NHC izolowanych w nieobecności inhibitorów proteaz chrom atyno- wych, w rozdziale tym zostaną pom inięte publikacje, w których brak w yraźnej wzm ianki o rodzaju i stężeniu odpowiedniego inhibitora.

Na szczególną uwagę zasługują rzetelne doświadczenia T s a n e v a i wsp. (93), dotyczące w ątroby szczurów, k tórym podawano nitrozom or- folinę. Zastosowano w nich: 1) 1-milimolowe stężenie PM SF we wszystkich roztworach, 2) analizę składu komórkowego badanych tkanek, 3) eliminowanie zanieczyszczeń cytoplazm atycznych przez izolowanie chrom atyny z jąder kom órkowych przem ytych detergentem Nonidet P-40, 4) usuwanie białek soku jądrowego, luźno związanych cząstek RNP poprzez ekstrakcję chrom atyny roztw oram i soli do 0,35M stężenia NaCl (z u tra tą części białek NHC luźno związanych z DNA) oraz 5) analizę porównawczą całości białek chrom atynow ych, w celu uniknięcia s tra t, zwłaszcza w białkach NHC, przy oddzielaniu ich od histonów.

W elektroferogram ach białek NHC tkanki w ątrobiaka indukowanego nitrozom orfoliną w zestawieniu z w ątrobą praw idłow ą nie zaobserwowano żadnych zmian jakościowych i tylko nieznaczne zm iany ilościowe, a m ianowicie: zwiększenie intensywności zabarwienia frakcji o masie 63 000, wzrost zawartości frakcji o masie 43 000 przy spadku ilości histonu Hl°.

W tkance z przerzutów w ątrobiaka stw ierdzono jednak, w porów naniu z w ątrobą prawidłową, następujące odchylenia jakościowe i ilościowe w regionie frakcji wysokocząsteczkowych: pojaw ienie się kom ponentów0 masie 60 000, 90 000 i 120 000, 2) wzrost zawartości białek o masie 63 0001 155 000, 3) spadek ilości pasma w obszarze 160 000. Ponadto autorzy zauważyli obniżenie zawartości prążków odpowiadających a- i |3-tubulinie oraz aktynie spośród białek NHC, a wśród ogółu białek chromoso- m alnych — zanik szybko poruszającej się podfrakcji histonu Hl°. W nikliwa ocena elektroferogram ów białek chrom osom alnych w ątrobiaka i w ątroby izolowanych w obecności i bez 1 mM PM SF, upoważniła autorów do kuszącej sugestii, że chrom atynę tkanki nowotworowej cechuje wyższa aktyw ność proteolityczna i w ystępowanie specyficznych proteaz (będących przecież białkam i NHC), które są łatw iej aktyw ow ane podczas kancerogenezy. Proponują oni również, jako praw dopodobny m echanizm

http://rcin.org.pl


zaburzeń funkcji genomu podczas kom órkowej transform acji nowotworowej, degradację enzym atyczną ważnych białek regulatorow ych w chrom atynie. Koncepcja ta jest zgodna z sugestią B r o w n a i wsp. (225) w ypowiedzianą na podstawie stym ulującego w pływu trypsyny na ak tyw ność polim erazy DNA fibroblastów chomika chińskiego, że trypsynopo- dobny enzym może odgrywać ważną rolę w inicjacji syntezy DNA, a więc w procesie replikacji komórki.

Wyższa aktyw ność proteazy serynow ej została stw ierdzona w preparatach chrom atyny i histonów 2 typów w ątrobiaka M orrisa (5123D i 7777) w porównaniu z w ątrobą prawidłową (226), a co ważniejsze — zlokalizowana w histonie H2B, k tóry w ydaje się być kompleksem histonu z białkiem NHC enzym atycznym , tj. proteazą chrom atynow ą ( 227). Wykazano, że po 24-godzinnej inkubacji (0,01M bufor Tris, pH 7,6; 37°C) kwasoroz- puszczalne produkty degradacji stanow iły 27° / q histonu H2B z w ątroby praw idłowej szczura, a 36% tej frakcji w przypadku w ątrobiaka M orrisa 7777.

Rozległe badania chrom atyny różnych tkanek nowotworowych prow adzone są od dawna w laboratorium B u s c h a (61, 228—231), zawsze z użyciem inhibitorów proteaz w postaci DFP (0,1 mM) lub PM SF (1 mM). Dotyczą one zarówno białek NHC ekstrahow anych 0,35M roztworem NaCl z jąder komórkowych przem ytych uprzednio zbuforowanym 0,14M roztw orem NaCl, jak również z tzw. II frakcji chrom atyny, tj. chrom atyny odhistonowanej.

W arto zacytować w tabeli 2 w yniki dw ukierunkow ej elektroforezy w żelu poliakryloam idowym z SDS (61, 62), która pozwoliła w ykryć w białkach NHC 6 badanych tkanek kilkadziesiąt (56—84) plam białkowych (228, 231).

Zdaniem Buscha większość plam reprezen tu je sobą kom ponenty wspólne białek NHC, a tylko nieliczne — ilościowo bądź jakościowo odm ienne. Elektroforogram y białek z szybko rosnących tkanek (wątroba re generująca, wątrobiak Novikoffa i m ięsakorak W alkera) cechuje się w yraźną obecnością 6 plam białkowych (CP, C21, C25, CR, CS i CT), które są tylko słabo zaznaczone wśród białek NHC praw idłow ych nerek i w ątroby, a także w ątroby szczurów poddawanych działaniu tioacetamidu (związku powodującego hipertrofię i wzmożenie funkcji jąderek). Trzy plam y, tj. BA, BP i CBL zostały w ykryte tylko w elektroforogram ach białek NHC wątroby, a plam a C J’ — tylko w nerkach. Natomiast białka CG’, CH’ i CP’ okazały się charakterystyczne dla tkanek nowotworowych.

W związku z zogniskowaną w ostatnich latach uwagą na możliwej roli regulatorow ej białek NHC luźno związanych z DNA (232, 233), tj. białek ekstrahow anych 0,35M roztworem NaCl z jąder kom órkowych (pozbawionych nukleoplazmy), zajęto się pod kierownictw em B u s c h a (229, 231) rozpuszczalnymi w fenolu [82P1 fosfoproteinam i tej frakcji.

http://rcin.org.pl


Szczególnie interesujące są badania porównawcze dotyczące znakowanych in vivo [®P] fosfoprotein wątrobiaka Novikoffa, a także w ątroby p rawidłowej, regenerującej oraz u szczurów poddawanych działaniu tioceta- midu (231). W ykazały one obecność 4 białek (CMp, C13p, C21p i CU’) tylko w tkance nowotworowej, a białek B6 i B10 — tylko w wątrobie praw idłowej, regenerującej i w zasięgu tioacetam idu. Na elektroferogra- mach białek NHC tych 2 ostatnich tkanek w ystępują 2 plam y (B23 i CU) obecne w w ątrobiaku, ale nie w ykryte w w ątrobie praw idłowej.

Tabela 2Niektóre dane z analizy dwukierunkowych elektroferogramów (PAGE—SDS) białek NHCP

Polipeptydy o specjalnym znaczeniu w proliferacji i neoplazji (228, 231)

Plama białkowa* (polipeptyd)

Wątroba szczurówWątrobiakNovikoffaprawidłowa „tioacetami-

dowa”regenerująca

Fenolorozpuszczalne fosfoproteiny jądrowe (0,35M NaCl) (231)

B6 + + + + + + + + + + + _B10 + + + + + + + + + + + -B23 — + + + + + + + + + +CU — + + + + + +CMp — — - H—1—hC13p - - - + +C21p - - - + +CU’ — — — + + +

NHCP silnie związane z DNA (frakcja Ii chromatyny) (228)

BA + + + + + + + +BP + + + + + + + + + + + -CBL + + + + + + + + + —BJ’ — — —CG’ — — — + + +CH’ — — — + + +CP’ — — — + + +

* Klasyfikacja plam wg ich rozmiarów oraz natężenia (gęstości) zabarwienia: + + + + bardzo duże i gęste, + + + mniejsze i gęste, + + mniej gęste, + śladowe, — brak plamy

Należy przypom nieć (por. rozdz. II), że zastosowanie fenolu powoduje znaczne zatężanie niektórych białek w fazie fenolowej. Odm ienna zawartość głównie białek NHC i alkalilabilnego fosforu cechowała frakcje chrom atyny guza puchlinowego Ehrlicha w yekstrahow ane roztw oram i 0,35M NaCl, 2M NaCl — 5M mocznik i pozostałość, w zestaw ieniu z uzyskanym i z tych ekstraktów białkam i fenolorozpuszczalnymi (232). Szczególnie in teresującym i z uwagi na wpływ na transk rypc ję okazały się

http://rcin.org.pl


białka NHC luźno związane z DNA (stym ulacja) i resztkowe (zahamowanie) (232, 233).

Bardzo intensyw ne, w porównaniu z kontrolą, włączanie [8H] tryptofanu w wysokocząsteczkowe polipeptydy niehistonowe (120 000— 140 000) zaobserwowano w przypadku neuroblastom y myszy (234).

Wzór elektroforetyczny (PAGE-SDS) i m etabolizm (włączanie [aH] Leu i [14C] Leu) zmienia się w procesie kancerogenezy. Przykładem mogą być wyniki szeroko zakrojonych doświadczeń przeprowadzonych w laboratorium A llfrey’a (235, 236) nad białkam i NHC gruczolakoraka indukow anego w okrężnicy szczurów cotygodniowym w strzykiw aniem podskór-

Ryc. 18. Zestawienie profili densytometrycznych (PAGE—SDS) białek NHC luźno związanych z DNA z tkanek nowotworowych i prawidłowych, a) Białka NHC z 4 okresów rozwoju w okrężnicy szczura gruczolakoraka indukowanego wstrzykiwaniem DMH (235). b) Białka NHC 3 tkanek jelita grubego u ludzi (236)

http://rcin.org.pl


nym 1,2-dw um etylohydrazyny (DMH). W puli luźno związanych z DNA białek NHC (ekstrakt w 0,35M NaCl) pojaw iają się 2 idyw idualne białka nazwane TNP1 (44 000) oraz TNP2 (62 000). Są one jeszcze niewidoczne w densytogram ach białek NHC tkanki pobranej w 3 tygodniu, w yraźne w 9 tygodniu, a najw yraźniejsze w 21 tygodniu kancerogenezy (Ryc. 18a). Ale synteza białek NHC okazała się w ybitna już po upływ ie 5 tygodni podawania DMH, a więc na długo przed morfologicznym i objawami uzło- śliwienia tkanki.

Obecność tychże białek została udowodniona w gruczolakoraku innego gatunku, tj. człowieka (236). Nie stw ierdzono ich jednak w nabłonku p rawidłowym ani w guzach łagodnych jelita grubego (ryc. 18b).

Lim itowane traw ienie DNazą I (237) uw alniało do supernatan tu jedy- ' nie białko TNP1, co sugeruje jego sprzężenie z aktyw nie transkrybow aną frakcją genomu.

We wzm iankowanej już w rozdziale II publikacji M i a z a k i i wsp.(122) z 1978 r. po raz pierw szy scharakteryzow ano wpływ w zrostu nowotworu (mięsaka Rhodamine) u szczurów na zawartość całkowitą białek chrom atyny (w tym histonów i NHCP) w 5 tkankach (wątroba, nerki, śledziona, grasica i mózg) nosicieli guza. W przypadku w ątroby podano nawet dynam ikę zmian zawartości tych białek oraz obrazu elektroforetycznego białek NHC (PAGE—SDS) w 4 okresach rozwoju tum oru (T—0,T— 3, T— 11 i T— 24), zdeterm inow anych stosunkiem ogólnej m asy guza do m asy ciała nosiciela, wynoszącym odpowiednio 0, 3, 11 i 24°/o.

Tabela 3

Wpływ rozwoju mięsaka (Rhodamine) na zawartość białek jądrowych (w mg/mg DNA) wątroby nosiciela (122)

Stadium rozwoju mięsaka*

Białkocałkowite

Histon NHCP Pasmo IID (52 000 D)

T—0 1,85 (100%) 0,93 (100%) 0,78 (100%) 100%T—3 1,87(101%) 0,95 (102%) 0,76 (97%) 87%T—11 1,73 (94%) 0,92 (99%) 0,68 (87%)

Os

00

T 24 '1,66 (90%) 0,90 (97%) 0,65 (83%) 78%

* Stadia rozwoju zdeterminowane stosunkiem:masa guza

masa ciała nosiciela %

W okresie m aksym alnego w zrostu guza (T— 10-T— 24) ilość histonów w 5 tkankach nosiciela pozostawała na poziomie grupy kontrolnej (100°/o) przy zmianach w zawartości białek całkowitych, w w yniku spadku ilości białek NHC w wątrobie (84 ± 2%), nerkach (89 ± 6%) i śledzionie (94 ± 6°/o), a nieznacznym wzroście — w grasicy (110±8°/o) i mózgu (107±5%>).

Stopniowe obniżenie zawartości białek NHC w w ątrobie nosiciela, jakie towarzyszyło rozwojowi nowotworu (Tab. 3), okazało się skorelowane z do

http://rcin.org.pl


m inującym spadkiem ilościowym kom ponentu IID (52 000) oraz całości grupy III (30 000—40 000), w tym — pasma IIIG (32 000).

A utorzy zbadali ponadto wpływ endogennej proteazy na białka (w tym NHCP) jąder kom órkowych w ątroby praw idłowej i nosiciela guza (T—24). Jądra komórkowe były inkubowane bez i w obecności 1 mM DFP (bufor Tris o pH 7,5; 37°C; 6, 18 i 54 h). Inh ib itor powodował zahamowanie proteolizy w około 35°/o. W stępna analiza elektroforetyczna białek chromoso- m alnych izolowanych z jąder komórkowych, inkubow anych przez 6 godzin w nieobecności DFP, udowodniła wybiórczą hydrolizę histonu HI oraz 2 białek NHC, tj. II—A (71 000) i II—B (64 000). Inne białka NHC, włączając pasmo II—D (52 000) i całą grupę III, były stosunkowo oporne na proteolizę w pH 7,5. Zdaniem autorów wyniki te dowodzą, że zaobserwowana przez nich tkankow a specyficzność białek NHC w tkance m ięsaka (por. Ryc. 12) oraz w w ątrobie nosiciela guza nie jest spowodowana proteolizą.

V-2. Specyficzność immunochemiczna

W procesie neoplazji kom órki dotąd praw idłowe ulegają transform acji w nowotworowe, przy jm ując nowy fenotyp charakterystyczny dla wzrostu złośliwego. Procesowi tem u towarzyszy zmiana fenotypu niektórych białek NHC, w yrażająca się pojawieniem nowych ich właściwości im m u- gennych i im m unoreaktyw nych (210).

W yjątkowo intensyw ne badania transform acji immunochemicznej białek NHC, skoncentrowane w laboratorium H n i l i c y (34, 55, 207—217), dotyczyły nowotworów transplantow anych oraz indukowanych chemicznie u szczurów, a także spontanicznych u ludzi.

Większość doświadczeń serologicznych została przeprowadzona z przeciwciałami wytworzonym i z surowicy królika przez wprowadzenie an ty genu w postaci odhistonowanej chrom atyny z w ątrobiaka puchlinowego Novikoffa (ascites). Chrom atyny 3 tum orów transplantow anych (w ątro- biak Novikoffa, AS-30D i m ięsakorak W alkera) różniły się tylko nieznacznie między sobą, w reakcji wiązania dopełniacza, ale w ybitnie w porównaniu z chrom atyną praw idłowej w ątroby szczura. W ysunięto sugestię, że proces nowotworowy zmienia sepcyficzność oryginalnej tkanki w im m unologicznie nowy typ, w spólny dla tum orów transplantow anych (207, por. poz. 5).

Im m unoreaktyw ność chrom atyn zmieniała się wraz z indyw idualnym tem pem wzrostu 4 transplantow anych w ątrobiaków M orrisa (Ryc. 19a), tj. w przypadku guzów ubogo zróżnicowanych i szybko rosnących (7777 i 3924 A) była porów nyw alna z im m unoreaktyw nością szybko rosnącego w ątrobiaka Novikoffa, podczas gdy chrom atyny wątrobiaków wolniej ro

http://rcin.org.pl


Antygen (/jg DNA)

Antygen (¿jg DNA)

Ryc. 19. Zestawienie krzywych wiązania dopełniacza w obecności przeciwciał przeciwko odhistonowanej chromatynie wątrobiaka Novikoffa przez kompleksy DNA— białko NP a) wątrobiaków Morrisa o różnym tempie wzrostu, b) wątrobiaka indukowanego karmieniem szczurów karcynogenem MDAB przez różne okresy czasu oraz c) wątroby regenerującej w różnych odstępach czasu od częściowej hepatekomii (210)

snących i więcej zróżnicowanych (7800 i 7787) wiązały dopełniacz w m niejszym stopniu.

Transform acji fenotypu kom órek praw idłowych w nowotworowe w ydaje się towarzyszyć pojaw ienie się nowych białek chrom atynow ych, a z uwagi na stosowanie w charakterze imm unogenu chrom atyn odhistono- w anych — białek niehistonowych. Podczas doświadczalnej hepatokarcyno- genezy, wywołanej u szczurów karm ieniem ich w okresie 175 dni, tzw. 3’MDAB, tj. N ,N -dw um etylo-p-/m -tolylazo/aniliną w 10% oleju z kukurydzy (Mazola), zmieniała się stopniowo im m unoreaktyw ność chrom atyn,

http://rcin.org.pl

[41] BIA Ł K A N IEH ISTO N O W E 327

a w istocie kompleksów białko NP-DNA, badanych co 7 dni na reakcję wiązania dopełniacza (ryc. 19b). Odm ienna im m unoreaktyw ność, charakterystyczna dla w zrostu nowotworowego, pojaw iała się stosunkowo wcześnie, tj. już po upływie 2 tygodni, osiągając reaktyw ność odnośnikowej chrom atyny w ątrobiaka Novikoffa po 111 i 175 dniach karm ienia. W p ierwszych dniach karm ienia reakcja wiązania dopełniacza była taka sama jak w przypadku w ątroby praw idłowej szczura.

Dynam ika im m unoreaktyw ności chrom atyny w hepatokarcynogenezie różni się od zmian będących odpowiedzią kom órek w ątroby na częściową hepatektom ię, a więc w okresie kom pensacyjnej h ipertrofii tego narządu (Ryc. 19c). P repara ty chrom atyny w ątroby regenerującej, badane na re akcję wiązania dopełniacza po upływie 6, 12, 24 i 48 godzin od częściowej hepatektom ii, cechowały się zróżnicowaną im m unoreaktyw nością z przeciwciałami przeciwko odhistonowanej chrom atynie w ątrobiaka Novikoffa, najsilniejszą w 24 godziny od hepatektom ii i praw ie równą natyw nej chrom atynie wątrobiaka. Próbki chrom atyny w ątroby w okresie 6 i 12 go-

Antygen (/jg DNA)

Ryc. 20. Zestawienie krzywych wiązania dopełniacza przez przeciwciała wytworzone przeciwko odhistonowanej chromatynie a) raka płuc u ludzi, b) wątrobiaka Novi- koffa u szczurów, w obecności chromatyn różnego pochodzenia, tj. raka płuc u ludzi ( • ---------• ) , płuca prawidłowego (O---------O), wątrobiaka Novikoffa (■ ---------■)> prawidłowego gruczołu piersiowego (A---------A) w a), zaś w b) — dodatkowo raka gruczołu piersiowego, łożyska i komórek HeLa (A---------A), raka gruczołu piersiowego( A -------- ▲) oraz prawidłowej wątroby szczura (□ ---------□ ) (214)

dzin regeneracji były istotnie niereaktyw ne immunologicznie i podobne do chrom atyny w ątroby praw idłowej. Niewielka im m unoreaktyw ność cechowała też chrom atynę po 48 godzinach od hepatektom ii a zapewne część

http://rcin.org.pl


zmian charakterystycznych dla nowotworów może iść na konto szybkiego wzrostu i proliferacji komórek, jaka ma m iejsce w 24-godzinnej wątrobie regenerującej (210). Zdaniem H n i 1 i c y i wsp. (216) surowica odpornościowa wyprodukow ana wobec odhistonowanej chrom atyny w ątrobiaka Novikoffa zawiera co najm niej 2 rodzaje przeciwciał: jedne charakterystyczne dla tkanek szybkorosnących, a inne specyficzne dla wzrostu nowotworowego.

W ostrym kontraście z tym i w ynikam i są w yniki serologicznych doświadczeń C h i u i wsp. (214) nad spontanicznym i nowotworam i u ludzi (rak płaca i gruczołu piersiowego) (Ryc. 20).

Przeciwciała wytworzone wobec odhistonowanej chrom atyny, np. raka płuc reagow ały w yjątkow o silnie jedynie z chrom atyną tego pochodzenia (Ryc. 20a). W szystkie inne badane chrom atyny, a więc: nowotworów spontanicznych u ludzi, w tym złośliwych (rak gruczołu piersiowego) i łagodnych oraz kom órek HeLa, zwierzęcych nowotworów transplan to- wanych (w ątrobiak Novikoffa), a także tkanek praw idłow ych pochodzenia ludzkiego (płuco, gruczoł piersiowy, łożysko) — nie dawały dodatniej reakcji wiązania dopełniacza.

Nieoczekiwana jednak sytuacja została zaobserwowana w reakcji omaw ianych chrom atyn z przeciwciałam i wytw orzonym i wobec odhistonow anej chrom atyny w ątrobiaka Novikoffa (Ryc. 20b). Chrom atyny obu złośliwych nowotworów spontanicznych u ludzi w iązały dopełniacz bez względu na odmienność gatunkow ą, ale w sposób zróżnicowany w znacznie większym stopniu niż w przypadku tum orów transplantow anych (207, por. poz. 5), podczas gdy chrom atyny z tkanek praw idłow ych człowieka i szczura były zupełnie n iereaktyw ne. A utorzy przypuszczają (214), że antygenow e determ inaty obecne w chrom atynie w ątrobiaka Novikoffa są niedostępne lub nieobecne w odhistonowanych chrom atynach raka płuc czy gruczołu piersiowego, ponieważ przeciwciała wytworzone przeciwko nim (Ryc. 20a) nie wiążą dopełniacza w obecności chrom atyny wątrobiaka Novikoffa.

W ram ach zupełnie niedaw nej pracy w laboratorium H n i 1 i c y (215) został częściowo oczyszczony i scharakteryzow any jądrow y antygen w chrom atynie w ątrobiaka Novikoffa (ryc. 21).

Okazało się nim niejednorodne jeszcze białko o masie 45 000—60 000, wydzielone w w yniku elektroforezy preparatyw nej w żelu poliakryloamidowym (ryc. 21c) z wysokocząsteczkowej porcji (25 000— 200 000) komponentu, wyeluowanego 50mM buforem fosforanowym w toku chrom atografii na hydroksyapatycie (Ryc. 21a) tzw. frakcji UC, tj. pozostałości chrom atyny w ątrobiaka Novikoffa po w yekstrahow aniu białek niehistonowych luźno związanych z DNA (białek UP). Jedynie ta frakcja, w ym yw ana 50mM buforem fosforanowym , w ykazywała im m unoreaktyw ność zbliżoną do rodzimej chrom atyny w ątrobiaka (ryc. 21b). W szystkie inne kom ponenty eluowane z hydroksyapaty tu nie wiązały dopełniacza. Oma-

http://rcin.org.pl

Nr frakcji Antygen (pg DNA)

O dleg fość od sta rtu (cm)

Ryc. 21. Zestawienie danych dotyczących wydzielenia i oczyszczenia białka antygenowego z chromatyny wątrobiaka Novikoffa.a) P r o f i l fr a k c jo n o w a n ia na h y d ro k sy a p a ty c ie c h r o m a ty n y p o zb a w io n ej b ia łk a U P (e lu c ja b u fo rem fo s fo r a n o w y m o pH 7,0. b) K rzy w e w ią za n ia d o p ełn ia cza przez p rzec iw c ia ła p rzec iw k o o d h isto n o w a n e j c h r o m a ty n ie w ą tro b ia k a N o v ik o ffa w o b e c n o śc i fr a k c ji c h ro m a ty n y w ą tro b ia k a w y e lu o w a n y c h z h y d r o k sy a p a ty tu za p om ocą 50mM (O —O ) oraz lOOmM b u foru fo sforan u p otasu (A —A)> fr a k c ji ch r o m a ty n y w ą tro b y p r a w id ło w ej szczura e lu o w a n e j 50mM bu forem fo s fo r a n o w y m ( □ —□ ), w sz y s tk ic h in n y ch fr a k c ji z h y d ro k sy a p a ty tu w ą tro b ia k a N o v ik o ffa lub ,w ą tro b y p ra w id ło w ej (V —V ). ° p on ad to n iero z fr a k c jo n o w a n e j ch ro m a ty n y w ątrob iak a N o v ik o ffa ( • —• ) . c) W yk res z p rep a ra ty w n ej e le k tr o fo r e z y w że lu p o lia k ry lo a m id o w y m fr a k c ji ch ro m a ty n y w ą tro b ia k a w y e lu o w a n e j z h y d ro k sy a p a ty tu 50mM b u forem fo sfo ra n o w y m . P o le z a k resk o w a n e o d p ow iad a b ia łk u a n ty g en o w e m u (215)


330 L. K ŁY SZEJK O -STE FA N O W IC Z [44]

wiane białko antygenow e, dla okazania jego specyficznej imm unogen- ności, musiało być skompleksowane z homologicznym DNA.

Reakcje wiązania dopełniacza udowodniły, że ten antygen był obecny w chrom atynie innego transplantow anego tum oru (m ięsakorak W alkera), a naw et w ątroby em brionalnej szczura, ale nie został w ykry ty w chro- m atynach jego tkanek prawidłowych.

Inny nowotworowy antygen jądrowy, tzw. białko NAg-1, tj. glikopro- teina o masie około 26 000, została wydzielona z chrom atyny zarówno wątrobiaka Novikoffa jak i m ięsakoraka W alkera w laboratorium B u s c h a (86, 87). Białko to pozostawało rozpuszczalne, kiedy ekstrak t jąder kom órkowych w układzie 3,OM NaCl—7,OM mocznik— 0,01M Tris (pH 8,0) dializowano wobec samego buforu Tris aż do osiągnięcia 0,15M stężenia NaCl. A ntygenu NAg-1 nie znaleziono w chrom atynie w ątroby szczura prawidłowej, ani naw et regenerującej.

Obecność cukrowców w antygenow ych białkach NHC reprezentu je nową możliwość m odyfikacji ich s tru k tu ry w uzupełnieniu do fosforylacji, acetylacji, m etylacji, wprowadzenia grup tiolowych, czy polimerów ADP-rybozy, a jednocześnie nowy poziom złożoności zagadnienia tych białek w obrębie jądra komórkowego.

Sonda specyficznych przeciwciał pozwala zlokalizować antygeny niehistonowe, zwłaszcza przy użyciu m etod imm unocytochem icznych bezpośrednich, tj. im m unofluorescencyjnych (238) oraz pośrednich, czyli im- m unoenzym atycznych (system peroksydaza-antyperoksydaza chrzanu) (239). Zastosowanie tych testów do natyw nej kom órki wyklucza możliwość zniszczenia lub zmodyfikowania właściwości immunologicznych białek NHC na skutek niewłaściwej m etody ich izolowania i frakcjonowania.

Przeciwciała przeciwko odhistonowanej chrom atynie w ątrobiaka No- vikoffa reagują in situ wysoce specyficznie tylko z chrom atyną użytą do imm unizacji, a nie z chrom atyną innego typu nowotworem (np. HeLa) czy tkanki praw idłowej (217).

Nowotworowa transform acja może być wyrazem głębokich zmian zachodzących podczas różnicowania komórek, którem u towarzyszą dram atyczne zm iany w immunospecyficzności n iektórych białek NHC odpowiedzialnych za tkankow o specyficzną regulację genetycznej ekspresji. Zapewne identyfikacja tych białek antygenow ych stanow i nieodzowny etap w zrozumieniu m echanizm u kancerogenezy.

VI. Białka NHC enzymatyczne i strukturalne

Zgodnie z przeglądem S t e i n a i wsp. (240) z 1978 r. w bogatej populacji białek NHC znajduje się całą rzeszę enzymów, dających się ująć

http://rcin.org.pl

[45] BIA ŁK A N IEH ISTO N O W E 331

w 2 grupy z uwagi na typ substra tu , którym mogą być: bądź kwasy nukleinowe, bądź histony i białka NHC.

Do pierwszej grupy zalicza się: polim erazy DNA, polim erazy RNA, nukleazy, ligazy nukleotydowe, term inalne nukleotydylotransferazy i me- ty lo transferazy. Do drugiej zaś grupy takie enzym y jak: proteazy, fosfo- transferazy (kinazy), m etylotransferazy, acetylotransferazy, deacetylazy, polim erazy ADP-rybozylowe, glikohydrolazy poli (ADP-ryboza) a także N M N -adenylilotransferazy (241).

Zadaniem niemal wszystkich enzymów II grupy są post-syntetyczne m odyfikacje histonów i białek NHC w celu zmodyfikowania s tru k tu ry i funkcji chrom atyny.

Przew ażająca większość białek NHC to białka struk tu ra lne, które wraz z wym ienionym i enzym am i wydają się być odpowiedzialne za występowanie w profilach densytom etrycznych zbadanych dotychczas białek NHC tak wielu pasm wspólnych i różnic w ich zawartości.

Spośród białek struk tu ra lnych białka grupy HMG, chyba jedyne białka niehistonowe łatw e do wydzielenia, stały się ostatnio przedm iotem intensyw nych badań.

Term in białka HMG (high mobility group) został wprowadzony przez J o h n s a (32, 242) w 1972 r. dla białek w ykrytych przez niego jeszcze w 1964 r. (243) jako zanieczyszczenie histonu silnie lizynowego (HI) grasicy cielęcia, odpowiedzialne za wyższą zawartość w preparacie tego h istonu aminokwasów kwaśnych (9°/o zam iast 5% wg C r a m p t o n a i wsp. (244)), a także obecność histydyny (245). Zanieczyszczenie to, jako bardziej kwaśne od histonu HI, dawało się usunąć w toku chrom atografii na CM-celulozie (pH 9,0). W krótce białka te udało się w yekstrahow ać z chrom atyny grasicy cielęcia 0,35M roztw orem NaCl (246), a także 0,75M roztw orem HC104 (247), a wśród nich wyodrębnić podczas elektroforezy w 20% żelu poliakryloam idowym o pH 2,4 (248), grupę o wysokiej ru chliwości (HMG) od grupy białek o niskiej ruchliwości w polu elektrycznym (LMG = Iow m obility group.) P rzy wprowadzeniu do ekstrak tu chrom atyny w 0,35M roztworze NaCl, kwasu trójchlo- rooctowego do stężenia 2% (w/v) białka HMG pozostawały w supernatancie, z którego daw ały się wydzielić 6 objętościami acetonu (32), lub 10% roztworem kwasu trójchlorooctowego (173), i rozdzielić (247), w toku chrom atografii na CM-celulozie (pH 9,0) z następczą elektroforezą w żelu poliakryloam idowym (pH 2,4), na około 20 białkowych pasm (Ryc. 22).

Z badań G 0 0 d w i n a i wsp. (249) opublikow anych w 1978 r. w ynika, że szereg tych pasm reprezentu je sobą p rodukty degredacji, np. białko HMG 3 jest produktem degradacji białka HMG 1, co w ydaje się t łu m aczyć m.in. identyczną im m unoreaktyw ność HMG 3 i HMG 1 (Ryc. 23) w ram ach przeprowadzonych niezależnie w tymże roku pierwszych serologicznych doświadczeń dotyczących białek HMG grasicy cielęcia (250).

http://rcin.org.pl

OsadHMG

9,0 | CM - Seph. C25

Frakcje A-H

HMG 1,2,14,17,20

Ryc. 22. Schemat izolowania białek HMG (173, 283)

0,06 0,12 0,25 0,5 1,0Antygen (p g HMG)

Ryc. 23. Krzywe wiązania dopełniacza przez przeciwsurowicę przeciwko HMG 1 (rozcieńczenie 1:1 200) i białka HMG (250)



Badania z laboratorium Johnsa z ostatnich 2 lat doprowadziły do w ydzielenia 5 indyw idualnych białek HMG grasicy cielęcia lub wieprza, tj. HMG 1, 2, 14, 17, 20. Od 1976 r. białka HMG stały się przedm iotem doświadczeń innych ośrodków (251— 256) zainteresow anych ich łatw ą ekstra- howalnością i rozpuszczalnością, a także możliwością uzyskania ich w s ta nie dużej jednorodności (jedno pasmo w żelu poliakryloamidowym).

Podobnie do histonów nukleosom alnych, a także przeciwciał (245) one wydają się zawierać region niezm ienny (N-końcowy) oraz zmienny (C- końcowy). Zostały one w yekstrahow ane nie tylko z tkanek ssaków, lecz również z innych źródeł, tj. z tkanek ryb (253, 257), ptaków (254, 255, 258), owadów (251, 252), drożdży i pszenicy (256). Sugeruje się ich obecność również u Procaryota (256).

N iektóre z nich, głównie z grasicy, gruczołów jądrow ych pstrąga (253) i erytrocytów ptasich (254, 255, 258) stały się obiektem badania s tru k tu ry pierwszorzędowej, a naw et wyższego rzędu (259—263). Tabela 4 jest p róbą podsumowania dotychczasowych danych o struk turze pierwszorzędowej białek HMG. Ogólnie charakteryzują się one niespotykanym składem aminokwasowym : w przybliżeniu połowa ich reszt to aminokwasy zasadowe (ok. 25% jak w histonach), a także am inokwasy kwaśne (ok. 30%, w odróżnieniu od histonów). *

Od 1976 r. datu ją się badania nad stru k tu rą pierwszorzędową białek HMG (264, 265) uwieńczone rozszyfrow aniem najpierw sekwencji N-koń- cowej części HMG 17 (75), HMG 1 i HMG 2 (266), HMG 14 (267, 268) oraz HMG—T (trout testis) (253), aż wreszcie w 1977 r. — pierwszej pełnej sekw encji białka niehistonowego, tj. HMG 17 (269). W ubiegłym roku podano N-końcową sekwencję HMG 20, analogiczną do ubikw ityny (270) i wręcz niezw ykłą kolejność aż 41 wyłącznie aminokwasów kwaśnych wśród 44 reszt C-końcowej części HMG 1 (271).

Rycina 24 podaje pełną sekwencję białka HMG 17, a rycina 25 zestawia poznane fragm enty s tru k tu ry pierwszorzędowej HMG 1, HMG 2 i HMG—T.

Skład am inokwasowy HMG 17 (75), małego białka o masie 9 247, jest wręcz w yjątkow y nie tylko z uwagi na wysoką zawartość am inokwasów zasadowych (24,3% Lys, 4% Arg) oraz kw aśnych (22,5% Asp + -f Glu), ale również fakt, że 3 am inokwasy obojętne (Ala, Pro i Gly) stanowią 42,5% wszystkich aminokwasów, przy braku cysteiny, m etioniny, izoleucyny, histydyny, tyrozyny, fenyloalaniny i tryp tofanu . Wobec b ra ku ostatnich 3 aminokwasów roztw ory HMG 17 nie w ykazują żadnego pochłaniania w zakresie 260— 300 nm (75).

W całkow itej sekwencji 89 reszt aminokwasowych (269) 2/3 cząsteczki od N-końca łańcucha ma charak ter w ybitnie zasadowy (na 58 am inokwasów — 22 reszty Lys i Arg oraz 7 reszt Glu i Asp). K ontrastu je z nim ujem nie naładow any C-końcowy region cząsteczki, zaw ierający na 31 reszt tylko 4 am inokwasy zasadowe.

4 P o s tę p y B io ch em ii http://rcin.org.pl

Zesta

wien

ie do

tych

czas

owyc

h da

nych

o

struk

turz

e I-r

zędo

wej

białek

HM

G i

ubik

wity

ny

(Ub)

Rok

i po

z.

piśm

ienn

ictw

a

1977

(2

66)

1978

(2

71)

1977

(2

66)

1978

(2

68)

1977

(2

69)

1978

(2

70)

1975

(2

84)

1977

(2

53)

.

1978

(2

54)

1978

(2

58)

Sekw

encj

a (il

ość

resz

t)

iN

—24

—C

44

N—

25—

N—

33—

Pełn

a

N—

20—

Pełn

a

N—

26—

50*

46*

Am

inok

was

yC

-koń

cow

e

Lys

Lys

Lys

Arg

Lys

Am

inok

was

yN

-koń

cow

e

Gly

Gly

Pro -

Pro

Met

Met

Pro

Ala

Gly

, + O) NO + 05 >> ° X

1 “ X T 1 o < i + E.

LZ voCA 27 OO 00 (N T j-

LZ (N 22 28 28+ X 8

S 5 O < + £'w'

Os<N r -(N 22 m

CA 26 25 rj 28

1ZZ 30 28 24 23

Iloś

ćam

ino

kwas

ów

l24

7

CA

89 t}-r-

126

5

M.c

z.(D

)

oOs

00

mCAoo 9

247

i

7 80

0

oo 28 13

3

28 00

0

Frak

cja

HMG

1

HMG

2

HMG

14

HMG

17

HMG

20

Ub

HMG

T

HMG

E

Oste HM

G 2

HMG

1

HMG

2

HMG

14

HMG

17

Tkan

ka

Gras

ica

ciel

ęcia

lub

w

iepr

za

Gru

czoł

y ją

dro

we

pstr

ąga

Eryt

rocy

ty

kacz

ki i

kur

częc

ia

Eryt

rocy

tyku

rczę

cia

[334]

Iloś

ć^pe

ptyd

ow

Tabe

la 4

http://rcin.org.pl

W sekw encji HMG 17 zwłaszcza w obszarze N-końcowym stw ierdza się wiele zgodności (269) z histonam i HI (272) oraz H6, inaczej histonem T z gruczołów jądrow ych pstrąga (273), a także z histonem H5 e ry tro cytów kurczęcia (274).

Homologie w regionach N-końcowych sekwencji białek HMG 1 i HMG 2 grasicy cielęcia (75) oraz ich odpowiednika z gruczołów jądrowych pstrąga, tj. HMG—T (253), zwanego poprzednio kom ponentem R (257) — uwidocznione są na rycinie 25.

[49] B IA Ł K A N IE H ISTO N O W E 335

HMG -1i

G ly L y s Gly5

A sp P ro L ys L ys P ro10

Arg G lyH M G - 2 Gly L y s Gly A sp P ro A sn Lys P ro Arg GlyHMG -T P ro G ly L y s A sp P ro A sn Lys P ro L ys G ly

HMG -1u

L ys M et S er S e r15

Tyr A la P h e P h e Val20

GinHMG - 2 Lys M et S e r S er Tyr A la P h e P h e Val GinH M G -T L ys Thr S e r S e r S e r A la P h e P h e Val A la

HMG -1 H M G - 2

21ThrThr

A rg A rg Glu A rg A rg A la

25

G lu.. .L y s A s x

J 3 12G lx

29

H M G -T Val A rg Arg G lx G lx His

Ryc. 24. Zestawienie dotychczasowych danych o sekwencji aminokwasowej HMG 1 (266, 271), HMG 2 (266) i HMG-T (253)

P ro L ys A rg Lys A la Glu Gly A sp A la LysG ly A s p L ys A la Lys Val Lys A s p Glu P roGin A rg Arg S e r A la A rg L eu S e r A la L ysP ro A la P ro P ro Lys P ro Glu P ro L ys P roL ys Lys A la P ro A la Lys Lys Gly Glu LysVal P ro Lys Gly Lys Lys Gly Lys A la A spAla Gly Lys A sx Gly A s x A sx P ro A la G lxA sx Gly A sx A la Lys Thr A sx G lx Ala G lxLys Ala Glu Gly A la Gly A sp Ala Lys

Ryc. 25. Sekwencja aminokwasowa białka HMG 17 (269)

One tłum aczą podobieństwo zachowania się elektroforetycznego w żelu poliakryloam idowym HMG 1 i HMG 2 wyizolowanych przez zespół J o h n s a (245) z 3 tkanek (grasica, w ątroba, nerki) 3 gatunków (cielę, szczur, królik), z erytrocytów kurczęcia (245, 258), a ponadto z pszenicyi drożdży (256).

Na b rak tkankow ej i gatunkow ej specyficzności białek HMG 1 i HMG 2 grasicy, w ątroby i nerek cielęcia, a także grasicy i erytrocytów kurczęcia oraz erytrocytów kaczki w skazują rów nież doświadczenia grupy V i d a - 1 i ’ e g o (255) z 1978 r. Dotyczą one białek HMG z grasicy cielęcia i e ry trocytów kaczki. Poza analizą w żelu poliakryloam idowym , autorzy po-

4 http://rcin.org.pl


dają w yniki jonowym iennej chrom atografii na kationicie, oznaczenia składu aminokwasowego, N-końcowych aminokwasów i m apę tryptycznych peptydów. Co praw da zespół V i d a l i ’ e g o (255) znalazł w ery trocytach kaczki i kurczęcia poza HMG 1 i HMG 2 trzecie większe białko, które oznaczył jako HMG—E, uznając je za unikalne dla erytrocytów ją- drzastych. Bardzo wnikliwe doświadczenia zespołu J o h n s a (258) rów nież z 1978 r., przeprowadzone na ery trocytach kurczęcia, przem aw iają jednak przeciw koncepcji tkankow ej i gatunkow ej specyficzności białek HMG.

Zawartość białek HMG 1 i HMG 2, wyliczona przez zespół J o h n s a (245, 260) wynosi 105— 10® cząsteczek na jedno jądro komórkowe, podczas gdy tylko kilka m olekuł białek regulatorow ych przypada na 1 gen s truk tu ra lny (245).

Od 1974 roku bada się in terakcję białek HMG, głównie HMG 1 i HMG 2 z DNA (174, 175, 275) i histonam i (245). Johns i wsp. sugerują, że jest to tylko niespecyficzne wiązanie między zasadowymi aminokwasami, a resztam i fosforanowym i DNA.

Badania konform acji cząsteczki HMG 17 (261), przeprowadzone z zastosowaniem dichroizmu kołowego, podczerwieni i m agnetycznego rezonansu jądrowego nie wykazały, w przeciw ieństw ie do HMG 1 i HMG 2 (259, 260), jakiegokolwiek uporządkow ania s tru k tu ry II czy III rzędu. One potw ierdzają jonową na tu rę oddziaływania z DNA, a naw et w skazują na segment cząsteczki HMG 17 wiążący się z DNA, tj. obszar między resztami am inokwasowym i w pozycjach 15 i 40 (ryc. 24).

W arto dodać, że w białkach HMG 1 i HMG 2 stw ierdzono obecność a-helikalnego zwinięcia łańcucha polipeptydowego w zakresie od 1/3 do 1/2 cząsteczki (175). Białka te wykazują silne powinowactwo do histonów (254), zwłaszcza do histonu H 1 (275).

In teresu jący jest wpływ tych białek NHC, przypuszczalnie s tru k tu ralnych, na proces transk rypc ji (245). W przeciw ieństw ie do histonów, nie okazują one żadnego oddziaływania na m atrycow ą aktyw ność DNA, naw et przy stosunku białko/DNA = 5. Zdaniem autorów fak t ten może być w ytłum aczony bądź 1) brakiem podobnego do histonów silnego powinowactwa białek HMG do DNA, bądź 2) pozostawieniem w roztworze kompleksu DNA z białkam i HMG. Już od dawna H o a r e i J o h n s (276, 277) lansują koncepcję godzącą w w yniki całej rzeszy badaczy, a mianowicie, że zaham owanie m atrycow ej aktyw ności DNA przez histony jest po prostu wynikiem strącenia kom pleksu histon*— DNA i niedostępności m atrycy dla polim erazy RNA. W ażne jest stw ierdzenie, że rozpuszczalny kompleks DNA — HMG 1 ma tę samą aktyw ność m atrycową, co czysty DNA. W ydaje się to sugerować, że DNA całkowicie pokryty białkam i HMG może ulegać transkrypcji.

Zespół J o h n s a (278) był pierwszym, k tó ry m etodam i elektroforetycznym i w żelu poliakryloam idowym w ykrył obecność 4 białek HMG

http://rcin.org.pl


(1, 2, 14 i 17) w m ononukleosomach grasicy cielęcia. Do dziś kontrow ersyjną jednak jest spraw a udziału tych białek w aktyw nych regionach chrom atyny, sugerow ana przez L e v y ’ e g o i D i x o n a (279) dla g ruczołów jądrow ych pstrąga, grupę A l l f r e y ’ a (254) dla erytrocytów kaczki, a naw et na wcześniejszych etapach przez zespół J o h n s a (245). W dociekliwych badaniach ery trecytów jądrzastych kurczęcia z ubiegłego roku (280) wycofał się on jednak z poprzedniego stanowiska, dowodząc braku białek HMG w produktach traw ienia chrom atyny DNazą, która zgodnie z pracam i W e i n t r a u b a i G r o u d i n e ’ a (237) ma selektyw nie degradować DNA genów aktyw nie transkrybow anych. Odnosi się wrażenie, że w polemice zespołów A l l f r e y ’ a i J o h n s a jak nara- zie — słuszność jest po stronie tego ostatniego. W „note in proof” dołączonej do niedaw nej jego publikacji (280) dodaje, że naw et zastosowanie buforu EDTA o niskiej sile jonowej, k tó ry odróżniał w arunki doświadczeń obu zespołów, większość białek HMG (1, 2, 14 i 17) pozostaje związana z fragm entam i chrom atyny o rozm iarach mono- i polinukleosomów.

Dalsze badania są niezbędne do rozstrzygnięcia spraw y specyficzności białek HMG i ich występowania w regionach aktyw nej chrom atyny.

Zapewne ogromnie pomocne okażą się m etody immunologiczne. W stępne badania imm unoenzym atyczne (281) przy użyciu przeciwsurowicy królika przeciwko białkom HMG 1 i HMG 2 grasicy wieprza oraz zsynchronizowanych hodowli różnych linii kom órkow ych (grasicy i nerek wieprza, myszy, jajników chomika chińskiego, HeLa), także białek HMG 1 i HMG 2 grasicy królika i cielęcia pozwoliły już stw ierdzić n iew ykry- walne dotąd jakościowe różnice gatunkow e m iędzy tym i białkami. Zlokalizowano je w chromosomach podczas mitozy, a także w ykryto, skorelowane z cyklem komórkowym, nieznaczne zm iany w ich reaktyw ności z system em peroksydaza — antyperoksydaza. Zm iany te w ydają się być w yrazem różnic w antygenow ych determ inantach HMG 1 i HMG 2 oraz w dostępności tych m iejsc antygenow ych podczas różnych faz cyklu komórkowego.

Ze stosunku molowego (1:50) białek HMG 1 i HMG 2 do całości hi- stonów przypuszcza się, że w przybliżeniu 1 cząsteczka HMG 1 i HMG 2 przypada na 10 nukleosomów (282). Oddziaływ anie tych białek na konfigurację heliksu DNA (rozwinięcie lub wyższego rzędu zwinięcie) przem awia za ważną ich rolą w strukturze, a przez to i funkcji chrom atyny.

O statnią sensacją w biochemii białek chrom atyny jest wykrycie w nu- kleosomach (285, 286) tzw. białka A24 o wręcz niespotykanej rozgałęzionej struk tu rze w kształcie litery ,,Y”, a zaw ierającego 2 N -term inalne zakończenia polipeptydowe na jedno C-końcowe. Złożone jest ono z histonu H2A i białka NHC, którego C -term inalny peptyd Gly-Gly łączy się kow alencyjnie wiązaniem izopeptydowym z e-aminową grupą lizyny w pozycji 119 histonu H2A (ryc. 26b).

Jest ono najciekawsze i najlepiej scharakteryzow ane spośród szeregu

http://rcin.org.pl

338 Li. K ŁY SZ EJK O -ST EFA N O W ICZ [52]

a)

A 24

H O H OM e t----- A - C H 2- C - Ń - C H 2- C - N H

G ly G ly(C H 2)<

T . “ 1 *Ar - AcetyloSeryna- - - - - - - N - C H - C - — LysH is to n 2A (L y s 119) (129)

o ) r 1G in

5M et

11I le Phe Val

15Lys T h r Leu

A24 L y s T h r I le T hr Leu Glu Val G luU b J«1

5 l PT h r Ile Glu

25Asn

35Gly

Val Lys A laG in Asp Lys Glu Ile Pro

20

Ryc. 26. Zestawienie danych dotyczących udziału białka A24 w strukturze nukleosomu (270, 284—285). a) Rozgałęziona cząsteczka białka A24 (kule zakreskowane) wmontowana w oktameryczny rdzeń nukleosomu zołożony z dimerów H2A, H2B, H3 i H4. Część histonowa białka A24 zajmuje miejsce cząsteczki H2A w rdzeniu nukleosomal- nym, podczas gdy ubikwityna znajduje się na zewnątrz rdzenia (286). b) 2 polipeptydy białka A24 połączone ze sobą wiązaniem izopeptydowym między glicyną z NHCPi e-aminową grupą lizyny w pozycji 119 histonu H2A (285). c) N-końcowa sekwencja 37 reszt białka A24 (285), identyczna z ubikwityną (284) i białkiem HMG 20 (270)

indyw idualnych białek NHC jądrow ych i jąderkow ych, a otrzym yw anych od 1973 r. przez zespół B u s c h a (153, 229, 285— 296) z tkanek o wzroście praw idłowym i patalogicznym. Zawartość jego spadała najszybciej w czasie hipertrofii jąderek w ątroby szczura, indukowanej tioacetam idem (289) lub procesem regeneracji w ątroby (290), co wskazywało na udział w re presji genów jąderkowych.

http://rcin.org.pl


Białko A24 daje się ekstrahow ać 0,4N roztw orem H2S 0 4 wraz z h istoriami, stanow i niem al 1,9% to talnej sumy histonów H2A + H2B + H3 + + H4. Ilość jego w histonie H2A jest obliczana na 3—4% (245) do 10% (286). Zaw iera niem al rów ną ilość aminokwasów kw aśnych i zasadowych (153), tryp tyczne i chym otryptyczne peptydy histonu H2A jak również dodatkowe, należące do białka NHC (291), a wreszcie niezablokowaną N-końcową sekwencję 37 reszt (ryc. 26c) obok N -term inalnej acetylosery- ny z pełną sekwencją histonu H2A (285, 292).

Pierw szym i, k tórzy dostrzegli identyczność sekw encji tych 37 am inokwasów białka A24 z N-końcowym fragm entem ubikw ityny, 74-aminokwasowego polipeptydu o charakterze horm onu (284), byli H u n t we w spółpracy z M ałgorzatą D a y h o f f (297), k tóra od 1966 r. jest redaktorem 5 tomów ,,A tlasu Sekwencji i S tru k tu ry B iałek” (298).

U bikw ityna, poprzednio „tym ina” (299), tym opoetyna (300), a w reszcie UBIP (ubiquitous immunopoietic polypeptide), została w ykryta niem al przypadkow o przez G o l d s t e i n a z Bostonu (299, 302) w ram ach jego w ieloletnich prac nad doświadczalną m iastenią (myastenia gravis), w którym to niedowładzie mięśni zaburzeniu przew odnictw a impulsów w synapsach nerwowo-m ięśniowych towarzyszy z reguły uszkodzenie grasicy. W 1974 r. wydzielono ją w stanie wysokiej czystości z pełnego homoge- na tu grasicy wołu (chrom atografia na SP-Sephadex, HPT i QAE-Sepeha- dex ekstrak tu w 0,1M roztworze dw uw ęglanu amonu) (299), a w rok później — m etodam i immunoizotopowymi (z [125J] UBIP jako II an tygenem) — w ykryto we wszystkich badanych tkankach ssaków, ptaków, ryb oraz wyższych roślin, w hodowanych kom órkach praw idłow ych i nowotworowych, a ponadto w drożdżach i bakteriach (np. E. coli, Clostridium histolyticum) (301). W doświadczeniach in vitro tym opoetyna obniżała transm isję impulsów w stykach nerwowo-mięśniowych, ale przede wszystkim stym ulow ała różnicowanie prekursorów im m unocytów grasicy, a naw et śledziony oraz szpiku, i to bez względu na gatunek, w lim focyty T (thym us-derived ), podczas gdy ubikw ityna z innych tkanek — odpow iednią transform ację w lim focyty zarówno typu T, jak i B (bone m arrow-derived). Ten stym ulatorow y wpływ wydaw ał się być spowodowan y aktyw acją cyklazy adenylow ej, prawdopodobnie poprzez wiązanie ub ikw ityny z (3-adrenergicznymi receptoram i w błonie kom órek docelow ych (300, 301). Funkcjonow anie ubikw ityny in vivo, chociaż nadal nieustalone, zapewne jest podstawowego znaczenia dla wszystkiego, co żyje, z powodu uniw ersalnej obecności oraz niespotykanie konserw atyw nej s tru k tu ry pierwszorzędowej (284, 301). Stałość sekw encji aminokwaso- w ej ubikw ityny z tak odległych ewolucyjnie źródeł jak grasica wołu i łodyga selera, daje się porównać jedynie z konserw atywnością m olekularną histonów H4, H3 i H2A, a naw et jest wyższego rzędu, z uwagi na w ystępow anie tego białka nie tylko u Eucaryota, ale i u Procaryota.

http://rcin.org.pl


I oto ten niezw ykły uniw ersalny polipeptyd okazał się niehistonowym fragm entem wm ontowanym w s tru k tu rę chrom atyny. H u n t i D a y - h o f f zastanaw iając się nad różnicą (ok. 4550) między masą cząsteczkową białka A24 (ok. 27 000) oraz sum aryczną m asą histonu H2A (14 000),i ubikw ityny (8451), w yrażają przypuszczenie, że w pełnej sekwencji białka A24 zostanie w ykry ty dalszy ciąg od 38. do 74. aminokwasu ubikw ityny, a także jakiś hydrofilow y peptyd łącznikowy (297).

Zespół B u s c h a zidentyfikow ał izopeptydowe wiązanie białka NHC z histonem H2A (285) i zaproponował model rdzenia nukleosomalnego z cząsteczką A24 (286) (Ryc. 26a). Co więcej, pokusił się o zlokalizowanie (294) białka A24, ew entualnie jego fragm entów we frakcjach chrom atyny wzbogaconych (supernatan t S2) oraz ubogich (osady P I i P2) w transkry- bowane sekwencje DNA, a uzyskanych za pomocą techniki DNaza II — 2mM MgCl2, opracowanej w laboratorium B o n n e r a (303). Zaskakującym było stw ierdzenie m etodą dw ukierunkow ej elektroforezy (62) obecności białka A24, wraz z nukleosom alnym i histonam i, we frakcjach PIi P2, a wolnej ubikw ityny — w supernatancie zaw ierającym chrom atynę aktyw ną w procesie transkrypcji. W ydaje się prawdopodobne, że sprzężenie ubikw ityny z histonem H2A zmienia konform ację chrom atyny w k ierunku obniżenia jej m atrycow ej aktywności, a rozszczepienie cząsteczki białka A24 — wzmaga w niej proces transkrypcji, zwiększając dostępność chrom atyny dla polim erazy RNA bądź bezpośrednio, bądź przez wzrost stężenia ubikw ityny. Białko A24 jako całość ulega A D P-rybozyla- cji kilkakrotnie efektyw niej niż histon H2A (85), co uzasadnia przypuszczenie, że ta post-translacyjna kow alencyjna m odyfikacja może być zaangażowana w represorow ą funkcję białka A24.

N-końcowa sekwencja ubikw ityny została ostatnio odnaleziona w oznaczonej kolejności pierwszych 20 am inokwasów białka HMG 20 grasicy cielęcia (270) (por. Tab. 4), a jej pełna sekwencja — w indyw idualnym białku niehistonow ym (S), jakie obok HMG—T (253) dało się w yekstrahować 0,35M roztw orem NaCl z chrom atyny gruczołów jądrow ych p strą ga (304). Podczas lim itowanego traw ienia tej chrom atyny m ikrokokalną nukleazą uw alniały się do supernatan tu zarówno HMG—T jak i białko S (wolna ubikwityna), co przem awiało za ich występowaniem w łącznikowych regionach m iędzynukleosom alnych (304).

K to wie, czy to uniw ersalne białko, w ykryte obecnie w chrom atynie, a nie będące histonem, doskonale zakonserwowane w procesie ewolucji m olekularnej, dla którego sugeruje się równie uniw ersalne biologicznie oddziaływanie na cyklazę adenylow ą błony kom órkowej (300, 301), nie odgrywa kluczowej roli w procesie różnicowania kom órek i zróżnicowanej ekspresji genu (304).

Niezbędne są dalsze dociekliwe doświadczenia w celu rozszyfrowania udziału białek niehistonow ych w struk tu rze a przez to i funkcji chrom a-

http://rcin.org.pl


tyny, zagadnienia — które z każdym rokiem staje się coraz bardziej skomplikowane, ponieważ zaw rotny postęp badań odsłania z roku na rok coraz to bardziej nieoczekiwane elem enty w spaniałej m aszynerii aparatu genetycznego.

Zaakceptowano do druku 27.03.1979

PIŚMIENNICTWO

1. B a r t k o w i a k J., K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., (1970), Post. Biochem,. 16, 263—296.

2. K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., B a r t k o w i a k J., (1970), Post. Biochem.,16, 347—388.

3. L i p o ń s k a A., K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., (1974), Post. Biochem., 20, 145—164.

4. P h i l l i p s D. M. P., (1971), Histones and Nucleohistones, Plenum Press, London.

4a. K i l i a n s k a Z., K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., (1973), Post. Biochem., 19, 533—558.

5. K i l i a ń s k a Z., K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., (1976), Post. Biol. Kom., 3, 31—50.

6. K a ń s k a - B r u d z y ń s k a K., W a l t e r Z., (1977), Post. Biochem., 23, 157— 173.

7. R a k o w i c z - S z u l c z y ń s k a E. M., (1977), Post. Biochem., 23, 189—209.8. F a m u l s k i K. S., (1977), Post. Biochem., 23, 379—397.9. W ie l a n d E., (1978), Post. Biol. Kom., 5, 217—232.

10. K r a j e w s k a W., K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., (1978), Post. Biochem., 24, 177—194.

11. K i l i a ń s k a Z., K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., (1978), Post. Biochem., 24, 431—442.

12. H o r s t A., (1976), Post. Biol. Kom., 3, 127—153.13. C h o r ą ż y M., (red.), (1978), Genom organizmów zwierzęcych struktura i tran

skrypcja, Monografie Biochemiczne, Nr 30, str. 1—123, PWN, Warszawa.14. N i e d ź w i e d z k a A., K a l i ń s k i A., (1977), Post. Biochem., 23, 175—188.15. M i c h a l s k a J., (1977), Post Biol. Kom., 4, 371—391.16. H u b n e r H., K o n o n o w i c z A. K., (1977), Post. Biol. Kom., 4, 339—370.17. L i l i e n f i e l d L., (1893), J. Physiol. Chem., 18, 1472.18. M i r s k y A., P o l l i s t e r A. W., (1946), J. Gen. Physiol., 30, 117—147.19. P a t e l G. L., W a n g T. Y„ (1964), Exp. Cell Res., 34, 120—130.20. W a n g T. Y., (1967), J. Biol. Chem., 242, 1220—1226.21. K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., P o l a n o w s k a Z., (1971), Post. Biochem.,

17, 601—629.22. W a n g T. Y., (1966), J. Biol. Chem., 241, 2913—2917.23. M a r u s h i g e K., B r u t l a g D., C o n n e r J., (1968), Biochemistry, 7, 3149—

3155.24. G i l m o u r E. S., P a u l J., (1969), J. Mol. Biol., 40, 137—139.25. B e k h o r J., K u n g G. M., B o n n e r J., (1969), J. Mol. Biol., 39, 351—364.26. B e n j a m i n W., G e 11 h o r n A., (1968), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 59, 262—

268.27. H i l l R. J., P o c c i a D. L., D o t y P., (1971), J. Mol. Biol., 61,445—462.

http://rcin.org.pl

342 L. K kY SZ E JK O -ST E F A N O W IC Z [56]

28. A r n o l d E. A., Y o u n g K. E., (1972), Biochim. Biophys. Acta, 257, 482—496.29. E l g i n S. C. R., B o n n e r J., (1972), Biochemistry, 11, 772—781.30. S t e e l W. J., B u s c h H., (1963), Cancer Res., 23, 1153—1163.31. S h e l t o n K. R., A l l f r e y V. G., (1970), Nature, 228, 132—134.32. G o o d w i n G. H., S a n d e r s C., J o h n s E. W., (1973), Eur. J. Biochem.,

38, 14—19.33. P a t e l G. L., (1974), w Acidic Proteins of the Nucleus, red. Cameron J. L.,

Jeter J. R., Jr., str. 30—57, Academic Press, London.34. C h i u J .-F ., H u n t M., H n i l i c a L. S., (1975), Cancer Res., 35, 913—919.35. K r i v c o v G. G., B o g d a n o w A. A., (1970), Mol. Biol., 4, 422—427.36. U m a n s k i j S. R., T o k a r s k a j a W. J., Z o t o v a R. N., M i g u s i n a

W. J., (1971), Mol. Biol., 5, 270—279.37. L e v y S., S i m p s o n R. T., S o b e r H. A., (1972), Biochemistry, 11, 1547—

1554.38. M a c k a y M., H i l g a r t n e r C. A., D o u n c e A. L., (1968), Exp. Cell. Res.,

49, 533—557.39. W i l s o n E. M., S p e l s b e r g T. C., (1973), Biochim. Biophys. Acta, 322,

145—154.40. Y o s h i d a M., S h i m u r a K., (1972)., Biochim. Biophys. Acta, 263, 690—696.41. O k a z a k i T., K o r n b e r g A., (1964), J. Biol. Chem., 239, 259—268.42. S i m o n J. H., B e c k e r W. M., (1976), Biochim. Biophys. Acta., 454, 154—171.43. K i k u c h i H., S a t o S., (1978), Biochim. Biophys. Acta, 532, 113—121.44. S h a w L. M. J., H u a n g R. C. C., (1970), Biochemistry, 9, 4530—4542.45. G r a z i a n o S. L., H u a n g R. C. C., (1971), Biochemistry, 10, 4470—4776.46. Van den B r o e k H. W. J., N o o d e n L. D., S e v a l l J. S., B o n n e r J.,

(1973), Biochemistry, 12, 229—236.47. F a u l h a b e r J., B e r n a r d i G., (1967), Biochim. Biophys. Acta, 140, 561—

564.48. M a c G i l l i v r a y A. J., C a m e r o n A., K r a u z e R. J., R i c k w o o d D.,

P a u l J., (1972), Biochim. Biophys. Acta, 277, 384—402.49. R i c k w o o d D., M a c G i l l i v r a y A. J., (1975), Eur. J. Biochem., 51, 593—601.50. B h o r j e e J. S., P e d e r s o n T., (1976), Biochim. Biophys. Acta., 418, 154—159.51. C h a u d h u r i S., (1973), Biochim. Biophys. Acta, 322, 155—165.52. M o n a h a n J. J., H a l l R. H., (1973), Can. J. Biochem., 51, 709—720.53. L a n g a n T. A., (1967), w Regulation of Nucleic Acid and Protein Biosynthesis,

red. Königsberger V. V., Bosch L., str. 223—242, Elsevier Publishing Company, Amsterdam.

54. T e n g C. S., T e n g C. T., A l l f r e y V. G., (1971), J. Biol. Chem. 246, 3597— 3609.

55. C h i u J.-F., H n i l i c a L. S., (1977), w Chromatin and Chromosome structure, red., str. 193—254, Academic Press, London.

56. R a y m o n d S., W a n g Y., (1960), Analyt. Biochem., 1, 391—396.57. S h a p i r o A. L., V e n u e l a E., M a i z e l Jr., J. V., (1967), Biochem. Biophys.

Res. Commun, 28, 815—820.58. W e b e r K., O s b o r n M., (1969), J. Biol. Chem., 244, 4406—4412.59. L a e m m l i U. K., (1970), Nature, 227, 680—685.60. K a l t s c h m i d t E., W i t t m a n H. G., (1970), Analyt. Biochem., 30, 401—412.61. Y e o m a n L. C., T a y l o r C. W., J o r d a n J. J., B u s c h H., (1973), Biochem.

Biophys. Res. Commun., 53, 1067—1076.62. B u s c h G. J., Y e o m a n L. C., T a y 1 o r C. W., B u s c h H., (1974), Physiol.

Chem. Phys., 6, 1—10.63. G r o n o w M., G r i f f i t h s G., (1971), FEBS Letters, 15, 340—344.

http://rcin.org.pl

V

[57] BIAL.KA N IEH ISTO N O W E 343

64. G r o n o w M., T h a c k r a h T. M., (1978), Experientia, 34, 430.65. B a r r e t R., G o u l d H. J., (1973), Biochim. Biophys. Acta, 294, 165—171.66. M a c G i l l i v r a y A. J., R i c k w o o d D., (1974), Eur. J. Biochem., 41, 181—

190.67. O ’ F a r r e l P. H„ (1975), J. Biol. Chem., 250, 4007—4021.68. J a c k o v/ s k i G., S u r i a D., L i e w C. C., (1976), Can. J. Biochem., 54, 9—14.69. P e t e r s o n J. L., M c C o n k e y E. H., (1976) J. Biol. Chem., 251, 548—554.70. E l g i n S. C. R., S t a m p h W. E., (1975), w The Structure and Function of

Chromatin, Ciba Foundation Symposium, t. 28, str. 113—130, Associated Scientific Publishers, Amsterdam.

71. F l e i s c h e r - L a m b r o p o u l o s H., P o l l o w K., (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun., 80, 773—780.

72. S t e i n G. S., S t e i n J. S., K l e i n s m i t h C. J., (1975), Scientific American,232, 46—57.

73. G a r r a r d W. T., P e a r s o n W. R., W a k e S. K., B o n n e r J., (1974), Biochem. Biophys. Res. Commun., 58, 50—57.

74. C a n d i d o E. P. M., H o n d a B. M., B a i l l i e D. L., (1976), FEBS Letters,61, 260—262.

75. W a l k e r J. M., H a s t i n g s J. R. B., J o h n s E. W., (1976), Biochem. Biophys. Res. Commun., 73, 72—78.

76. H a c h a R., F r e d r i c q E., (1975), Eur. J. Biochem, 52, 83—92.77. K l e i n s m i t h L. J., (1974), w Acidic Proteins of the Nucleus, red. Cameron

J. L., Jeter J. R. Jr., str. 103—135, Academic Press, London.78. B e r e n d e s H. D., H e 1 m s i n g P. J., (1974), w Acidic Proteins of the

Nucleus, red. Cameron J. L., Jeter J. R., Jr., str. 191—212, Academic Press, London.

79. K a d o h a m a N., A n d e r s o n K. M., (1977), Canad. J. Biochem., 55, 513—520.80. T h a k u r M. K., R a t n a D a s , K a n u n g o M. S., (1978), Biochem. Biophys.

Res, Commun., 81, 828—831.81. B r o n o w M., T h a c k r a h T., (1973), Arch. Biochem. Biophys., 158, 377—386.82. G r o n o w M., L e w i s F. A., (1975), Exp. Cell. Res. (1975), 93, 225—229.83. O c h a l s k a - C z e p u l i s M., B i t n y - S z l a c h t o S., (1977), Int. J. Biochem.,

8, 831—834.84. T a n i g a w a Y., K a w a m u r a M., S h i m o y a m a M., (1977), Biochem.

Biophys. Res. Commun., 76, 406—412.85. O k a y a m a H., H a y a i s h i O., (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun, 84,

755—762.86. Y e o m a n L. C., J o r d a n J. J., B u s c h R. K., T a y l o r C. W. S a v a g e

H. E., B u s c h H., (1976), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 73, 3258—3262.87. D a v i s F. M., B u s c h R. K., Y e o m a n L. C., B u s c h H., (1978), Cancer

Res., 38, 1906—1915.88. V a l m e t E., (1969), Science Tools, 16, 1.89. R o d r i g u e z L. V., B e c k e r F. F., (1976), Arch. Biochem. Biophys, 173,

438—447.90. M o n t a g n a R. A., R o d r i g u e z L. V., B e c k e r F. F., (1977), Arch. Bio

chem. Biophys., 179, 617—624.91. R o d r i g u e z L. V., B e c k e r F. F., (1976), Arch. Biochem. Biophys., 173,

428—437.92. F r e n s t e r J., (1965), Nature, 206, 680—683.93. T s a n e v R., H a d j i o l o v D., (1978), Z Krebsforsch., 91, 237—247.94. L u b o n H., T y r a w s k a - S p y c h a l o w a D., (1978), Post. Biol. Kom., 6,

31—49.

http://rcin.org.pl

344 L. K L.YSZEJK O -STEFANO W ICZ [58]

95. D a v i s R. H., C o p e n h a v e r J. H., (1972), J. Neurochem., 19, 473—477.96. E l g i n S. C. R., B o n n e r J., (1970), Biochemistry, 9, 4440—4447.97. W u F. C., E l g i n S. C. R., H o o d L. E., (1973), Biochemistry, 12, 2792—2797.98. E l g i n S. C. R., B o y d J. B., H o o d L. E., W r a y W., W u F. C., (1973),

Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 38, 821—833.99. E l g i n S. C. R . , S t u m p h W. E., (1975) w The Structure and Function of

Chromatin, Ciba Foundation Symposium, t. 28, str. 113—130 Associated Scientific Publishers, Amsterdam.

100. S i l v e r L. M., E l g i n S. C. R., (1978), w The Cell Nucleus, tom. 5, red. Busch H., str. 215—262, Academic Press, London.

101. R i c k w o o d D., R i e h e s P. G., M a c G i l l i v r a y A. J., (1973), Biochim. Biophys. Acta, 299, 162—171.

102. R u s s e v G., A n a c h k o v a B., T s a n e v R., (1975), Eur. J. Biochem, 58, 253—257.

103. D j o n d j u r o v L. P., I v a n o v a E. C., T s a n e v R. G., (1977), Eur. J. Biochem, 77, 545—553.

104. K o l e v a S t., T s a n e v R. G., (1978), Cell Differentiation, 7, 83—88.105. Y e o m a n L. C., S e e b e r S., T a y l o r Ch. W., F e r n b a c h D. J., F a l -

l e t t a J. M., J o r d a n J. J., B u s c h H., (1976), Exp. Cell. Res., 100, 47—55.106. F u j i t a n i H., H o l o u b e k V., (1973), Biochem. Biophys. Res. Commun., 54,

1300—1305.107. F u j i t a n i H., H o l o u b e k V., (1974), Experientia, 30, 474—476.108. F u j i t a n i H., H o l o u b e k V., (1975), Int. J. Biochem., 6, 547—554.109. P l a t z R. D., K l e i n s m i t h L. J., (1976), Comp. Biochem. Physiol., 55B,

9—18.110. B h o r j e e J. S., P e d e r s o n T., (1976), Analyt. Biochem., 71, 393—404.111. P l a t z R. D., H n i l i c a L. S., (1973), Biochem. Biophys. Res. Commun., 54,

222—227.112. D a v i s R. H., C o p e n h a v e r J. H., C a r v e r M. J., (1975), Int. J. Biochem.,

6, 399—404.113. C h a t t e r j e e R., N a r a y a n a s w a m i A., (1977), Indian J. Biochem. Bio

phys., 14, 251—254.114. L e S t o u r g e o n W. M., T o t t e n R., F o r e r A., (1974), w Acidic Proteins

of the Nucleus, red. Cameron J. W., Jeter J. B., Jr., str. 59—102, Academic Press, London.

115. R u b i n R. W., H i l l M. C., H e p w o r t h P., B o e h m e r J., (1976), J. Cell Biol., 68, 740—751.

116. A l l f r e y V. G., I n o u e A., K a r n J., J o h n s o n E. M., G o o d R. A., H a d d e n J. H., (1975), w The Structure and Function of Chromatin, Ciba Foundation Symposium, t. 28, str. 199—228, Associated Scientific Publishers, Amsterdam.

117. L e i b o v i t c h M. P., T i c h o n i c k y L., K r u h J., (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun., 81, 623—629.

118. B l ü t h m a n n H., (1978), Molec. Biol. Rep., 4, 97—100.119. P l a t z R. D., S t e i n G. S., K l e i n s m i t h L. J., (1973), Biochem. Biophys.

Res. Commun., 51, 735—740.120. J e t e r J. R., Jr, C a m e r o n J. L., (1974), w Acidic Proteins of the Nucleus,

red. Cameron I. L., Jeter J. R., Jr., str. 213—245, Academic Press, London.121. S t e i n G. S., H u n t e r G., L a v i e L., (1974), Biochem J., 139, 71—76.122. M i y a z a k i K., H a g i w a r a H., N a g a o Y., M a t u o Y., H o r i o T.,

(1978), J. Biochem., 84, 135—143.

http://rcin.org.pl


123. H a g i w a r a H., N a g a o Y., M i y a z a k i K., N a k a m u r a T., H ö r i o T.,(1977), Proc. Japan, Biochem. Soc., 50th Ann. Meet., 49, 702 (cyt. wg poz. 122).

124. D o u v a s A. S., H a r r i n g t o n C. A., B o n n e r J., (1975), Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 72, 3902—3906.

125. D o u v a s A. S., B a k k e A., B o n n e r J., (1977), w The Molecular Biology of the Mammalian Genetic Apparatus, red. Ts’o P., str. 143—163, North-Holland Publishing Company, Amsterdam.

126. C o m i n g s D. E., H a r r i s D. C., (1975), Exp. Cell Res., 96, 161—179.127. C o m i n g s D. E., H a r r i s D. C., (1976), J. Cell Biol., 70, 440—452.128. J o c k u s c h B. M., B e c k e r M., H i n d e n n a c h I., J o c k u s c h M., (1974),

Exp., Cell Res., 89, 241—246.129. L e S t o u r g e o n W. M., F o r e r A., L a n g L. Z., B e r t r a m J. S., R u s c h

H. P., (1975), Biochim. Biophys. Acta, 379, 529—552.130. C o m i n g s D. E., O k a d a T. A., (1976), Exp. Cell Res., 103, 341—360.131. L a z a r i d e s E., W e b e r K., (1974), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71, 2268—2272.132. W a t t e r s o n D. M., V a n E 1 d i k L. J., S m i t h R. E., V a n a m a n T. C.,

(1976), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 73, 2711—2715.133. S a n g e r J. W., (1975), Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 72, 2451—2455.134. C a n d e W. Z., L a z a r i d e s E., M c I n t o s h J. A., (1977), J. Cell Biol., 72.

552—567.135. C o r c e s V. G., A v i l a J., (1978), Eur. J. Biochem., 83, 529—535.136. G o I d s t e i n L., K o Ch., E r r i c k J., (1977), Cell Biol. Int. Rep., 1, 511—515.137. G i l b e r t W., M u e l l e r - H i 11 B., (1966), Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 56,

1891—1898.138. R i g g s A. D., B o u r g e o i s S., N e w b y R. F., C o h n M. J., (1968), J. Mol.

Biol., 34, 365—368.139. P t a s h n e M., (1967), Nature, 214, 232—234.140. A l l f r e y V. G.1, (1974), w Acidic Proteins of the Nucleus, red. Cameron I. L.,

Jeter J. R., Jr., str. 2—27, Academic Press, London.140a. B l o o m K. S., A n d e r s o n J. N., (1978), J. Biol. Chem., 253, 4446-^450.141. L i t m a n R. M., (1968), J. Biol. Chem., 243, 6222—6233.142. A l b e r t s B. M., A m o d i o F. J., J e n k i n s M., G u t m a n n E. D., F e r

r i s F. J., (1968), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 33, 289—305.143. G i 1 h a m P. T., (1968), Biochemistry, 7, 2809—2813.144. K le i n s m i t h L. J., H e i d e m a J., C a r r o l l A., (1970), Nature, 226,

1025—1026.145. C a v a l i e r i L. F., C a r r o l l E., (1970), Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 807—

812. ,146. R i c k w o o d D., (1972), Biochim. Biophys. Acta, 269, 47—50.147. S c h a l l e r H., N ü s s l e i n C., B o n h o e f f e r F. J., K u r z C., N i e t z -

s c h m a n n J., (1972), Eur. J. Biochem., 26, 474—481.148. B l ü t h m a n n H., (1976), Eur. J. Biochem., 70, 233—240.149. K 1 e i n s m i t h L. J., (1973), J. Biol. Chem., 248, 5648—5653.150. B l ü t h m a n n H., (1978), Molec. Biol. Rep., 4, 33—37.151. B l ü t h m a n n H., M r o z e k S., G i e r e r A., (1975), Eur. J. Biochem., 58,

315—326.152. T i s e 1 i u s A., H j e r t e n S., L e v i n O., (1966), Arch. Biochem. Biophys.,

65, 132—135.153. G o l d k n o p f I. L., T a y l o r C. W., B a u m R. M., Y e o m a n L. C.,

O l s o n O. J., P r e s t a y k o A. W., B u s c h H., (1975), J. Biol., Chem., 250, 7182—7187.

154. H e r r i c k G., A l b e r t s B., (1976), J. Biol. Chem., 251, 2124—2132.

http://rcin.org.pl

346 L. K L Y SZ EJK O -ST E FA N O W IC Z [60]

155. W a n g T. Y., J o h n s E. W., (1968), Arch. Biochem. Biophys., 124, 176—183.156. K a p l o W i t z P. B., P l a t z R. D., K l e i n s m i t h L. J., (1971), Biochim.

Biophys. Acta, 229, 739—748.157. C a i f a P., A l l e g r a P., F e r r a r o A., B a r r a D., B i a g i o n i S.,

T u r a n o C., (1977), Bull. Mol. Biol. Med., 2, 165—171.158. M c C l e a r y A. R., N o o d é n L. D., K l e i n s m i t h L. J., (1978), J. Biol.

Chem., 253, 5199—5205.159. C o n n e r B. J., C o m i n g s D. E., (1978), Biochim. Biophys. Acta. 532, 122—136.160. N o o d é n L. D., Van den B r o e c k H. W. J., S e v a i l J. S., (1973), FEBS

Letters 29, 326—328.161. L a p e y r e J.-N., B e k h o r I., (1976), J. Mol. Biol., 104, 25—58.162. G a d s k i R. A., C h a e C.-B., (1976), Biochemistry, 15, 3812—3817.163. P a t e l G. L., T h o m a s T. L., (1973), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 2524—

2528.164. P a t e l G. L., T h o m a s T. L., (1975), w Chromosomal Proteins and their

Role in Regulation of Gene Expression, red. Stein G. S., Kleinsmith L. J., str. 249—264, Academic Press, London.

165. C h i u J.-F., W a n g S., F u j i t a n i H., H n i l i c a L. S., (1975), Biochemistry, 14, 4552—4558.

166. R i c k w o o d D., M a c G i l l i v r a y J., (1977), Exp. Cell Res. 104, 287—292.167. B i r n i e G. D., R i c k w o o d D., H e l l A., (1973), Biochim. Biophys. Acta,

331, 283—294.168. U m a n s k y S. R., K o v a l e v Yu. J., T o k a r s k a y a V. I., (1975), Biochim.

Biophys. Acta, 383, 242—254.169. S e v a l l J. S., C o c k b u r n A., S a v a g e M., B o n n e r J., (1975), Bio

chemistry, 14, 782—789.170. T h o m a s T. L., P a t e l G. L., (1976), Biochemistry, 15, 1481—1489.171. B l ü t h m a n n H., (1978), Mol. Cell Biochem., 19, 147—153.172. B l ü t h m a n n H., (1978), Int. J. Biochem., 9, 469—476.173. G o o d w i n G. H., J o h n s F. W., (1973), Eur. J. Biochem., 40, 215—219.174. S h o o t e r K. V., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1974), Eur. J. Biochem.,

47, 263—270.175. G o o d w i n G. H., S h o o t e r K. V., J o h n s E. W., (1975), Eur. J. Biochem,

54, 427—433.176. G e o r g i e v G. P., (1969), J. Theor. Biol., 25, 473—490.177. G i e r e r A., (1973), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 38, 951—961.178. D a v i d s o n E. H., B r i t t e n R. J., (1973), Q. Rev. Biol., 48, 565—613.179. V a u g h a n S. T., C o m i n g s D. E., (1973), Exp. Cell Res., 80, 265—274.180. F o u g è r e C., R u i z F., E p h r u s s i B., (1972), Proc. Nat. Acad. Sci. USA,

69, 330—334.181. P e t e r s o n J. A., W e i s s M. C., (1972), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, >

' 571—575.182. G u r d o n J. B., (1970), Proc. Roy Soc. London B, 176, 303—314.183. J o h n s o n J. D., J o h n T. S t., B o n n e r J., (1975), Biochim. Biophys. Acta,

378, 424—438.184. M a g u n B. E., (1976), Exp. Cell Res., 103, 219—231.185. M a g u n B. E., (1974), w Acidic Proteins of the Nucleus, red. Cameron I. L„

Jeter J. R., Jr., str. 137—158, Academic Press, London.186. S t e i n G. H., (1976), Exp. Cell Res., 99, 115—125.187. C h a e C.-B., S m i t h M. C., M o r r i s H. P., (1974), Biochem. Biophys. Res.

Commun., 60, 1468—1474.188. J o s t E., L e n n o x E., H a r r i s H., (1975), J. Cell Sci., 18, 41—65.

http://rcin.org.pl

[61] BIA Ł K A N IE H IST O N O W E 347

189. H a r r i s H., W a t k i n s J., (1965), Nature, 205, 640—646.190. S a l a s J., G r e e n H., (1971), Nature New Biol., 229, 165—169.191. F o x T. O., P a r d e e A. B., (1971), J. Biol. Chem., 6159—6165.192. B r e h m S. P., H o c h S. O., H o c h J. A., (1975), Biochem. Biophys. Res.

Commun., 63, 24—31.193. H o c h S. O., M c V e y E., (1977), J. Biol. Chem., 252, 1881—1887.194. P a r s o n s R. G., H o c h S. O., (1976), Eur. J. Biochem., 71, 1—8.195. A l b e r t s B. M., F r e y L., (1970), Nature, 227, 1313—1318.196. S i g a l N., D e l i u s H., K o r n b e r g T., G e f f e r M. L., A l b e r t s B. M.,

(1972), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 3537—3541.197. B a n k s G. R., S p a n o s A., (1975), J. Mol. Biol., 93, 63—77.198. H o t t a Y., S t e r n H., (1971), Nature, New Biol., 234, 83—86.199. P h i l l i p s A. P., (1968), Biochem. Biophys. Res. Commun., 30, 393—399.200. H e r r i c k G., A l b e r t s B., (1976), J. Biol. Chem., 251, 2124—2132, 2133—2141.201. T h o m a s T. L., P a t e l G. L., (1976), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 4364—4368.202. D u g u e t M., d e R e c o n d o A.-M., (1978), J. Biol. Chem., 253, 1660—1666. t203. W a s s e r m a n E., L e v i n e L., (1961), J. Immunol., 87, 290—295.204. S t o l l ar B. D., W a r d M., (1970), J. Biol. Chem., 245, 1261—1266.205. C h y t i l F., S p e l s b e r g T. C., (1971), Nature New Biol., 233, 215—218.206. W a k a b a y a s h i K., H n i 1 i c a L. S., (1972), J. Cell Biol., 55, 271.207. W a k a b a y a s h i K., H n i l i c a L. S., (1973), Nature, New Biol., 242, 153—155.208. W a k a b a y a s h i K., W a n g S., H o r d G., H n i l i c a L. S., (1973), FEBS

Letters, 32, 46—48.209. C h i u J.-F., C r a d d o c k C., M o r r i s H. P., H n i 1 i c a L. S., (1974), FEBS

Letters, 42, 94—97.210. C h i u J.-F., W a k a b a y a s h i K., C r a d d o c k C., M o r r i s H. P., H n i

l i c a L. S., (1974), w The Cell Cycle Controls, red. Padilla G. M., ZimmermanA. M., Cameron I. C., str. 309—318, Academic Press, London.

211. W a k a b a y a s h i K., W a n g S., H n i l i c a L. S., (1974), Biochemistry, 13, 1027—1032.

212. W a k a b a y a s h i K., W a n g S., H n i l i c a L. S., (1973), w Fogarthy Inter- natl. Center Symposium on Poly/ADP-ribose), NIH, str. 261—273, Bethesda.

213. W a n g S., C h i u J.-F., K i y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L., F u j i t a n i H., H n i l i c a L. S., A n s e v i n A. T., (1976), J. Biol. Chem., 251, 1471—1475.

214. C h i u J.-F., H n i l i c a L. S., C h y t i l F., O r r a h o o d J. T., R o g e r s L. W., (1977), J. Nat. Cancer. Inst., 59, 151—154.

215. F u j i t a n i H., C h i u J.-F., H n i 1 i c a L. S., (1978), Proc. Nat. Acad. Sci. USA,75, 1943—1946.

216. H n i l i c a L. S., C h i u J.-F., H a r d y K., F u j i t a n i H., B r i g g s R., (1978), w The Cell Nucleus, red. Busch H., t. 5, str. 307—331, Academic Press, London.

217. C a m p b e l l A. M. , B r i g g s R. C., Z i m m e r M. S. , K r a j e w s k a W. M., C h i u J.-F., H n i l i c a L. S., (1978), w Biological Markers of Neoplasia: Basic and Applied Aspects, red. Ruddon, str. 369—384, Elsevier North Holland. Inc., Amsterdam.

218. H a r d y K., C h i u J.-F., B e y e r A. L., H n i l i c a L. S., (1978), J. Biol. Chem., 253, 5825—5831.

219. K r a j e w s k a W. M., B r i g g s R. C., C a m p b e l l A. M., C h i u J.-F., H n i l i c a L. S., (1978), J. Cell Biol., 79, 114a.

220. K r a j e w s k a W. M., H a r d y K., B r i g g s R. C., C h i u J.-F., H n i l i c a L. S., (1978), 7th Int. Cell Cycle Conf., Knoxville.

221. Z a r d i L., L i n J. C., B a s e r g a R., (1973), Nature New Biol., 245, 211—213.

http://rcin.org.pl

348 L. K Ł Y SZEJK O -STEFA N O W IC Z [62]

222. Z a r d i L., (1975), Eur. J. Biochem., 55, 231—238.223. K o n o N., S h i m a I., O h t a G., (1977), J. Biochem., 81, 1549—1555.224. S p e l s b e r g T. C., M i t c h e l l W. M., C h y t i l F., W i l s o n E. M.,

O ’ M a l l e y B. W., (1973), Biochem. Biophys. Acta, 312, 765—778.225. B r o w n R. W., C l a r k R. W., C h i u J.-F., S t u b b l e f i e l d E., (1977),

Exp. Cell Res., 104, 207—213.226. K r a j e w s k a W., L i p i ń s k a A., K i l i a ń s k a Z., K ł y s z e j k o - S t e

f a n o w i c z L., (1977), Acta Biochim. Pol., 24, 127—132.227. L i p i ń s k a A., K r a j e w s k a W., K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i c z L.,

K r a w c z y k Z., (1978), 12 th FEBS Meeting Abstracts, nr 2142, Drezno.228. Y e o m a n L. C., T a y l o r C. W., J o r d a n J. J., B u s c h H., (1975), Exp.

Cell Res., 91, 207—215.229. P r e s t a y k o A. W., C r a n e P. M., B u s c h H., (1976), Biochemistry, 15,

414—421.230. E z r a i l s o n E. G., O l s o n M. O. J., G u e t z o w K. A., B u s c h H., (1976),

FEBS Letters, 62, 69—73.231. G a n p a t h N., P r e s t a y k o A. W., B u s c h H., (1977), Cancer Res., 37,

1290—1300.232. M o n t a g n a R. A., W a n g T. Y., (1976), Cancer Res., 36, 3138—3142.233. K o s t r a b a N. C., M o n t a g n a R. A., W a n g T. Y., (1975), J. Biol. Chem.

250, 1548—1555.234. Z o r n e t z e r M. S., S t e i n G. S., (1975), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72,

3119—3123.235. B o f f a L. C., V i d a l i G., A l l f r e y V. G., (1975), Cancer Res. 36, 2356—

2363.236. B o f f a L. C., A l l f r e y V. G., (1977), Cancer, 40, 2584—2591.237. W e i n t r a u b H., G r o u d i n e M., (1976), Science, 193, 848—856.238. Y e o m a n L. C., (1978), w The Cell Nucleus, red. Buch H., t. 5 str. 263—306,

Academic Press, London.239. N a k a n e P. K., P i e r c e G. B., (1967), J. Cell Biol., 33, 307—318.240. S t e i n G. S., S t e i n J. L., T h o m p s o n J. A., (1978), Cancer Res. 38,

1181—1201.241. C a n t a r o w W., S t o l l a r B. D., (1977), Arch. Biochem. Biophys., 180, 26—34

oraz 34—40.242. G o o d w i n G. H„ J o h n s E. W., (1972), FEBS Letters, 21, 103—104.243. J o h n s E. W., (1964), Biochem. J., 92, 55—59.244. C r am p t o n C. F., S t e i n W. H., M o o r e S., (1957), J. Biol. Chem., 225,

363—386.245. J o h n s E. W., (1975), w The structure and Function of Chromatin, Ciba Foun

dation Symposium, t. 28, str. 95—112, Associated Scientific Publishers, Amsterdam.

246. G o o d w i n G. H., N i c o l a s R. H., J o h n s E. W., (1975), Biochim. Biophys.- Acta, 405, 280—291.

247. S a n d e r s C., J o h n s E. W., (1974), Biochem. Soc. Trans., 2, 547—550.248. J o h n s E. W., (1967), Biochem. J., 104, 78—82.249. G o o d w i n G. H., W a l k e r J. M., J o h n s E. W., (1978), Biochim. Biophys.

Acta, 519, 233—242.250. B u s t i n M., H o p i n k s R. B., I s e n b e r g I., (1978), J. Biol. Chem., 253,

1694—1699.251. A l f a g m e C. R., R u d k i n G. T., C o h e n L. H., (1976), Proc. Nat. Acad.

Sci. USA, 73, 2038—2048.

http://rcin.org.pl


252. F r a n c o L., M o n t e r o F., R o d r i g u e s - M o l i n a J. J., (1977), FEBS Letters., 78, 317—320.

253. W a t s o n D. C., P e t e r s E. H., D i x o n G. H., (1977), Eur. J. Biochem., 74, 53—60.

254. V i d a l i G., B o f f a L. C., A l l f r e y V. G., (1977), Cell, 12, 409—415.255. S t e r n e r R., B o f f a L. C., V i d a l i G., (1978), J. Biol. Chem., 253, 3830—

3836.256. S p i k e r S., M a r d i a n J. K. W., I s e n b e r g I., (1978), Biochem. Biophys.

Res Commun., 82, 129—135.257. M a r u s h i g e K., D i x o n G. H., (1971), J. Biol. Chem., 246, 5799—5805.258. R a b b a n i A., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1978), Biochem. Biophys.

Res. Commun., 81, 351—358.259. C a r y P. D., C r a n e - R o b i n s o n C., B r a d b u r y E. M., J a v a h e r i a n

K., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1976), Eur. J. Biochem, 62, 583—590.260. B a k e r C., I s e n b e r g I., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1976), Bioche

mistry, 15, 1645—1649.261. A b e r c r o m b i e B. D., K n e a l e G. D., C r a n e - R o b i n s o n C., B r a d

b u r y E. M., G o o d w i n G. H., W a l k e r J. M., J o h n s E. W., (1978), Eur. J. Biochem., 84, 173—177.

262. J a v a h e r i a n K., A m i n i S., (1977), Biochim. Biophys. Acta., 478, 295—304.263. J a v a h e r i a n K., A m i n i S., (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun., 85,

1385—1391.264. W a l k e r J. M., S h o o t e r K. V., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1976),

Biochem. Biophys. Res. Commun., 70, 88—93.265. W a l k e r J. M., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1976), Eur. J. Biochem, 62,

461—469.266. W a l k e r J. M., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., W i e t z e s P., G a a s t r a

W., (1977), Int. J. Peptide Protein Res., 9, 220—223.267. G o o d w i n G. H., R a b b a n i A., N i c o l a s R. H., J o h n s E. W., (1977),

FEBS Letters., 80, 413—416.268. W a l k e r J. M., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1978), Int. J. Peptide

Protein Res., 11 , 301—304.269. W a l k e r J. M., H a s t i n g s J. R. B., J o h n s E. W., (1977), Eur. J. Biochem,

76, 461—468.270. W a l k e r J. M., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1978), FEBS Letters, 90,

327—330.271. W a l k e r J. M., H a s t i n g s J. R. B., J o h n s E. W., (1978), Nature, 271,

281—282.272. D i x o n G. H., C a n d i d o E. P. M., H o n d a B. M., L a u i e A. J., M a c

L e o d A. R., S u a g M. T., (1975), Ciba Fundation Symposium, t. 28, str. 229—250, Associated Scientific Publishers, Amsterdam.

273. H u n t l e y G., D i x o n G. H., (1972), J. Biol. Chem., 247, 4916—4919.274. G r e e n a w a y P. J., M u r r a y K., (1971), Nature, New Biol., 229, 233—238.275. Y u S. S. , L i H. J., G o o d w i n G.'H., J o h n s E. W., (1977), Eur. J. Biochem..

78, 497—502.276. H o a r e T. A., J o h n s E. W., (1970), Biochem. J., 119, 931—932.277. H o a r e T. A., J o h n s E. W., (1971), Biochim. Biophys. Acta., 247, 408—411.278. G o o d w i n G. H., W o o d h e a d J. L., J o h n s E. W., (1977), FEBS Letters,

73, 85—88.279. L e v y B. W., W a n g N. C., D i x o n G. H., (1977), Proc. Nat. Acad. Sei. USA,

74, 2810—2814.280. G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1978), Biochim. Biophys. Acta, 519, 279—284.


350 L. K tiY SZ E JK O -ST E F A N O W IC Z [64]

281. S m i t h B. J., R o b e r t s o n D., B i r b e c k M. S. C., G o o d w i n G. H., J o h n s E. W., (1978), Exp. Cell Res., 115, 420—423.

282. J a v a h e r i a n K., L i u L. F., W a n g J. C., (1978), Science, 199, 1345—1345.283. S a n d e r s C., (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun., 78, 1034—1042.284. S c h l e s i n g e r D. H., G o l d s t e i n G., N i a l l H. D., (1975), Biochemistry,

14, 2214—2218.285. G o l d k n o p f I. L., B u s c h H., (1977), Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 74, 864—868.286. G o l d k n ö p f I. L., F r e n c h M. E., M u s s o R., B u s c h H., (1977), Proc.

Nat. Acad. Sei. USA, 74, 5492—5495.287. B a 11 a 1 N. R., B u s c h H., (1973), Cancer Res., 33, 2737—2743.288. O r r i c k L. R., O l s o n M. O. J., B u s c h H., (1973), Proc. Nat. Acad. Sei.

USA, 70, 1316—1320.289. B a l l a l N. R., G o l d k n o p f I. L., G o l d b e r g D. A., B u s c h H., (1974),

Life Sei., 14, 1835—1845.290. B a l l a l N. R., K a n g Y.-J., O l s o n M. O. J., B u s c h H., (1975), J. Biol.

Chem., 250, 5921—5925.291. G o l d k n o p f I. L. T a y l o r Ch. W., B a u m R. M., Y e o m a n L. C., O l

s o n M. O. J., P r e s t a y k o A. W., B u s c h H., (1975), J. Biol. Chem., 250, 7182—7187.

292. O l s o n M. O. J., G o l d k n ö p f I. L., G u e t z o w K. A., J a m e s G . T., H a w k i n s T. C., M a y s - R o t h b e r g C. J., B u s c h H., (1976), J. Biol. Chem. 251, 5901—5903.

293. B u s c h H., B a l l a l N. R., R a o M. R. S., C h o i Y. C., R o t h b 1 u m L. C.,(1978), w The Cell Nucleus, red. Busch H. t. 5, str. 415—468, Academic Press, London.

294. G o l d k n ö p f I. L., F r e n c h M. F., D a s k a l Y., B u s c h H., (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun., 84, 786—793.

295. J a m e s G. T., Y e o m a n L. C., M a t s u i S., G o 1 d b e r g A. H., B u s c hH., (1977), Biochemistry, 16, 2384—2389.

296. C a t i n o J. J., Y e o m a n L. C., M a n d e l M., B u s c h H., (1978), Biochemistry, 17, 983—987.

297. H u n t L. J., D a y h o f f M. O., (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun., 65,951—960.

298. D a y h o f f M. O., (red.) (1976), Atlas of Protein Sequence and Structure, t. 5., National Biomedical Research Foundation, Washington.

299. G o l d s t e i n G., (1974), Nature, 247, 11—14.300. B a s c h R. S., G o l d s t e i n G., (1974), Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71, 1474—

1478.301. G o l d s t e i n G., H e m m e r l i n g U., B o y s e E. A., S c h l e s i n g e r D. H.,

N i a l l H.JD., (1975), Proc Nat. Acad. Sei. USA, 72, 11—15.302. G o l d s t e i n G., W h i t t i n g h a m S., (1966), Lancet, ii, 315—318.303. G o t t e s f i e l d J. M., G a r r a r d W. T., B a g i G., W i l s o n R. F., B o n

n e r J., (1974), Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 71, 2193—2197.304. W a t s o n D. C., L e v y B. W., D i x o n G. H., (1978), Nature, 276, 196—198.

http://rcin.org.pl

Post. B io c h em . , 25, 351—371, (1979),

KAROL TAYLOR *>, ALINA TAYLOR **>

Wykorzystanie fragmentów DNA bakteriofaga X w konstrukcji wektorów plazmidowych dla klonowania genów. Mapa restrykcyjna X DNA

The Use of Bacteriophage X Fragments in the Construction of Plasmid Vectors for Gene Cloning. Included: Restriction Map of X DNA

Spis treści

WstępI. Elementy regulacji transkrypcji DNA bakteriofaga l

II. Mapa fizyczna DNA bakteriofaga ).II-1. Mapa genetyczna II-2. Mapa restrykcyjna

III. Konstrukcja plazmidów zawierających fragmenty X DNAIV. Uwagi końcowe

Contents

IntroductionI. Regulatory elements of K DNA transcription

II. Physical map of I DNA II-1. Genetic map II-2. Restriction map

III. Construction of plasmids containing Â DNA fragmentsIV. Concluding remarks

Bakteriofag X jest ulubionym dzieckiem biologii m olekularnej. W wielu dziedzinach badanie tego pozornie nieskom plikowanego „organizm u” torowało drogę nowym ideom, a różne przyczyny, m iędzy innym i dobra znajomość genetyki tego w irusa spraw iają, że jest on chętnie stosowanym narzędziem badawczym. Regulacja ekspresji genów na poziomie tran sk ry pcji jest w łaśnie jedną z dziedzin biologii m olekularnej, k tóra w iele zaw-

*> Prof. dr hab., **) Doc. dr hab., Zakład Biochemii Uniwersytetu Gdańskiego, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk

Autorzy uczestniczą w realizacji problemu 09.7. koordynowanego przez Instytut Biochemii i Biofizyki P.A.N.


352 K. TAYLO R , A . TAYLO R [21

dzięcza badaniom rozwoju faga 1 w komórce gospodarza — Escherichia coli (1). W genomie X w ystępują liczne elem enty kontroli transkrypcji (Ryc. 1): są to geny (cl, ero) determ inujące syntezę białek represorow ych i sekwencje nukleotydowe zdolne do wiązania tych białek (operatory); są to sekwencje rozpoznawane przez RNA-polim erazę gospodarza, wiążące ją, i te, od których s ta rtu je transkrypcja; w ystępują one w tandem ie i tworzą jednostki funkcjonalne (promotory); są to wreszcie sekwencje decydujące o term inacji tran sk rypc ji (term inatory) i geny (N , Q) determ i-

Ryc. 1. Uproszczona mapa fizyczna genomu faga X, skonstruowana na podstawie pomiarów heterodupleksów DNA w mikroskopie elektronowym (2).K o m p lem en ta rn e pasm a X D N A o zn a czo n e są lite r a m i l (tra n sk ry p c ja na lew o ) i r (tra n sk ry p c ja na p raw o). R e jo n y D N A tr a n sk r y b o w a n e p od czas r ó żn y ch e ta p ó w ro zw o ju lity c z n e g o faga X (3) p r z ed sta w io n e są p o z io m y m i s trza łk a m i. S trz a łk i z a c z e r n io n e p r zed sta w ia ją n a jw c z e ś n ie jszą sy n te z ę R N A , p row ad zon ą przez b ia łk a gosp od arza . S trz a łk i za k ra tk o w a n e p rzed sta w ia ją w c zesn ą -o p ó źn io n ą s y n te z ę R N A w k tó re j b ia łk o fa g o w e N a k ty w u je tra n sk ry p c ję r e jo n ó w c l l l - in t - b i c I I -0 -P -Q . S trza łk i za k r esk o w a n e p r z ed sta w ia ją p ó źn y e ta p s y n te z y R N A , w k tórym b ia łk o Q a k ty w u je tr a n sk r y p c ję r e jo n ó w S -R i A -J. W ty m c z a s ie b ia łk o Cro h am u je już tr a n sk r y p c ję w czesn ą . P o n ie w a ż X D N A w y stę p u je w fo r m ie k o lis te j lu b k o n k a te m ery czn e j przez w ięk szą część r o zw o ju w e w n ą tr zk o m ó r k o w e g o , w ła śc iw ą jed n o stk ą późn ej tra n sk ry p c ji m oże b y ć rejo n S -R - A - J . R y c in a z p ra cy (4), z m o d y fik o w a n a .

nujące syntezę białek znoszących efek t działania n iektórych term inatorów. Dzięki niedawno opracowanym , efektyw nym m etodom sekwencjonowania DNA, sekwencja nukleotydow a większości elem entów kontroli transkrypcji X DNA została ustalona i można mieć nadzieję, że w ciągu najbliższych miesięcy ten etap zostanie zakończony.

Pow stająca na naszych oczach nowa gałąź biologii m olekularnej, inżynieria genetyczna, w ykorzystując bakteriofaga X jako jeden z wektorów do klonowania dowolnych genów, w tym i genów eukariotycznych. Gdy ce

http://rcin.org.pl

[3] M APA R E ST R Y K C Y JN A X D N A 533

lem włączenia obcego genu do genomu X jest osiągnięcie m aksim um ekspresji tego genu, ogromnym ułatw ieniem przy projektow aniu rekom binacji in vitro jest znajomość kontroli transk rypcji X DNA. W efekcie można doprowadzić do tego, że po zakażeniu E. coli tak skonstruow anym rekom - binantem faga X białko determ inow ane przez gen wklonowany stanowi znaczną część syntetyzow anych przez bakterie białek (5, 6, 7, 8). Inną klasę w ektorów do klonowania genów stanow ią plazm idy (9, 10), autonom icznie replikujące się jednostki dziedziczności pozachromosomalnej, które, w odróżnieniu od wirusów, mogą istnieć wyłącznie w ew nątrz komórki. Tu znajomość regulacji transkrypcji jest wciąż jeszcze niewielka, a obserwowana ekspresja genu wklonowanego do plazm idu jest wypadkową działania słabo poznanych czynników. Pomimo tego, już w pierwszych próbach zastosowania inżynierii genetycznej do przem ysłow ej produkcji polipepty- dów zwierzęcych potrzebnych m edycynie użyto właśnie plazm idy bak tery jne (11). Być może, zakażenie bakterii fagiem X, tak proste w laboratorium, przedstaw ia pewne problem y w skali przem ysłowej, chociaż niew y- m agająca dodatkowych m anipulacji hodowla drobnoustrojów syn tetyzujących pożądaną substancję jest bez w ątpienia w w arunkach przem ysłowych procesem dobrze opanowanym technologicznie.

Uważny czytelnik dojdzie w tym momencie do wniosku, że należy skonstruow ać plazmid, zaw ierający pożądane elem enty regulacji tran skrypcji pochodzące od bakteriofaga X. Do tego samego wniosku doszło już kilku badaczy, a wyniki ich pracy zostaną przedstaw ione w niniejszym artykule. Przedtem jednak zostanie przedstaw iony pokrótce ak tualny stan wiedzy o elem entach regulacji transk rypcji X DNA. N ajcenniejszą częścią artyku łu jest, zdaniem autorów, załączona m apa fizyczno-genetyczna DNA bakteriofaga X z zaznaczonymi m iejscam i cięcia przez endonukleazy re strykcyjne. W łaśnie wiadomości zaw arte w tej mapie um ożliwiają wybór odpowiedniego fragm entu X DNA do różnych celów, między innym i do konstrukcji plazm idu z odpowiednim układem regulacji transkrypcji.

I. Elementy regulacji transkrypcji DNA bakteriofaga X

W cyklu życiowym bakteriofaga X istotną rolę odgrywają dwa białka represorow e, determ inow ane przez geny cl i ero. Oba białka oddziaływują na te same miejsca operatorowe oL i oR, przy dużym stężeniu ham ując transk rypcję z zachodzących na te operatory prom otorów pL, pM i Pr (12). Ciekawie przedstaw ia się regulacja transk rypcji przy m ałym stężeniu re presora. W tedy białko represorow e cl, u trzym ując blokadę transkrypcji z prom otorów pL i pR, ak tyw uje transk rypcję operonu cl—rea:, startu jącą z prom otora p M (13) (Ryc. 2A). W ystępuje tu więc układ sam oregulujący, zapew niający stałe stężenie represora cl. Sytuacja taka w ystępuje, gdy X DNA („profag”) jest zintegrow any z chromosomem gospodarza (bakterii

http://rcin.org.pl

354 K. T A YL O R , A . TAYLO R [4]

„lizogennej”): żadne geny fagowe (z w yjątkiem cl i rex) są nie wyrażane i profag ulega replikacji, jako część chromosomu bakteryjnego.

Białko represorow e Cro zaczyna przejaw iać swą aktyw ność od zablokowania transk rypcji zachodzącej z prom otorów pL i pM (Ryc. 2B). Zablokowanie transkrypcji s tartu jącej w promotorze pR następuje dopiero przy dużym stężeniu Cro. Zatem i w tym przypadku zachodzi sprzężenie zw rot-

Ryc. 2. Regulacja transkrypcji X DNA przez białka represorowe, determinowane przez geny cl i cro.M iejsca w ią ż ą ce rep resor, to o p era to r y o L i o R. M iejsca in ic ja c j i tr a n sk r y p c ji, ter p ro m o to ry p M, P L (w lew o ) i P f i (w p raw o). Z a zn aczon o r ó w n ież m ie jsca te r m in a c ji tra n sk r y p c ji, te rm in a to ry tM i t R . Z nak ” ozn acza b lo k o w a n ie tr a n sk ry p c ji, zn a k ,, + ” a k ty w a c ję tr a n sk ry p c ji. (A) P rzy u m ia rk o w a n y m s tę że n iu rep reso ra c l tra n sk ry p c ja z p ro m o to ró w p L i p R je s t za b lo k o w a n a , a tra n sk ry p c ja z p M za k ty w o w a n a ; d op iero w y so k ie s tę ż e n ie b ia łk a c l b lo k u je tr a n sk ry p c ję o p ero n u c l -re,x. (B) U m ia r k o w a n e s tę że n ie rep reso ra C ro b lo k u je tr a n sk r y p c ją z p ro m o to ró w p L i p M, d op u szcza ją c do p ew n ej tr a n sk r y p c ji z p rom otora p R, w y so k ie dop iero s tę że n ie Cro b lo k u je tę tra n sk r y p c ję . U k ła d A w y stęp u je , g d y X D N A je s t z in te g r o w a n y z ch ro m o so m em b a k ter ii liz o g en n e j (p rofag), u k ła d B — g d y X D N A r ep lik u je s ię ja k o p lazm id .

ne: represor reguluje własną syntezę. Stałe, niewielkie stężenie represora Cro jest niezbędne do utrzym ania 1 DNA w stanie replikującego się au tonomicznie plazm idu l (14). Cro kontroluje znajdujący się w tym samym operonie rejon rep likacyjny ori— O—P; w efekcie replikacja plazm idu X zachodzi wolniej od replikacji faga X — plazmid rep liku je się zgodnie z podziałami komórkowymi. Natom iast w toku rozwoju litycznego bakteriofaga l zadaniem białka Cro jest zaham owanie niepotrzebnej już, a naw et szkodliwej ekspresji genów „w czesnych” .

W arto zwrócić uwagę na to, że działając (przy m ałym stężeniu) na ten sam operator oR, każdy z dwu represorów wyw ołuje odm ienne efekty: re presor cl ham uje transkrypcję genu cro zachodzącą z pR, a represor Cro ham uje transkrypcję genu cl zachodzącą z pM. Ten w zajem ny antagonizm dwu represorów faga 1 można w yjaśnić w oparciu o budowę m iejsca

http://rcin.org.pl

15] M APA R E ST R Y K C Y JN A X D N A 355

Pm—Or—Pr (15) (Ryc. 3). O perator oR składa się z trzech sekwencji polin- dromowych. Każda z nich liczy 17 par zasad i wiąże dimeryczne białko cl. Na sekw encje te (oR1, oR2, oR3) zachodzą prom otory pR i pM. Represor cl w ykazuje najw iększe powinowactwo do m iejsca oR1, a najm niejsze do oR3. Przy m ałym stężeniu represora zablokowane jest więc tylko oR1, co uniemożliwia dostęp RNA-polimerazy do prom otora pR i, tym samym, tra n skrypcję genu cro. Cro w ykazuje natom iast najw iększe powinowactwo do miejsca oR3, a więc przy m ałym stężeniu represor Cro związany z oR3 nie zezwala RNA-polimerazie na transkrypcję genu cl sta rtu jącą z pM.

Ityc. 3. Rejon DNA bakteriofaga X zawierający operator oR, w powiększeniu.Jego cz ę śc i sk ła d o w e: o R1, o R2 i o R3 to p o d o b n e do s ie b ie s e k w e n c je n u k le o ty d o w e . N a s e k w e n c je te za ch od zą s ek w e n c je p ro m o to ró w p R i p M. P o z o s ta łe o z n a k o w a n ie ja k w R yc. 1. i 2. B ia łk o r ep reso ro w e c l w y k a z u je n a jw ięk sz e p o w in o w a c tw o do o R1, b lo k u ją c tr a n sk r y p c ję cro. B ia łk o r ep reso ro w e Cro w y k a z u je n a jw ięk sz e p o w in o w a c tw o do o R3, b lok u jąc tr a n sk r y p c ję cl. R y c in a z p ra cy (15), z m o d y fik o w a n a .

Oprócz przedstaw ionych wyżej prom otorów pL i Pr transkrypcji wczesnej: najw cześniejszej (ang. immediate-early) i wczesnej-opóżnionej (ang. delayed-early (Ryc. 1), nieźle scharakteryzow any jest prom otor pR tra n skrypcji późnej (16,17). Ten w yjątkow o silny prom otor odgrywa istotną rolę w rozwoju litycznym faga, um ożliwiając ekspresję genów lizy (S, R) oraz genów determ inujących syntezę główek i ogonków potomstwa fago- wego (rejon A —J).

Na dość wczesnym etapie po zakażeniu bakterii bakteriofagiem A dochodzi do wyboru dalszej drogi rozwoju; a lte rnatyw ą dalszej autonom icznej replikacji i rozwoju litycznego jest integracja A, DNA z chromosomem bakteryjnym . Ważną rolę odgrywa tu aktyw acja ekspresji genów cl i in t : represor cl pośrednio ham uje dalszą replikację X' DNA i ekspresję genów późnych, a białko In t (18) bierze udział w in tegracyjnej rekom binacji l DNA z DNA E. coli. Wiadomo, że na praw o od int znajduje się dodatkowy prom otor pT, k tóry zapewnia wzmożoną ekspresję tego genu po zakażeniu bakterii fagiem (19). Wiadomo również, że bardzo intensyw na

http://rcin.org.pl

356 K. TA YLO R , A. TAYLO R [6]

transkrypcja genu cl po zakażeniu zachodzi z prom otora pE (20). Dobrze udokum entow any jest udział genów cli i c lii w aktyw acji ekspresji genów cl i int. W przypadku represora cl m echanizm działania białek cII/cIII polega prawdopodobnie na aktyw acji prom otora pE lecz nie można wykluczyć alternatyw nego m echanizm u — an ty term inacji transkrypcji s tartu jącej z p0 (21).

Pozytyw na regulacja transk rypc ji l DNA w dużej mierze polega na zjaw isku an ty term inacji, które, choć dobrze poznane od strony genetycznej, wciąż czeka na w yjaśnienie podstaw biochemicznych. A nty term ina- torowa rola genu N faga l jest najlepiej poznana i stanow i najw ażniejszy model badawczy w tej dziedzinie biologii m olekularnej. P rzy jrzy jm y się raz jeszcze wczesnym wydarzeniom po infekcji fagiem X (Ryc. 1 i Ryc. 5), k tóre zresztą podobnie przebiegają i po indukcji profaga X w bakteriach lizogennych. E fektyw na transkrypcja rozpoczęta w silnym prom otorze pL ulega praw ie w 100% term inacji w m iejscu tL, natom iast część tran sk ryp cji zainicjowanej w pR przebija się przez słaby term inato r tR1 i ulega zakończeniu dopiero w tR2. Zarówno w inicjacji transkrypcji, jak i w jej term inacji biorą udział wyłącznie białka baktery jne: DNA-zależna poli- m eraza RNA E. coli (EC 2.7.7.6) rozpoznająca sekwencje prom otorów pL i pR, oraz białko „ro” biorące udział w term inacji w m iejscach tu tm i tR2. Pow stający najw cześniejszy 1 mRNA determ inuje syntezę przede wszystkim dwu białek: N i Cro. W odróżnieniu od Cro, białko N bardzo szybko m anifestuje swoją aktywność. W w yniku jego działania RNA-polimeraza przestaje rozpoznawać sygnały term inacji w tL, tR1 i tR2. Dwie fale tra n skrypcji przesuw ają się: z pL w lewo, aż do rejonu b, z pR w prawo, aż do genu Q włącznie. Ta zależna od białka N transk rypcja nosi nazwę wczesnej-opóżnionej. Gen N w sposób pośredni ak tyw uje replikację l DNA, do której niezbędna jest (i) ekspresja genów O i P, a także (ii) transkrypcja m iejsca ori, lub zachodząca w jego pobliżu (22, 23).

Opierając się głównie na w ynikach badań genetycznych, został zaproponowany m echanizm term inacji transk rypc ji zachodzącej przy współudziale białka „ro” (24), przedstaw iony schem atycznie na Rycinie 4. W bakteriach E. coli, tak jak we wszystkich organizm ach prokariotycznych, transkrypcja jest ściśle sprzężona z translacją. Bezpośrednio po inicjacji transkrypcji, do krótkiego jeszcze, świeżo zsyntetyzow anego łańcucha mRNA przyłączają się od końca 5' rybosomy, k tóre przesuw ając się wzdłuż niego syntetyzują łańcuch polipeptydowy. Jeden, lub \yięcej ko- donów nonsensownych — UAA (ochre), UAG (amber) lub U G a (opal) — w ystępujących w mRNA tam gdzie kończy się odczyt genu, jest elem entem sygnału term inacji translacji. Jest to sygnał do dysocjacji rybosomów i uwolnienia zsyntetyzow anego łańcucha polipeptydowego. Po zakończeniu transkrypcji ostatniego z genów operonu, polim eraza dalej syntetyzuje ' mRNA, póki nie dotrze do sekw encji term inatorow ej. Tuż przed tym miejscem, jak się okazało z badań in vitro, polim eraza w yraźnie zwalnia

http://rcin.org.pl


swój bieg wzdłuż DNA, co prawdopodobnie ma związek z w ystępującym i tam palindrom ow ym i sekwencjam i. Sądzi się, że białko ,,ro” wiąże się z w olnym od rybosomów odcinkiem mRNA i, w ykorzystując swą ak tyw ność RNA-zależnej ATPazy, prześlizguje się wzdłuż tego odcinka i do-

Ryc. 4. Model terminacji transkrypcji zachodzącej z udziałem białka „ro”.L in ia fa lis ta p r zed sta w ia m R N A , k ó łk a z a c z ern io n e — R N A -p o lim era zę , k ó łk a p u ste — r y b o so m y , p r o s to k ą ty — czą s te c zk i b ia łk a „ ro ” . A U G je s t k o d o n em in ic ja c j i, a U A P u — k o d o n em term in a c ji s y n te z y ła ń cu ch a p o lip e p ty d o w e g o . B ia łk o „ r o ” p rzesu w a s ię (k o sz tem en e rg ii h y d ro lizy A T P) w z d łu ż w o ln e g o od r y b o so m ó w m R N A i d ogan ia R N A -p o lim era zę , k tóra zw o ln iła b ieg u w m ie js c u te r m in a to ro w y m t. W w y n ik u w za je m n e g o o d d z ia ły w a n ia ty c h d w u b ia łek d och od zi do te r m in a c j i tr a n sk r y p c ji i u w o ln ien ia z sy n te ty z o w a n eg o ła ń cu ch a m R N A . R y c in a z p ra cy (26), z m o d y fik o w a n a .

gania polim erazę w m iejscu term inatorow ym . Istn ieją dane genetyczne, silnie sugerujące wzajem ne oddziaływanie RNA-polimerazy i białka „ro” związanego z mRNA (25). W w yniku tego oddziaływania dochodzi zapewne do term inacji transk rypcji i uwolnienia łańcucha mRNA.

M utacyjna zamiana jednej zasady może doprowadzić do powstania kodonu nonsensownego. M utacja tego typu inaktyw uje funkcję zm utowanego genu: translac ja ulega term inacji w ew nątrz genu doprowadzając do syntezy niekom pletnego polipeptydu. N iektóre z tych m utacji w ykazują dodatkowo tzw. efekt polarności: zm niejszają lub likw idują ekspresję w szystkich genów operonu znajdujących się od miejsca m utacji do term ina to ra transkrypcji, (ang. downstream). W ydaje się, że i w tym w ypadku dysocjacja rybosom ów w nowo— utw orzonym kodonie nonsensownym i u jaw nienie się dłuższego odcinka mRNA wolnego od rybosomów jest sygnałem włączającym do akcji białko „ro” i wyw ołującym przedwczesną term inację transkrypcji. Szczególnie in teresującym jest fakt, że białko N bakteriofaga 1 znosi efekt polarności we wszystkich zbadanych do tej pory przypadkach.

Choć białko determ inow ane przez gen N faga 1 zostało zidentyfikow ane (27) i opracowano m etody oznaczania jego aktywności, nie zostało

(http://rcin.org.pl

358 K. T A YLO R , A . TAYLO R [8]

ono jeszcze wyizolowane. N ajbardziej praw dopodobny mechanizm działania białka N, oparty na badaniach genetycznych, przedstaw ia się następująco: białko to działa na RNA-polimerazę, lecz nie na wolny enzym, tylko na taki, k tóry już rozpoczął transkrypcję. Miejsce działania, lub wiązania się białka N z RNA-polim erazą zostało zlokalizowane metodami genetycznym i — znajduje się w pobliżu prom otora. RNA-polimeraza zmodyfikowana działaniem białka N nie jest już wrażliw a na działanie białka ,,ro” i transkrypcja ulega zakończeniu dopiero w jednym z niezależnych od ,,ro” term inatorów .

Jedyną wyraźnie zdefiniowaną klasą cząsteczek X RNA, syntetyzow aną in vitro pod nieobecność białka ,,ro” jest RNA 6S (28). Jest to produkt transkrypcji inicjow anej w prom otorze genów późnych i ulegającej term inacji bez udziału „ro”. Przypuszcza się, że białko determ inow ane przez gen Q aktyw uje transkrypcję późną m echanizm em an ty term inacji — przedłużenia transk rypcji zachodzącej z p'n (10, 11). W odróżnieniu od białka N, białko Q faga 1 nie znosi efektu polarności (29).

II. Mapa fizyczna DNA bakteriofaga l

II-l. Mapa genetyczna

Przed wklonowaniem pożądanego genu (elem entu kontroli tran sk ry p cji) faga A. do w ektora plazmidowego, należy dysponować inform acjam i (i) w jakim m iejscu l DNA się on znajduje i (ii) jaką endonukleazę re strykcyjną należy zastosować, by wyciąć go możliwie „czysto” .

Najnowszy zespół inform acji pierwszego rodzaju zaw arty jest w pracy E c h o l s a i M u r i a l d o (30). Dane przedstaw ione w tej publikacji w formie tabeli są podstawą naszej m apy fizycznej genomu bakteriofaga 1 (Ryc. 5, część górna). W spomniani wyżej autorzy podają przybliżone współrzędne każdego genu na mapie, a więc położenie jego lewej i praw ej granicy, w odniesieniu do długości cząsteczki DNA faga l (100%), zawierającej około 47 000 par nukleotydow ych (31). W spółrzędne te pochodzą z badań elektronom ikroskopowych heterodupleksów , zrenaturow anych cząsteczek DNA w których jedna z nici wykazuje scharakteryzow ane genetycznie delecje, oraz z badań m asy cząsteczkowej białek kodowanych przez określone geny faga A. Z założenia, że trzy nukleotydy kodują jeden aminokwas i że średnia masa reszty aminokwasowej wynosi 107 wynika, że np. białko o masie cząsteczkowej 16 760 jest kodowane przez gen, k tóry na mapie fizycznej znajm uje 1% długości l DNA. E c h o l s i M u r i a l - d o zw racają uwagę na to, że pewne rejony 1 DNA są „przesycone” , tzn. kodują większą liczbę aminokwasów, niż to wynika z liczby nukleotydów.

http://rcin.org.pl

[9] M APA R E ST R Y K C Y JN A *. D N A 359

Sugerują oni, że jest to przesycenie pozorne, w ynikające z błędów oznaczania m asy cząsteczkowej białek faga l m etodą elektroforezy w żelu akryloam idow ym z siarczanem dodecylu. W istocie, m asy cząsteczkowe zarówno represora cl (32) jak i represora Cro, oznaczone ze znanej sekwencji aminokwasowej, były niższe (33, 34). To samo dotyczyło głównego białka ogonka, determ inowanego przez gen V, którego masa cząsteczkowa została obliczona ze składu aminokwasowego (35). Anorm alnej ruchliwości białek faga 1 w żelu akryloam idowym z siarczanem dodecylu poświęcona została ostatnio oddzielna praca (36). E c h o l s i M u r i a l d o przyjm owali, że w niektórych przypadkach masa cząsteczkowa białka jest niższa (o 3 do 10°/o) niż to w ynika z analizy elektroforetycznej i w tedy gen białko to determ inujący mieści się pomiędzy sąsiednimi genami. Przedstaw iony problem staje się jednak m niej istotny, gdy przyjąć na podstawie n a jnowszych badań, że cząsteczka A. DNA składa się nie z 47 000, lecz z 49 000 par nukleotydow ych (P. P h i l i p p s e n i R. W. D a v i s , cyt. wg 37), a co za tym idzie, gen zajm ujący l°/o długości l DNA może kodować białko o masie cząsteczkowej 17 480. Pomimo tej popraw ki (o 4,3°/o), pozostaje w yraźne przesycenie rejonu gam-kil. Być może w ystępuje tu zjawisko translacji z przesuniętej fazy odczytu, a więc kodowanie dwu białek przez jeden gen, znane z badania fagów $X174 (38) i G4 (39). E c h o l s i M u r i a l d o (30) podają współrzędne genu z dokładnością do ± 0 ,2% długości 1 DNA. Mniej dokładnie określone jest — według nich — położenie następujących genów:

P i, redX, kil, c lii, rai, t L, t M , rex, t R2, p'n, S, R

Po ukazaniu się artyku łu przeglądowego wyżej wym ienionych autorów ukazała się praca, dotycząca m iejsc term inacji transkrypcji startu jącej z prom otora pL (40). W ykazano w niej, że oprócz term inatora tL (aktualnie ¿li) w ystępują dwa nowe term inato ry t L2 i tL3. T erm inator tL1 został zlokalizow any bardziej na lewo, w m iejscu o współrzędnej 71,1%, co sprawia, że granica genu rai w Ryc. 5 uległa skorygow aniu z praw ej strony. W pracy tej zostały określone również współrzędne term inatorów tL2 (68,9%) i tL3 (64,4%). Lokalizacja tL2 w ym agała niewielkiej (o 0,1%) korek ty lewej granicy genu c lii. Należy jednak zwrócić uwagę, że mapa rejonu att— N przedstaw iona przez S z y b a l s k i c h (41) nie zgadza się z m apą E c h o l s a i M u r i a l d o (30); S a l s t r o m i S z y b a l s k i (40) uw ażają w związku z tym, że term inato r tL3 mieści się w genie redX (exo ), a term inato r tR2 w genie c lii.

Zgodnie z wynikam i analizy restrykcy jnej rejonu Q— p'R (17) prom otor Pk został przez nas przesunięty w lewo, na miejsce o współrzędnej 92,2% X DNA. /

R. Y o u n g , M. S y v a n e n i wsp. (inform acja bezpośrednia) w yk ry li nowy gen, Rz, biorący udział w końcowym etapie cyklu życiowego

http://rcin.org.pl

360 K. TA YLO R , A . TAYLOR [10]

faga X— lizie komórki. Gen ten mieści się w przedziale od 95,1% do 97,9% X DNA, a więc na praw o od genu R, k tó ry determ inuje syntezę tzw. endolizyny faga X. Być może dwa działające na m ureinę enzymy lizatu kom órek E. coli po zakażeniu fagiem X — endopeptydaza (42) i trans- glikozylaza (43) są determ inow ane przez geny Rz i R.

Masy cząsteczkowe białek kodowanych przez geny lizy: S, R i Rz nie zostały określone eksperym entalnie. B l a c k i H o g n e s s (44) wyizolowali ,,lizozym faga X”, jako białko o masie cząsteczkowej 17 900 (45) nie wiadomo jednak, jaka jest swoistość tego enzymu, oraz k tóry gen go koduje. Nieznane są m asy cząsteczkowe dwu innych białek „późnych” — N u l i I, a także kilku białek „wczesnych” — xis, kil, c lii, rai. Natomiast w yniki uzyskane dla białka syntetyzow anego in vitro i kodowanego przez gen O zostały potwierdzone in vivo w m inikom órkach: to białko replika- cyjne posiada masę cząsteczkową 34 000 (46).

B rak miejsca nie pozwala na opisywanie funkcji wszystkich genów; w poprzednim rozdziale zostały omówione jedynie te, które odgrywają rolę w regulacji transkrypcji. Zainteresow anego czytelnika odsyłamy do ostatniego artyku łu przeglądowego (30).

Istn ieje wiele natu ralnych m utantów delecyjnych, insercyjnych lub substytucyjnych faga X. M utanty te mogą być dogodnym m ateriałem w yjściowym przy klonowaniu fragm entów X DNA do w ektorów plazmidowych. N ajbardziej znane są delecje w nieistotnych dla rozwoju faga re jonach b (np. Xb2 od 45,3 do 57,3°/o) (47) i ninR, pomiędzy P i Q (np. Xnin5 od 83,7 do 89,5%) (48). Ostatnio coraz więcej wiadomo o lokalizacji poszczególnych sekw encji insercyjnych (IS) i transpozonów w różnych m iejscach X DNA (49, 50, Y o u n g i S y v a n e n , inform acja bezpośrednia). Nawet bardzo długie fragm enty X DNA mogą być zastąpione DNA bak tery jnym (np. Xpbio256 od 57,3 do 72,5%) (41), (np. X pgal8 od 42,4 do 57,3% i Xpiac5 od 39,5 do 48,0%) (50), bez uszkodzenia funkcji istotnych dla rozm nażania się faga X. Dodatkową możliwość stw arzają hybrydy faga X z innym i fagam i lam bdoidalnym i (z fagiem P22 włącznie), w których fragm ent X DNA został wym ieniony na spełniający podobne funkcje fragm ent DNA faga pokrewnego. N ajbardziej znane są tu X imm434 (od 73,5 do 79,1%) i Ximm21 (od 71,1 do 79,8%) (1). Oczywiście wymienione m utacje mogą usuwać istniejące w X DNA miejsca atakow ane przez endonukleazy restrykcyjne, lecz (z w yjątkiem delecji) mogą także wprowadzać nowe takie miejsca. Należy się tu również liczyć z usuw aniem elem entów regulacji transkrypcji faga X, jak i z wprowadzaniem nowych promotorów i term inatorów . W niniejszym artyku le jesteśm y w stanie zaledwie wska-

0 zać na to zagadnienie, dzięki k tórem u bakteriofag X jest szczególnie bogatym źródłem elem entów kontroli ekspresji genów. Dla zachowania przejrzystości naszej m apy X DNA nie w prowadzam y do Ryc. 5 inform acjio w spółrzędnych poszczególnych delecji, insercji i substytucji.

http://rcin.org.pl


II-2. Mapa restrykcyjna

P rzejdźm y z kolei do problem u wyboru właściwego enzym u do w ycięcia pożądanego fragm entu X DNA. W ostatnich kilku latach byliśmy, i jesteśm y nadal, świadkam i izolacji endonukleaz restrykcyjnych z drobnoustrojów różnych gatunków (51). Enzym y te (endonukleazy res try k cyjne typu II) przecinają cząsteczkę DNA w miejscach, o ściśle określonych sekw encjach nukleotydowych. W w yniku działania określonej endonukleazy restrykcy jnej na zespół identycznych cząsteczek DNA (np. X DNA) pow staje więc szereg jednorodnych klas fragm entów DNA. Masy cząsteczkowe fragm entów DNA z poszczególnych klas określa się bądź m ierząc wobec odpowiednich standardów ich ruchliwość elektroforetycz- ną, bądź też ich długość w m ikroskopie elektronow ym . Stosując różne podejścia eksperym entalne, można znaleźć kolejność, w jakiej „ restryk cy jne” fragm enty w ystępowały w wyjściowej, niezdegradow anej cząsteczce DNA. O trzym ana w ten sposób m apa restrykcy jna DNA mówi więc nam , w k tórych m iejscach liniowej cząsteczki zachodzi cięcie określoną endonukleazą restrykcyjną. DNA bakteriofaga X jest najczęściej stosow anym substra tem do scharakteryzow ania nowowyizolowanej restryk - tazy, zwłaszcza w tedy, gdy swoiste dla enzymu sekwencje nukleotydowe nie w ystępują zbyt często i, co za tym idzie, ilość pow stających fragm entów DNA nie jest zbyt duża. Pomimo tego do tej pory ukazała się tylko jedna praca kom pilacyjna, podająca zbiorczo, w formie mapy, efekt działania na X DNA czterech endonukleaz restrykcyjnych: H indlll, HpaI, Bam HI i EcoRI (50). Zapełnienie tej w łaśnie luki (Ryc. 5) jest zasadniczym celem niniejszego artykułu .

W arto zdać sobie sprawę ze stopnia dokładności, z jaką podawane są inform acje dotyczące m iejsc X DNA przecinanych przez endonukleazy restrykcy jne . Uważa się, że oznaczanie długości w m ikroskopie elek tronowym jest obarczone najm niejszym błędem, i uzyskane w ten sposób m apy restrykcy jne EcoRI (52) i H ind lll (53) stanow iły nieraz układ odniesienia przy sporządzaniu map restrykcy jnych innych enzymów. Dopiero jednak poznanie pełnej sekwencji jednoniciowego DNA faga $X174, k tó ry składa się z 5386 nukleotydów (38), pozwoliło na zastosowanie jego dwuniciow ej form y replikacyjnej (RFII), jako bezwzględnego standardu długości. W ażnym było również to, że długość jego cząsteczki była zbliżona do przeciętnej długości fragm entu restrykcyjnego X DNA. Porów nanie położenia miejsc cięcia, uzyskanych tą m etodą (54, P h i l i p p s e n i D a v i s , cyt. wg 37) z wcześniej uzyskanym i wartościam i dla EcoRI (52) i H in d lll (53) przedstaw ione jest w tabeli 1.

M niej dokładną, choć częściej stosowaną m etodą oznaczania masy cząsteczkowej fragm entu X DNA jest elektroforeza w żelu akryloam ido- w ym lub agarozowym. Już w 1975 r. wykazano, że lepszą zgodność po

http://rcin.org.pl

362 K. T A YLO R , A. TAYLO R [121

między ruchliwością elektroforetyczną, a wielkością fragm entu DNA daje elektroforeza agarozowa (52). Stosując odpowiednie w arunki e lektroforezy, można było doprowadzić do liniowej zależności między ruchliwością elektroforetyczną a logarytm em m asy cząsteczkowej (55). Masa określonego fragm entu X DNA, oznaczona na podstawie tej zależności, może być jednak obarczona dość znacznym błędem, gdyż specyficzny skład zasad, a może naw et specyficzna sekwencja nukleotydow a może wpływać na ruchliwość elektroforetyczną (56, 57). Gdy DNA z delecyjnych lub substy tucyjnych m utantów X służy jako substrat, to dołącza się błąd oznaczania granic delecji lub substy tucji w m ikroskopie elektronow ym . Biorąc dodatkowo pod uwagę błąd zaw arty w oznaczeniu m asy cząsteczkowej stosowanych standardów , R o b i n s o n i L a n d y (55) oceniali, że dokładność m etody elektroforetycznej nie jest lepsza od ± 10% m asy fragm entu, a więc np. w przypadku fragm entu o długości 10% X DNA może wynosić co najm niej ± 1% X DNA. Dopiero ostatnio dostępne sq bezwzględne standardy mas cząsteczkowych DNA w postaci fragm entów restrykcyjnych DNA form y RFII faga $ X 174 (38) lub plazm idu pBR322 (58).

Tabela 1Porównanie współrzędnych (% długości X DNA) miejsc cięcia DNA faga A endonukle- azą restrykcyjną, oznaczanych przy pomocy mikroskopu elektronowego wg 52, 53, 54

£«>RI44,544,3

54,354,16

65,665,67

81,081,01

93,192,90

Hindlll48,5 52,2 56,8 76,5 77,6 77,8 91,248,0 52,03 56,63 76,24 77,38 77,66 91,17

Z przedstaw ionej wyżej analizy wynika, że m apy restrykcy jne niek tórych enzymów na rycinie 5 mogą być obarczone dość znacznym błędem. Dla bardziej precyzyjnego zlokalizowania interesującego nas cięcia należałoby określić jego odległość od najbliższych m iejsc cięcia EcoRI lub H ind lll, badając masę/długość pow stających fragm entów wobec standardów bezwzględnych.

Rycina 5 zawiera z konieczności tylko te inform acje, które dotyczą endonukleaz restrykcy jnych tnących X DNA na niew ielką liczbę fragm entów. Endonukleazy w ytw arzające wielką liczbę m ałych fragm entów zostały w ykorzystane do analizy niektórych specjalnie in teresujących rejonów X DNA. Badania te z reguły stanow iły wstęp do określenia sekwencji nukleotydow ej danego rejonu X DNA, i w odnośnych publikacjach znajdują się odpowiednie szczegółowe m apy restrykcyjne.

W m apach tych zlokalizowane są, i to z większą precyzją, n iektóre cięcia endonukleolityczne przedstaw ione na rycinie 5.

http://rcin.org.pl

K . T a y lo r , A . T a y lo r , (1979), Post. B iochem ., 25, 351—371.

Hyc. 5. Mapa fizyczna DNA bakteriofaga X.U g ó ry : m a p a g e n e ty c z n a X D N A , c z ą s te c z k i o m a s ie o k o ło 31,8X:106, s k ła d a ją c e j s ię z o k o ło

49.000 p a r n u k le o ty d ó w (P . P h i l i p p s e n i R. W. D a v i s , c y tt. w g . 37). Z a z n a c z o n e są m ie js c a k o n t r o l i t r a n s k r y p c j i : o p e r a to r y (o), p r o m o to r y (p), t e r m in ta to r y (t), a ta k ż e m ie js c e o r ig in (o ri) o d k tó re g o z a c z y n a s ię w c z e s n a , d w u k ie ru n k o w a ( ty p u i te ta ) r e p l ik a c ja l D N A . Z a z n a c z o n e są ró w n ie ż w s z y s tk ie d o b rz e u d o k u m e n to w a n e g e n y s t r u k t u r a l n e fa g a K d e t e r m in u ją c e s y n te z ę o d p o w ie d n ic h b ia łe k , p rz y c zy m d łu g o ś ć p r o s to k ą tó w je s t w p rz y b l iż e n iu p ro p o r c jo n a ln a d o w ie lk o ś c i b ia łe k . J e d y n ie m a s y c z ą s te c z k o w e b ia łe sk k o d o w a n y c h p rz e z g e n y N u l, I , x is , k i l , c l i i , ra i, S , R , R z n ie z o s ta ły o k re ś lo n e e k s e p ry m e n t;a ln ie .

P o n iż e j : z e s ta w m a p r e s t r y k c y jn y c h X D N A , o k re ś lo n y c h d la k a ż d e j z p r z e d s ta w io n y c h s z e s n a s tu e n d o n u k le a z r e s t r y k c y jn y c h . W p ie rw s z e j k o le jn o ś c i u m ie śśc iliśm y 5 e n zy m ó w , k tó r e ro z p o z n a ją ty lk o p o je d n y m m ie js c u w D N A p la z m id u pBR322. Z p rr a w e j s t r o n y : o d s y ła c z e do

l i t e r a tu r y . P o d k r e ś lo n e są . o d s y ła c z e do ty c h w y b ra n y c h a r b i t r a ln ie p u b l ik a c j i , z k tó r y c h p o c h o d z ą p o z y c je c ię ć n a n ie s io n e n a m a p ę , p o z o s ta łe k i e r u j ą do p r a c w y k o n a n y c h n ie z a le ż n ie ; p o d a n e w n ic h p o z y c je c ię ć (z e s ta w io n e p o n iż e j) są z az w y c z a j n ie c o ró ż n e . W sz y s tk ie p o z y c je c ię ć są p o d a n e w % d łu g o ś c i X D N A , z a te m w p rz y p a d k a c h , g d y w c y to w a n e j p r a c y p o d a w a n o w y łą c z n ie l ic z b ę p a r z a s a d lu b m a s y c z ą s te c z k o w e f r a g m e n tó w o ra z ic h k o le jn o ś ć , z a s to so w a liś m y p rz e l ic z e n ie p r z y jm u ją c s u m ę m a s f r a g m e n tó w za 100%. N ie k tó re c ię c ia (P s t l i H in d l l ) z a z n a c z o n o w o d p o w ie d n ic h m ie js c a c h m a p y s t r z a łk a m i b ez lic z b o k re ś la ją c y c h p o z y c ję , p o n ie w a ż a u to r z y (84, 55, 79) z a z n a c z y li je d y n ie ic h p rz y b liż o n e p o ło ż e n ie n a ry s u n k u . W o b s z a ra c h z a z n a c z o n y c h f a l is tą l in ią n ie p e w n a je s t k o le jn o ś ć f r a g m e n tó w r e s t r y k c y jn y c h , a z a te m i p o z y c ję c ię ć . N ie w y k o rz y s ta n e p r z y k o n s t r u k c j i m a p y r e s t r y k c y jn e j p o z y c je c ię ć en d o - n u k le o l i ty c z n y c h są j a k n a s tę p u je : E co R I (52) 44,5, 54,3, 60,6, 81,0, 93,1, H in d l l l (53) 48,5, 52,2,

56.8, 76,5, 77,6, 77,8, 91,2, B a m H I (80) 13, 46, 58,8, 71, 85,5%, S a l i (83) 67,7, 68,6%, P s tl (85) 5,8, 45,6,54.8, 65,7, 75,5%, A v a l (87) 10,2, 40,2, 43,8, 58,4, 65,2, 69,4 o ra z p o m ię d z y 78,8 a 79,3 i p o m ię d z y 82,7 a 83,1%, S m a l (89) 40,5, 65,3%, 82,3%, B grlll (90) 0,8, 46,9, 73,5, 79,1, 80,7%, X h o l (87) 69,4%, S s t l (cyt. w g 37) 51,6, 53,8%. D o k ła d n a lo k a l iz a c ja c ię ć j e s t m o ż liw a ty lk o w o b s z a ra c h o z n a n e j s e k w e n c j i n u k le o ty d o w e j . D la k i lk u r e jo n ó w g e n o m u X z o s ta ły s p o rz ą d z o n e szc z eg ó ło w e m a p y r e s t r y k c y jn e i o z n a c z o n e s e k w e n c je n u k le o ty d o w e . S ą to : r e jo n o ta c z a ją c y m ie js c e a t t (59, 60, 83), odc in e k o d N do P (13, 61—68), n ie d u ż y o d c in e k w re jo n ie Q (17) o ra z k r ó tk ie o d c in k i p rz y k o ń c a c h k o h e z y jn y c h le w y m i p ra w y m (69). Z e w z g lę d u n a ła tw o ś ć o t r z y m y w a n ia d u ż y c h ilo śc i fa g a X, do s p o rz ą d z a n ia m a p r e s t r y k c y jn y c h s to s o w a n y j e s t z a z w y c z a j je g o m u ta n t XcIts857indSam 7, k tó r y d z ię k i m u ta c j i in d w g e n ie c l z a w ie ra d o d a tk o w e m ie js c e c ię c ia H in d l l l o z n a c z o n e n a m a p ie g w ia z d k ą (55).

0 5 to 15 2(0 25 ........... 30 -------------ę -------------------40------------------- 45------------------- SO-------------------55------------------- 60-------------------65 ......... .. 70 75 80 85 90 95 ,0 0 V

Nul W ' Nu3 ‘ FI " M - f *j* t , gam kil rai o, c™ cl ' 1 1 1 1 I 1 ____ _______ _______ ______- .................. - 1 LP1 13 \ .0-1 Pl m Pm Pf Po cri 1

F T “ a I I B 1 c M D Ï E |F I | ‘ 1 Z I U I V || G I l f H f t L 1 K j j j -------------_3_-----------------1 b L l nt 1J (redxjred B] - j [ | cM H (Ñ) [ r e x ] | d )| i f l f 0 1 P 1 f o “) [ S R ® ¡

- i— i— i— i— r ' ' i i i i H - i , . a \ i - i r , — ¡ 7 ^ — Í - »37, 52

Hindi 1 I 1 I ¡I 1 1 , } < & ! ,œ -m 1 ,56-6| ¡ • j ^ M n e o ; 1 ł n „ , U M E 37, 54, 53BamHI 1 1 1 tli,4 I M 1 1 1 i Í4$,6 i 1 I , , 1 t?'-3 i ¡ 1 W l 1 I 1 BamHl 81,80

53,1 i 1 J ! ! 11 cięć w tiilm reionie ! I 1 ł I ) ! ) ł 1 i jl ' ' ! j i ! ¡ l 1 ¡ Sal1 82, 83pet T i ! 1 '* CI^C W ‘■tÿn reJon,e J ________ !_________ ____L_J---- -- -------- — 1___—L.---- ----- I---- I ----------------- f-------------------------------------------- L___________l i _ _ _ _ < i T V i 1 [ 1 nc4T

f-r—7------------ — -------- *------------- i—------- V—r----- !— -----------T i— ff i i \ k _ c 1 , i L „ . łJ0K 4 L . , f i . - . i ^ r i „ C f i 1 „i i i i J i i T " ~~k~~T \ f i --------r l ----------------- t— f----------------------1---------------------- 1 84,85Uînrlïï ifruiłi* i 1- 12.ót 113.4 I ł ł II t __T___ ! Î25.5 T29,g ¡32,4 136,4 LES-----!-----Î 43.3 [ ¡46,1 *48,5 ¡ 55,4Î ¡56,5 Î59/7 ,66,3t t t 168,8 73,01 173,6 t7&4t79.5 Ri,nł łffl.a ł f 1 f 4 1 1 findE 55,79I-Ipa T 1 łl,S I ■ I 12.5ł łl3,4 L ...............Í L J --------------------- L'25,5 | T32,4 j i 1 Ii ’1 ' 1 56,5 1 ! i66'3/ *67>° J 73-°* ¡ j 81.9Î łs2,3 I 1 j 99’6 | upsłj 55, ZR

Aval j ! V * j ! 1 L ™ ! i -3 82'4 i ! i *“ 1 86,87

XmaI !■ ! i i ! 1 ' f « e ! 1 1 ! ! t i “ ' 1 1 l 814 i ! ! XmaI 8688,89

Bgin ! lo,8 1 I i I j 1 i ! ! t47-° ¡ 1 1 i i i ’? W 80,3 ' i 1 1 Bgll 83,90

BluI' H ' ¡ I II i I ¡ ł,s„ t , L ! i ! ! ! T 1 ! ' !BIUI' 1<ho1 83,87

KpnI ! 1 1 ! 1 1 7 ' ! fs,a Jo ! ¡ 1 ! KpnI83

SacI’SstI ! 1 ! ! „o««, It«, i f 1 1 i ! ! 1 !sa0l'sstl 83,3783

«■ai i T ! ! 1 i ! 1 ! ! ! ,H0 ! ■ ! í 1 ! ! ! T l 1 « » i 83

http://rcin.org.pl


Poznano już sekwencję nukleotydow ą rejonu zawierającego miejsce att, tak istotne dla rekom binacji pomiędzy X DNA a DNA E. coli (59, 60,83); zaawansowane są prace nad sekwencją genu N (N. Franklin , inform acja bezpośrednia). Przedm iotem intensyw nych badań była sekwencja pLoL— rex—cl—PmOrPri (13, 61, 62, 63, 64), a okolicom term inatora tR1 obejm ującym część genów ero i c li została poświęcona oddzielna praca (65). W dwu ośrodkach zajęto się m iejscem inicjacji replikacji X DNA, ori, leżącym w ew nątrz genu O (66, 67). Poznana została również całkowita sekw encja genów ero i c li (68), a sekw encja genu P czeka na opublikowanie (E. S c h w a r z, inform acja bezpośrednia). A więc pełna sekwencja od genu N do genu P (około 10% X DNA) została rozszyfrowana. Został zm apowany rejon Q—p ’R i oznaczono sekwencję nukleotydową odcinka determ inującego początek transk rypcji późnej (17). Ostatnio poznano jeszcze krótkie sekwencje w. pobliżu obu końców liniowej cząsteczki X DNA (69).

W prowadzenie nowych, efektyw nych m etod sekwencjonowania DNA (70) umożliwia szybkie postępy w tej dziedzinie. Na przykład J. G. S u t - c 1 i f f e z pracow ni W. G i l b e r t a pisze (71), że sekwencję genu oporności na am picylinę plazmidu pBR322 (1100 par nukleotydowych) oznaczył w okresie od m arca do sierpnia 1977 roku. Porów nanie zaś sekwencji nukleotydow ej z sekwencją aminokwasową, ustaloną przez innych autorów nastąpiło 25 sierpnia 1977 (przy herbatce), wykazując pełną zgodność. W ydaje się więc, że poznanie pełnej sekw encji nukleotydow ej X DNA nie jest spraw ą dalekiej przyszłości. W oparciu o znajomość sekw encji swoistych dla każdej endonukleazy restrykcy jnej, będzie można w tedy sporządzić pozbawioną błędów mapę restrykcy jną X DNA.

III. Konstrukcja plazmidów zawierających fragmenty 1 DNA

W rozdziale tym pragniem y przedstaw ić dwa przykłady wykorzystania elem entów kontroli transk rypcji X DNA dla zwiększenia ekspresji genu wklonowanego w w ektor plazmidowy. Znam ienne jest to, że dotyczą one prac opublikowanych niedawno, w 1978 roku.

W pierwszej z nich (72) autorzy zam ierzali wykorzystać silny promotor pL faga X, anty term inatorow ą aktyw ność białka N, a także możliwość w łączania/wyłączania transk rypc ji s ta rtu jące j z pL przy pomocy term o- labilnego represora clts. Endonukleaza EcoRI wycina z X DNA fragm ent (od 65,7 do 81,0%), zaw ierający rejon N —pLoL—cl (Ryc. 5), lecz fragm ent ten zawiera również gen kil, którego produkt w ytw arzany w nadm iarze jes t zabójczy dla kom órki gospodarza. W m utancie substytucyjnym X pbio256 rejon X DNA (od 57,3 do 72,5%) obejm ujący gen kil, zastąpiony jes t DNA bakteryjnym ; miejsce cięcia EcoRI określone współrzędną 65,7% oczywiście zanika, pojawia się natom iast nowe, w pobliżu 71%.

http://rcin.org.pl

364 K. T AYLO R, A. TAYLO R [14]

Te „strategiczne” rozważania doprowadziły do wyboru DNA faga X pbio256c!tscro~ jako substra tu endonukleazy EcoRI (Ryc. 6); m utacja w genie cro m iała na celu uniknięcie ham ow ania transk rypcji przez białko Cro.

Ryc. 6. Fragment X DNA wycinany endonukleazą EcoRI (strzałki) z DNA bakteriofaga X pbio256cItscro~.O b ja śn ien ie s y m b o li w te k śc ie .

Jako w ektor plazm idowy w ybrany został pCR l, plazmid w ystępujący w stosunkowo dużej ilości kopii w komórce E. coli, nadający jej oporność na antybiotyk kanam ycynę i posiadający tylko jedno miejsce wrażliwe na endonukleazę EcoRI. M ieszaninę produktów traw ienia obu DNA: X pbio256cItscro~ i pCRl potraktow ano ligazą polinukleotydową. Kom plem entarne w stosunku do siebie, kohezyjne końce fragm entów DNA wytworzone działaniem EcoRI mogły się więc połączyć wiązaniam i kow alencyjnym i. W tym wypadku koliste, zdolne do replikacji s tru k tu ry mogły się wytworzyć (i) przez rekonstrukcję kolistego DNA plazmidu pCRl, bądź (ii) przez włączenie do tego plazm idu (w m iejscu swoistym dla EcoRI) dowolnego fragm entu 1 DNA. W czasie inkubacji takiej m ieszaniny z odpowiednio przygotowanym i bakteriam i, pewna ilość cząsteczek DNA wnika do komórek, gdzie może replikować się i m anifestować swoją obecność (transform acja). Przez posiew na podłoże zawierające kanam ycynę wyselekcjonowano kanam ycyno-oporne transfo rm an ty zawierające plazm id pCRl i jego pochodne. Represor cl nadaje bakteriom oporność na zakażenie bakteriofagiem A, zatem przez kolejny posiew na podłoże przesycone zawiesiną tego faga wyselekcjonowano te komórki, które zaw ierały plazmid pCRl z wklonowanym fragm entem l DNA zaw ierającym gen cl (Ryc. 7).

Podobny tok m yślenia i m anipulacji laboratory jnych doprowadził do uzyskania szczepu bakteryjnego, zawierającego plazm id pCRl z wklonowanym genem iks — nazw ijm y tak, dla uproszczenia, gen, którego ekspresja m iała zostać zwiększona. Oba skonstruow ane in vitro plazm idy zostały namnożone i wyizolowane w ilościach preparatyw nych. W każdym z nich na krańcach wklonowanego fragm entu DNA istn iały miejsca w rażliwe na EcoRI, zatem podziałanie tym enzymem na m ieszaninę obu plazmidów doprowadziło do w ytw orzenia trzech liniowych fragm entów DNA: iks , N —pLoL—clts, oraz pCR l. Jednym z produktów kolejnego działania

http://rcin.org.pl


ligazą polinukleotydow ą był kolisty DNA plazmidowy, w którym fragm ent 1 DNA sąsiadował z fragm entem zaw ierającym gen iks w orientacji przedstaw ionej na rycinie 8.

Ryc. 7. Klonowanie fragmentu X DNA (linia pogrubiona) zawierającego gen cl do plazmidu pCRl.S trz a łk i w sk a zu ją na sek w e n c je n u k le o ty d o w e w r a ż liw e na en d o n u k le a z ę EcoR I: 5'G IAATTC3'

3'CTTAA | G5'

Ryc. 8. Plazmid pCRl z wklonowanym fragmentem h DNA (N-pLoL-cIis) i fragmentem DNA zawierającym gen iks. In a k ty w a c ja c ie p ln a rep reso ra c l w y w o łu je tr a n sk r y p c ję z p rom otora p L p rzy czy n ia ją cą s ię do z w ięk sz o n e j e k sp r e s ji g en u iks.

Bakterie zawierające ten złożony plazm id syntetyzow ały bardzo in ten sywnie białko Iks, zwłaszcza w podwyższonej tem peraturze. Autorzy udowodnili, że wynikło to (i) z występowania genu iks w kilkudziesięciu kopiach na komórkę i (ii) z intensyw nej tran sk rypc ji startu jącej z silnego prom otora pL w w arunkach inaktyw acji cieplnej represora cl. Białko N faga l powodowało, że RNA-polimeraza nie reagow ała na sygnały ter- m inacji znajdujące się na drodze od pL do genu iks o długości około 3000 par nukleotydow ych (6°/o X DNA).

W drugiej publikacji, k tórą zam ierzam y przedstaw ić dla przykładu (73), autorzy wklonowali do plazmidu pBR322 rejon replikacyjny A DNA,


366 K. TA YLO R , A . TAYLO R [16]

ori—O—P, a elem enty transk rypc ji X DNA, N —pLoL—clts—oRpR zostały w ykorzystane do aktyw acji replikacji z ori 1, a tym samym do zwiększenia ilości kopii skonstruow anego z pBR322 plazmidu.

P rzy pomocy endonukleazy BamHI został wycięty z X DNA fragm ent (od 71,3 do 86,5°/o) zaw ierający rejon od N do P (Ryc. 5), k tó ry następnie został wklonowany do plazm idu pBR322. Ten niedawno otrzym any plazmid (74) posiada wiele cech wartościowych w inżynierii genetycznej, m.in. nadaje komórkom oporność na am picylinę i tetracyklinę i zawiera po jednym tylko m iejscu w rażliw ym na endonukleazy EcoRI, H indlll, BamHI, Sali i P stl. Cięcie BamHI i w prowadzenie w to miejsce ,,obcego” fragm entu DNA inaktyw uje operon oporności na tetracyklinę, co bardzo ułatw ia selekcję poszukiw anych rekom binantów . W ten sposób powstał więc plazm id zaw ierający dwa m iejsca inicjacji replikacji: jedno plazm idowe, orip, a drugie fagowe, ori l (Ryc. 9). W tem peraturze 32°C, gdy w ytw arzany represor clts zachowywał swą aktyw ność, replikacja z ori X nie zachodziła. Plazm id mógł się replikować jedynie z orip. Natom iast po przeniesieniu do 42°C, inaktyw acja represora clts umożliwiała tra n skrypcję z pL i pR, syntezę antyterm inatorow ego białka N, które przedstaw ionym już w rozdziale I m echanizm em aktyw ow ało replikację z ori X. I rzeczywiście, autorzy stw ierdzali znacznie większą liczbę kopii skonstruowanego przez siebie plazm idu w podwyższonej tem peraturze.

Ryc. 9. Plazmid pBR322 z wklonowanym fragmentem DNA (linia pogrubiona).S trza łk i w sk a zu ją n a s e k w e n c je n u k le o ty - d o w e w r a ż liw e na e n d o n u k le a z ę B am H I. W o b n iżo n ej tem p era tu rze in ic ja c ja r e p lik a c ji za ch o d z i w y łą c z n ie z o r ig in p lazm idu pBR322, orip . In a k ty w a c ja c iep ln a rep resora c l w y w o łu je c ią g r ea k cj i, k tó ry c h e fe k tem je s t a k ty w a c ja r ep lik a c ji s ta r tu ją c e j z ori X.

Genem, którego ekspresję zam ierzano zwielokrotnić w oparciu o przedstawioną wyżej strategię, był gen x th E. coli, determ inujący syntezę egzonukleazy III. Uprzednio autorzy stw ierdzili, że gen ten w ystępuje w jednym z fragm ęntów DNA E. coli, otrzym anych działaniem endonukleazy BamHI. Dla zwiększenia szans izolowania pożądanego rekom bi- nanta, z poprzednio opisanego plazm idu (Ryc. 9) usunięto jedno z dwu m iejsc wrażliwych na BamHI; pożądaną delecję otrzym ano stosując odpowiednie endonukleazy restrykcyjne. Po wklonowaniu genu x th do tak skonstruow anego plazm idu okazało się, że bakterie zaw ierające ten plaz-

http://rcin.org.pl


mid w ytw arzają w 42°C 125 razy więcej egoznukleazy III od bakterii zaw ierających gen x th zlokalizowany w chromosomie.

IV. Uwagi końcowe

Oczywistym jest, że inne elem enty kontroli transk rypcji X DNA i inne sposoby ich sprzężenia mogą być w ykorzystane w przyszłości do osiągnięcia możliwie najwyższej ekspresji wklonowanego genu. Można się spodziewać, że np. w yjątkow o silny prom otor genów późnych, p'R odegra tu istotną rolę. Z pewnością dalszy rozwój badań pójdzie drogą „czystego” wycinania krótkich fragm entów zaw ierających wyłącznie interesu jący elem ent transk rypcji (a więc np. prom otor, bez znajdujących się w pobliżu term inatorów ) i łączenia tych fragm entów ze sobą. Być może, interesującym byłby np. układ clts—oRpR—Q—p'R.

Ekspresja genu zależy nie tylko od regulacji transk rypcji tego genu, ale i od tych w szystkich mało poznanych procesów, którym podlega mRNA przed, w czasie i po translacji, oczywiście również i od regulacji translacji. W ydaje się, że i w tej dziedzinie biologia m olekularna i inżynieria genetyczna będą mogły skorzystać ze swego ulubionego objektu badawczego — faga X.

Nietrwałość większości prokariotycznych mRNA może zmniejszać efektywność ekspresji odpowiednich genów. Pomiędzy genami xis i redX znajduje się rejon hin, k tóry odgrywa rolę w stabilizacji mRNA faga X (D. C o u r t, cyt. wg 50) a obserwacje z naszej pracowni sugerują, że X mRNA syntetyzow any w zakażonych fagiem m inikom órkach jest w yjątkow o trw ały.

Zastanaw iająca jest również nadzwyczaj efektyw na i selektyw na synteza niektórych białek — składników dojrzałej cząstki fagowej. Na przykład białko kodowane przez gen D syntetyzow ane jest 870 razy efektyw niej od białka genu A (75). Nie wiadomo, co jest przyczyną tak efektyw nej syntezy białka d. Z innych modeli wiadomo, że dla w ydatnej tra n slacji konieczne jest występowanie w mRNA m iejsca wiążącego rybosomy, postulowanego po raz pierwszy przez S h i n e i D a l g a r n o (76). W E. coli miejsce to obejm uje kodon inicjacji translacji AUG (lub GUG) i sekwencję kom plem entarną do sekw encji końca 3’ rybosom alnego RNA 16s. Poznane do tej pory sekwencje S h i n e - D a l g a r n o (SD) składają się z 3— 9 nukleotydów i poprzedzają kodon inicjacji translacji o 3— 12 nu- kleotydów. W pierwszej z publikacji przedstaw ionych w poprzednim rozdziale (72) autorzy sugerują możliwość występowania sekwencji SD przed genem iks, co może tłum aczyć w yjątkow o w ydajną ekspresję tego genu w plazmidzie przedstaw ionym na Ryc. 8. Sekwencje takie znaleziono i w X DNA, można się zatem spodziewać, że fragm enty restrykcy jne X DNA z sekwencjam i SD znajdą zastosowanie w inżynierii genetycznej.


368 K. TAYLO R, A. TAYLOR [18]

Coraz bliższa realizacji w ydaje się idea w ykorzystania szybko zwiększającej się puli krótkich fragm entów restrykcy jnych DNA o znanej sekwencji nukleotydowej do chemicznej syntezy fragm entów o zaprogramowanej sekwencji. Swoiste dla prokariota elem enty kontroli tran sk ry p cji/translacji w ystępujące w tych fragm entach m ożnaby na przykład w iązać m etodam i chemicznymi z genem uzyskanym na drodze syntezy w jedną funkcjonalną całość. Być może, będzie można w ten sposób ominąć przeszkody stojące na drodze klonowania i właściwej ekspresji genów eukariotycznych w bakteriach.

Na zakończenie pragniem y przyznać, że nie tylko DNA bakteriofaga X służy jako źródło elem entów kontroli transk rypc ji w konstrukcji w ydajnych wektorów plazmidowych. Jako przykład pięknej, precyzyjnej pracy może służyć tu wklonowanie silnego prom otora lac (operonu ferm entacji laktozy) do plazm idu pMB9 (77). Genem, którego ekspresja uległa zwielokrotnieniu był gen cl bakteriofaga X!

Z a a k cep to w a n o do d ru k u 22.03.1979

PIŚMIENNICTWO

1. S z y b a l s k i W., (1978), Postępy Mikrobiologii 17, 153—179.2. F i a n d t M., H r a d e c n a Z., L o z e r o n H. A., S z y b a l s k i W., (1971),

w The Bacteriophage Lambda, red. Hershey A. D., str. 329—334, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. York.

3. T a y l o r K., H r a d e c n a Z., S z y b a l s k i W., (1967), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 57, 1618—1625.

4. G r z e s i u k E., T a y l o r K., (1977), Virology 83, 329—336.5. M o i r A., B r a m m a r W. J., (1976), Molec. Gen. Genet. 149, 87—99.6. H o p k i n s A. S., M u r r a y N. E., B r a m m a r W. J., (1976), J. Mol. Biol., 107,

549—569.7. P a n a s e n k o S. M., C a m e r o n J. R., D a v i s R. W., L e h m a n I. R., (1977),

Science 196, 188—189.8. K e l l e y W. S., C h a 1 m e r s K., M u r r a y N. E., (1977), Proc. Nat. Acad. Sci.

USA 74, 5632—5636.9. C o l l i n s J., (1977), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 78, 122—170.

10. T i m m i s K. N., C o h e n S. N., C a b e l l o F. C., (1978), w Progress in Molecular and Subcellular Biology, t. 6, red. Hahn F. E., str. 1—58, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, N. York.

11. I t a k u r a K., H i r o s e T., C r e a R., R i g g s A r D., H e y n e k e r H. L., B o l i v a r F., B o y e r H. W., (1977), Science 198, 1056—1063.

12. T a k e d a Y., F o l k m a n i s A., E c h o l s H., (1977), J. Biol. Chem. 252, 6177— 6183.

13. P t a s h n e M., B a c k m a n K., H u m a y u n M. Z., J e f f r e y A., M a u r e r R., M e y e r B., S a u e r R. T., (1976), Science 194, 156—161.

14. P o d h a j s k a A., (1979), Postępy Mikrobiologii, wysłane do druku.15. J o h n s o n A., M e y e r B. J., P t a s h n e M., (1978), Proc. Nat. Acad. Sci. USA

75, 1783—1787.16. R o b e r t s J. W„ (1975), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72, 3300—3304.

http://rcin.org.pl

[19] M APA R E ST R Y K C Y JN A X D NA 369

17. S k l a r J., Y o t P., W e i s s m a n S. M., (1975), Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72, 1817—1821.

18. K i k u c h i Y., N a s h H. A., (1978), J. Biol. Chem. 253, 7149—7157.19. O p p e n h e i m A., O p p e n h e i m A. B., (1978) Molec. Gen. Genet. 165, 39—45.20. J o n e s M. O., F i s c h e r R., H e r s k o w i t z I., E c h o l s H., (1979), Proc.

Nat. Acad. Sei. USA, 76, 150—154.21. H o n i g m a n A., H u S.-L., C h a s e R., S z y b a l s k i W., (1976), Nature

262, 112—116.22. S k a l k a A. M., (1977), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 78, 201—237.23. H o b o m G., G r o s s c h e d l R., L u s k y M., S c h e r e r G., S c h w a r z E.,

K ö s s e i H., (1978), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, w druku.24. A d h y a S., G o t t e s m a n M., (1978), Ann. Rev. Biochem. 47, 967—991.25. D a s A., M e r r i l l C., A d h y a S., (1978), Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75,

4828—4837.26. A d h y a S., G o t t e s m a n M., d e C r o m b r u g g h e B., C o u r t D., (1976),

w RNA Polymerase, red. Losick R., Chamberlin M., str. 719—730. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. York.

27. S h a w J. E., J o n e s B. B., P e a r s o n M. L., (1978), Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75, 2225—2229.

28. R o s e n b e r g M., W e i s s m a n S., d e C r o m b r u g g h e B., (1975), J. Biol. Chem. 250, 4755—4764.

2D. D a m b l y C., C o u r t D., B r ä c h e t P., (1976), Molec. Gen. Genet., 148, 175—182.

30. E c h o l s H., M u r i a l d o H., (1978), Microbiol. Revs. 42, 577—591.'31. D a v i d s o n N., S z y b a l s k i W., (1971), w The Bacteriophage Lambda, red.

Hershey A. D., str. 45—82, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. York.

32. S a u e r R. T., A n d e r e g g R., (1978), Biochemistry 17, 1092—1100.33. H s i a n g M. W., C o l e R. D., T a k e d a Y., E c h o l s H., (1977), Nature 270,

275—277.34. R o b e r t s T. M., S h i m a t a k e H., B r a d y C., R o s e n b e r g M., (1977),

Nature 270, 274^275.35. K a t s ur a I., Ts u g i t a A., (1977), Virology 76, 129—145.36. B e i f o r t M., (1978), J. Virology < 28, 270—278.37. P h i l i p p s e n P., K r a m e r R. A., D a v i s R. W., (1978), J. Mol. Biol. 123,

371—386.38. S a n g e r F., A i r G. M., B a r r e l l B. G., B r o w n N. L., C o u l s o n A. R.,

F i d d e s J . C., H u t c h i n s o n I I I C. A., S l o c o m b e P. M., S m i t h M.,(1977), Nature 265, 687—695.

39. S h a w D. C., W a l k e r J. E., N o r t h r o p F. D., B a r r e 11 B. G., G o d s o n G. N., F i d d e s J. C., (1978), Nature 272, 510—515.

40. S a l s t r o m J. S., S z y b a l s k i W., (1978), Virology 88 , 252—262.41. S z y b a l s k i E., S z y b a l s k i W., (1974), Biochimie 56, 1497—1503.42. T a y l o r A., (1971), Nature 234, 144—145.43. T a y 1 o r A., D a s B. C., v a n H e i j e n o o r t J., (1975), Eur. J. Biochem.

53, 47—54.44. B l a c k L. W., H o g n e s s D. S., (1969), J. Biol. Chem. 244, 1968—1975.45. T s u g i t a A., (1971), w The Enzymes, t. 5, wyd. 3, red. Boyer P. D. str. 343—411,

Academic Press, New York, London.46. L i p i ń s k a B., P o d h a j s k a A., T a y l o r K., wysłanew do druku.47. F i a n d t M., H o n i g m a n A., R o s e n v o l d E. C., S z y b a l s k i W., (1977),

Gene 2, 289—293.

http://rcin.org.pl

370 K. TAYLOR, A . TA YLO R [20]

48. S z y b a l s k i E. H., H o n i g m a n A., R o s e n v o l d E. C., F i a n d t M., S z y b a l s k i W., (1977), Gene 2, 295—297.

49. S z y b a l s k i W., (1977), w DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes, red. Bukhari A. J., Shapiro J. A., Adhya S. L., str. 583—590, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

53. G o 11 e s m a n S., A d h y a S., (1977), w DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes, red. Bukhari A. J., Shapiro J. A., Adhya S. L., str. 713—718, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

51. R o b e r t s R. J., (1976), Crit. Rev. Biochem. 4, 123—164.52. T h o m a s M., D a v i s R. W., (1975), J. Mol. Biol. 91, 315—328.53. W e l l a u e r P. K., R e e d e r R. H., C a r r o l l D., B r o w n D. D., D e u t c h

T., H i g a s h i n a k a g a w a T., D a v i d I., (1974), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 2823—2827.

54. H o b o m G., P h i l i p p s e n P., (1979), Gene, (w druku).55. R o b i n s o n L. H., L a n d y A., (1977), Gene 2, 1—31.56. Z e i g e r R. S., S a l o m o n R., D i n g m a n W., P e a c o c k A. C., (1972),

Nature New Biology 238, 65—68.57. Z e i g e r R. S., S a l o m o n R., D i n g m a n C. W., P e a c o c k A. C., (1974),

Biochemistry 16, 3388—3393.58. -S u t c l i f f e J. G., (1978), Nucl. Acid Res. 5, 2721—2728.59. L a n d y A., R o s s W., (1977), Science 197, 1147—1160.60. D a v i e s R. W., S c h r e i e r P. H., B ü c h e l D. E., (1977), Nature 270, 757—

760.61. W a l z A., P i r r o t t a V., I n e i c h e n K., (1976), Nature 262, 665—669.62. H u m a y u n Z., J e f f r e y A., P t a s h n e M., (1977), J. Mol. Biol. 112, 265—

277.63. H u m a y u n Z., (1977), Nucl. Acid Res. 4, 2137—2143.64. S a u e r R. T., (1978), Nature 276, 301—302.65. R o s e n b e r g M., C o u r t D., S h i m a t a k e H., B r a d y C., W u l f f D. L.,

(1978), Nature 272, 414—423.66. D e n n i s t o n - T h o m p s o n K., M o o r e D. D., K r u g e r K. E., F u r t h

M. E., B l a t t n e r F. R., (1977), Science 198, 1051—1056.67. S c h e r e r G., (1978), Nucl. Acid Res. 5, 3141—3156.68. S c h w a r z E., S c h e r e r G., H o b o m G., K ö s s e l H., (1978), Nature 272,

410—413.69. N i c h o l s B. P., D o n e l s o n J. E., (1978), J. Virol. 26, 429—434.70. M a x am A., G i l b e r t W., (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 560—564.71. S u t c l i f f e J. G., (1978), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 3737—3741.72. H e d g p e t h J., B a l l i v e t M., E i s e n H., (1978), Molec. Gen. Genet. 163,

197—203.73. R a o R, N., R o g e r s S. G., (1978), Gene 3, 247—263.74. B o l i v a r F., R o d r i g u e z R. L., G r e e n e P. J., B e t l a c h M. C., Hey

necker H. L., Boyer H. W., (1977), Gene 2, 95—113.75. R a y P. N., P e a r s o n M. L., (1974), J. Mol. Biol. 85, 163—175.76. S h i n e J., D a l g a r n o L., (1974), Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71, 1342—1346.77. B a c k m a n K., P t ä s h n e M., (1978), Cell 13, 65—71.78. M u r r a y K., M u r r a y N. E., (1975), J. Mol. Biol. 98, 551—564.79. R o b i n s o n L. H., L a n d y A., (1977), Gene 2, 33—54.80. P e r r i c a u d e t . M., T io 11 a i s P., (1975), FEBS Letters 56, 7—11.PI. H a g g e r t y D. M., S c h l e i f R. F., (1976), J. Virol. 18, 659—663.82. B o t c h a n P., (1976), J. Mol. Biol. 105, 161—176.

http://rcin.org.pl

[21] M A PA R E ST R Y K C Y JN A X D N A 371

83. K a m p D., K ah m a n n R., Z i p s e r D., R o b e r t s R. J. (1977), Mol. Gen. Genet. 154, 231—248.

84. S m i t h D. J., B l a t t n e r F. R., D a v i e s J., (1976), Nucl. Acid Res. 3, 343— 353.

85. C h a t e r K., (1977), Nucl. Acid Res. 4, 1989— 1998.86. R o s e n v o l d E., H o n i g m a n A., (1977), Gene 2, 273—288.87. H u g h e s S. G., (1977), Biochem. J. 163, 503—509.88. M c P a r l a n d R. H., B r o w n L. R., P e a r s o n G. D., (1976), J. Virol. 19,

1006—1011.89. J a m e s P. M., S e n s D., N a t t e r W., M o o r e S. K., J a m e s E., (1976),

J. Bacteriol. 126, 487—'500.90. P i r r o t t a V., (1976), Nucl. Acid Res. 3, 1747—1760.

http://rcin.org.pl

A N O N S R E D A K C JI

Oprócz artykułów monograficznych omawiających wąskie tematy oraz artykułów przeglądowych referujących szersze zagadnienia Postępy Biochemii publikują krótkie noty informujące o nowych ważnych osiągnięciach biochemii.

Redakcja prosi Autorów o nadsyłanie takich zwięźle i syntetycznie napisanych not o objętości 2 do 4 stron maszynopisu, przypominając równocześnie o konieczności ograniczania objętości artykułów monograficznych i przeglądowych do 25 stron tekstu i uzyskania pisemnej zgody wydawnictw i autorów na przedruk dokumentacji z prac źródłowych.

V

http://rcin.org.pl

Post. B io c h e m . , 25, 373—400 (1979).

IWONA SKRZYPEK-OSIECKA *

Receptory hormonów peptydowych

Receptors of Peptide Hormones

Spis treści

I. WstępII. Występowanie receptorów w komórceIII. Właściwości chemiczne receptorówIV. Oddziaływania hormon-receptorIV-1. Charakterystyka wiązania hormonu przez receptorIV-2. Wpływ hormonów peptydowych na rozmieszczenie i aktywność receptorówIV-3. Degradacja hormonu związanego z receptoremIV-4. Współoddziaływanie receptorów a wiązania hormonów peptydowychV. Praktyczne aspekty badań nad receptorami hormonów peptydowychVI. Wiązanie hormonu przez receptor a skutek biologiczny VI-1. Błonowy mechanizm wiązania hormonów peptydowychVl-2. Wewnątrzkomórkowy mechanizm wiązania hormonów peptydowych

C ontents:

I. IntroductionII. Intracellular location of hormone receptorsIII. Chemical properties of hormone receptorsIV. Hormone-receptor interactionsIV-1. Characteristics of hormone binding to the receptorIV-2. Effects of peptide hormone on distribution and activity of receptorsIV-3. Degradation of hormone bound to its receptorIV-4. Interactions of receptors and peptide hormone bindingV. Practical aspects of investigation of the peptide hormone receptors

* Mgr, Zakład Biochemii, Instytutu Biofarmacji Akademii Medycznej, ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa.

Wykaz stosowanych skrótów: cAMP — cykliczny adenozynomonofosforan; cGMP — cykliczny guanozynomonofosforan; GDP — guanozynodwufosforan; GTP — guanozynotrójfosforan.

http://rcin.org.pl

374 1. SK R Z Y PE K -O SIE C K A 12]

VI. Hormone binding and biological effectVI-1. Membrane mechanism of peptide hormone bindingVI-2. Intracellular mechanism of peptide hormone binding

I. Wstęp

Term inem receptory komórkowe hormonów określa się składniki kom órki zdolne do wybiórczego rozpoznawania i w iązania hormonów. Połączenie z receptorem kom órkowym stanowi pierw szy etap w działaniu ho rmonów. Dla w yjaśnienia m olekularnego m echanizm u działania horm onów peptydow ych dokładne poznanie oddziaływań horm on-receptor ma zatem zasadnicze znaczenie. Obserwowany w ostatnich latach szybki rozwój biochemii hormonów wiąże się z opracowaniem nowych m etod badawczych, między innym i otrzym yw ania i charakteryzow ania składników kom órko-

Tabela 1Występowanie receptorów hormonów peptydowych

Hormon Tkanka Piśmiennictwo

Angiotensyna nerka, nadnercza 11, 12, 13Bradykinina aorta, macica, jelito 14Choriogonadotropina jądro, jajnik 15—19Epidermalny czynnik wzrostu fibroblasty 20Folitropina jądro 21—24Gastryna = mięśnie gładkie żołądka 25, 26Glukagon wątroba, trzustka 27, 28, 29Insulina wątroba, komórki tłuszczowe,

limfocyty, łożysko, fibroblasty,mięśnie 30—42

Kalcytonina nerka, kość 43Kortykotropina nadnercza 44, 45Luliberyna przysadka 46Lutropina jądro, jajnik 15—19, 47Czynnik wzrostu nerwu zwoje układu sympatycznego 48Ocytocyna (oksytocyna) pęcherz, macica, sutki 49—55Parathormon nerka 56—60Prolaktyna gruczoł mlekowy 61—64Somatostatyna mózg, przysadka, serce,

mięśnie, żołądek, płuca, macica, nerka, śledziona,ślinianka 66a

Somitomedyna łożysko, monocyty 65, 66Somatotropina limfocyty, wątroba 67, 68Tyreoliberyna przysadka 69—72Tyreotropina tarczyca 73—78Wazoaktywny peptyd jelita wątroba, komórki tłuszczowe 79Wazopresyna nerka 80,81

http://rcin.org.pl

[3] RECEPTORY HORM ONÓW PEPTY D O W Y C H 375

wych (1) oraz preparatów hormonów o wysokim stopniu oczyszczenia jak rów nież ich znakowanych radioizotopam i pochodnych (2, 3).

W r. 1955 H e c h t e r sform ułował zasadę, zgodnie z którą związanie horm onu przez receptor wyzwala szereg reakcji składających się na biologiczny efek t działania horm onu (4). W cztery lata później B e r s o n i Y a 1 o w opracowali metodę radioimmunologiczną, pozwalającą na oznaczanie m ałych ilości hormonów (5), co znacznie przyspieszyło rozwój badań nad mechanizmem ich działania.

W następnych latach ukazały się prace P a s t a n a (6), i C u a t r e - c a s a s a (7), które na długi okres czasu ugruntow ały przekonanie, że horm ony peptydowe nie w nikają do w nętrza komórek, zaś działanie ich ogranicza się do kontaktu z powierzchnią błony komórkowej, gdzie zlokalizowane są swoiste białka receptorow e. Odkrycie przez Sutherlanda cyklicznego AMP i wykazanie jego roli w działaniu wielu hormonów sta nowiło potw ierdzenie teorii receptorow ej (8). Działanie receptorów błonowych można było wyjaśnić opierając się na mozaikowym modelu budowy błony kom órkowej przedstaw ionym przez S i n g e r a i N i c o l s o - n a (9).

Jeszcze do niedaw na uważano, że horm ony peptydowe nie w nikają do w nętrza komórki. Nowsze doniesienia (10) o występow aniu receptorów w ew nątrzkom órkow ych i przechodzeniu hormonów peptydow ych przez błonę kom órkową spowodowały rew izję u ta rty ch poglądów. Tym niem niej obecny stan wiedzy o struk tu rze i funkcji receptorów zawdzięczam y głównie badaniom receptorów umieszczonych na zewnątrz komórek. W ykaz tkanek, w których w ykryto receptory hormonów peptydow ych zamieszczono w tabeli 1.

II. Występowanie receptorów w komórce

Jak już wspomniano na wstępie, do niedaw na powszechnie sądzono, że recep to ry hormonów peptydow ych w tkankach docelowych w ystępują wyłącznie na powierzchni komórek.

W ykazanie (7), że insulina połączona kow alencyjnie z agarozą, a więc niezdolna do przenikania przez błonę komórkową ze względu na znaczne rozm iary cząsteczki, w yw ołuje zwiększenie u tleniania glukozy oraz ham ow anie stym ulow anej horm onalnie lipolizy w izolowanych komórkach tłuszczow ych szczura, uważano za najw ażniejszy argum ent na rzecz w ystępow ania receptorów w błonie kom órkowej. Brak obecności receptorów insuliny na powierzchni „odwróconych” pęcherzyków z błon adipocytów w skazyw ał także na występowanie receptorów na zew nętrznej pow ierzchni ich błony (82).

W prepara tach błon kom órek w ątrobow ych i tłuszczowych przygotow yw anych metodą freeze etching (kriorytow ania) m iejsca wiążące insu

http://rcin.org.pl

376 I. SK R Z Y PE K -O SIE C K A [4]

linę odpowiadały receptorom tkw iącym w podwójnej w arstw ie lipidowej błony. Zlokalizowano je za pomocą insuliny znakowanej ferry tyną (83,84). Okazało się, że receptory insuliny w błonach hepatocytów rozmieszczone są nierównom iernie, tworząc w niektórych m iejscach skupiska, gdzie wiąże się od 3 do 12 cząsteczek horm onu. Średnia gęstość rozmieszczenia wynosiła około 90 receptorów na urn2 powierzchni błony kom órkowej. Możliwość zastosowania znakowanych przeciwciał antyreceptoro- wych do wykazania obecności receptorów insuliny w błonie komórkowej również przem aw iała za występowaniem receptorów na powierzchni kom órek (85). Podobnie in terpretow ać należy fakt, że wzrostowi aktyw ności S '-nukleotydazy, enzymu będącego znacznikiem błon komórkowych tow arzyszy wzrost ilości receptorów w otrzym yw anych preparatach z błon hepatocytów (86).

Ostatnio pojawiło się jednak wiele doniesień o receptorach insuliny w ystępujących także w ew nątrz komórek, między innym i w jądrach (87), w błonach retiku lum endoplazm atycznego szorstkiego i gładkiego (88, 89), w aparacie Golgi’ego (90, 91), w m itochondriach (92). G o l d f i n e i wsp. (10) inkubowali hodowane in vitro lim focyty ludzkie IM-9 z [125J]insuliną wieprzową. Wyliczono, że ponad połowa odnalezionej radioaktyw ności w ystępowała w błonach kom órkowych pozostała zaś w jednakow ym stosunku w cytosolu i jądrach komórkowych. Stwierdzono również, że w ją drach hepatocytów insulina wiązała się głównie z błoną jądrow ą (93). Co więcej stw ierdzono także, że insulina połączona z agarozą powoduje odpowiedź komórkową stukro tn ie słabszą niż natyw ny horm on (94, 95). W ykazano ponadto, że podczas kontaktu tego kom pleksu z błoną kom órkową ma miejsce przechodzenie insuliny do w nętrza kom órki (96), w brew dotychczasowym poglądom.

Przypuszcza się obecnie, że receptory wszystkich hormonów peptydowych mogą występować w ew nątrz komórek; uważa się też, że w szystkie horm ony mogą przenikać przez błonę komórkową. Stwierdzono na p rzy kład, że cząsteczki parathorm onu mogą wnikać do w nętrza kom órek kanalika nerkowego i gromadzić się w m itochondriach (97). W ew nątrz ludzkich fibroblastów wykazano również obecność epiderm alnego czynnika wzrostowego (98), a w kom órkach gruczołu mlekowego — obecność pro lak tyny (99). Gonadotropina wiązana jest przez jądra, m itochondria, m ikrosomy i cytosol kom órek ciałka żółtego (100), a ponieważ p repara ty tych frakcji nie w ykazyw ały zanieczyszczeń błonam i kom órkow ymi (brak aktyw ności 5'-nukleotydazy), wnioskowano o w ystępow aniu receptorów gonadotropiny we wszystkich w ym ienionych stru k tu rach komórkowych. Opisano również odmienne param etry wiązania z horm onem i różne własności immunologiczne receptorów w ystępujących na powierzchni i w ew nątrz kom órek (88, 93). W ykazanie receptorów horm onów peptydow ych w ew nątrz kom órek spowodowało przew rót w podejściu do problem u czynności biologicznej hormonów peptydow ych.

http://rcin.org.pl


III. Właściwości chemiczne receptorów

Receptory hormonów peptydow ych są wrażliwe na działanie enzymów proteolitycznych, ponieważ zawierają składnik białkowy. Białka receptorowe stanowią zaledwie od 0,0001 do 0,001% wszystkich białek kom órkowych, stąd ich w yodrębnienie i poznanie własności fizyko-chemicznych jest niełatw e. Inform acje o właściwościach i budowie cząsteczek receptorowych uzyskiwano często drogą pośrednią, badając wpływ różnych czynników na przebieg wiązania hormonu z receptorem . Na przykład w przypadku receptorów glukagonu (101, 102), kortykotropiny (103), gonadotropiny (104, 105) oraz tyreo liberyny (70) zaobserwowano obniżone wiązanie horm onu przez receptor po działaniu nań fosfolipazy. W skazuje to na obecność składnika lipidowego w cząsteczce receptora lub na wpływ lipidów błony komórkowej na wiązanie receptora z hormonem. Przeprow adzony do roztw oru receptor gonadotropiny poddany działaniu chlorowodorku guanidyny rozdziela się na kolum nach z Sepharose 4B na dwa składniki: białkowy i lipidowy. Odłączenie fragm entu lipidowego wiąże się z u tra tą zdolności receptora do łączenia się z hormonem. Dodanie do białka receptorowego lipidów w yekstrahow anych z błon komórkowych (zwłaszcza fosfatydyloseryny i fosfatydyloetanolam iny) przyw raca zdolność wiązania hormonu. W ydaje się, że kwaśne fosfolipidy błony kom órkowej odgryw ają pewną rolę w rozpoznawaniu horm onu przez receptor, natom iast lipidy obojętne przyczyniają się do utrw alenia określonej konform acji cząsteczki receptora gonadotropiny (106). Enzym y rozkładające cukrowcowe składniki błon — neuram inidaza oraz |3-galaktozydaza powodują uszkodzenie receptora insuliny uniem ożliwiające związanie hormonu (107). Receptory te można oczyścić stosując m etodę chrom atografii powinowactwa na ConA-Sepharose. Przytoczone fak ty świadczą o glikopro- teidowej struk tu rze receptorów insuliny. Cukrowce wchodzą również w skład receptorów gonadotropiny (108) i ty reo tropiny (109). Receptor ty reo tropiny traci aktyw ność po traw ieniu neuram inidazą i wybarw ia się w żelu poliakryloam idowym barw nikam i swoistym i zarówno dla białek jak i cukrowców.

H am ujący wpływ tetran itrom etanu oraz dwuazowych pochodnych te- trazolu na wiązanie insuliny pozwala przypuszczać, że uczestniczą w nim reszty tyrozyny i tryp tofanu białka receptorow ego (110). Podobnie obserwow any wpływ para-chlorortęciobenzoesanu i N-etylom idu kwasu m aleinowego na wiązanie horm onu przez receptor w skazuje na znaczenie grup sulfhydrylow ych w tym procesie, co opisano w przypadku receptorów kortykotropiny (103), oksytocyny (51) i gonadotropiny (17).

Znany jest ciężar cząsteczkowy tylko kilku receptorów . Wynosi on od 100 tys. do 200 tys. (porównaj tabela 2). Stosując elektroforezę w żelu poliakryloam idowym z dodatkiem siarczanu dodecylu lub ograniczoną proteolizę uzyskiwano dane wskazujące na niższy ciężar cząsteczkowy

http://rcin.org.pl


receptorów. Uważa się to za następstw o dysocjacji receptorów na podjednostki, zwłaszcza, że w w arunkach sprzyjających dysocjacji obserwowano zmianę prom ienia Stokesa badanych cząsteczek.

Jak wynika z przedstaw ionego skrótowo przeglądu właściwości chemicznych receptorów , do najlepiej scharakteryzow anych należą receptory insuliny, gonadotropiny, glukagonu, p ro lak tyny i tyreotropiny.

Tabela 2

Właściwości chemiczne receptorów hormonów peptydowych

Hormon Charakterchemiczny

Masa cząsteczkowa Piśmiennictwo

Kortykotropina lipoproteid 6 000 000“ 44, 45Glukagon lipoproteid 190 000 (90 000)c 111, 27

(20 000)c 112Gonadotropina glikolipoproteid 194 000 (90 000)* 18Insulina glikoproteid 300 000 (135 000)6

(75 000)c 113, 114Prolaktyna białko 220 000 115Tyreotropina glikoproteid 166 000 (75 000)d

(24 000)d 109

a — wartości uzyskane dla receptorów wykazujących znaczne zanieczyszczenia błonami komórkowym i; b — wartość uzyskane po elektroforezie w żelu ppliakryloamidowym z dodatkiem siarczanu dodecylu; c — wartości uzyskane po roiz dziale na kolumnach z agarozą; d — wartości uzyskane po przeprowadzeniu ograniczonej proteolizy.

IV. Oddziaływania hormon-receptor

W badaniach oddziaływań horm on-receptor bardzo użytecznym narzędziem są znakowane horm ony. Najczęściej stosowanym znacznikiem jest radioizotop 125J ze względu na najdogodniejszy okres półtrw ania i możliwość uzyskiw ania preparatów o wysokiej aktyw ności właściwej (86, 116). Próbowano również znakować peptydy węglem 14C (117) i try tem (118). Oprócz radioizotopów do znakowania hormonów peptydow ych używa się ferry tyny i barw ników fluorescencyjnych (83, 119). O statnio opracowano m etody znakowania wielu hormonów peptydow ych przy pomocy związków fotolabilnych. Poddanie fotolizie kompleksów takich pochodnych z receptorem powoduje nieodw racalne znakowanie m iejsc w iążących podstawnikam i, które można zidentyfikować na podstawie pom iarów radioaktyw ności lub fluorescencji (120, 121).

Oddziaływania horm on-receptor nie ograniczają się do rozpoznawania horm onu przez receptor i jego związania; w następstw ie tego procesu mogą zachodzić dalsze, istotne dla biologicznej funkcji horm onu zjawiska, jak przechodzenie składników kom pleksu horm on-receptor do w nętrza komórki lub ich degradacja. Zaobserwowano także zjawisko kooperacji

http://rcin.org.pl


pomiędzy cząsteczkami receptorów zlokalizowanym i w błonie komórkowej.

Badania oddziaływań horm on-receptor są w tej chwili dziedziną budzącą wielkie zainteresowanie i — mimo znacznych jeszcze luk — pozwalają na precyzyjniejsze niż dotychczas określenie m echanizm u działania hormonów.

IV -1. Charakterystyka wiązania hormonu przez receptor

Oddziaływanie horm onu z receptorem cechuje: swoistość struk tu ra lna i przestrzenna, wysokie powinowactwo i odwracalność wiązania. Swoistość oddziaływania horm onu z receptorem wykazano na podstawie przebiegu wiązania znakowanych hormonów i analogów przez p repara ty receptorów (122, 123). Proces ten przedstawiono schem atycznie na rycinie 1.

Ryc. 1. Sposoby badania swoistości wiązania hormonu przez receptor.A — h o rm o n z n a k o w a n y ra d io iz o to p e m H * w sp ó łz a w o d n ic z y z n a ty w n y m h o rm o n e m H , o m ie js c e w ią ż ą c e r e c e p to r a R.B — a n a lo g h o rm o n u A j w sp ó łz a w o d n ic z y z h o rm o n e m H t o m ie js c e w ią ż ą c e r e c e p to r a R.C — h o rm o n H . o o d m ie n n e j b u d o w ie n ie w s p ó łz a w o d n ic z y z h o rm o n e m H t o m ie js c e w ią ż ą c e r e c e p t o r a R.

Istotnym czynnikiem w pow staw aniu połączeń między białkowym fragm entem cząsteczki receptora i peptydow ą cząsteczką horm onu jest ich w zajem ny układ przestrzenny. Metodą analizy rentgenow skiej i dichroizm u kołowego P u l l e n i L i n d s a y (124) wykazali, że połączenie cząsteczki insuliny z receptorem następuje tylko wówczas gdy przybiera ona pewną określoną konform ację.

Obszar cząsteczki insuliny odpowiedzialny za wiązanie z receptorem zaw iera dużą liczbę reszt hydrofobow ych i jest identyczny w hormonach otrzym yw anych z tkanek różnych zwierząt. Połączenie horm onu luteini-

http://rcin.org.pl


żującego z receptorem wym aga również dopasowania przestrzennego, do uzyskania którego niezbędne są obydwie podjednostki horm onu (125)." W badaniach wiązania horm onu przez receptor należy uwzględniać zjawisko nieswoistej adsorpcji horm onu na błonach (126). Wiązanie hormonu przez receptor jest procesem odwracalnym . Znakow any horm on oddysocjowuje z kompleksu horm on-receptor po rozcieńczeniu m ieszaniny reakcyjnej lub po dodaniu nadm iaru nieznakowanego horm onu. Proces ten można przyspieszyć przez podwyższenie tem peratury . Wysokie powinowactwo receptora do hormonu zapewnia jego działanie biologiczne przy niskich stężeniach horm onu (10-10 M i mniejszych).

Szybkość wiązania horm onu przez receptor zależy od stężenia horm onu, stężenia receptora, tem peratury , pH i czasu trw ania inkubacji. O ptym alna tem pera tu ra wynosi na ogół 25°C—37°C, a optim um pH leży w granicach 7,0— 7,4. Jedynie wiązanie tyreo tropiny przez błony komórek ta r czycy przebiega przy pH 5,5. Jakkolw iek optym alna tem pera tu ra wiązania jest wyższa niż 20°C, obniżenie tem pera tu ry naw et do 4°C obniża tylko nieznacznie szybkość wiązania.

W celu scharakteryzow ania przebiegu wiązania horm onu przez receptor podaje się w artości stałych szybkości reakcji wiązania (dwucząstecz- kowej) i dysocjacji (jednocząsteczkowej) oraz stałych powinowactwa. W yliczenie param etrów procesu wiązania horm onu przez receptor przeprowadza się na podstawie wzoru na stałą równowagi reakcji:

[H] + [R ]^ [H -R ]

[H—R]K = -----------

[H] [R]

Do wyliczeń tych stosuje się najczęściej metodę Scatcharda (127). Mierzy się wówczas ilość wolnego [H] i związanego [H—R] hormonu. W ykreślając zależność [H— R]/[H] od [H—R] otrzym uje się prostą o nachyleniu — K (Rycina 2A). P unk t przecięcia się krzyw ej z osią odciętych wyznacza stężenie wysycające, a zatem jest m iarą całkow itej ilości m iejsc wiążących — [R0].Prostoliniow y w ykres Scatcharda obserw uje się w przypadkach gdy: iedna cząsteczka horm onu łączy się z jedną cząsteczką receptora, w szystkie receptory są homogenne i nie w ystępują żadne wzajem ne oddziaływania między receptoram i.

Z przebiegu w ykresu Scatcharda można wnioskować o heterogenności miejsc wiążących. W takich przypadkach krzyw a ma charak ter wieloskładnikow y (27) (rycina 2B). Odstępstwa od liniowego przebiegu krzyw ej (rycina 2C) pojaw iają się również na skutek zmian powinowactwa do horm onu sąsiadującego ze sobą miejsc wiążących w w yniku zachodzącej między nimi kooperacji (128)v

Poszczególni badacze podają różne wartości niektórych param etrów wiązania horm onu przez receptor. Na przykład C u a t r e c a s a s (37)

http://rcin.org.pl


wyliczył stałą powinowactwa receptora insuliny jako rów ną 2X1010M-1, inni zaś badacze wartości 2X108M-1 (133), i 1,3X105M_1 (.86). Źródłem tych rozbieżności może być odmienna in terp re tac ja nieliniowego wykresu Scatcharda.

Ryc. 2. Wykres Scatcharda.(H] — s tę ż e n ie h o rm o n u , [R] — s tę ż e n ie r e c e p to r a , [H—R] — s tę ż e n ie k o m p le k s u h o rm o n - re c e p - t o r , [K] — s ta ła ró w n o w a g i lu b p o w in o w a c tw a . [ A ] — lin io w y , B i C — n a jc z ę ś c ie j s p o ty k a n e ro d z a je o d c h y le ń o d lin io w e g o w y k re s u S c a tc h a r d a .

Liczba receptorów danego horm onu w różnych tkankach wynosić może od 2000 do 100 000 na komórkę. Początkowo przypuszczano (129), że odpowiedź horm onalna jest wprost proporcjonalna do liczby receptorów związanych z horm onem i m aksym alną reakcję powoduje wysycenie wszystkich receptorów w komórce. Taką in terp re tac ję przyjm ow ali na przykład G o l d f i n e i wsp.; opisali oni wiązanie insuliny przez komórki grasicy, którem u towarzyszyło proporcjonalne do ilości związanego horm onu uw alnianie kwasu Y-aminomasłowego (130). Liczne są jednak dane wskazujące, że m aksym alny efekt fizjologiczny w ystępuje już przy bardzo m ałej liczbie zajętych receptorów . D u f a u zaobserwowała najw iększą intensywność steroidogenezy w jądrach, gdy zajęty był zaledwie 1% obecnych w kom órkach receptorów gonadotropiny (131). Podobne w yniki uzyskano badając kortykotropinę (132), insulinę (133) i tyreotropinę (134). Sugerują one możliwość w ystępowania w komórce pewnego nadm iaru receptorów zwanych „zapasowym i” („spare” receptors), nie znamy jednak dotąd ich roli. W edług Rodbarda (135) kom órki reagują na pobudzenie horm onalne zgodnie z zasadą „wszystko albo nic” , jeżeli liczba zajętych receptorów przekracza pewną wartość progową. Prawdopodobieństwo połączenia horm onu z receptorem zależy od stężenia horm onu i receptora. P rzy dużej liczbie receptorów stężenie horm onu potrzebne dla szybkiego osiągnięcia wartości progowej będzie m niejsze. Duża liczba receptorów



kom órkowych ma być w tym ujęciu czynnikiem w arunkującym wysoką czułość komórki na bodziec horm onalny. W ykazano też zależność między szybkością wiązania insuliny przez receptory a stanem m etabolicznym komórki^ (136).

Przypuszcza się, że odpowiedź kom órki na sygnał horm onalny może być zróżnicowana nie w zależności od liczby zajętych receptorów , ale w zależności od ich rodzaju, przy założeniu heterogenności receptorów dla danego hormonu. Ilościowe zależności między wiązaniem horm onu przez receptor i rozm iarem odpowiedzi komórkowej pozostają nadal niewyjaśnione. Dodatkowymi czynnikam i, które należy uwzględnić przy określaniu tych zależności są: charak ter wzajem nych oddziaływań hor- m on-receptor oraz kooperacja między poszczególnymi m iejscam i receptorowym i i ich heterogenność.

IV-2. Wpływ hormonów peptydowych na rozmieszczenie i aktywność receptorów

Liczba i stan receptorów kom órkowych danego horm onu mogą ulegać zmianom w zależności od wielu czynników. Należą do nich: stan fizjologiczny organizmu, wiek, dieta. W ykazano występowanie różnej liczby

, receptorów gonadotropiny w kolejnych stadiach cyklu m enstruacyjnego u kobiet (137). W m onocytach noworodków zaobserwowano około 6-krotne więcej receptorów insuliny niż u osobników dorosłych 45 000 i 7000 re ceptorów przypadających na jedną komórkę i dw ukrotnie większą stałą powinowactwa (138). Stwierdzono możliwość zwiększenia liczby receptorów insuliny u pacjentów z insulinoopornością przez zastosowanie odpowiedniej diety (139). W opisanych sytuacjach w ystępują zmiany w stężeniu krążących hormonów. W ydaje się, że stężenie hormonów ma decydujący wpływ na liczbę i stan receptorów in vivo (140). Do takich wniosków skłania obserwowana w wielu przypadkach redukcja wiązania horm onu przez swoisty receptor po działaniu in vitro lub in vivo horm onów w daw kach odpowiadających stężeniom fizjologicznym i wyższym (efekt homo- tropow y — patrz Tabela 3).

Z analizy kinetyki procesu wiązania horm onu przez receptor wynika, ze przyczyną obniżonego wiązania może być zmniejszenie liczby m iejsc wiążących (142— 146) lub też zm iany w powinowactwie receptora do hormonu (149, 150), bądź też jednoczesne występowanie obydwu zjawisk (151, 152). Działanie n iektórych hormonów tropow ych np. folitropiny, luto tropiny i pro lak tyny na receptory powodowało w zrost wiązania hormonu (142).

W pływ hormonów na receptory nie ogranicza się tylko do oddziaływań homotropowych: horm on — swoisty receptor. Możliwa jest rów nież reg u lacja heterotropow a, jak w przypadku ham owania wiązania gonadotropiny przez lim focyty IM-9 w obecności estradiolu (153). Obserwowano

http://rcin.org.pl

[Il l RECEPTORY HORM ONOW PEPTY D O W Y C H 383

zwiększenie wiązania androgenów przez jądra szczurów pozbawionych przysadek mózgowych pod wpływem działania folitropiny i lutropiny (154). Możliwa jest także indukcja receptorów gonadotropiny przy udziale androgenów (155). Zm iany liczby receptorów pod wpływem hormonów mogą polegać na regulacji procesów biosyntezy i rozkładu białek receptorowych. Istnieje także możliwość regulow ania ilości receptorów na e tapie asocjacji ich podjednostek.

Tabela 3Homotropowy wpływ hormonu na przebieg wiązania z receptorem

Hormon Sposóbdziałania

Wiązanie znakowanego hormonu przez receptor

Piśmiennictwo

Angiotensyna in vitro zmniejszone 141Folitropina in vivo zwiększone 142Glukagon in vivo zmniejszone 143Insulina in vitro zmniejszone 144, 145, 146

in vivo zmniejszoneLutropina in vivo zwiększone 142Prolaktyna in vivo zwiększone 147Somatotropina in vitro zmniejszone 148

W doświadczeniach in vitro preinkubowano preparaty receptorów z hormonem, a następnie badano wiązanie nowych porcji hormonu przez te receptory.

W doświadczeniach in vivo zwierzętom podawano określone dawki hormonów, a następnie badano wiązanie horm onu przez receptory otrzymane z tkanek tych zwierząt.

Badając wpływ som atotropiny ludzkiej na liczbę swoistych receptorów w lim focytach IM-9, L e ś n i a k i R o t h (142) stw ierdzili zmniejszenie liczby receptorów po działaniu horm onu w stężeniach 2X 10-11— 2X 10-10 M (nie przekraczających stężenia in vivo). Ten sam skutek zaobserwowano po inkubacji komórek z cyklokeksoimidem w stężeniu 0,1 mM. Jednoczesne dodanie cyklokeksoimidu i som atotropiny dawało skutek sum ujący się. W ydaje się zatem, że horm on ten reguluje procesy zachodzące po zakończeniu biosyntezy receptora. Zm niejszenie liczby receptorów kom órkowych pod wpływem hormonów ostatnio wiążą badacze ze zjawiskiem przenikania hormonów do w nętrza kom órki (156). W ykazano na przykład obecność kompleksów horm on-receptor w kom órkach jajn ika szczura(157). Zjawisko zmniejszenia liczby receptorów pod wpływem działania horm onu tłum aczyć można wchodzeniem kom pleksu horm on-receptor do kom órki. Mogłoby to, jak się zdaje odgrywać pewną rolę w ochronie tkanek przed zbyt dużymi stężeniam i horm onu (por. rozdz. IV-3).

W ykazanie roli hormonów jako czynników regulujących poziom receptorów tkankow ych rzuciło nowe światło na zagadnienie wrażliwości i opornośsi tkanek na działanie hormonów Stwierdzono, norm alny lub naw et podwyższony poziom insuliny we krw i u niektórych pacjentów



opornych na działanie insuliny. Towarzysząca hyperinsulinem ii insulino- oporność jest wynikiem redukcji liczby receptorów pod wpływem nadm iaru horm onu (rozdz. V).

IV-3. Degradacja hormonu związanego z receptorem

Do niedaw na sądzono, że degradacja horm onu zachodzi we krw i i jest procesem całkowicie niezależnym od wiązania z receptorem . Brak zależności m iędzy wiązaniem i degradacją horm onu w ykazano m iędzy innym i badając insulinę (158), glukagon (159), gonadotropinę (160) i kortykotro- pinę (103). Odmienne wartości optym alnej tem peratu ry , pH i siły jonowej, przy których zachodzi wiązanie horm onu przez receptor i degradację horm onu świadczą o niezależnym przebiegu obu procesów. Odm ienny jest także wpływ związków blokujących grupy sulhydrylow e: po ich zablokowaniu degradacja horm onu ham ow ana jest silniej niż wiązanie. A nalogi hormonów łączą się z receptoram i z szybkością w prost proporcjonalną do ich aktyw ności biologicznej. Częściowo zdegradowana insulina, od której odłączono alaninę i kwas asparaginow y, a która wykazuje już tylko 1— 2°/o aktyw ności natyw nej insuliny ulega degradacji z taką samą szybkością co hormon natyw ny (158). Stwierdzono także w ystępowanie różnic w szybkości degradacji insuliny natyw nej i jej monojodopochodnej, przy braku różnic w szybkości wiązania obu hormonów (161).

Dodanie związku będącego analogiem horm onu nie wpływało na szybkość degradacji horm onu, chociaż hamowało jego wiązanie przez receptor. Stała K m reakcji rozkładu insuliny przez błony hepatocytów wynosiła1,7X10“ 7M, z czego wynika, że enzym degradujący ma znacznie niższe powinowactwo do insuliny niż znane receptory. Degradacja insuliny zachodzi najin tensyw niej w obecności zanieczyszczonych błon hepatocytów(158). .

W nowszych pracach można jednak znaleźć wiele argum entów przem aw iających na korzyść znaczenia pow staw ania połączenia horm on-receptor dla następczej degradacji jednego lub obu składników tego połączenia. Stwierdzono na przykład, że podczas oczyszczania błon hepatocytów w zrasta zarówno wiązanie glukagonu przez receptory jak i degradacja tego horm onu (159). W skazywałoby to na w ystępowanie s truk tu ra lnej zależności między czynnikam i odpowiedzialnym i za wiązanie i degradację hormonu. G uanozynotrójfosforan, którego obecność niezbędna jest do ak ty wacji cyklazy adenylow ej przez związany glukagon, nie wykazyw ał żadnego w pływ u na przebieg degradacji horm onu. Okazało się także, że szybkość degradacji insuliny przez zawiesinę hepatocytów w tem peratu rze 30°C była proporcjonalna do liczby receptorów zajętych przez insulinę w stanie równowagi (162). Zm iany poglądów w tej dziedzinie dobrze ilu stru ją prace G a m m e l t o f t a i G l i e m a n n a , którzy do

http://rcin.org.pl

[13] RECEPTORY HORM ONÓW PE PTY D O W Y C H 385

nosili o b raku zależności degradacji insuliny od związania jej przez komórki tłuszczowe szczura (163). Obecnie autorzy ci kom unikują, że w stanie równowagi połowa radioaktyw nej insuliny połączonej z receptorem ulega degradacji, podczas gdy reszta dysocjuje w niezmienionej postaci (164). Podczas degradacji związanego horm onu pow stają peptydy, które natychm iast ulegają dalszemu rozkładowi tak, że jedynym możliwym do zidentyfikow ania produktem degradacji insuliny jest [125J]tyrozyna.

Pochodzące ze związanej z receptorem znakowanej radioizotopem insuliny piętno odnajdyw ano w związkach o większej od m asy insuliny lub m niejszej masie cząsteczkowej. Przedłużając czas inkubacji horm onu z kom órkam i tłuszczowymi stwierdzono spadek ilości insuliny zdolnej do oddysocjowania z kompleksów horm on-receptor (165). W ydaje się zatem, że związanie z receptorem jest koniecznym w arunkiem dla późniejszej degradacji horm onu. Przypuszcza się, że receptor pełni rolę czynnika przenoszącego horm on do miejsca degradacji, co potw ierdzają ostatnie doniesienia o odnalezieniu znakowanych hormonów w lizosomach (166), a także kompleksów horm on-receptor w ew nątrz kom órek (157).

W św ietle wyników nowszych badań przedstaw ione na początku rozdziału dane o niezależności procesów wiązania i degradacji dotyczą, jak się zdaje, czynników odpowiedzialnych za nieswoisty rozkład hormonów peptydowych.

Znacznie m niej uwagi poświęcano dotychczas procesom degradacji receptorów. O zachodzeniu tego zjawiska świadczy fakt, że preinkubacja błon hepatocytów szczura w nieobecności horm onu powoduje zmniejszenie pojem ności wiązania insuliny, a więc redukcję liczby receptorów (86). Wielu autorów przyjm uje jako hipotezę roboczą założenie, że degradacja receptorów może być mechanizmem samoobrony kom órki w przypadku nadm iaru hormonów peptydowych. Obserwowane „znikanie” receptorów z powierzchni kom órek pod wpływem nadm iaru horm onu może być spowodowane wejściem receptora połączonego z horm onem do w nętrza komórki. W ielu autorów wysuwa przypuszczenie, że produkty w ew nątrzkom órkowej degradacji horm onu lub receptora mogą przejaw iać czynność biologiczną (156).

IV-4. Współoddziaływanie receptorów a wiązania hormonów peptydowych

W badaniach kinetyki procesu wiązania hormonów przez receptory obserw uje się często odchylenia od liniowego przebiegu w ykresu Scatcharda (Ryc. 2). Zjawisko takie zaobserwowano na przykład podczas wiązania insuliny przez hepatocyty (167), kom órki tłuszczowe (168), lim focyty (169) i fibroblasty (170). Początkowo za przyczynę takich odchyleń uważano heterogenność miejsc wiążących hormon. Postulow ano w ystę

http://rcin.org.pl

386 I. SK R Z Y PE K -O SIE C K A [141

powanie w kom órkach dwóch typów receptorów każdego horm onu różniących się powinowactwem przynajm niej o jeden rząd wielkości.

W roku 1973 D e M e y t s i wsp. (128) badając dysocjację kom pleksów [125J]insuliny z receptorem z błon lim focytów stw ierdzili, że proces ten można przyspieszyć przez dodanie natyw nego horm onu w nadmiarze. W edług autorów dodanie nadm iaru horm onu prowadzi do zajęcia dotychczas wolnych miejsc receptorow ych. Między sąsiadującym i ze sobą receptoram i zachodzą oddziaływania typu kooperacji negatyw nej a indukowane w ten sposób zmiany konform acji powodują przyspieszenie dysocjacji kompleksów horm on-receptor na skutek zm niejszenia się powinowactwa receptora do hormonu. Postulow ano w ystępowanie kooperacji negatyw nej także dla receptorów innych horm onów peptydow ych, w tym tyreotro- p jny (78), ty reoliberyny (171) i czynnika wzrostowego nerw u (149). Zdaniem niektórych autorów kooperacja negatyw na jest szeroko rozpowszechnionym mechanizmem regulacji poprzez sprzężenie zwrotne, m ającym na celu ochronę tkanek przed wpływem nadm iernych ilości hormonu. Jakkolw iek zjawisko to tłum aczy się często w ystępowaniem in te rakcji między podjednostkam i białek receptorow ych (172— 174) w ydaje się, że może być ono również spowodowane przemieszczaniem się niezm ienionych receptorów w płynnej w arstw ie lipidów błony (175, 179) prow adzącym do tworzenia przez cząsteczki receptorów charakterystycznych skupisk (clustering) (176).

W pływ insuliny na dysocjację kompleksów horm on-receptor próbowano także tłum aczyć tw orzeniem się polimerów horm onu lub w ystępowaniem zawady przestrzennej związanej z oddziaływaniam i typu ligand- ligand. Jednakże D e M e y t s i wsp. ustalili, że insulina w stężeniach, w których obserwowano badany efekt tj. nie przekraczających 10~7 M w ystępuje w formie nomomerów. K ontynuując badania nad kooperacją negatyw ną stw ieidzili oni, że receptory insuliny z lim focytów ludzkich, rnonocytów i hepatocytów szczura i myszy w ystępują w dwóch’ stanach: stan I obserwowano przy niskim wysyceniu receptora hormonem . Oddy- socjowTanie insuliny od takiego receptora zachodzi powoli w tem peraturze 4°C i pH 8—9. S tan II związany jest z większym wysyceniem receptora przez hormon. Dysocjacja kom pleksu jest szybsza niż w stanie I i może przebiegać w niższym pH (pH 5— 6), wyższej tem peraturze i obecności 1 M mocznika. Przejście receptora ze stanu I (wolno dysocjujące kompleksy horm on-receptor) do stanu II (szybko dysocjujące kom pleksy hor- m on-receptor) następuje przy zwiększającym się w ysyceniu przez hormoni zależy od w arunków środowiska. Przejście takie można wywołać obniżając pH środowiska, stosując wysoką tem peraturę, mocznik lub przeciwciała antyreceptorow e (172). Ostatnio D e M e y t s donosi o zbadaniu obszaru odpowiedzialnego za kooperację w cząsteczce insuliny (177). Na przykładzie przeprowadzonego do roztw oru receptora insuliny z e ry tro cytów ptasich opisano występowanie kooperacji negatyw nej z jednoczesną

http://rcin.org.pl


dysocjacją receptora na podjednostki (114). Inkubując p repara ty receptorów z insuliną we w zrastających stężeniach obserw uje się zmianę prom ienia Stockesa białka receptorowego z 72 A do 40 A. Te dwa rodzaje cząsteczek rozdzielono podczas sączenia na kolum nach z Sepharose. Obie form y m iały jednak identyczne powinowactwo do hormonu, co przeczyło ścisłemu powiązaniu zmiany powinowactwa z rozpadem receptora na podjednostki. Podobne zmiany rozm iarów receptora pod wpływem działania horm onu wykazano także w innych układach: glukagon-receptor z serca (178) oraz horm on uw alniający gonadotropinę-receptor przysadkowy (179).

Teoria kooperacji negatyw nej ma wielu przeciwników. Należą do nich C u a t r e c a s a s i H o l l e n b e r g , którzy wykazali, że opisane przez De M eytsa przyspieszenie dysocjacji związanej insuliny po dodaniu nadm iaru hormonu, może zachodzić również w przypadku nieswoistego w iązania przez talk lub dw uam ino-dwupropyloam inoagarozę (180). Zdaniem tych autorów przyczyną omawianego zjawiska jest występowanie oddziaływ ań pomiędzy cząsteczkami insuliny prowadzących do zmian w s tru k turze II i III rzędowej a w konsekw encji także do zmian w oddziaływaniu tego horm onu z receptorem.

V. Praktyczne aspekty badań nad receptorami hormonów peptydowych

Badania receptorów, prowadzone w celu w yjaśnienia m olekularnego m echanizm u działania hormonów, m ają jednocześnie poważny aspekt praktyczny. Śledząc bowiem przebieg oddziaływania hormonów z receptoram i wyjaśniono częściowo przyczynę stanów patologicznych związanych z upośledzonym działaniem hormonu. Ponadto prace te przyczyniły się do opracowania czułych metod analitycznych o dużym znaczeniu w chemii klinicznej. Receptory można wykorzystać do oznaczania stężenia hormonów. Zasada m etody radioreceptorow ej przedstaw iona na rycinie 1A jest taka sama jak w przypadku stosowanej powszechnie m etody ra- dioimmunologicznej. W ykorzystuje się tu współzawodnictwo między cząsteczkami substancji znakowanej izotopem H* i tej samej substancji bez znacznika H! o ograniczoną liczbę m iejsc swoiście wiążących — R. (Ryc. 1A) (181— 184).

Badania nad receptoram i hormonów mogą umożliwić wyjaśnienie patofizjologii wielu schorzeń, których przyczyny leżą w zakłóceniu praw idłowego oddziaływania hormonów z receptoram i tkankow ym i. Dotyczy to zwłaszcza chorób m etabolicznych i endokrynopatii. Po raz pierwszy stw ierdzono zaburzenie funkcji receptorów hormonów peptydowych u opornych na działanie insuliny myszy ob/ob (185, 186). W ykazanie obniżonego wiązania [125J] insuliny przez lim focyty ludzkie w stanach oporności na insulinę związanej z otyłością stw orzyło nowe możliwości w diag

http://rcin.org.pl

388 I. SK R Z Y PE K -O SIE C K A [161

nostyce i terapii. N ieprawidłowa odpowiedź kom órki na działanie hormonu może wynikać ze zmian w kinetyce oddziaływań horm onu z receptorem , w liczbie receptorów lub mechanizmie przekazyw ania sygnału do w nętrza komórki.

W tabeli 4 podano przypadki chorób, w k tórych w ykryto zaburzenia w in terakcji horm on-receptor.

Tabela 4Stany patologiczne związane z zakłóceniem interakcji hormon-receptor

Rodzaj zaburzenia i objawy Przyczyna Piśmiennictwo

Otyłość u ludzi związana z insu- zmniejszone wiązanie insuliny przez re 187linoopornością ceptoryGenetycznie uwarunkowana oty i J *>łość u myszy ob/ob 186, 187Rzekoma niedoczynność przy- przypuszczalnie zmniejszone wiązanietarczyc parathormonu przez receptory 188Moczówka prosta oporna na wa- przypuszczalnie zmniejszone wiązaniezopresynę wazopresyny przez receptory 189Karłowatość Larona przypuszczalnie zmniejszone wiązanie

hormonu wzrostu przez receptory 190Rak gruczołu mlekowego zwiększone wiązanie prolaktyny przez

receptory 191Rogowacenie ciemne skóry, hiper- występowanie przeciwciał antyreceptoroinsulinemia i insulinooporność wych 192, 193,

194, 198, 199Cukrzyca >, » >> >insulinooporność 195Choroba Gravesanadczynność tarczycy 196

Zm iany w liczbie i stanie receptorów danego horm onu w poszczególnych tkankach wiążą się bezpośrednio z ak tualnym poziomem tego hormonu we krwi. Podwyższenie stężenia danego horm onu prowadzi do re dukcji lub wzrostu ilości homologicznych receptorów (rozdz. IV) lub też zmian w powinowactwie receptora do hormonu.

U chorych z wrodzoną lipodystrofią obserw uje się zanikanie w mono- cytach frakcji receptorów insuliny charakteryzujących się wysokim powinowactwem w stosunku do horm onu. Jednocześnie rośnie inna frakcja tych receptorów o niskim powinowactwie w stosunku do horm onu (197).

Oporność na działanie horm onów może być spowodowana również obecnością przeciwciał antyreceptorow ych, które zm ieniają oddziaływanie horm onu z receptorem , jak to w ykazano w przypadkach receptorów insuliny (192, 193, 194) i ty reo trop iny (196). Przeciwciała skierowane przeciw receptorom insuliny w ykryto we frakcji IgG białek surow icy osoby chorej na diabetes mellitus. Dodanie tej frakcji — oczyszczonej wstępnie

http://rcin.org.pl


na kolum nach z DEAE-Sephadex — do hodowanych limfocytów linii Im-9 powodowało zahamowanie wiązania przez nie [ł25J]insuliny. Podobny efekt obserw owano po dodaniu surowicy tej samej pacjentki. Podczas rem isji insulinooporności nie w ykryto obecności przeciwciał antyreceptorow ych w surow icy (195).

Na' inny aspekt czynności biologicznej przeciwciał antyreceptorow ych w skazują badania nad receptoram i tyreo trop iny u pacjentów z chorobą G raves’a przeciwciała w ystępujące w krw i tych pacjentów jak gdyby zastępują tyreotropinę; określane są one m ianem LATS (long acting thyroid stimulator) (196). Podobne skutki działania przeciwciał an tyreceptorow ych polegające na wyw oływ aniu reakcji fizjologicznej charak tery stycznej dla danego horm onu przytoczono w rozdziale VII-2.

VI. Wiązanie hormonu przez receptor a skutek biologiczny

Poniżej przedstaw iono starsze i nowsze koncepcje dotyczące sposobu działania horm onów peptydowych.

V I-1. Błonowy mechanizm wiązania hormonów peptydowych

W m yśl ogólnie — do niedawna — przyjm ow anej teorii mechanizm u błonowego cząsteczki horm onu peptydowego wiążą się z receptoram i um ieszczonym i na powierzchni komórki. Do uzyskania skutku biologicznego w edług tej teorii niezbędne jest przekształcenie konform acyjne re ceptora w efektor, k tó ry uczestniczy w przekazyw aniu sygnału z błony kom órkow ej do w nętrza komórki. Efektorem w przypadku zbadanych hormonów peptydow ych jest cyklaza adenylowa. P rodukt działania cyklazy — cAMP stanowi m ediator, k tóry poprzez aktyw ację odpowiednich układów enzym atycznych w komórce w yw ołuje reakcję fizjologiczną. Postulow ano również udział układu: cyklaza guanylowa — cGMP. W wielu przypadkach wykazano niezbędność jonów wapniowych w tym procesie. Ich udział stw ierdzono badając kortykotropinę (198), glukagon (199, 200, 201), oksytocynę (55), wazopresynę (80) i gonadotropinę (19). Sposób w jaki pobudzenie przez bodziec horm onalny przekazane zostaje do następnego ogniwa — cyklazy — nie jest dotychczas wyjaśniony. Mechanizm ak tyw acji cyklazy adenylow ej przy udziale hormonów omówiono w a rty kułach publikow anych w Postępach Biochemii t. 18, 1972 r.

Początkowo zakładano ścisłą zależność struk tu ra lną pomiędzy receptorem i cyklazą. Kom órki tłuszczowe wiążą przynajm niej osiem różnych horm onów : glukagon ACTH, sekretynę, horm on luteinizujący, katecholam iny, prostaglandyny i insulinę. Jeżeli przyjąć, że receptor każdego horm onu jest podjednostką regulatorow ą cyklazy adenylow ej i ma masę

http://rcin.org.pl


cząsteczkową rzędu 100— 200 tysięcy daltonów, to zgrupowanie w błonie komórkowej tak dużej ilości złożonych kompleksów w ydaje się mało prawdopodobne (180).

O statnio wielu autorów wykazało doświadczalnie odrębność s tru k tu ralną receptorów i cyklazy adenylow ej. Kompleks receptora z horm onem oddzielono od cyklazy m etodą sączenia m olekularnego (202, 203). S tw ierdzono również, że jednoczesna stym ulacja aktyw ności cyklazy adenylowej przez dwa różne horm ony: sekretynę i glukagon — nie daje efektu addytyw nego, co w skazuje na udział jednej cyklazy nie powiązanej stale z receptoram i w procesie działania obu tych horm onów (198). O statnio O r ł y i wsp. przeprowadzili fuzję komórek F myszy pozbawionych receptorów katecholam in z erytrocytam i, w których hamowano nieodw ra-

Ryc. 3. Aktywacja cyklazy adenylowej (Ac) w błonie komórkowej za pośrednictwem kompleksów hormon-receptor (Ac-Hi, Ac-H2) zgodnie z teorią ruchomego receptora (wg 180, zmodyfikowane).

calnie aktywność cyklazy adenylow ej (204). W tak skonstruow anych układach obserwowali oni stym ulację aktyw ności cyklazy za pośrednictwem katecholam in.

Dla w yjaśnienia m echanizm u współdziałania receptora z cyklazą posłużono się modelem Nicolsona i Singera (9) zakładającym płynną, mozaikową struk tu rę błony kom órkowej. Uważa się, że cząsteczki białkowe, w tym również różne receptory, mogą swobodnie przemieszczać się w płynnej w arstw ie lipidowej. B e n e t t , O ’ K e e f e i C u a t r a c a s a s

http://rcin.org.pl

[ 19] RECEPTORY HORM ONÓW PEPTY D O W Y C H 391

w roku 1975 ogłosili tzw. teorię ruchomego receptora (180, 209). Według tej teorii receptor po związaniu cząsteczki horm onu uzyskuje powinowactwo do cyklazy adenylowej i przem ieszczając się w błonie łączy się z tym enzym em powodując jego aktyw ację (Ryc. 3).

Teoria ruchomego receptora sform ułow ana została na podstawie badań nad działaniem toksyny cholery na cyklazę adenylową w różnych kom órkach. Działanie to przejaw ia ścisłą analogię z działaniem hormonów. Opierając się na takim modelu doświadczalnym wykazano, że aktyw acja cyklazy jest procesem zależnym od płynnej w arstw y lipidowej błon plazma- tycznych um ożliw iających dyfuzję cząsteczek białkowych.

W pływ fosfolipidów błony na proces aktyw acji cyklazy adenylowej postulowano już wcześniej na podstawie doświadczeń, w których obserwowano hamowanie przez fosfolipazę syntezy cyklicznego AMP pobudzanej przez glukagon. U tratę wrażliwości na glukagon w błonach hepa- tocytów traktow anych fosfolipazą można odwrócić dodając p reparaty fosfolipidów błonowych (206). Zanik aktyw acji cyklazy adenylowej przez horm on obserwowano także po dodaniu Lubrolu do preparatów błon kom órkowych z serca kota (207). Stosując fosfolipazy z różnych źródeło różnej swoistości substratow ej m.in. z Bacillus aurens i Clostridium perfringeris wykazano, że na aktyw ację cyklazy adenylow ej z błon hepa- tocytów odpowiedzialna jest frakcja kwaśnych fosfolipidów (102). W ykazano, że GTP i GDP są niezbędne do aktyw acji cyklazy przez glukagon w hepatocytach (208).

GTP i jego fosforanowe pochodne stym ulują aktyw ność cyklazy powodując jednocześnie zmniejszenie powinowactwa receptorów glukagonu do tego horm onu (209). W ydaje się, że GTP wpływa zarówno na cyklazę adenylow ą jak i na receptor na drodze odm iennych mechanizmów. R o d - b e l i i wsp. (215) wykazali, że GTP zmienia konform ację cząsteczki re ceptora prowadząc w konsekwencji do obniżenia powinowactwa (zmiana stałej dysocjacji kompleksu horm on-receptor z 2 nM do 10— 20 nM). Tylko tak przekształcony receptor może połączyć się z cyklazą adenylową. Enzym zaś może występować w dwóch stanach konform acyjnych, z których tylko stan I, charakteryzujący się wysokim powinowactwem w stosunku do GTP przejaw ia zdolność do łączenia się z receptorem glukagonu. Podobny wpływ nukleotydów obserwowano w przypadku innych hormonów: iolitropiny, adrenaliny, ty reo tropiny (208).

V I-2. Wewnątrzkomórkowy mechanizm wiązania hormonów peptydowych

Teoria receptorów błonowych, które po połączeniu z hormonem indukują w błonie zmiany prowadzące przy udziale pośredników do zmian w metabolizmie komórkowym, zakładała tylko jedną, uniw ersalną drogę działania wszystkich hormonów peptydow ych. N iektórych zjawisk nie

http://rcin.org.pl


można jednak wyjaśnić opierając się na tej teorii. Nie udało się bowiem dotąd w ykryć ani efektora ani m ediatora insuliny i hormonu wzrostu. W ykazano niezgodność między stężeniem horm onu wyw ołującym wzrost stężenia cAMP i stężeniem, przy którym obserw uje się największą in ten sywność reakcji fizjologicznej. Stwierdzono występowanie receptorów hormonów peptydow ych w różnych organellach komórkowych.

W ykrycie obecności horm onów i receptorów w ew nątrz kom órek zapoczątkowało zmianę poglądów na m echanizm działania hormonów peptydowych. Uważa się obecnie, że przenikanie do w nętrza kom órek stanowi a lternatyw ną drogę działania hormonów peptydowych. Mechanizm błonowy (pośredni) odpowiedzialny jest, jak się wydaje, za kró tkotrw ałe efekty działania hormonów, jak na przykład przyspieszanie przez insulinę transportu cukrów i aminokwasów. W ejście zaś do w nętrza kom órki jest w arunkiem w yw ierania przez horm on długotrw ałych efektów, na p rzykład pobudzanie przez insulinę biosyntezy białek, kwasów nukleinowych, ham owanie rozkładu białek poprzez odpowiednią regulację aktyw ności enzymów w ew nątrzkom órkow ych (211).

R ejestru jąc proces wchodzenia do kom órki a2-m akroglobuliny surow icy znakowanej fluoresceiną przy użyciu kam ery telew izyjnej wykazano, że odbywa się ono na drodze endocytozy (212) co sugerowano już wcześniej na przykład w przypadku epiderm alnego czynnika wzrostowego, pobieranego do w nętrza fibroblastów (98). Okazało się, że a2-m akroglobu- lina wchodzi do w nętrza fibroblastów razem z cząsteczkami insuliny i epiderm alnego czynnika wzrostowego. Białko to posiada zdolność ham ow ania aktyw ności w ew nątrzkom órkow ych proteaz i zdaniem W i 11 i n g h a m a chroni horm ony przed inaktyw acją, pozwalając na w yw ieranie d ługotrw ałych efektów m etabolicznych.

W nikanie hormonów peptydow ych do kom órek uważane jest obecnie za fak t bezsporny. K ontrow ersyjne są natom iast hipotezy w yjaśniające dalsze losy hormonów w kom órkach. Przypuszcza się, że horm on wchodzi do kom órki razem ze swoim receptorem . Wiadomo, że dzieje się tak isto tnie w przypadku choriogonadotropiny i epiderm alnego czynnika wzrostowego (212). A zatem przyjęto, ,,że raczej receptory, a nie horm ony mogą być aktyw ne biologicznie. Zgodnie z tą hipotezą horm ony wchodzą do kom órek tylko po to, żeby przenieść ze sobą recep tory” (213).

Potw ierdzeniem zdolności receptorów do w yw ierania określonych skutków fizjologicznych są cytow ane w rozdziale VI-2 przykłady uzyskiwania swoistych dla horm onów zmian fizjologicznych przez podziałanie na ich receptory przeciw ciałam i antyreceptorow ym i. J a c o b s i C u a - t r e c a s a s wykazali, że przeciwciała uzyskane przeciw receptorom insuliny z błon hepatocytów szczura powodują zwiększenie utleniania glukozy i zahamowanie indukow anej przez adrenalinę lipolizy w kom órkach tłuszczowych szczura (214). Za hipotezą aktyw ności biologicznej receptorów przem aw iają również wyniki obserw acji Kahna, k tóry

http://rcin.org.pl

[21] RECEPTORY HORMONÔW PEPTY D O W Y C H 393

stw ierdził redukcję liczby receptorów insuliny w adipocytach szczura poddanych działaniu przeciwciał. Efektu takiego nie zauważono w przypadku izolowanych błon kom órkowych co świadczy o tym, że zniknięcie receptorów z powierzchni komórki polega na ich przeniknięciu przez błonę do w nętrza (215).

Niezależnie od ustalenia, czy hormon, czy też jego receptor przejaw ia właściwą dla pobudzenia aktywność biologiczną, pozostaje do rozstrzygnięcia problem dalszych losów kom pleksu horm on-receptor w komórce. W ykrycie obecności hormonów peptydow ych i receptorów w lizosomach (166, 212), a także obecności kompleksów horm on-receptor w ew nątrz kom órek (157), skłania do przypuszczenia, że kompleks ten ulega w komórce rozkładowi.

Jak w ynika z przedstaw ionych wyników badań nad receptoram i hormonów peptydow ych — wyłoniły się w ostatnich latach zupełnie nowe pytania:— jaka jest rola receptorów w procesie przechodzenia hormonów przez

błonę kom órkową, a także czy i w jaki sposób receptory pośredniczą w degradacji hormonów?

— któ ry z dwóch składników połączenia horm on-receptor odpowiedzialny jest za wywołanie zmian fizjologicznych?

— jaką rolę odgryw ają produkty rozpadu receptora i hormonu?— jaką funkcję pełnią receptory wewnątrzkom órkowe?

Należy spodziewać się, że udzielenie odpowiedzi na te pytania przyczyni się do pełnego zrozumienia m echanizm u działania hormonów peptydow ych. M echanizm ten wydaje się bardziej złożony niż dotychczas sądzono. H orm ony peptydowe w yw ierają w kom órkach różnorodne skutki, a każdy z nich może być osiągany na innej drodze. Ponadto poszczególne horm ony peptydow e mogą działać na różne sposoby. Obalenie niepodw ażalnej do tej chwili tezy, że horm ony te nie przenikają do kom óreki m ają w spólną drogę działania stworzyło nowe perspektyw y badawcze.

Z a o k c e p t o w a n o d o d r u k u 27.03.1979

PIŚMIENNICTWO

1. D e P i e r r e ' J. W., K a r n o v s k y M. L., (1973), J. Celi. Biol. 56, 275—303.2. H u n t e r W. M., G r e e n w o o d F. C., (1962), Nature, 194, 495—496.3. T u r k i n g t o n R. W., M a j u m d e r B. C., K a d o n arna G. C., (1973),

Recent. Prog. Horm. Res., 29, 417—455.4. H e c h t e r O., (1955), Vitamines and Hormones, 13, 293—314.5. B e r s o n S. A., Y a 1 o w R. S., (1959), Ann. N. Y. Acad. Sci., 82, 338—344.6. P a s t a n J., R o t h J., M a c c h i a V., (1966), Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 56,

1802—1809.7. C u a t r e c a s a s P., (1969), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 63, 450—457.8. R a i l T. W., S u t h e r l a n d E. W., (1959), J. Biol. Chem., 232, 1065—1076.

http://rcin.org.pl

394 I. SK R Z Y PE K -O SIE C K A

9. S i n g e r S. J., N i c o l s o n G. L., (1972), Science, 175, 720—731.10. G o l d f i n e I. D., S m i t h G. J., W o n g K. Y., J o n e s A. L., (1977), Proc.

Nat. Acad. Sei. USA., 74, 1368—1372.11. L in S. Y., G o o d f r i e n d T. L., (1970), Am. J. Physiol., 218, 1319—1328.12. R o u z a i r e - D u b o i s B., D e v y n c k M. A., C h e v i l o t t y E., M e y e r P.,

(1975), FEBS Letters, 55, 168—172.13. D e v y n c k M. A., M e y e r . P , (1976), Am. J. Med., 61, 758—767.14. R e g o l i D., B a r a b e J., P a r k W. K., (1977), J. Can. Physiol. Pharmacol.,

55, 855—867.15. D u f a u M. L., C h a r r e a u E. H., C a t t K. J., (1973), J. Biol. Chem., 248,

6973—6982.16. C a 11 K. J., D u f a u M. L., T s u r u h a r a T., (1971), J. Clin. Endocrinol. Me-

tabol., 32, 860—870.17. D u f a u M., C h a r r e a u E. H., R y a n D., C a t t K. J., (1974), FEBS Letters,

39, 149—153.18. D u f a u M., R y a n D. W., B a u k a l A. J., C a t t K. J., (1975), J. Biol.

Chem., 250, 4822—4824.19. M e n d e l s o n C., D u f a u M., C a t t K., (1975), J. Biol. Chem., 250, 8818—

8823.20. H o l l e n b e r g M. D., C u a t r e c a s a s P., (1973), Proc. Nat. Acad. Sei. USA.,

70, 2964—2968.21. M e a n s A. R., V a i t u k a i t i s J., (1972), Endocrinology, 90, 39—46.22. A b o u - I s s a H., R e i c h e r t L. E., (1976), J. Biol. Chem., 251, 3326—3337.23. C h e n g K. W., (1975), Biochem. J., 149, 123—132.24. M a g h u i n G., C l o s s e t J., C o m b a r n o u s Y., H e n n e n G., D e -

c h e n n e C., K e t e l s l e g e r s J. M., (1978), Eur. J. Biochem,., 86, 121—131.25. B a u r S., B a c o n V. C., (1976), Biochem. Biophys. Res. Commun., 73, 928—933.26. B r o w n J., G a l l a g h e r D., N e i l D., (1978), Biochem. Biophys. Acta, 538,

42-49 .27. G i o r g i o N. A., J o h n s o n C. B., B l e c h e r M., (1974), J. Biol. Chem.,

249, 428—437.28. T o m a s s i V., K o r e t z S., R a y T. K., D u n n i c k J., M a r i n e t t i G. V.,

(1970), Biochim. Biophys. Acta, 211, 31—42.29. G o l d f i n e I. D., R o t h J., B i r n b a u m e r L., (1972), J. Biol. Chem., 247,

1211—1218.30. A r c h e r J. A., G o r d e n P., G a v i n J. R., (1973), J. Clin. Invest., 21, 4a.31. G a v i n J. R., B u e l l D. N., R o t h J., (1972), Science, 178, 168—169."32. G a v i n J. R., M a n n D. L., B u e l l D. N., R o t h J., (1972), Biochem. Bio

phys. Res. Commun., 49, 870—876.33. Cu a t r e e a s a s P., (1972), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 69, 318—322.34. C a u t r e c a s a s P., (1972), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 69, 1277—1281.35. H o u s e P. D. R., W e i d e r m a n n M. J., (1970), Biochem. Biophys. Res.

Commun., 41, 541—548.36. F r e y c h e t P., R o t h J., N e v i l l e D. M., (1971), Biochem. Biophys. Res.

Commun., 43, 400—408.37. C u a t r e c a s a s P., (1971), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 68, 1264—1268.38. C u a t r e c a s a s P., (1971), J. Biol. Chem., 246, 6522—6531. ,39. P o s n e r B. J., (1972), Clin. Res., 20, 922.40. P o s n e r B. J., (1974), Diabetes, 23, 209—217.41. G a v i n J. R., R o t h J., J e n P., F r e y c h e t P., (1972), Proc. Nat. Acad

Sei. USA., 69, 747—75(1.42. F r e y c h e t P., F o r g u e E., (1974), Diabetes, 23, (supl. I), 354.

http://rcin.org.pl

[23] RECEPTORY HORM ONOW PEPTY D O W Y C H 395

43. M a r x S. J., W o o d w a r d C. J., A u r b a c h C. D., (1972), Science, 178, 999—1001.

44. L e f k o w i t z R. J., R o t h J., P r i n c e r W., (1970), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 65, 745—752.

45. L e f k o w i t z R. J., P a s t a n I., R o t h J., (1969), w The Role of Adenyl Cyclase 3'5<' AMP in Biological System, red. Rail T., Rodbell M., Condliffe P., str. 88—95, NIH Fogarthy International Center Proceedings nr 4. National Institutes of Health, Bethesda, Md.

46. S p o n a J., (1974), FEBS Letters, 39, 221—224. v47. L e e C. Y., R y a n L. J., (1971), Endocrinology, 89, 1515—1523.48. B a n e r j e e S. P., S n y d e r S. H., C u a t r e c a s a s P., G r e e n e - L . A.,

(1973), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 70, 2519—2523.49. W a l t e r R., S c h w a r t z J. L., H e c h t e r O., (1972), Endocrinology, 91,

39—48.50. R o y C., B o c k a e r t J., R a j e r i s o n R., J a r d S., (1973), FEBS Letters,

30, 329—334.51. S o l o f f M. S., S c h w a r t z T. L., (1974), J. Biol. Chem., 249, 1376—1381.52. S o l o f f M. S., S c h w a r t z T. L., M o r r i s o n M., S a f f r a n M., (1973),

Endocrinology, 92, 104—107.53. S o l o f f M. S., S c h w a r t z T. L., S a f f r a n M., (1972), Endocrinology, 91.

213—216.54. S o l o f f M. S., S c h w a r t z T. L., (1973), J. Biol. Chem., 248, 6471—6478.55. S o l o f f M. S. , S c h r o e d e r B. T., C h a k r a b o r t h y J., P e a r l m u t t e r

F., (1977), Fed. Proc., 36, 1861—1866.56. S u t c l i f f e H. S., M a r t i n T. J., P i l c z y k R., (1973), Biochem. J., 134,

913—921.57. M a 1 b o n C. C., Z u l l J. E., (1974), Biochem. Biophys. Res. Commun., 56,

952—958.58. D i B e l l a F. P., D o u s a t T. P., M i l l e r S. S., (1974), Proc. Nat. Acad.

Sci. USA., 71, 723—726.59. Z u 11 J. E., M a l b o n C. C., C h u a n g J., (1977), J. Biol. Chem., 252, 1071—

1078.60. M a 1 b o n C. C., Z u l l J. E., (1977), J. Biol. Chem., 252, 1079—1083.61. S h i u R. P. C., K e l l y P. A., F r i e s e n H. G., (1973), Science, 180, 968—971.62. C o s t l o w M. E., B u s h o w R. A., Me G u i r e W. L., (1975), Life Sci., 17,

1457—1466.63. P o s n e r B. J., K e l l y P. A., S h i u R. P. C., (1974), Endocrinology, 95, 521—

531.64. K e l l y P. A., P o s n e r B. J., T a u s h i m a T., (1974), Endocrinology, 95.

532—539.65. V a n W y k J. J., U n d e r w o o d L. E., H i n t z R. L., (1974), Rec. Prog.

Horm. Res., 30, 259—295.66. H a l l K., T a k a n o K., F r y k l u n d L., (1974), J. Clin. Endocrinol. Metab.,

3J9, 973—976.66a. O g a w a N . , T h o m p s o n T., F r i e s e n H. G., M a r t i n J. B., B r a z e a u P.,

(1977), Biochem. J., 165, 269—277.67. T s u s h i m a T., F r i e s e n H. G., (1973), J. Clin. Endocrinol. Metab., 37.

334—337.68. H e r i n g t o n A. C., P h i l i p s L. S., D a u g h a d a y W. H., (1976), Meta

bolism, 25, 341—353.69. P o i r i e r G., L a b r i e F., B a r d e n N., L e m a i r e S., (1972) FEBS Letters,

20, 283—286.

http://rcin.org.pl


70. B a r d e n N., L a b r i e F., (1973), J. Biol. Chem., 248, 7601—7606.71. H i n k l e P. M., T a s h i j a n A. H., (1973), J. Biol. Chem., 248, 6180—6186.72. W i l b e r J. F., S e i b e i M. J., (1973), Endocrinology, 92, 888—893.73. H a y e B., J a c q u e m i n C., (1971), FEBS Letters, 18, 47—'52.74. M a n l e y S. W., B o u r k e J. R., H a w k e r R. W., (1972), J. Endocrinol., 55.

555—563.75. A m i r S. M., C a r r a w a y T. F., K o h n L. D., (1973), J. Biol. Chem., 248,

4092—4100.76. L i s s i t z k y S., F a y e t G., V e r r i e r B., (1973), FEBS Letters, 29, 20—24.77. V e r r i e r B., F a y e t G., L i s s i t z k y S., (1974), Eur. J. Biochem. 42, 355—

365.78. K o h n L. D., W i n a n d L. J., (1975), w Molecular aspects of Membrane Phe

nomena, red. Kaback H. R., Neurath H., i in., str. 149—180, Springer Varlag, Berlin.

79. D e s b o q u o i s B., L a u d a t M. H., L a u d a t P., (1973), Biochem. Biophys. Res. Commun., 53, 1187—1194.

80. C a m b e l l B. J., W o o d w a r d G., B o r b e r g V., (1972), J. Biol. Chem., 247, 6167—6175.

81. B o c k a e r t J., R o y C., R a j e r i s o n R., J a r d S. J., (1973), J. Biol. Chem.,249, 5922—5931.

82. B e n n e t V., C u a t r e e as a s P., (1973), Biochim. Biophys. Acta, 311, 362— 380.

83. O r c i L. C., R u f e n e r F., i M a l a i s s e - L a g a e F., B l o n d e l B., A m - h e r d t M., B a t a i 11 e D., F r e y c h e t P., P e r r e l e t A., (1975), Isr. J. Med. Sei., II, 639—655.

34. J a r r e t L., S m i t h R. M., (1974), J. Biol. Chem., 249, 7024—7031.8?. J a r r e t D. B., R o t h J., K a h n C. R., F l i e r J. S., (1976), Proc. Nat. Acad.

Sci. USA., 73, 4115—4119.86. K a h n C. R., (1975), w Methods in Membrane Biology, red. Korn D., t. 3,

str. 81—146, Plenum Press, London.87. G o 1 d f i n e I. D., S m i t h G. J., (1976), Proc. Nat. Acad. Sci., USA. 73, 1427—

1431.88. K a h n C. R., (1976), J. Cell. Biol., 70, 261—286.89. H o r v a t A., L i E., K a t s o y a n n i s P. G., (1975), Biochim. Biophys. Acta,

382, 609—620.90. B e r g e r o n J. J. M., E v a n s W. H., G e s c h w i n d J. J., (1973), J. Cell. Biol.,

59, 771—776.91. B e r g e r o n J. J. M., P o s n e r B. J., J o s e f s b e r g Z., S i k s t r o m R.,

(1976), J. Biol. Chem., 253, 4058-4066.92. F o r g u e M. E., F r e y c h e t P., (1975), Diabetes, 24, 71i5—723.93. V i g n e r i R., G o l d f i n e I. D., W o n d K. Y., S m i t h G. J., P e z z i n o

V., (1978), J. Biol. Chem., 253, 2098—2103.94. G a r v i n J. L., C e l e h r t e r T. D., (1974), Arch. Biochem. Biophys., 164, 52—

59.95. K o l b H. J., R e n n e r R., H e p p K. D., W e i s s L., W i e 1 a n d O. H., (1975),

Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 72, 248—252.96. O k a T., T a p p e r Y. J., (1974), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 71, 1630—1633.97. N o r d q u i s t R. E., P a l m i e r i G. M. A., (1974), Endocrinology, 95, 229—237.98. C a r p e n t e r A. G., C o h e n S., (1976), J. Cell. Biol., 71, 159—171.99. N o l i n J. M., W i t o r c h R. J., (1976), Endocrinology, 99, 949—958.

100. R a o Ch. V., S a t y b r a t a M., (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 636—643.

http://rcin.org.pl


101. P o h l S. L., K r a n s M. J., K o z y r e f f V., B i r n b a u m e r L., R o d b e l l M., (1971), J. Biol. Chem., 246, 4447—4454.

102. R u b a l c a v a B., R o d b e l l M., (1973), J. Biol. Chem., 248, 3831—3837.103. L e f k o w i t z J. R:, R o t h J., P a s t a n I., (1971), Proc. Nat. Acad. Sci. USA.,

185, 195—209.104. D u f a u M. L., C h a r r e a u E., C a t t K. J., (1973), J. Biol. Chem., 248, 6973—

6982.105. A z a h a r S., H a j r a A. K., M e n o n K. M. J., (1976), J. Biol. Chem., 251,

7405—7412.106. S a x e n a B. B., (1976), w Methods in Receptor Research red. Blecher M., t. 1

str. 251—299, Marcel Dekker N. York107. C u a t r e c a s a s P., I l l i . a n o G., (1971), J. Biol. Chem., 246, 4938—4946.108. L e e G., A l o j S. M., K o h n L. D., (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun.,

77, 434—441.109. T a t e R. L., H o l m e s J. M., K o h n L. D., W i n a n d R., (1975), J. Biol.

Chem., 250, 6527—6535.110. C u a t r e c a s a s P., (1971), J. Biol. Chem., 246, 6532—6542.111. K l e i n I. M., F l e t c h e r M. A., L e v e s G. S., (1973), J. Biol. Chem., 248,

5552—5554.112. L e v e y G. S., F l e t c h e r M. A., R a m a c h a n d r a n S., (1976), w „Me

thods in receptor research”, red. Blecker M., t. 1, str. 143—158, Marcel Dekker, N. York.

113. J a c o b s S., S h e c h t e r Y., B i s s e l K., C u a t r e c a s a s P., (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun., 77, 981—988.

114. G i n s b e r g B. H., K a h n C. R., R o t h J., D e M e y t s P., (1976), Biochem. Biophys. Res. Commun., 73, 1068—1074.

115. S h i u R. P. C., F r i e s e n H. G., (1974), J. Biol. Chem., 249, 7902—7911.116. B e r s o n S. A., Y a 1 o w R. S., (1969), w Methods in Investigative and Diagno

stic Endocrinology red. Berson S. A., Yalow R. S., t. 2, str. 84—125, North Holland, Amsterdam.

117. E d d y L. J., H e r s h m a n J. M., T a y l o r R. E., B a r k e r S. B., (1973), Biochem. Biophys. Res. Commun., 54, 140—146.

118. G r a n t G., V a l e W., G u i l l e m i n R., (1972), Biochem. Biophys. Res Commun., 46, 28—34.

119. H s e u c h A. J. W., D u f a u M. L., K a t z S. J., C a t t K. J., (1976), Nature,261, 710—712.

120. G a l a r d y R. E., G r a i g L. C., J a m i e s i n J. D., P r i n t z H. P., (1974), J. Biol. Chem., 249, 3510—3518.

121. Y ip C. C., Y o u n g C. W. T., M o u k M. L., (1978), J. Biol. Chem., 253, 1743— 1745.

122. H o f m a n K., W i n g e n d e r W., (1970), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 67, 829— 836.

123. G o o d f r i e n d T., L i n S - Y., (1969), Clin Res., 17, 243.124. P u l l e n R. A., L i n d s a y D. G., (1976), Nature, 259, 369—373.125. W a n - K y n g Li u , K u o - P a o Y a n d , B u r l e i g h B. D., W a r d D. N.,

(1974), w Current topics in molecular endocrinology, red. Dufau M. L., MeansA. R., t. 1, str. 89—108, Plenum Press, N. York, London.

126. P o s n e r B. I., (1975), J. Can. Physiol. Pharmacol., 53, 689—703.127. S c a t c h a r d G., (1949), Ann. N. Y. Acad. Sei., 51, 660—672.128. D e M e y t s P., R o t h J., N e v i l l e D. M., G a v i n J. R., L e s n i a k M. A.,

(1973), Biochem. Biophys. Res. Commun., 55, 154—161.



129. R;o;d;b;a;r;d; W., (1973), w Receptors for reproductive hormones, red. O’MalleyB. W., Means A. R., str. 342—364. Plenum, New York.

130. G o l d f i n e I. D., G a r d n e r J. D., N e v i l l e D. M.( (1972), J. Biol. Chem.,247, 6919—6926.

131. D u f a u M. L., M a t a n a b e F., C a t t K. J., (1973), Endocrinology, 92, 6—11.132. B e a l R. J., S a y e r s G., (1972), Arch. Biochem. Biophys., 148, 70—76.133. K o n o T., B a r h a m F., (1971), J. Biol. Chem., 246, 6210—6216.134. W i l l i a m s J. H., (1972), Endocrinology, 91, 1411—1417.135. R o d b a r d D., (1973), w Receptors for Reproductive Hormones, red. O’Malley

B. W., Means A. R., str. 289—326, Plenum New York.136. G l i e m a n n J., G a m m e l t o f t S., (1974), Diabetologia, 10, 105—113.137. H o n t e l a S., (1974), Lancet, 7894, 1454—1455.138. T h o r r s o n A. U., H i n t z R. L., (1977), N. Engl. J. Med., 297, 908—912.139. A r c h e r J. A., G o r d e n P., R o t h J., (1975), J. Clin. Invest., 55, 166—174.140. R a f f M., (1976), Nature, 259, 265—266.141.. D e v y n c k M. A., R o u z a i r e - D u b o i s B., C h e v i l o t t e E., M e y e r P.,

(1976), Eur. J. Pharmacol., 40, 27—37.142. L e s n i a k M. A., R o t h J., (1976), J. Biol. Chem., 251, 3720—3729.143. S o m a n Y., F e l i g P., (1978), Nature, 272, 829—832.144. K a h n C. R., N e v i l l e D .M ., G o r d e n P., F e y c h e t R., R o t h J., (1972),

Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 135—142.145. S o l l A. H., K a h n C. R., N e v i l l e D. M., R o t h J., (1975), J. Clin. In

vest., 56, 769—780.146. B a r R. S., G o r d e n P., R o t h J., K a h n C. R., D e M a y t s P., (1976),

Clin. Res., 24, 269A.147. P o s n e r B. J., K e l l y P. A., F r i e s e n H. G., (1975), Science, 188, 57—59.148. L e s n i a k M. A., B i a n c e A. R., R o t h J., G a v i n J. R., (1974), Clin. Res.,

22, 343A.149. F r a z i e r W. A., B o y d C. F., B r a d s h a w R. A., (1974), J. Biol. Chem., 249,

5513—5519.150. L i m b i r d L. E., D e M e y t s P., L e f k o w i t z R. J., (1975), Biochem. Bio

phys. Res. Commun., 64, 1160—1168.151. O l e f s k y J. M., J o h n s o n J., L i n F., J e n P., R e a v e n G. M., (1975),

Metabolism, 24, 517—527.152. B a r R. S., G o r d e n P., R o t h J., (1976), J. Clin. Invest., 58, 1123—1135.153. R a n k e M. B., P a r k s J. S., (1974), Endocrinology, 94, supl. A-73.154. F r i t z J. B., K o p e c B., K a m L a m , V e r n o n R. G., (1974), w Current

topics in molecular endocrinology, red. Dufau M. L., Means A. R., t. 1, str. 311— 328, Plenum Press, N. York, London.

155. P u r v i s K., (1977), Nature, 265, 169—170.156. K o l a t a B. G., (1977), Science, 196, 747—748.157. C o n n P. M„ C o n t i M., H a r w o o d J. F., (1978), Nature, 274, 598—600.158. F r e y c h e t P., K a h n R., R o t h J., N e v i l l e D. M., (1972), J. Biol.

Chem., 247, 3953—3961.159. P o h l S. L., K e a n s M. J., R o d b e l l M., (1972), J. Biol. Chem., 247,

2295—2301.160. D u f a u M., C a t t K., T a u r u h a r a T., (1972), Proc. Nat. Acad. Sei. USA,

69, 2414—2416.161. S o d o y e z J. C. F., S o d o y e z - G o l f a u x M. M., G o f f A. E., Z i m e r -

m a n n E. R., A r q u i 11 a A. H., (1975), J. Biol. Chem., 250, 4268—4277.162. T e r r i s S., S t e i n e r D. F., (1975), J. Biol. Chem., 250, 8389—8398.

http://rcin.org.pl


163. G a m m e l t o f t S., G l i e m a n n J., (1973), Biochem. Biophys. Acta, 320, 16—32.

164. G a m m e l t o f t S., G l i e m a n n J., (1978), J. Biol. Chem., 253, 7857—7863.165. K a h n C. R., B a i r d K., (1978), J. Biol. Chem., 253, 4900—4906.166. G o r d e n P., C a r p e n t i e r J. I., (1978), Science, 200, 782—785.167. K a h n C. R., F r e y e c h t P., R o t h J., N e v i l l e D. M., (1974), J. Biol.

Chem., 249, 2249—2259.168. F r e y c h e t P., L a u d a t M. H., L a u d a t P., R o s s e 1 i n G., K a h n C. R.,

G o r d e n P., R o t h J., (1972), FEBS Letters, 25, 339—342.169. G a v i n J. R., R o t h J., A r c h e r J. A., B u a l l D. N., (1973), J. Biol.

Chem., 248, 2202—2207.170. R e c h l e r M. M., P o d s k a l n y J. M., (1976), Diabetes, 25, 250—255. .171. G r a n t G., V a l e W., G u i l l e m i n R., (1972), Endocrinology, 92, 1629—

1633.172. D e M e y t s P., B i a n c o A. R., R o t h J., (1976), J. Biol. Chem., 251,

1877—1888.173. L e v i t z k i A., (1974), J. Theor. Biol., 44, 367—372.174. C o l o s i m o A., B r u n o r i M., W y m a n J., (1976), J. Mol. Biol., 100,

47—57.175. J a c o b s S., C u a t r e c a s a s P., (1976), Biochim. Biophys. Acta, 433,

482—498.176. R o t h J., L e s n i a k M. A., K a h n C. R., M e g y e s i K., (1975), Rec. Prog.

Horm. Res., 31, 95—139.177. D e M e y t s P., V a n O b b e r g h e n E., R o t h J., W o l l m e r A., B r a n

d e n b u r g D., (1978), Nature, 273, 504—509.178. K l e i n O., F l e t c h e r M. A., L e v e y G. S., (1973), J. Biol. Chem. 248,

5552—5554.179. Z o l m a n J., V a l e n t a L., (1976), The Fifth International Congress of En

docrinology, Abstracts 29.180. C u a t r e c a s a s P., H o l l e n b e r g M. D., K w e n J e n C h a n g , B e n -

n e t V., (1975), Rec. Prog. Horm. Res. 31, 37—94.181. L e f k o w i t z R. J., R o t h J., P a s t a n J., (1970), Science, 170, 633—635.182. S h i u R. P, C., F r i e s e n H., (1973), Science, 180, 968—971.183. C a 11 K. J., D u f a u M., T s a u r u h a r a T., (1972), J. Clin. Endocrinol. Metab.,

34, 123—132.-184. M e g y e s i K., K a h n C. R., (1974), Biochem. Biophys. Res. Commun. 57,

307—315.185. K a h n C. R., N e v i 11 e D. M., G o r d e n P., F r e y c h e t P., R o t h J., (1972),

Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 135—142.186. K a h n C. R., N e v i l l e D. M., R o t h J., (1973), J. Biol. Chem., 248, 244—

250.187. A r c h e r J. A., G o r d e n P., G a v i n J. R., L e s n i a k M. A., R o t h J.,

(1973), J. Clin. Endocrinol. Metab., 36, 627—633.188. C h a s e L. R., M e l s o n G. L., A u r b a c h G. D., (1969), Clin. Invest. 48,

1832—1844.189. H a y s R. M., (1976), N. Engl. J. Med. 295, 659—665.190. L a r o n Z., P e r t z e l a n A., K a r p M., (1968), Isr. J. Med. Sei., 4, 885—894.191. K e l l y P. A., B r a d l e y C., S h i u R. P. C., M e i t e s J., F r i e s e n H. G.,

(1974), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 156, 816—819.192. F l i e r J. S., K a h n C. R., J a r r e t D. B., (1976), Immunol. Commun. 5,

361—375.

http://rcin.org.pl


193. F l i e r J. S., K a h n C. R., J a r r e t D. B., (1976), J. Clin. Invest., 58, 1442— 1449.

194. P u l l i n i M., (1976), Ann. Intern. Med.., 85, 749—751.195. B l a c k b a r d W. G., A n d e r s o n J. W., Mu 11 i n a x F., (1977), Ann.

Intern. Med., 86, 84—85.196. M e K e n z i c J. M., (1972), Metabolism, 21, 883—894.197. O s e i d S., B e c k - N i e l s e n H., P e d e r s o n O., S o v i k C., (1977), New

Engl. J. Med., 296, 245—248.198. R o d b e l l M., B i r n b a u m e r L., P o h l S., (1970), J. Biol. Chem., 245,

718—722.199. S a y e r s G., B e a l l R. J., S e e l i g S., (1972), Science, 175, 1127—1133.200. H a s k a r A., P e r o n F. G., (1972), Biochem. Biophys. Res. Commun., 47,

445—450.201. R a y T. K., T o m a s s i V., M a r i n e t t i G. V., (1970), Biochim. Biophys.

Acta, 211, 20—30.202. W e i t o n A. F., L a d P. L., N e w b y A. A. , Y a m a m u r a H., (1977), J. Biol.

Chem., 252, 5947—5950.203. T o m a s s i V., K o r e t z S., R a y T. K., D u n n i c J., M a r i n e 11 i G. V.,

(1979), Biochem. Biophys. Acta, 211, 31—42.204. S c h r a m m M., O r l y J., E i m e r l S., K o r n a M., (1977), Nature, 268,

310—313.205. C u a t r e c a s a s P., (1975), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72, 33—37.206. P o h l S. L., K r a n s H. M. J., K o z y r e f f V., B i r n b a u m e r L., R o d -

b e l l M., (1971), J. Biol. Chem., 246, 4447—4454.207. L e v e y G. S., F l e t c h e r M. A., K l e i n J., (1975), Adv. Cyclic Nucleotide

Res., 5, 53—65.208. R o d b e l l M., (1973), Fed. Proc., 32, 1854—1858.209. L a d P. M„ W e i t o n A. F., R o d b e l l M., (1977), 252, 5942—5946.210. L in M. C., N i c o s i a S., L a d P. M., R o d b e l l M., (1977), J. Biol. Chem.,

252, 2790—2792.211. G o l d f i n e I. D., (1977), Diabetes, 26, 148—155.212. W i l l i n g h a m M. C., P a s t a n I., (1978), Cell, 13, 501—507.213. K o ł a t a B. G„ (1978), Science, 201, 895—897.214. J a c o b s S., C h a n g K. J., C u a t r e c a s a s P., (1978), Science, 200, 1283—

1289.215. K a h n C. R., B a i r d K., F l i e r J. S., J a r r e t D. B., (1977), J. Clin.

Invest., 60, 1094.216. M i t r a S., R a o C h. V., (1978), Arch. Biochem. Biophys., 185, 126—133.

http://rcin.org.pl

Post. B io c h e m . , 25, 401—416 (1979).

ANNA POTEM PSKA *

Biochemiczna charakterystyka neurotubuli

Biochemical Characteristics of Neurotubules

Spis TreściI. WstępII. Tubulina

II-1. Występowanie w mózguII-2. Preparatyka i oznaczanie ilościowe tubulinyII-2.1. PreparatykaII-2.2. Oznaczenia ilościoweII-3. BudowaII-4. Aktywności enzymatyczne II-5. Miejsca wiążące tubuliny

III. Białka towarzysząceIV. Agregacja i dezagregacja mikrotubuliV. Fizjologiczna rola tubuliny w mózgu

Contents

I. IntroductionII. Tubulin

II-l. Distribution in the brainII-2. Isolation and estimation of tubulin contentII-2.1. Isolation proceduresII-2.2. Analytical methodsII-3. StructureII-4. Enzymic activityII-5. Binding sites on tubulin

III. Microtubule associated proteinsIV. Assembly and disassembly of microtubulesV. Physiological role of tubulin in the brain

* Dr, Zakład Biochemii Układu Nerwowego i Mięśni, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, PAN, Pasteura 3, 02-093 Warszawa

http://rcin.org.pl

402 A . PO TEM PSK A [2)

I. Wstęp

M ikrotubule są białkowym i, rurkow atym i organellam i w ystępującymi niemal we w szystkich kom órkach. Powszechność ich występow ania wiąże się z szeregiem funkcji jakie pełną w komórce, np.: udział m ikro tubuli w ruchu chromosomów podczas mitozy, przy różnicowaniu i zachowaniu kształtu komórek, w w ew nątrzkom órkow ym transporcie i zjaw iskach ruchliwości kom órkowej.

Ryc. 1. Budowa mikrotubuli A — schemat mikrotubuli, B — schemat pod jednostkowej budowy mikrotubuli (na podstawie: 3, 9, 70).

N a sch em a c ie n ie u w zg lęd n io n o b ia łe k to w a rzy szą cy ch .

Typowe m ikrotubule, k tórych schem at przedstaw iono na Ryc. 1, są cylindram i o średnicy około 24 nm (1) i grubości ścian 4 nm. Zbudow ane są one z podłużnych protofilam entów (najczęściej 13), ułożonych lewo- skrętnie o skoku 10-20° (2). Protofilam enty składają się z g lobularnych podjednostek białkowych.

C harakterystyczną cechą m ikro tubuli jest ich zdolność do agregacjii dezagregacji.

dezagregacjaM ikrotubule *-------- -----------: Podiednostki białkowe

agregacja

Procesy te zależą od szeregu czynników takich jak np. zm iany tem peratury , ciśnienie hydrostatyczne.

Głównym białkiem tw orzącym podjednostki jest tubulina stanow iąca około 80—90°/o w szystkich białek, ponadto w skład m ikrotubuli wchodzą tzw. białka towarzyszące, których część tworzy w ypustki nazwane ram ionam i i mostami.

M ikrotubule, ich budowę, właściwości i funkcję w ielokrotnie opisyw ano w artyku łach przeglądow ych (3— 7) i opracowaniach m onograficznych (8, 9). W literatu rze polskiej b rak jest jednak dotychczas biochemicznej charak terystyk i neuro tubuli czyli m ikrotubuli neuronalnych.

http://rcin.org.pl

[3] BIOCHEM IA N E U R O T U B U LI 403

II. Tubulina

II-l. W ystępowanie w mózgu

Tubulina w ystępuje w mózgu w znacznych ilościach (dwu-, trzykro tnie w yższych niż w innych tkankach — cyt. wg. 9) stanowiąc 3— 7% całkow itej ilości białek mózgu ssaków (10— 12). Jej bezwzględna ilość we frakc ji rozpuszczalnej i błonowej jest podobna. Procentow ą zaw artość tubu liny we frakcji rozpuszczalnej szacuje się na 15— 25% wszystkich białek tej frakcji, natom iast we frakcji błonowej zaledwie na 1,5— 5% (10, 11, 13— 15). Tubulina frakcji błonowej w ystępuje głównie (70°/o) w zakończeniach nerw owych to jest synaptosom ach, stanowiąc czwartą część w szystkich białek synaptosom alnych (16). Podobny udział tubuliny stw ierdzono w białkach błon synaptoplazm atycznych — 23%, pęcherzyków synap tycznych— 19%, i synap top lazm y— 17—28% (13, 17— 19).

Rozdzielając elektroforetycznie białka oczyszczonych błon postsynap- tycznych (19— 22) i złącza synaptycznego (22, 23) stwierdzono, że głównym białkiem tych substruk tu r jest tubulina.

II-2. Preparatyka i oznaczanie ilościowe tubuliny

II-2.1. P r e p a r a ty k a

Przez szereg Jat nie udawało się otrzym ać czystej tubuliny i w związku z tym często przypisywano tubulinie właściwości, które jak się okazało, w ynikają z zanieczyszczeń.

HOMOGENAT

100 000 g 0°C

SUPERNATANT (tubulina frakcji rozpuszczalnej mikrotubule w formie zdezagregowanej)

IIinkubacja 37°C

100 000 g

OSAD(mikrotubulezagregowane)

SUPERNATANT (pozostałe białka rozpuszczalne)

OSAD(tubulina frakcji nierozpuszczalnej)

+ 0,5% Nonidet P40, 0°C|

+ Winblastyna

IKRYSZTAŁY TUBULINY

B

Ryc. 2. Schemat otrzymywania mikrotubuli z frakcji rozpuszczalnej (A) i tubuliny z frakcji błonowej (B).

http://rcin.org.pl

404 A. PO TEM PSK A [4]

Tubulinę na skalę p reparatyw ną otrzym uje się obecnie z mózgów świni lub wołu. Zasadę metody, opartą na właściwościach agregacji i dezagregacji m ikrotubuli w różnych w arunkach tem peratu ry , podał S h e - 1 a n s k i (24). Schem at m etody przedstaw ia rycina 2A. W pierwszym etapie, dzięki k ilkukrotnym cyklom agregacji i dezagregacji otrzym uje się p repara t oczyszczonych m ikrotubuli zaw ierających głównie tubulinę (80—90%) oraz białka towarzyszące. W e i n g a r t e n i wsp. (15) otrzym ali 75 mg białka m ikrotubuli z jednego mózgu świni. Analiza sedym entacyjna wykazała, że p repara ty otrzym ane m etodą Shelanski’ego zawiera ją co najm niej trzy składniki o stałych sedym entacji około: 6S (dimer tubuliny), 20S i 36S (25, 26). Te dwa ostatnie są form am i oligomerycz- nym i w ystępującym i jako pierścienie lub spirale (26, 27). Należy podkreślić, że stosując metodę cyklicznej agregacji i dezagregacji otrzym uje się m ikrotubule w ystępujące we frakcji rozpuszczalnej to jest supernatancie otrzym anym po w irow aniu przy 100 OOOg w 0°C. Natom iast tu b u linę frakcji nierozpuszczalnej otrzym uje się ekstrahu jąc błony roztworem detergentu — 0,5°/o Nonidet-P40 w 0°C a następnie w ytrąca z ekstrak tu w inblastyną (28) — Ryc. 2B. Alkaloidy Vinca : w inblastyna, w inkrystyna, w ytrącają wybiórczo tubulinę z roztw oru (29). Procedura ta jednakże m odyfikuje cząsteczkę tubuliny (por. III-4), ma więc ograniczone zastosowanie. Czystą tubulinę można otrzym ać z p repara tu m ikrotubuli stosując chrom atografię na DEAE-Sephadex lub hydroksyapatycie oraz w ytrącanie siarczanem amonu (30, 31).

%II-2.2. O znaczen ia ilo śc io w e

Oznaczenia ilości tubuliny w tkance przeprowadza się w dwojaki sposób. W pierwszym w ykorzystuje się ilościowe łączenie się tubuliny z kolchicyną 37°C. Nadm iar niezwiązanej kolchicyny usuwa się, sącząc badane próby przez DEAE-celulozę, do której tubulina ma silne powinowactwo (34), lub adsorbując na węglu aktyw nym (12). Za pomocą tej m etody można oznaczyć kilkadziesiąt m ikrogram ów tubuliny, w ychodząc z kilkunastu m iligram ów świeżej tkanki. Ostatnio wprowadzono metodę radioimmunologiczną, która jest około 100 razy bardziej czuła niż metoda oparta na wiązaniu kolchicyny. Można przy jej użyciu oznaczyć jeden do kilku m ikrogram ów tubuliny w próbie (35, 36). Zasada m etody polega na współzawodnictwie w reakcji immunologicznej m iędzy radioaktyw nym [125J] standardem tubuliny a dodawaną nieznaną ilością tubuliny.

II-3. Budowa

Ze względu na duży udział procentow y tubuliny w białkach frakcji rozpuszczalnej homogenatów tkanki mózgowej (por. I I- l) i dobrze opra-

http://rcin.org.pl


cowaną m etodę jej otrzym yw ania (por. II) większość badań dotyczących s tru k tu ry i właściwości tego białka przeprowadzono stosując tubulinę wyizolowaną z frakcji rozpuszczalnej. W budowie i właściwościach tubuliny frakcji błonowej i rozpuszczalnej stw ierdzono jedynie niewielkie różnice (28, 37).

T ubulina jest białkiem o ciężarze 110— 120 tys. i stałej sedym entacji S2W0 = 5,8 S (38—40). Jej cząsteczka ma kształt elipsoidalny o stosunku średnic 5:7. Badano trzeciorzędową s tru k tu rę tubuliny z mózgu świni przy zastosowaniu analizy dichroizm u kołowego i stwierdzono, że w tem peratu rze 4°C i w pH .= 6,5 ma ona s truk tu rę a-heliksu w 22°/o, typu (3 w 30°/o i kłębka statystycznego w 48°/o. W tem peraturze 37°C następuje całkowita u tra ta s tru k tu ry a-heliksu (41). Tubulina jest białkiem kwaśnym o pi w granicach 5,2—5,4. Podczas elektroforezy w żelu poliakrylam idow ym cząsteczka tubuliny rozdziela się na dwie podjednostki a

i P o ciężarze około 53 000—56 000 w ystępujące w stosunku 1:1 (30, 31, 42— 45). P rążek P m igruje nieco szybciej w kierunku do anody niż a.

Bardziej czułe metody, elektroforeza dw ukierunkow a połączona z izc- elektroogniskowaniem wykazały m ikroheterogenność obu prążków (31, 45— 46). Podjednostka a ma 4 form y o takiej samej masie różniące się punktem izoelektrycznym , a podjednostka (3 — 5 form (46). Skład amino- kwasowy obu podjednostek jest bardzo podobny lecz nie identyczny (31, 48— 52). Każdy z łańcuchów zawiera ponad 500 reszt aminokwasowych. W obu podjednostkach przew ażają reszty kwasu glutaminowego i asparaginow ego (odpowiednio około 130 i 100 reszt na dimer tubuliny). Am inokwasem N-końcowym jest w obu podjednostkach m etionina (42). Łańcuch a tubuliny frakcji rozpuszczalnej ma na C-końcu tyrozynę. Am inokwas ten nie w ystępuje na C-końcu podjednostki a tubuliny frak cji błonowej (28). Nie stwierdzono obecności m ostków dwusiarczkowych (42), wykazano natom iast występowanie 16 grup -SH na cząsteczkę dim eru (52). Nieznaczne różnice stw ierdzono w składzie peptydowym podjednostek a i (i po traw ieniu ich trypsyną (13, 51, 53).

Pomimo, że niektórzy badacze (53) stw ierdzili w tubulinie znaczną zawartość aminocukrów, w świetle ostatnich badań, wydaje się, że nie zawiera ona reszt aminocukrów a jedynie nieznaczne ilości (około 1 mola na dimer) cukrów obojętnych (49). Prawdopodobnie uprzednie wyniki były następstw em niedostatecznego oczyszczania preparatów tubuliny.

II-4. Aktywności enzymatyczne

Ze względu na trudności z otrzym aniem czystej tubuliny, przypisywano jej często aktyw ności enzym atyczne znajdow ane w preparatach m ikrotubuli, a związane z innym i białkami. Najwięcej uwagi poświęcono kinazie białkowej w prowadzającej resztę fosforanową do podjednostki (3. Początkowo sądzono, że tubulina pełni funkcję tego enzymu (54). W nikliwe badania nie potw ierdziły jednak tego przypuszczenia (55). S tw ie r-

http://rcin.org.pl


dzono bowiem, że kinaza adsorbuje się na cząsteczce tubuliny i jej aktywność można oddzielić od tubuliny w procesie wielokrotnego oczyszczania. Fosforylacji ulega jedna reszta seryny z podjednostki 0 wówczas gdy tubulina jest w form ie dim eru (55— 57). Reakcję tę stym ulują cykliczne nukleotydy i jony Zn2+ (56, 58, 59). Należy zaznaczyć, że fosfory lacji ulegają również białka towarzyszące (56, 60).

W preparatach oczyszczonych m ikrotubuli znaleziono aktywność enzymu wbudowującego tyrozynę w pozycję C-końcową podjednostki a bez udziału t-RNA (61— 63). Aktywność tego enzym u zmienia się z wiekiem zwierząt (63), nie wiadomo jednak, jaka jest jego rola fizjologiczna. Nie ma również danych w skazujących, że oczyszczona tubulina w ykazuje aktyw ność tego enzymu.

O statnio przypisuje się tubulinie aktyw ność ATPazy (64) i GTPazy (65).

II-5. Miejsca wiążące tubuliny

Wykazano, że tubulina ma zdolność wiązania nukleotydów, alkaloidów i wapnia. K ażdy dimer tubuliny ma dwa m iejsca wiążące nukleotydy guaninowe, jedno — wiążące kolchicynę i podofilinę, jedno — wiążące alkaloidy Vinca oraz szereg miejsc wiążących wapń.

Nukleotydy

C harakterystyka m iejsc wiążących nukleotydy guaninowe wykazała, że jedno z nich (N) wiąże cząsteczkę nukleotydu trw ale, natom iast nukleotyd związany w m iejscu (E) łatw o ulega wym ianie z nukleotydam i znajdującym i się w środowisku (39, 66, 67). Stwierdzono, że łączenie nukleotydów wym aga obecności jonów Ca2+, Mg2+ oraz wolnych grup -SH tubuliny (68). Stałe dysocjacji kom pleksu tubulina-nukleotyd w ynoszą 0 ,5X 10-6M dla GTP i 1 ,9X 10-6M dla GDP (68).

Kolchicyna

Tubulina mózgowa, podobnie jak tubulina z innych tkanek wiąże ilościowo kolchicynę w stosunku 1 mol kolchicyny na 1 mol dimeru tu buliny (39). Optym alne w arunki tej reakcji to pH = 6,7— 6,8 (40), tem pera tu ra 37°C (37). W iązanie zachodzi powoli i w czasie reakcji część cząsteczek tubuliny denatu ru je (69). Stała asocjacji (in vitro) kompleksu tubulina-kolchicyna wynosi 0,4X 10“® M (70), a okres półtrw ania 36 godzin (69). Stabilność kom pleksu w zrasta wraz ze wzrostem siły jonowej

http://rcin.org.pl


(40). Czynniki denaturujące (mocznik, etanol, aceton, kwas nadchlorowy) uniemożliwiają łączenie się tubuliny z kolchicyną. Inny alkaloid, podo- filina współzawodniczy z kolchicyną o miejsce wiązania. Alkaloidy Vinca stabilizują kompleks tubulina—kolchicyną, nie w pływ ają jednak na szybkość reakcji wiązania (37, 40). K inetyka reakcji wiązania kolchicyny z tubuliną w ystępująca we frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej homogenatów tkanki mózgowej różnią się. Okres półtrw ania kompleksu kolchicyny z tubuliną frakcji nierozpuszczalnej jest dw ukrotnie dłuższy (37).

Alkaloidy Vinca

W inblastyna (VBL) i w inkrystyna (VCR) w stężeniu 10~5— 10~3M w ytrącają tubulinę z roztw oru w postaci kryształów (71, 72). K ryształy te zawierają rów ną ilość tubuliny a i (5 (29). Uważa się, że precypitacja w ywołana w inblastyną polega na uwolnieniu z cząsteczki tubuliny trw ale związanego GTP z miejsca N, co zmienia konform ację tubuliny (66).

Wapń

W nikliwe badania nad wiązaniem wapnia przez tubulinę (73) wykazały występowanie dwóch rodzajów m iejsc wiążących: o wysokim i niskim powinowactwie do wapnia. Dimer tubuliny zawiera jedno miejsce o w ysokim powinowactwie do Ca2+ (stała dysocjacji wynosi 3,2X10-8 M) i 16 miejsc o niskim powinowactwie do Ca2+ (stała dysocjacji rów na się 2,8X10-4M).

III. Białka towarzyszące

Jak wspomniano uprzednio klkanaście procent białek m ikrotubuli s ta nowią tzw. białka towarzyszące. Nie można ich oddzielić od tubuliny w procesie oczyszczania m ikrotubuli. Rozdział elektroforetyczny w żelu poliakrylam idowym wykazał obecność szeregu białek o ciężarze cząsteczkow ym 'w granicach 270 000— 370 000; są to tzw. białka HM W (High Molecular Weight) (33) oraz białka niskocząsteczkowego nazwanego przez W eingartena (74) białkiem t. Brak jest dotychczas dokładnych danych na tem at liczby białek HMW i ich ciężarze cząsteczkowym. Dane przedstawiane przez poszczególne pracownie różnią się dość znacznie w zależności od stosowanej metody oczyszczania m ikrotubuli i rodzaju elektroforezy (67, 75— 77). Sugeruje się, że białka HMW tworzą boczne wypustki, ,,ra miona” m ikrotubuli (76, 78—81, Ryc. 1).

http://rcin.org.pl

408 A. PO TEM PSK A 181

Białko t ma ciężar 55 000—70 000 (3, 25, 74, 82) i współczynnik sedym entacji, oznaczony m etodą analitycznego ultraw irow ania — S°ow = 2,6 S (32, 83). Świadczy to, że cząsteczka białka r w ykazuje znaczną asym etrię (stosunek średnic 20:1). Badania przy zastosowaniu dichroizm u kołowego w ykazały małą zawartość s tru k tu ry a-heliksu. Podczas elektroforezy w żelu poliakrylam idowym w połączeniu z izoelektroogniskowaniem białko to rozdziela się na 4 prążki o ciężarze 62 000, 58 000, 56 000 i 55 000. P unkt izoelektryczny dwóch cięższych składników leży w granicach 6,5— 7,7, a lżejszych — 7,4-8,0 (83).

Białko t jest oporne na 5-minutowe ogrzewanie w 100°C (74). S tw ierdzono, że białko to, podobnie jak białka HMW, ulega fosforylacji (60, 83). Stosując m etody immunologiczne (84) wykluczono wcześniejsze przypuszczenie (81), iż białko to jest produktem degradacji białek HMW.

Ostatnio stw ierdzono metodami im m unofluorescencyjnym i, że w nienaruszonych kom órkach zarówno białka HMW jak i białko t, są związane z tubuliną (84). Można więc powiedzieć, że kompleks tubuliny z białkam i towarzyszącym i jest kompleksem natyw nym (analogicznie do kom pleksu DNA z białkam i w chrom atynie).

IV. Agregacja i dezagregacja mikrotubuli

Tworzenie długich, cylindrycznych s tru k tu r z dimerów tubuliny jest przedm iotem wielu prac ostatnich lat. Badania, prowadzone głównie in vitro, m ają na celu określenie optym alnych w arunków , mechanizm u i czynników regulujących procesy agregacji i dezagregacji. Zjawiska te m ają zasadnicze znaczenie dla wyjaśnienia funkcji m ikrotubuli w komórce.

Optym alne w arunki agregacji m ikrotubuli in vitro to: tem peratu ra 37°C (26, 85), stężenie tubuliny około 1 mg/ml (86), obecność GTP (24, 87—89), brak jonów Ca2+ (26, 90), pH w granicach 6,8— 6,9 (9), obecność białek towarzyszących (74, 83, 91). Stwierdzono, że agregację ułatw iają: czynnik wzrostowy nerw ów — NGF (92), polikationy (93) i glicerol (24).

Czynnikami ham ującym i agregację są polianiony, np. RNA (94, 95), alkaloidy Vinca i kolchicyna (6). W nieobecności białek towarzszących i w wyższym stężeniu tubuliny — 2,5 mg/ml (85) agregacja zachodzi, jed nak niecałkowicie. Pow stałe wówczas m ikrotubulne m ają gładkie pow ierzchn ie— bez w ypustek (78, 79, 81).

W świetle najnow szych badań można zaproponować następujący schem at agregacji (Ryc. 3). W procesie agregacji można w yróżnić dwie fazy: inicjacji i wydłużania m ikrotubuli. P ierw szym etapem inicjacji jest u tw orzenie „aktyw nego” dim eru tubuliny, co wym aga udziału nukleotydów guaninowych. Stwierdzono, że w arunkiem niezbędnym do inicjacji jest związanie GTP w m iejscu E i następnie hydroliza GTP do GDP i Pi (82).

http://rcin.org.pl

BIOCHEM IA N E U R O T U B U L I 409

Cząsteczka tubuliny zyskuje w tedy konform ację sprzyjającą agregacji. A ktyw ny dimer może agregować tworząc form y oligomeryczne: pierścienie i spirale, które są ze sobą w równowadze. Do tworzenia form oligo- m erycznych niezbędne są, jak to omówiono wyżej, białka towarzyszące (27, 70, 80, 96). Obecność białka t umożliwia tworzenie się pojedynczego pierścienia, a białka HMW — podwójnego (27). Przypuszcza się, że form y oligomeryczne pełnią rolę ośrodków nukleacji w procesie agregacji m ikrotubuli (97). Należy zaznaczyć, że często ośrodkam i nukleacji są również organelle komórkowe — centriole, ciałka podstawowe lub fragm enty m ikrotubuli.

Ryc. 3. Schemat powstawania mikrotubuli (na podstawie: 9, 26, 70, 96').

Powyższe procesy należą do fazy inicjacji. W fazie wydłużania z form oligomerycznych powstają krótkie protofilam enty, do których dołączają się kolejne cząsteczki dim eru tubuliny tworząc, dzięki wiązaniom bocznym i podłużnym, płaskie s tru k tu ry — arkusze oraz rurkow ate m ikrotu-

http://rcin.org.pl


bule. W ydaje się, że nukleotyd z m iejsca N bierze udział w tworzeniu wiązań podłużnych, zaś z m iejsca E — bocznych (66).

Badania prowadzone in vitro w ykazały złożony mechanizm regulacji procesów agregacji i dezagregacji. Do głównych czynników regulujących zalicza się stężenie jonów Ca2+, ilość białek towarzyszących, obecność nukleotydów guaninowych, przede wszystkim — GTP oraz tem peraturę. Trudno jest na razie określić, które z tych czynników pełnią zasadniczą rolę w procesach agregacji i dezagregacji in vivo. Istn ieją dane w skazujące na regulacyjne działanie tem pera tu ry w tych zjaw iskach (98, 99), nie wyklucza się również udziału jonów Ca2+ (17).

V. Fizjologiczna rola tubuliny w mózgu

M ikrotubule w układzie nerw ow ym oprócz funkcji jakie pełnią we w szystkich kom órkach (por. rozdz. I.), biorą udział w procesach tran spo rtu wzdłuż aksonu i dendrytów . Synteza większości składników m akrom olekularnych odbywa się w ciele kom órki nerw owej. Substancje te są tra n sportowane następnie do zakończeń nerw owych znajdujących się nieraz w bardzo znacznej odległości od m iejsca ich syntezy. Alkaloidy (kolchicyna, w inblastyna) ham ują szybki aksonalny przepływ szeregu substancji, co w skazuje na udział neuro tubuli w tym rodzaju transportu (9, 100— 102). W ydaje się, że neurotubule w aksonie pełnią rolę nośnika, po którym „ślizgają” się poruszające się cząsteczki (cyt. za 103). Badania prowadzone in vivo i in vitro na nerw ach obwodowych ropuchy (98), oraz na izolowanych nerw ach kraba (99) w ykazały, że w aksonach zachodzi agregacja i dezagregacja neurotubuli pod wpływem zmian tem pera tu ry w zakresie + 2°C— +25°C. Czas trw ania kom pletnej agregacji i dezagregacji wynosi kilkanaście do kilkudziesięciu m inut. Procesy te nie są sterow ane przez ciało kom órki (98).

W zakończeniach nerw owych obserwowano znaczne nagrom adzenie m ikrotubuli w pobliżu pęcherzyków synaptycznych i w rejonie błony presynaptycznej (104, 105). Stwierdzono, że neurotubule w zakończeniu nerw owym mogą ulegać dezagregacji, nie zaobserwowano jednak ponownej agregacji (106). W ydaje się, że dezagregację m ikrotubuli w zakończeniu nerw owym powodują jony Ca2f, których stężenie jest wyższe niż w aksonie (106). Przypuszcza się, że tubulina synaptosom alna odgrywa rolę przy wydzielaniu neurotransm iterów : noradrenaliy i serotoniny (107, 108). Stwierdzono ponadto ham ujący wpływ alkaloidów na pobieranie i wydzielanie z synaptosom ów kwasu y-aminomasłowego (GABA), noradrenaliny i dopaminy (109). Postuluje się, że tubulina może być czynnikiem regulującym neurotransm isję dzięki zmianom swoich własności w zależności od stężenia Ca2+ (17).

http://rcin.org.pl

[11] BIOCHEM IA N E U R O T U B U L I 411

Kolejnym , mało poznanym zagadnieniem jest rola tubuliny związanej z błonami zakończeń nerwowych, w k tórych tubulina w ystępuje w znacznych ilościach (por. I I - l .). Przypuszcza się, że jest ona białkiem s tru k tu ralnym i stanowi szkielet, w którym umieszczone są inne białka (32, 36).

Ilość tubuliny w mózgu, szybkość jej syntezy oraz zdolność do agregacji zm ieniają się podczas rozwoju oraz w różnych w arunkach fizjologicznych. Jest to białko o okresie półtrw ania wynoszącym kilka dni (110, 111). Stężenie tubuliny w mózgu różnych zw ierząt oraz szybkość syntezy tego białka osiągają m aksim um w krótkim czasie po urodzeniu, po czym wartości te spadają osiągając poziom charakterystyczny dla zwierząt dorosłych (11, 14, 110, 112, 113). Dokładne badania zmian ilości tubuliny podczas rozwoju kurczęcia przeprowadził B a m b u r g (112, Tabela 1). Trudno jest natom iast interpretow ać rozbieżne w yniki dotyczące zmian zdolności tubuliny do agregacji (por. 113 z 114, 115).

Tabela 1Porównanie zmian ilości tubuliny we frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej ze zmianami

ilości białka w tych frakcjach podczas rozwoju mózgu kurczęcia

Czas inkubacji jaja (dni)

Frakcja ro;

białko A %

jpuszczalna (A)

tubulina A %

.Frakcja nieroz

białko B %

puszcza!na (B)

tubulina B %białko calkow. białko całkow. białko całkow, białko całkow.

5 _ 10.5 07 58 15.7 42 09 54 22.5 46 0.5

11 56 22.1 42 —

13 56 23.2 44 0.915 46 22.8 54 —

17 50 21.5 50 1.819 46 — 54 —

22a 48 15.1 52 —

28—29 42 14.1 58 3.2200b 37 9.4 63 2.2

—, brak danych; a, wyklucie się kurczęcia; b, osobniki dorosłe D ane wybrane ze 112

W ydaje się, że zmiany ilości tubuliny w poszczególnych częściach mózgu wiążą się z przejm ow aniem funkcji przez daną struk turę . Na przykład stężenie i szybkość syntezy tubuliny w korze wzrokowej szczurów jest największa w ciągu kilku dni po otw arciu oczu (116, 117). Zjawiska tego nie obserwowano w przypadku szczurów hodowanych w ciemności. Natom iast w ystawienie na światło szczurów hodowanych przez 25—50 dni od urodzenia w ciemności, powoduje wzrost ilości i szybkości syntezy tubuliny (117— 120). Obserwowano również wzrost ilości tubuliny w ko

http://rcin.org.pl

412 A. PO TE M PSK A [12]

rze wzrokowej kotów w podobnych w arunkach doświadczalnych (A. P o - t e m p s k a — nieopublikowane). Na podstawie ham ującego w pływu kolchicyny na proces trw ałego zapam iętyw ania wyuczonego zadania postulowano, że tubulina może być chemicznym podłożem pamięci (100). W ydaje się jednak, że na obecnym etapie wiedzy nie można jeszcze w yciągać tak daleko idących wniosków. Hipoteza ta w skazuje w jakim kierunku mogą się rozwijać badania nad rolą tubu liny w układzie nerw owym.

Zaakceptowano do druku 22.03.1979

PIŚMIENNICTWO

1. B r y a n J., (1974), Bioscience, 24, 701—711.2. B u r t o n P. R., (1966), J. Morphol., 120, 397—424.3. G a s k i n F., S h e l a n s k i M. L., (1976), Assays in Biochemistry, 12, 115—146.4. K w i a t k o w s k a M., (1974), Post. Biol. Kom., 1, 237—253.5. K w i a t k o w s k a M., (1974), Post. Biol. Kom., 1, 255—275.6. O l m s t e d J. B., B o r i s y G. G., (1973), Ann. Rev. Biochem., 42, 507—540.7. S n y d e r J. A., M c I n t o s h J. R., (1976), Ann. Rev. Biochem., 45, 699—720.8. B o r g e r s M., D e B r a b a n d e r M., (1975), „Microtubules and Microtubu

le Inhibitors”, North-Holland Publishing Company, Amsterdam.9. D u s t i n P., (1978), „Microtubules”, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New

York.10. G o z a 1 e s L. W., G e e 1 S. E., (t978), J. Neurochem., 30, 237—245.11. S c h m i t t H., G o z e s I., L i t t a u e r U. Z., (1977), Brain Res., 121, 327—

342.12. S h e r l i n e P., B o d w i n C. K., K i p n i s D. M., (1974), Anal. Biochem., 62,

400—407.13. F e i t H., D u t t o n G. R., B a r o n d e s S. H., S h e l a n s k i M. L., (1971),

J. Cell Biol., 51, 138—147.14. N u n e z J., F e l l o u s A., F r a n c o n J., L e n n o n A.-M., (1975), w „Mi

crotubules and Microtubule Inhibitors” red. Borgers M., De Brabander M.,North- -Holland Publishing Company, Amsterdam, str. 269—279.

15. W e i n g a r t e n M. D., S u t e r M. M., L i t t m a n D. R., K i r s c h n e r M. W., (1974), Biochemistry, 13, 5529—5537.

16. L a g n a d o J. R., L y o n s C., W i c k r e m a s i n g h e G., (1971), FEBS Letters, 15, 254—258.

17. B l i t z A. L., F i n e R. E., (1974), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 71, 4472—4476.18. F e i t H., B a r o n d e s S., (1970), J. Neurochem., 17, 1355—1364.19. W a l t e r s B. B., M a t u s A. I., (1975), Nature, 257, 496—498.20. B a n k e r G., C h u r c h i l l L., C o t m a n C. W., (1974), J. Cell Biol., 63,

456—465.21. F e i t H., K e l l y P., C o t m a n C. W., (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 74,

1047—1051.22. K e l l y P. T., C o t m a n C. W., (1978), J. Cell Biol., 79, 173—183.23. W a l t e r s B. B., M a t u s A. I., (1975), Biochem. Soc. Trans., 3, 109—112.24. S h e l a n s k i M. L., G a s k i n F., C a n t o r Ch. R., (1973), Proc. Nat. Acad.

Sci. USA., 70, 765—768.

http://rcin.org.pl


25. D o e g n e s K. H., B i e d e r t S., P a w e l e t z N., (1976), Biochemistry, 15, 2995—2999.

26. K i r s c h n e r M. W., W i l l i a m s R. C., W e i n g a r t e n M., G e r h a r t J. C., (1974), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 71, 1159—1163.

27. V a l l e e R. B., B o r i s y G. G., (1978), J. Biol. Chem., 253, 2834—2845.28. N a t h J., F l a v i n M., (1978), FEBS Letters, 95, 335—338.29. B r y a n J., (1972), J. Mol. Biol., 66, 157—168.30. L e e J. C., F r i g o n R. P., T i m a s h e f f S. N., (1973), J. Biol. Chem., 248,

7253—7262.31. L u R. C., E l z i n g a M., (1977), Anal. Biochem., 77, 243—250.32. C l e v e l a n d D. V., H w o S.-Y., K i r s c h n e r M. W., (1977), J. Mol. Biol.,

116, 207—225.33. K u z n e t s o v S. A., R o d i o n o v V. I., G e l f a n d V. I., R o s e n b l a t

V. A., (1978), FEBS Letters, 95, 339—342.34. B o r i s y G. G., (1972), Anal. Biochem., 50, 373—385.35. J o n i a u M., D e B r a b a n d e r M., D e M e y J., (1977), Biochem. Soc.

Trans., 5, 1118—1119. *36. M o r g a n J. L., R o d k e y L. S., S p o o n e r B. S., (1977), Science, 197,

578—580.37. L a g n a d o J. R., L y o n s C. A., (1972), Biochem. J., 126, 9P—10P.38. S h e 1 a n s k i M. L., T a y l o r E. W., (1968), J. Cell Biol., 38, 304—316.39. W e i s e n b e r g R. C., B o r i s y G. G., T a y l o r E. W., (1968), Biochemi

stry, 7, 4466—4479.40. W i l s o n L., (1970), Biochemistry, 9, 4999—5007.41. V e n t i l l a M., C a n t o r Ch. R., S h e l a n s k i M., (1972), Biochemistry, 11,

1554—1561.42. E i p p e r B. A., (1974), J. Biol. Chem., 249, 1407—1416.43. E l - H a m a l a w i A.-R.A., (1978), Biochem. J., 169, 717—719.44. F e i t H., S l u s a r e k L., S h e l a n s k i M., (1971), Proc. Nat. Acad. Sei. USA.,

68, 2028—2031.45. O l m s t e d J. B., W i t m a n G. B., C a r l s o n K., R o s e n b a u m J. L.,

(1971), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 68, 2273—2277.46. G o z e s I., L i t t a u e r U. Z., (1978), Nature, 273, 411—413.47. M a r o t t a Ch. A., H a r r i s J. L., G i l b e r t J. M., (1978), J. Neurochem.,

30, 1431—1440.48. B r y a n J., W i l s o n L., (1971), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 68, 1762—1766.49. E i p p e r B. A., (1972), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 69, 2283—2287.50. F e i t H., N e u d e c k U., G a s k i n F., (1977), J. Neurochem., 28, 697—706.51. I q b a l K., G r u n d k e - I q b a l I., W i s n i e w s k i H. M., T e r r y R. D.,

(1977), J. Neurochem., 29, 417—424.52. L u d u e n a R. F., W o o d w a r d D. O., (1973), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 70,

3594—3598.53. M a r g o l i s R. K., M a r g o l i s R. U., S h e l a n s k i M. L., (1972), Biochem.

Biophys. Res. Commun., 47, 432—437.54. S o i f e r D., L a s z l o A. H., S c o t t o J. M., (1972), Biochim. Biophys. Acta,

271, 182—192.55. E i p p e r B. A., (1974), J. Biol. Chem., 249, 1398—1406.56. L a r s s o n H., E d s t r ö m A., W a l l i n M., (1977), J. Neurochem., 29, 115—

120.57. R e d d i n g t o n M., L a g n a d o J. R., (1973), FEBS Letters, 30, 188—194.58. G o o d m a n D. B. P., R a s m u n s s e n H., D i B e l l a F., E a r l G u t h r o w

C., Jr., (1970), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 67, 625—659.

9 P o stę p y B io ch em ii http://rcin.org.pl


59. L a g n a d o J. R., L y o n s C. A., W e l l e r W., P h i l l i p s o n O., (1972), Biochem. J., 128, 95P.

60. L a g n a d o J. R., K i r a z o v E. P., (1975), w „Microtubules and Microtubule Inhibitors” red. Borgers M., De Brabander M., Nort-Holland Publishing Company, Amsterdam, str. 124—140.

61. A r c e C. A., H a l l a k M. E., R o d r i g u e z J. A., B a r r a H. S., C a p u t o R., (1978), J. Neurochem., 31, 205—210.

62. A r g a r a n a C. E., A r c e C. A., B a r r a H. S., C a p u 11 o R., (1977), Arch. Biochem. Biophys., 180, 264—268.

63. D e a n in G. G., T h o m p s o n W. C., G o r d o n M. W., (1977), Develop. Biol.,57, 230—233.

64. G e l f a n d V. I., G o y e v a F. K., R o s e n b l a t V. A., S h a n i n a N. A., (1978), FEBS Letters, 88, 197—200.

65. D a v i d - P f e u t y T., L a p o r t e J., P a n z a l o n i D., (1978), Nature, 272, 282—284.

66. B e r r y R. W., S h e l a n s k i M. L., (1972), J. Mol. Biol., 71, 71—80.67. B o r i s y G. G. , M a r c u m J. M., O l m s t e d J. B., M u r p h y D. B., J o h n

s o n K. A., (1975), Ann. N.Y. Acad. Sei., 253, 107—132.68. A r a i T., I h a r a Y., A r a i K., K a z i r o Y., (1975), J. Biochem., 77,647—658.69. G a r l a n d D., T e l l e r D. C., (1975), Ann. N.Y. Acad. Sei., 253, 232—238.70. B o r i s y G. G., J o h n s o n K. A., M a r c u m J. M., (1976), w „Cell Motility”

red. Goldman R., Pollard T., Rosenbaum J., Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1093—1108.

71. B e n s c h K. G., M a r a n t z R., W i s n i e w s k i H., S h e l a n s k i M. L., (1969), Science, 165, 495—496.

72. M a r a n t z R., V e n t i l l a M., S h e l a n s k i M., (1969), Science, 165, 498— 499.

73. S o l o m o n F., (1977), Biochemistry, 16, 358—363.74. W e i n g a r t e n M. D., L o c k w o o d A. H., H w o S.-Y., K i r s c h n e r

M. W., (1975), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 72, 1858—1862.75. D e l a c o u r t e A., P l a n c o t M.-T., H a n K.-K., H i l d e b r a n d H., B i -

s e r t e G., (1977), FEBS Letters, 77, 41—46. <.76. G a s k i n F., K r a m e r S. B., C a n t o r C. R., A d e l s t e i n R., S h e l a n

s k i M. L., (1974), FEBS Letters, 40, 281—286.77. S a n d o v a l I. V., C u a t r e c a s a s P., (1976), Biochem. Biophys. Res. Com

mun., 68, 169—177.78. D e n t l e r W. L., G r a n e t t S., R o s e n b a u m J. L., (1975), J. Cell Biol., 65,

237—241.79. M u r p h y D. B., B o r i s y G. G., (1975), Proc. Nat. Acad. Sei. USA., 72, 2696—

2700.80. S l o b o d a R. D., D e n t l e r W. L., B l o o d g o o d R. A., T e l z e r B. R.,

G r a n e t t S., R o s e n b a u m J. L., (1976), w „Cell Motility” red. Goldman R., Pollard T., Rosenbaum J., Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1171—1212.

81. S l o b o d a R. D., D e n t l e r W. L., R o s e n b a u m J. L., (1976), Biochemistry, 15, 4497—4505.

82. D e l a c o u r t e A., P l a n c o t ' M.-T., B o u t t e a u F., H a n K.-K., H o l - d e b r a n d H. F., B i s e r e t e G., (1977), Biochimie, 59, 479—486.

83. C l e v e l a n d D. W., H w o S.-Y., K i r s c h n e r M. W., (1977), J. Mol. Biol., 116, 227—247.

84. C o n o l l y J. A., K a l n i s U. I., C l e v e l a n d D. W. , K i r s c h n e r M. W.,(1978), J. Cell Biol., 76, 781—786.

http://rcin.org.pl


85. G a s k i n F., C a n t o r C. R., S h e l a n s k i M. L., (1974), J. Mol. Biol., 89, 737—758.

86. O l m s t e d J. B., M a r c u m J. M., J o h n s o n K. A., A l l e n C., B o r i - s y G. G., (1974), J. Supramol. Struct., 2, 429—450.

87. A r a i T., K a z i r o Y., (1977), J. Biochem., 82, 1063—1071.88. S a n d o v a l I. V., J a m e s o n J. L., N i e d e l J., M a c D o n a l d E., C u

a t r e c a s a s P., (1978), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 75, 3178—3182.89. S a n d o v a l I. V., M a c D o n a l d E., J a m e s o n J. L., C u a t r e c a s a s

P., (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 74, 4881—4885.90. W e i s e n b e r g R. C., (1972), Science, 177, 1104—1105.91. F e l l o u s A., F r a n c o n J., L e n n o n A.-M., N u n e z J., (1977), Eur. J.

Biochem., 78, 167—174.92. M e n e s i n i M. G., C h e n J. S., C a l i s s a n o P., L e v i - M o n t a l c i n i R.,

(1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 74, 5559—5563.93. K u z n e t s o v S. A. , G e l f a n d V. l . , R o d i n o v V. l . , R o s e n b l a t V. A.,

G u l y a e v a V. A., (1978), FEBS Letters, 95, 343—346.94. B r y a n J., N a g l e B. W., (1975), w „Microtubules and Microtubule Inhibi

tors”, red. Borgers M., De Brabander M., North-Holland Publishing Company, Amsterdam, str. 91—101.

95. N a g l e B. W., B r y a n J., (1976), w „Cell Motility” red. Goldman R., Pollard T., Rosenbaum J., Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1213—1232.

96. P e n n i n g r o t h S. M., C l e v e l a n d D. W., K i r s c h n e r M. W., (1976), w „Cell Motility” red. Goldman R., Pollard T., Rosenbaum J., Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1233—1257.

97. B o r i s y G. G., O l m s t e d J. B., (1972), Science, 177, 1196—1197.98. E c h a n d i a E. L. R., P i e z z i R. S., (1968), J. Cell Biol., 39, 495—497.99. R o m e - T a l b o t D., A n d r e D., C h a l a z o n i t i s N., (1978), J. Neurobiol.,

9, 247—254.100. C r o n l y - D i l l o n J., C a r d e n D., B i r k s C., (1974), J. Exp. Biol., 61, 443—

454.101. M c C l u r e W. O., (1972), Advanc. Pharmacol. Chemother., 10, 185—220.102. P a u l s o n J. C., M c C l u r e W. O., (1974), Brain Res., 73, 333—337.103. L u b i ń s k a L., (1975), Int. Rev. Neurobiol., 17, 241—296.104. G r a y E. G., (1976), J. Neucytol., 5, 361—370.105. G r a y E. G., (1975), Proc. R. Soc. Lond. B., 190, 369—372.106. L a s e k R. J., H o f f m a n P. N., (1976), w „Cell Motility” red. Goldman R.,

Pollard T., Rosenbaum J., Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1021—'1049.107. S e g a w a T., M u r a k a m i H., I n o u y e A., T a n a k a Y., (1978), J. Neuro-

chem., 30, 175—180.108. T h o a N. B., W o o t e n G. F., A x e l r o d J., K o p i n I. J., (1972), Proc. Nat.

Acad. Sci. USA., 69, 520—522.109. N i c k l a s W. J., P u s z k i n S., B e r l S., (1973), J. Neurochem., 20, 109—'121.110. D u t t o n G. R., B a r o n d e s S., (1969), Science, 166, 1637—1638.111. F o r g u e S. T., D a h l J. L., (1978), J. Neurochem., 30, 1289—1297112. B a m b u r g J. R., S h o o t e r E. M., W i l s o n L., (1973), Biochemistry, 12,

1476—1482.113. K o e h n J. A., O l s e n R. W., (1978), Arch. Biochem. Biophys., 186, 114—120.114. F r a n c o n J., F e l l o u s A., L e n n o n A.-M., N u n e z J., (1977), Nature,

266, 188—189.115. F r a n c o n J., F e l l o u s A., L e n n o n A.-M., N u n e z J., (1978), Eur. J.

Biochem., 85, 43—53.116. C r o n l y - D i l l o n J. R., P e r r y G. W., (1976), Nature, 261, 581—583.



117. P e r r y G. W., C r o n l y - D i l l o n J. R., (1978), Brain Res., 142, 374—378.118. R o s e S. P. R., S i n h a A. K., J o n e s - L e c o i n t e A., (1976), FEBS Letters,

65, 135—139.119. S t e w a r t M. G., R o s e S. P. R., H e d g e s T., (1977), 6th ISN Meeting, Ab

stracts, str. 364.120. S t e w a r t M. G., R o s e S. P. R., (1978), J. Neurochem., 30, 595—599.

http://rcin.org.pl

Post . B lo c h e m . , 25, 417—436 (1979).

JOLANTA UŁAS*

Metody rozdziału komórek neuronalnych i glejowych: ich wykorzystanie w badaniach biochemicznych

Methods of Separation of Neuronal and Glial Cells: their Application for Biochemical Investigation

Spis treści

I. WstępII. Rozdział neuronów i komórek glejowych za pomocą wirowania w gradiencie

stężeńII - l. Rozdrabnianie tkanki mózgowej II-2. Płyny dezintegrująceII-3. Wirowanie

III. Ocena metod rozdziału neuronów i glejuIII-l. WydajnośćIII-2. Czystość otrzymywanych frakcji komórkowychIII-3. Wygląd otrzymywanych komórek i ocena ich właściwości metabolicznych

IV. Niektóre właściwości biochemiczne frakcji neuronalnej i glejowej V. Uwagi końcowe

Contents

I. IntroductionII. Separation of neuronal and glial cells by gradient centrifugation

II-1. Mechanical preparation of the brain tissue II-2. Desintegration mediaII-3. Centrifugation

IIL Evaluation of the methods of separation of neurons and glia IH-1. YieldHI-2. Purity of isolated neuronal and glial cells fractionsIII-3. Morphology of isolated cells and the evaluation of their metabolic pro

pertiesIV. Some biochemical properties of neuronal and glial cells fractions

V. Concluding remarks

* Mgr, Zakład Biochemii Układu Nerwowego i Mięśni, Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Pasteura 3, 02-093 Warszawa

Wykaz stosowanych skrótów: PVP — poliwinylopirolidon; BSA — albumina z surowicy wołu; GABA — kwas Y-am inornasłowy; AChE — acetylocholinoesteraza

http://rcin.org.pl

418 J . UL,AS [2]

Ze względu na morfologiczne zróżnicowanie mózgu poznanie biochem icznych właściwości poszczególnych typów kom órek stało się jednym z istotnych problem ów dynamicznie rozw ijającej się neurochem ii. W ciągu ostatnich piętnastu lat ukazało się wiele prac, w których podjęto próby rozdzielenia kom órek nerw owych i glejowych. Niniejszy a rty k u ł s ta nowi przegląd stosowanych m etod rozdziału tych kom órek z uw zględnieniem ich przydatności do badań biochemicznych.

Skład kom órkowy mózgu jest heterogenny. W mózgu w ystępują neurony, kom órki glejowe (astrocyty, kom órki oligodendrogleju i m ikro- gleju), kom órki ependym y oraz kom órki śródbłonkowe naczyń włosowatych (Ryc. 1).

I. Wstęp

Ryc. 1. Schemat niektórych typów komórek występujących w mózgu a — k o m órk a n er w o w a ; b — a s tr o c y t w łó k n is ty ; c — a s tr o cy t p la z m a ty cz n y ; d — k om órk a o lig o d e n d ro g le ju ; e — k o m órk a m ik ro g le ju .

http://rcin.org.pl

[3] M ETODY RO ZD ZIA ŁU KOM ÓREK NERW OW YCH 419

O kom órkach glejowych i neuronach, s truk tu ra lnych jednostkach ośrodkowego układu nerwowego, wiemy już dość dużo. Opisano ich budowę morfologiczną i subkomórkową oraz embriogenezę. W zajemne oddziaływania i zależności pomiędzy tym i typam i komórek są natom iast jeszcze niejasne i w ym agają dalszych badań.

Wiadomo, że neurony w ciągu długiej ewolucji wyspecjalizowały się jeśli chodzi o odbieranie, przewodzenie i przekształcanie impulsów nerwowych. Kom órki glejowe spełniają rolę kom órek wspomagających, tj. kom órek podporowych, odżywiających, oczyszczających i ochraniających neurony. Przem awia za tym zarówno ukształtow anie gleju, ułatw iające jego kon tak ty z naczyniami krwionośnym i i z neuronam i, jak i zachowanie się komórek glejowych w wypadkach uszkodzenia tkanki mózgowej. Wiadomo np., że astrocyty zmieniają w tedy swój wygląd, mnożą się i usuwają szczątki zniszczonej tkanki w drodze fagocytozy oraz w ypełniają ubytki neuronalne glejową blizną. K om órki glejowe, w przeciw ieństwie do neuronów, zachowują bowiem zdolność podziału w ciągu całego życia zwierzęcia a zwiększanie się liczby kom órek glejowych jest jak sugerują niektórzy autorzy (1) odbiciem procesów kom pensacyjnych mózgu związanych z u tra tą neuronów lub zmianą ich funkcjonalnych właściwości. Przypuszcza się też, że kom órki glejowe oprócz tego, że uczestniczą w re gulacji mikrośrodowiska wokół neuronów, mogą brać także udział w w ychw ytyw aniu neurom ediatora ułatw iając jego inaktyw ację (1). W dorosłym i starzejącym się organizmie kom órki glejowe stanow ią główny kom órkowy składnik mózgu i mogą jak się przypuszcza odgrywać pewną rolę, oprócz komórek nerwowych, w procesach utrzym ania zdolności adaptacyjnych ośrodkowego układu nerwowego tj. w m echanizmie mózgowej homeostazy. Komórki glejowe uczestnicząc pośrednio w procesie przew odnictw a mogą, być może, modulować także pobudliwość tkanki mózgowej.

Dla określenia wzajem nych zależności pomiędzy neuronam i i kom órkami glejowym i niezbędna jest biochemiczna charak terystyka komórek obu typów.

Szybki rozwój techniki pomiarowej, a zwłaszcza elektroniki i techniki m ikroelektrodow ej, umożliwił przeprowadzenie badań elektrofizjolo- gicznych naw et pojedynczego neuronu, jednakże biochemiczne zmiany zachodzące w pojedynczej komórce są niekiedy niezwykle trudne do w ykrycia. Dlatego też do biochemicznych badań mózgu bierze się bądź to cały mózg, bądź jego określone struk tu ry , albo też przeprowadza się biochemiczną charakterystykę niektórych subkom órkowych elem entów mózgowia jak np. m itochondriów czy mikrosomów. Należy jednak zdawać sobie sprawę, że wyniki otrzym ane przy zastosowaniu takiego m ateriału badawczego nie reprezentu ją biochemicznych zmian w kom órkach poszczególnych rodzajów, a stanow ią jedynie wypadkową zmian zachodzących w kom órkach mózgowych różnych typów.

http://rcin.org.pl

420 J. U Ł A S 14]

Kom órki nerw owe i glejowe można rozdzielać za pomocą kilku m etod. Jedną z nich jest m ikrodysekcja pojedynczych kom órek ze świeżego mózgu lub z zamrożonych skraw ków przy użyciu m ikroskopu stereoskopowego (2, 3, 4). Procedurę tę stosuje się przede wszystkim do izolowania kom órek glejowych i neuronów z bardzo m ałych obszarów mózgu, które m ają ściśle określone funkcjonalne znaczenie. Jest ona n iełatw a w w ykonaniu i dostarcza jedynie niewielkiej ilości m ateriału . P rzed m ikro- dysekcją stosuje się niekiedy rozdrabnianie m echaniczne m ateria łu (5).

M etody drugiej grupy polegają na w irow aniu w gradiencie stężeń sacharozy lub Ficollu zawiesiny z tkank i mózgowej poddanej działaniu płynu dezintegrującego i przesączonej przez sita o określonej porowatości. Okazało się, że ta ostatnio wym ieniona technika dostarcza takiej ilości kom órek glejowych i neuronalnych, która w ystarcza do przeprow adzenia wielu oznaczeń biochemicznych oraz, że otrzym uje się przy jej pomocy frakcje wzbogacone w dany rodzaj komórek. Należy jednak zaznaczyć, że otrzym yw aną za pomocą większości m etod frakcję neuronalną stanowią głównie perikariony.

Metoda w irowania w gradiencie stężeń jest dziś najpow szechniej stosowaną w badaniach biochemicznych techniką rozdziału kom órek glejowych i neuronów.

II. Rozdział neuronów i komórek glejowych za pomocą wirowania w gradiencie stężeń

Rozdział neuronów i kom órek glejowych z mózgu metodą w irow ania w gradiencie stężeń polega na ogół na:a) m echanicznym rozdrabnianiu tkanki mózgowej,b) zawieszaniu rozdrobnionej tkanki w płynie dezintegrującym i prze

puszczaniu otrzym anej zawiesiny przez sita o określonej porowatości,c) w irowaniu w gradiencie stężeń w celu otrzym ania różnego typu ko

mórek.Różnorodność opublikow anych m odyfikacji (Tabela 1) dotyczy nie

tylko sposobów m echanicznego rozdrabniania tkanki i w arunków w irow ania, ale przede wszystkim składu płynów dezintegrujących. A utorzy re prezentu ją często przeciw staw ne poglądy odnośnie roli poszczególnych, a naw et tych sam ych składników płynów dezintegrujących, np. stężenia jonów potasu i wapnia, obecności i stężenia poliw inylopirolidonu, konieczności dodawania enzymów proteolitycznych itp. U trudnia to w znacznym stopniu wybór odpowiedniej m etody rozdziału i wykazanie wyższości jednej techniki nad innymi.

http://rcin.org.pl

II-l. Rozdrabnianie tkanki mózgowej

[5] M ETODY RO ZD ZIA ŁU KOM OREK NERW OW YCH 421

Przed zawieszeniem kom órek w płynie dezintegrującym stosuje się mechaniczne rozdrabnianie tkanki. Na ogół tkankę mózgową (minimum 100 mg) po w ypreparow aniu umieszcza się na ochłodzonej szalce P etrie- go i sieka różnego typu ostrzami na bardzo drobne kawałki. N iektórzy p referu ją jednak rozdrabnianie tkanki za pomocą bezpośredniego przeciskania jej przez drobne nylonowe sita (6) lub stosowanie m etalow ych pras z otw oram i wielkości kom órek (7). Jako dodatkowy etap stosuje się również inkubację rozdrobnionej tkanki w środowisku zaw ierającym glukozę i fruktozę, bez (8, 9) lub z dodatkiem enzymów proteolitycznych (10— 13). N astępnie zawiesinę tkanki przeciska się kilkakrotnie przez sita o określonej porowatości — nylonowe lub stalowe. Dzięki tem u zachodzi dalsze rozdrabnianie tkanki oraz usuw anie jej nierozdrobnionych części. Porowatość końcowych sit waha się pomiędzy 30— 100fxm, średnica przeciętnego perikarionu wynosi zaś tylko ok. 15 jim. Pow stała zawiesina zawiera nieuszkodzone komórki, elem enty subkom órkowe oraz pewną ilość komórek śródbłonkowych naczyń włosowatych, które ze względu na swój w ydłużony kształt przechodzą przez sita. W celu usunięcia kapilar wprowadzono przepuszczanie zawiesiny wyjściowej przez kolumnę ze szklanych kulek Ballotini Nr 11 (14).

II-2. Płyny dezintegrujące

Dalsze rozluźnienie spójności kom órek zachodzi w płynie dezintegrującym. Skład płynów dezintegrujących, jak widać z Tabeli 1, może być bardzo różny.

Głównym składnikiem płynu jest sacharoza bądź Ficoll. Sacharozę (15, 16) w ykorzystuje się nie tylko dlatego, że jest ona powszechnie stosowana do różnicowego frakcjonow ania ale również dlatego, że okazała się ona odpowiednim środowiskiem do m ikrodysekcji kom órek układu nerwowego (17).

Większość autorów jednakże używa zam iast sacharozy Ficoll (6, 7, 9, 14, 18—23) w stężeniu od l°/o do 20%. Ficoll nie zwiększa bowiem ciśnienia osmotycznego roztw oru przy wzroście stężenia, w przeciw ieństw ie do sacharozy. Uważa się, że Ficoll jest obojętny dla komórek. P reparaty jego mogą jednak różnić się masą cząsteczkową (stopniem polim eryzacji) w zależności od serii produkcyjnej oraz zawartością jonów (24), co może wpływać na rozdział kom órek w gradiencie stężeń. Dlatego też zaleca się stosowanie Ficoll z jednego opakowania oraz jego dializę przed użyciem.

http://rcin.org.pl

422 J. i j ł a s [6]

Tabela 1Porównanie metod rozdziału komórek nerwowych i glejowych w gradiencie stężeń

Materiał Otrzymywane komórki

Rozdrabnianietkanki

Płyndezintegrujący

Wirowanie Autor

1 2 3 4 5 6

Kora mózgowa szczura

Neurony i glej

S.n. (110), s.s. (40)

10—11% Ficoll 100—110 mM KC110 mM—P pH—7,4

Sach.-Ficoll g.n.

R o s e (6)R o s e i S i n h a (14) i


Neurony i glej

S.n. (435, 193, 105,55)

10% Ficoll 100 mM KC1 10 Mm—P pH—7,4

Sach.-Ficollg.n.

N a g a t a i wsp.(19,94)

; Kora mózgowa szczura

Neurony i glej

S.n. (333, 110, 73)

2% Ficoll 7,5% PVP 1% BSA lOmM CaCl2 pH—4,7

Sach.-Ficollg.n.

S e 11 i n g e r i wsp. (18,26)


Neurony i glej

S.n. (110, 54,33), s.s. (40)

8% Ficoll 0,2% PVP 100 mM KCI 10 mM MgCl2 10 mM—P pH—7,4

Sach.-Ficollg.n.

S i n h a i : wsp. (27)


Neurony S.n. (71,31) Aceton-glicerol —H20(1:1:1 v/v) Glicerol —0,25 M sacharoza (3:1)

Sacharozag.n.

S a t a k e i Abe (33)

Kora mózgowa, hipokamp szczura

Neurony, glej i kom. śródbłonko- we

Prasa tkankowa, s.s. (75, 37x3)

10% Ficoll 5 mM CaCl2 50 mM Tris— HCl pH—7,8

Sach.-Ficollg.c.rotor strefowy

F 1 a n g a s i Bowman (7)

Mózg szczura Neurony i glej

inkubacja (37°C 60 min. +1% trypsyna) s.n. (150), s.s. (74)

5% glukoza 5% fruktoza 1% BSA 10 mM—P pH—6,0

Sach.-Ficollg.n.

N o r t o n i P o d u s 1 o (10)


Inkubacja (37°C 45 min + trypsyna) s.n. (110), s.s. (105,73,53)

1% trypsyna 5% glukoza 5% fruktoza 1% BSA 100 mMk 2h p o 4—NaOHpH—6,2

Sach—g.n. sach. g.c. rotor strefowy

G i o r g i (11)

http://rcin.org.pl

[71 M ETODY RO ZDZIAŁU KOM ÓREK NERW OW YCH 423

Tabela 1 c.d.

Materiał Otrzymywane komórki

Rozdrabnianietkanki

Płyndezintegrujący

Wirowanie Autor

1 2 3 4 5 6


Inkubacja (37°C 90 min +1% trypsyna) s.n (150), s.s (74)

1% BSA 5% glukoza 5% fruktoza lO m M -P pH—6,0

Sach.—g.n. rotor strefowy

K u e n z 1 e i wsp. (12)

Kora móżdżkowa szczura

Komórki Purkinjego i granúlame

S.n. (333 x3 110x3, 74x3)

7,5% PVP 1% BSA 3,77 mMCaCl2

Sach.-Ficollg.n.

Se 11 i n g e r i wsp.(25)

Kora móżdżkowa szczura

Komórki Purkinjego i granúlame

Inkubacja (37°C 60 min.)S.n. (286, 111, 45,35)

2% Ficoll 10% glukoza 10% fruktoza 10 mM—P pH 7,2

Sach.—g.n.

.'

H a za m a i U c h i - mu r a (20)

Kora mózgowa i rdzeń przedłużony królika

Neurony i glej

Inkubacja (37°C 30—60 min.) lub bez inkubacjiS.n. (1000, 120, 75, 50)

0.32 M sacharoza1 mM EDTA 2% Ficoll lOmMTris— HC1 pH 7,4

Sach.-Ficollg.n.

B l o m s t - r a n d i H a m b e r - g e r (16,80)

Kora mózgowa królika

Neurony i glej

Inkubacja (37°C 60 min.)S.n. (1000x10 150, 50x2)

2% Ficoll 20 mM glukoza 120 mM NaCl2.5 mM MgCl22.5 mM ADP 35 mM Tris— HC1 pH 7,6

Sach.-Ficollg.n.

H a m b e r - g e r i wsp. (8)

Kora mózgowa owcy

Glej•

Sita jedwabne 0,25Msacharoza 3 mM K2HPO*

Sach.—g.n. K o r e y i wsp. (15)

Biała substancja mózgowa cielęcia

Oligodend-droglej

Inkubacja (37°C 90min + 0.1% trypsyna)S.n. (150), s.s. (74)

5% glukoza 5% fruktoza 1% BSA 10 mMk h 2po4—NaOH pH—6.0

Sach.—g.n. P o d u s 1 o i N o r t o n (13)

Kora mózgowa człowieka i kora mózgowa szczura

Neurony i glej

Inkubacja (37°C 60 min)S.n. (149), s.s. (74 x 5)

1% Ficoll 10% glukoza 10% fruktoza 10 mM—P pH—6,0

Sach.—g.n. I q b a 1 i T e l l e z - N a g e 1 (9) 1

Skróty stosowane w Tabeli I :Sach. — sacharoza; P — bufor fosforanowy; S.n. — sita nylonowe; S.s. — sita stalowe; g.c. — gradient ciągły; g .n .— gradient nieciągły; liczby w nawiasach — porowatość sit w pim.

http://rcin.org.pl

424 J . U Ł A S [8]

W niektórych przypadkach Ficoll zastąpiono poliw inylopirolidonem (PVP) (25, 26) lub zastosowano ich m ieszaninę (18, 27). PV P u łatw ia sedym entację krw inek co nie jest bez znaczenia, jako że tkanka mózgowa jest silnie ukrwiona, wpływa także na odporność kom órek na m echaniczny i osmotyczny szok (28). Należy jednak pam iętać o dokładnym przem yw aniu izolowanych frakcji kom órek w celu usunięcia PVP (2957) ponieważ związek ten wpływa ham ująco na aktyw ność niektórych enzymów, np. Na+K + — ATPazę.

Jednym z często stosowanych składników płynów dezintegrujących jest l°/o album ina z surow icy wołu (BSA) (10— 12, 18, 25, 30— 32). Badania A z c u r r y i S e l l i n g e r a (dane nieopubl.) wskazują, że kw asy tłuszczowe i album ina w obecności PVP, w hypotonicznym środow isku u łatw iają rozluźnienie m iędzykomórkowej spójności. A lbum ina stab ilizuje ponadto błony komórkowe. W ydaje się jednak, że można ją z powodzeniem zastąpić odpowiednią kom binacją p repara tu Ficoll i jonów potasu lub wapnia (6, 7, 14, 19).

Zastosowanie m ieszaniny acetonu i glicerolu (33) zapewnia ochronę składników w ew nątrzkom órkow ych i zapobiega oderw aniu w ypustek, ale środowisko to nie jest zalecane przy biochemicznych badaniach frakcji kom órkowych (34).

Zaskakuje również swoją różnorodnością skład jonowy stosow anych płynów dezintegrujących. Dotyczy to przede wszystkim stężenia jonów wapnia i potasu, k tórych rola w zjawisku kom órkowej adhezji nie jest jeszcze w ystarczająco w yjaśniona. Stężenie jonów wapnia waha się w granicach 3,8— lOmM a stężenie jonów potasu w granicach 100— 300mM. Rzadko stosuje się obecnie związki chelatujące jony wapnia takie jak cytryn ian lub EDTA, a wręcz przeciwnie wielu autorów wprowadza te jony do środowiska (7, 18, 23). Jedni stosują czterofenyloboran (TBP) jako czynnik kom pleksujący jony K + (35), inni natom iast płyny dezin tegrujące zawierające znaczną ilość tych jonów (6, 14, 19, 22, 23, 36). W ykazano ponadto, że czterofenyloboran wpływa ham ująco na oddychanie kom órkowe oraz powoduje morfologiczne zmiany w kom órkach (37) — dlatego też zaniechano obecnie jego stosowania.

W płynach dezintegrujących, najczęściej stosuje się bufor fosforanowy lub bufor Tris-HCl o pH pomiędzy 6.0 i 7.8, używa się jednak i p łyny o niższym pH (18, 26).

Szereg autorów uważa za konieczne dla ,,dysocjacji” tkanki dodanie do płynów dezintegrujących enzymów proteolitycznych: trypsyny (10— 13) lub kolagenazy i hialuronidazy (30, 31, 38). Do tego celu niekiedy używano również papainę (39).

Stosowanie enzymów proteolitycznych spotyka się jednak z zastrzeżeniami. Trawienie np. trypsyną ułatw ia dezintegrację tkanki. Enzym ten może jednak atakow ać białka błony komórkowej (31, 40) i wnikać do kom órek (41) powodując między innym i s tra ty DNA (31). T rypsynę t ru

http://rcin.org.pl

19] METTODY RO ZDZIAŁU KOM OREK NERW O W YCH 425

dno ponadto usunąć z powierzchni kom órek — jest więc możliwe, że może ona m askować ich norm alne właściwości m etaboliczne (42— 44).

H ialuronidaza i kolagenaza nie uszkadzają błon plazm atycznych, dlatego też n iektórzy zastosowali przy izolacji neuronów perfuzję mózgu płynem zaw ierającym oba te enzym y oraz glukozę i fruktozę (38). Ten sposób postępow ania ma dodatkową zaletę — usuw a z mózgu krew — co u łatw ia dalsze postępowanie. W tym sam ym celu inni autorzy przeprow adzają kró tko trw ałą perfuzję mózgu płynem fizjologicznym (8, 19).

II-3. Wirowanie

K olejnym etapem rozdziału gleju i neuronów jest w irowanie w gradiencie stężeń sacharozy i Ficollu. Neurony i kom órki glejowe m ają różną gęstość i są zbierane z innych w arstw sacharozy lub Ficollu. Czystą fra kcję neuronalną udaje się otrzym ać zazwyczaj już w pierwszym wirowaniu, natom iast frakcja gleju wymaga na ogół dalszego oczyszczania w kolejnych w irowaniach.

Stosuje się różne w arian ty w irowania. Do sedym entacji podobnych frakcji stosowane są zarówno małe jak i duże przyśpieszenia oraz różne grad ien ty stężeń: g rad ien ty ciągłe i nieciągłe, g rad ien ty z jednego lub kilku związków (Tabela 1).

W iększość technik w ykorzystuje głowice horyzontalne, ale stosuje się też głowice strefow e (7, 11, 12).

O trzym yw ane frakcje byw ają zanieczyszczone m.in. subkomórkowym i elem entam i powstałym i w w yniku zniszczenia kom órki w czasie dezin tegracji tkanki. Można tem u zapobiec stosując w stępne w irowanie zaw iesiny kom órek przy m ałych przyspieszeniach. M itochondria, m ikrosomy i synaptosom y sedym entują w tedy ty lko w bardzo nieznacznym stopniu, chociaż istnieje możliwość, że pewna ich ilość przechodzi do osadu „przylepiona” do całych, nienaruszonych kom órek.

III. Ocena metod rozdziału neuronów i gleju

P rzy ocenie wartości m etod rozdziału neuronów i kom órek glejowych większość autorów przyjm uje następujące k ry teria :a) ilość otrzym yw anych komórek,b) stopień czystości izolowanych frakcji kom órkowych,c) zm iany morfologiczne otrzym yw anych kom órek i ich właściwości

m etabolicznych.Istn ieje jednak wiele trudności ze stosowaniem wym ienionych k ry

teriów . Nie wiadomo bowiem w jakim stopniu otrzym yw ane kom órki

http://rcin.org.pl

*

odpowiadają populacji kom órek in situ i czy procedura rozdziału nie wpływa na m etabolizm izolowanych komórek. U trata przez neurony wypustek, a zwłaszcza ich proksym alnego segm entu, prowadzi bowiem do rozerw ania błony plazm atycznej, co z kolei może pociągać za sobą dość znaczne s tra ty w zawartości elem entów cytoplazm atycznych (45). Ponadto do w nętrza kom órki mogą w tedy przenikać pozaneuronalne składniki.

Nie wszyscy au torzy stosują te same k ry teria przy ocenie stosowanej techniki, pom ijając n iektóre z nich lub wprowadzając niekiedy inne. Pow oduje to często niedosyt inform acji, zwłaszcza na tem at zachowania właściwości m orfologicznych i m etabolicznych otrzym yw anych kom órek oraz u trudn ia w znacznym stopniu porów nanie i ocenę różnych m etod rozdziału.

426 ' j- UŁAS [10]

III-l. Wydajność

Ilość otrzym yw anych kom órek jest różna w zależności od m etody rozdziału jaką stosowano. Liczba neuronów w przeliczeniu na g kory mózgowej szczura w aha się w granicach 1,2— 37X10® (6, 9, 38, 46), zaś liczba kom órek glejow ych 2,2—6,6X10® (9, 10). Podobne ilości kom órek

Ryc. 2. Wydajność otrzymywanych frakcji komórek neuronalnych i glejowych izolowanych z mózgu szczura wyrażona jako ilość białka na korę mózgową jednego zw ierzęcia (wg 51)

http://rcin.org.pl

M ETODY RO ZDZIAŁU KOM OREK NERW O W YCH 427

otrzym ywano, gdy rozdzielano kom órki z mózgu ludzkiego (9, 46). Zw raca uwagę fakt, że pomimo przewagi ilościowej kom órek glejowych w mózgu otrzym uje się ich po rozdziale znacznie m niej niż komórek nerwowych.

Większą wydajność komórek osiąga się, gdy tkankę mózgową inku- buje się w podwyższonej tem peraturze (37°C) (9). Ilość i typ otrzym yw anych kom órek glejowych zależy od części mózgu, z której izoluje się komórki. Gdy stosuje się cały mózg lub korę mózgową to otrzym uje się przede wszystkim astroglej, jeśli zaś istotę białą, to oligodendroglej i kom órki podobne do oligodendrogleju (13, 22).

W ydajność p repara tyk i zależy od wieku zwierzęcia (9, 18, 47— 51). Lepszą wydajność osiąga się z kory mózgowej młodych zwierząt niż starszych (Ryc. 2).

Średnica kom órek (jum)

Ryc. 3. Wpływ przedłużenia czasu inkubacji skrawków kory mózgowej w płynie dezintegrującym na liczebność populacji komórek o różnej średnicy w e frakcji neuronalnej. Czas inkubacji w ynosił— 30, 60 i 120 minut (wg 8).

Analiza wielkości kom órek (8) jest szybką m etodą, k tóra na podstawie wielkości kom órek pozwala w ykryć zanieczyszczenia innego typu kom órkam i i ich fragm entam i. Za pomocą tej m etody wykazano, że przedłużenie czasu inkubacji zwiększa wydajność p repara tyk i i przyczynia się do tego, że przew ażają kom órki o średnicy 10— 15 vi. Natom iast dodanie do środowiska 1% trypsyny spraw ia, że otrzym uje się więcej komórek m ałych i cząstek subneuronalnych o średnicy m niejszej od 10 ¡i (Ryc. 3).

http://rcin.org.pl

428 J. U Ł A S [12]

III-2. Czystość otrzymywanych frakcji komórkowych

Dotychczas nie udało się otrzym ać zupełnie czystej frakcji neuronalnej ani glejowej. Są to jedynie frakcje „wzbogacone” . S tąd też w ynika problem oceny czystości otrzym yw anych frakcji komórkowych. Zanieczyszczenia mogą być dwojakiego rodzaju:a) frakcje neuronów i kom órek glejowych mogą być w zajem nie zanie

czyszczone, ew entualnie mogą występować jeszcze inne typy komórek, np. krw inki lub fragm enty kapilar,

b) mogą występować zanieczyszczenia elem entam i subkomórkowym i, co łączy się ściśle ze spraw ą uszkodzenia komórek.W celu oceny stopnia czystości frakcji kom órkow ych i identyfikacji

kom órek stosuje się przew ażnie następujące k ry te ria morfologiczne: kształt komórek, intensywność w ybarw iania się jądra i liczba jąderek (34). Kom órki ogląda się przyżyciowo w m ikroskopie św ietlnym lub w kontraście fazowym. Do barw ienia preparatów stosuje się błękit m etylenowy, kwaśną tioninę lub fiolet krezylow y (19, 34).

Tabela 2Aktywność anhydrazy węglowej we frakcji neuronalnej i glejowej

Autor

Materiał

"■Rosę(14)

^ N o r t o n i P o d u sl o

(wg 29)

*S e 11 i n g e r i A z c u r r a

(wg 29)

**K i m e l - b e r g (56)

Zawiesinawyjściowa 122 ± 16 227 ±2 147 ±29 27

Frakcja gleju (A) 529 ±57 500 ±67 485 ±93 37

Frakcja neuronów (B) 152± 33 123 ± 38 37 ±3 17,5

A/B 3,5 4,1 12,0 2,1

* Jednostki um owne/m g białka ** (m ole C O j/l/sek ./m g białka) x 10-5

Frakcja neuronalna zawiera 64— 90%> neuronów , 8— 23% kom órek glejowych i 2—21% kom órek śródbłonkowych naczyń włosowatych a frakcja gleju 64—88% kom órek glejowych, 6— 11% neuronów oraz 6— 25% kom órek śródbłonkowych naczyń w łosowatych (6, 9, 12, 52). Niekiedy w rozdzielonych frakcjach stw ierdzano występow anie n iezidentyfikow anych kom órek jak i zanieczyszczeń subkom órkowym i fragm entam i: mieliną, synaptosom am i, m itochondriam i, m ikrosom am i i ją drami. Zanieczyszczenia synaptosom am i spotyka się znacznie częściej we frakcji gleju (53) niż neuronów.

http://rcin.org.pl

[13] M ETODY RO ZD ZIA ŁU KOM OREK NERW O W YCH 429

Oznaczanie aktyw ności enzymów charakterystycznych dla danego typu kom órek może być również wskaźnikiem w zajem nych zanieczyszczeń. Za enzym m arkerow y frakcji glejowej na podstawie badań G i a - c o b i n i e g o (54, 55) można uważać anhydrazę węglową (E.C. 4.2.1.1). A utor ten w izolowanych metodą m ikrodysekcji kom órkach glejowych stw ierdził 100-krotnie wyższą aktyw ność tego enzym u niż w neuronach. Tak dużych różnic nie stwierdzono rozdzielając glej od neuronów za pomocą w irowania w gradiencie stężeń (14, 29, 56) — Tabela 2.

Za enzym wskaźnikowy neuronów uważa się P-galaktozydazę, której aktyw ność w neuronach jest około 10-krotnie większa niż w gleju (57), jak i glukozylotransferazę ceramidową (58) oraz glukozo-6-fosfatazę (59). Zanieczyszczenia otrzym yw anych frakcji kom órkowych np. synapto- somami lub m ieliną można ocenić oznaczając aktyw ność charakterystycznych enzymów. W przypadku synaptosom ów są to: acetylotransferaza cholinowa (E.C. 2.3.1.6) i dekarboksylaza glutam inianow a (E.C. 4.1.1.15), a w przypadku m ieliny 3'-fosfodiesteraza 2'-3'-cyklicznego nukleotydu (E.C. 3.1.4.37) (53, 60).

III-3. Wygląd otrzymywanych komórek i ocena ich właściwości metabolicznych

Z obserw acji m ikroskopowych rozdzielonych frakcji kom órkowych wynika, że w ypustki neuronów, tak aksony jak i dendryty , są najczęściej pouryw ane. Lepiej zachowane kom órki o trzym uje się, gdy źródłem ich jest pień mózgowy lub rdzeń przedłużony, a nie kora mózgowa (21, 23) lub gdy inkubacja rozdrobnionej tkank i zachodzi w obecności enzymów proteolitycznych (38, 61, 62). N eurony m ają na ogół dość dobrze zachowaną stru k tu rę w ew nątrzkom órkową, z w yjątkiem m itochondriów i zew nętrznej błony plazm atycznej, która jest często porozrywana z powodu u tra ty aksonu lub dendrytów (27, 47, 63— 65).

Błona plazm atyczna kom órek glejowych jest najczęściej dobrze zachowana, tak samo jak i większość organelli komórkowych.

Oprócz obserw acji kom órek w m ikroskopie św ietlnym i elektronow ym powszechnie przyjętym k ry terium integralności błon plazm atycznych jest b rak w ybarw iania się kom órek błękitem trypanow ym . Niekiedy jednak zdarza się, że barw nik ten wnika do nieuszkodzonych kom órek (66, 67).

W celu określenia stopnia zachowania właściwości m etabolicznych izolowanych komórek oznacza się aktyw ność enzymów oddechowych i gli- kolitycznych takich jak: oksydaza cytochromowa, dehydrogenaza mlecza- nowa, dehydrogenaza bursztynianow a oraz kinaza pirogronianowa (6, 29, 34, 53, 68, 69). Wielu autorów m ierzy także pobieranie tlenu i wydalanie dw utlenku węgla (14, 29, 30).

W otrzym yw anych frakcjach kom órkowych oznacza się również zawartość białka i kwasów nukleinowych, przy czym stosunek RNA/DNA

1* P o s tę p y B io c h e m ii http://rcin.org.pl

430 J . U Ł A S 114]

może służyć zarówno jako k ry terium czystości frakcji jak i wydajności p repara tyk i (14, 26).

IV. Niektóre właściwości biochemiczne frakcji neuronalnej i glejowej

Obecnie techniki rozdziału kom órek glejowych i neuronów pozwalają już na określenie różnic i wzajem nych zależności pomiędzy tym i frak cjami.

W mózgu w ystępują specyficzne dla tej tkank i białka: S— 100 i 14— 3— 2. Badania rozmieszczenia i właściwości tych białek, jakie przeprow adzono między innym i m etodą im m unoelektroforezy i im m unofluorescen- cji, nie są całkowicie zgodne. Większość autorów sądzi, że S— 100 jest białkiem charakterystycznym dla gleju (70) i obecnym przede wszystkim w astrocytach i w oligodendrogleju (71, 72, 73). Białko 14— 3— 2 w ystępuje natom iast głównie w neuronach (74) i w ykazuje aktyw ność enolazy (E.C. 4.2.1.11) (75). Jak dotychczas jest to jedyne specyficzne białko mózgowe o aktyw ności enzym atycznej. Stwierdzono (76), że charakterystyczna dla frakcji neuronalnej enolaza tj. białko 14— 3—2 jest w przeciw ieństwie do enolazy z gleju białkiem term ostabilnym i ma inną budowę pod- jednostkową.

Bardzo obiecujące dla poznania m etabolizm u kom órek obu typów w ydają się doświadczenia nad syntezą białka w gleju i w neuronach. Zdają się one wskazywać na bardziej intensyw ną syntezę białka w neuronach niż w kom órkach glejowych (21, 33, 77, 78, 78a) chociaż niektórzy postulu ją wyższą syntezę białka w gleju (11, 47). W iek zw ierząt z których otrzym ywano kom órki (47, 50, 79), m etoda rozdziału komórek, rodzaj oraz sposób wprowadzania radioaktyw nego prekursora (11, 47, 80, 81) mogą jednak wpływać na otrzym yw ane wyniki.

Ilość poszczególnych wolnych aminokwasów w obu mózgowych frak cjach kom órkowych jest różna (19). G lutam inian, glicyna, alanina i kw as Y-aminomasłowy (GABA) w ystępują w neuronach w wyższych stężeniach niż we frakcji gleju (19). Specyficzna aktyw ność tych aminokwasów oznacza przy użyciu [14C]glukozy jako prekursora, jest natom iast kilkakrotnie wyższa we frakcji gleju (77, 82).

Inkubacja izolowanych kom órek w środowisku zaw ierającym znakowane am inokwasy wykazała, że zarówno neurony jak i kom órki glejowe mogą akum ulować aminokwasy; ich stężenie w komórce może być w yższe niż w środowisku (19, 83). F rakcja gleju w ykazuje przy tym w yraźnie większą zdolność pobierania n iektórych aminokwasów, zwłaszcza g lu ta m inianu, asparaginianu, seryny, proliny i glicyny a w m niejszym stopniui GABA (83). Ponieważ niektórym z tych am inokwasów (glutam inian, asparaginian i glicyna) przypisuje się rolę neuro transm iterów zdolność do ich pobierania i akum ulow ania sugeruje, że kom órki glejowe mogą brać

http://rcin.org.pl

udział w regulacji procesów przekaźnictwa. Zaobserwowano, że kom órki glejowe podobnie jak neurony akum ulują także am iny biogenne (84, 85). W ydaje się jednak, że zanieczyszczenia otrzym yw anych frakcji kom órkowych mogą zniekształcać otrzym yw ane w yniki eksperym entalne.

Zachodzący podczas dojrzewania mózgu wzrost zawartości w nim noradrenaliny tłum aczy się rozwojem neuronalnych mechanizmów w ychw ytyw ania i gromadzenia, a także możliwością akum ulow ania noradrenaliny w gleju (1). Rola komórek glejowych w regulacji ilości neurotransm ite- rów w szczelinie synaptycznej jest jednak w chwili obecnej raczej spe- kulatyw na. Hipotetyczny udział tych kom órek w regulacji procesów przekaźnictw a przedstaw ia rycina 4.

[15] M ETODY R O Z D ZIA ŁU KOM OREK NERW O W YCH 431

Ryc. 4. Hipotetyczny schemat regulacji ilości neurotransmitera w szczelinie synaptycznej.A — k o m ó rk a g le jo w a ; B — za k o ń cz en ie n er w o w e z p ę c h erzy k a m i sy n a p ty czn y m i; C — błon a p o stsy n a p ty cz n a z recep to ra m i (m iejsca za c iem n io n e ); D — szc ze lin a sy n a p ty czn a ;

W y d z ie lo n y do s zc z e lin y sy n a p ty c z n e j n eu ro tra n sm iter w ią ż e s ię z rec ep to rem w y w o łu ją c d e p o la r y z a c ję b ło n y p o stsy n a p ty cz n e j; in a k ty w a c ja n e u r o tra n sm itera m oże zach o d z ić p op rzez: en z y m a ty c z n ą d eg ra d a cję n eu ro tra n sm itera , p o n o w n e p o b ra n ie n eu ro tra n sm itera przez z a k o ń c z e n ie n er w o w e , w y c h w y c e n ie n eu ro tra n sm itera przez k o m ó rk i g le jo w e (s trza łk i p rzery w a n e).

Kilka prac wskazuje na wyższą aktyw ność N a+K + — ATPazy we frak cji gleju w porównaniu z frakcją neuronalną (56, 63). Wykazano, że zarówno neurony jak i kom órki glejowe akum ulują potas z zewnątrzko- mórkowego środowiska w czasie inkubacji. Kom órki glejowe mogą aku- m ulować jony K + w stopniu nieco większym niż neurony (19, 86, 87).

O statnio postuluje się też udział gleju w dostarczaniu białek do neuronów (88, 89). Badania dotyczą głównie aksonów olbrzym ich z kałam ar- nicy Loligo pealii. Jak jest w ośrodkowym układzie nerwowym kręgow-


432 J. U Ł A S ti 6]

ców jeszcze nie wiadomo. Chociaż techniki rozdziału gleju i neuronów z tkanki nerwowej um ożliw iają również śledzenie zmian rozwojowych zachodzących w mózgu, to jednak brak jest jeszcze badań k tó re by w kompleksowy sposób trak tow ały o zachodzących w tedy w mózgu zm ianach kom órkowych i biochemicznych.

Badania frakcji neuronów i kom órek glejowych w czasie rozw oju potwierdziły, że kształt i wielkość kom órek mózgowych zależą od wieku zwierzęcia (27). Z wiekiem zachodzą w korze mózgowej zmiany w stosunkach ilościowych neuronów i kom órek glejowych, ponieważ neurogeneza jest u zw ierząt wielu gatunków zakończona przed urodzeniem zwierzęcia, podczas gdy proliferacja gleju jest głównie procesem postnatalnym . I tak np. w korze mózgowej 1-dniowego szczura 53°/o całej populacji kom órek mózgowych stanowią neurony, a kom órki gleju tylko 37°/o. W ciągu 20 dni w artości te zm ieniają się i wynoszą odpowiednio 35°/o i .52%. W artość stosunku glej/neurony wynosi więc 1,49 (27). Inn i podają niższe w artości: 0,96 dla 1-miesięcznych szczurów i 1,30 dla szczurów 5-miesięcz- nych (90).

Ilościowym zmianom w czasie rozwoju podlegają także neuro transm i- tery. Aktywność acetylocholinoesterazy (E.C. 3.1.1.7) i acety lo transferazy cholinowej są wskaźnikiem neuro transm isji cholinergicznej. U kurcząt np. aktyw ność AChE w zrasta w yraźnie podczas rozwoju płodowego aż do 3 miesiąca po urodzeniu i od 20 miesiąca do 36 miesiąca po wykluciu (91). Badania V e r n a d a k i s wykazały, że nie tylko neurony ale i kom órki glejowe zaw ierają AChE (92), a ponieważ zachodzi w yraźna proliferacja gleju z wiekiem, autorka przypuszcza, że obserw owany wysoki poziom AChE w mózgu związany jest z obecnością tego enzym u w gleju.

Przeprowadzone badania postnatalnych zmian aktyw ności enzym atycznych (25, 51) wykazały, że istnieją różnice w aktyw ności specyficznej m itochondrialnej neuronalnej i glejowej dehydrogenazy a-glicerofosfo- ranow ej, która jest w gleju około 6 razy wyższa w pierwszym miesiącu życia. Nie stw ierdzono natom iast różnic w obu frakcjach kom órkowych, w tym okresie, w aktyw ności m itochondrialnej dehydrogenazy burszty- nianowej.

V. Uwagi końcowe

O trzym yw anie kom órek różnego typu z mózgu um ożliwia przeprowadzenie badań ich m etabolizm u. Do tego celu stosuje się m.in. metodę wirow ania w gradiencie stężeń. Pozwala ona na ilościowe i jakościowe określenie zmian, które zaszły in vivo i na przypisanie ich danem u typowi komórek. Umożliwia również zbadanie właściwości biochem icznych neuronów i kom órek glejowych w określonych w arunkach in vitro. Ma to duże znaczenie zwłaszcza dla zbadania w pływu na kom órki mózgowe

http://rcin.org.pl

[17] M ETODY R O Z D ZIA ŁU KOM OREK NERW O W YCH 433

związków, które nie przenikają przez barierę krew —mózg, a więc których nie można testować in vivo.

O trzym yw ane kom órki nie zawsze m ają w pełni zachowane swoje właściwości fizjologiczne i morfologiczne, a frakcje komórkowe są w zależności od m etody rozdziału w różnym stopniu zanieczyszczone. Niedoskonałość procedury rozdziału jest powodem, że wartości dotyczące tych sam ych zjawisk są niekiedy rozbieżne i tym samym trudno jest je z in terpretow ać (np. aktyw ność anhydrazy węglowej we frakcji neuronów i gleju). Szczególne trudności napotyka, się zwłaszcza przy badaniach mózgu w czasie rozwoju. Wiadomo bowiem, że m etoda rozdziału kom órek mózgu z dorosłego zwierzęcia nie zawsze jest odpowiednia do rozdziału kom órek z tkank i rozw ijającej się. Nieliczne do tej pory próby opracowania takich m etod rozdziału, które um ożliw iłyby porów nanie właściwości komórek neuronalnych i glejowych z mózgu zw ierząt w różnym wieku są jeszcze niew ystarczające.

Dotychczasowe prace dostarczyły już wielu inform acji o właściwościach biochemicznych izolowanych kom órek, np. udziału kom órek glejow ych w pobieraniu neurotransm iterów (GABA, glicyny, glutam inianu) ze szczeliny synaptycznej, zmian ilościowych neuronów i kom órek glejowych w czasie rozwoju mózgu, .zmian aktyw ności n iektórych enzymów itp. Dalsze wysiłki powinny jednak zmierzać w k ierunku opracowania takich technik rozdziału, dzięki k tórym można będzie otrzym ać jeszcze m niej zanieczyszczone frakcje komórkowe i lepiej zachowane komórki. Nie bez znaczenia jest też um iejętność przyżyciowego przechowywania izolowanych frakcji kom órkowych (44, 93).

W ydaje się, że pomimo wielu ograniczeń i niedoskonałości proceduralnych, na k tóre wskazywano w niniejszym opracowaniu, m etoda ta obok innych technik takich jak: hodowla tkanek, badania skraw ków mózgow ych czy m etody histochemiczne w połączeniu z autoradiografią, umożliwia w yjaśnienie procesów biochemicznych zachodzących w mózgu i funkcjonalnych powiązań pomiędzy kom órkam i mózgowymi różnych typów.

Zaakceptowano do druku 8 03.1979

PIŚMIENNICTWO

1. V e r n a d a k i s A., (1975) Fed. Proc., 34, 89—95.2. G i a c o b i n i E., (1968), w Neurosciences Research, red. Ehrenpreis S., Solnitz-

ky D. C., t. 1, str. 1—71, Academic Press, New York.3. H y d e n H., (1967), w The Neuron, red. Hyden H., str. 179—219, Elsevier, Am

sterdam.4. L o w r y O. H., (1962), Bull. N. Y. Acad. Med. Soc. Ser., 38, 788—818.5. R o o t s B. J., J o h n s t o n P. V., (1964), J. Ultrastruct. Res., 10, 350—361.6. R o s e S. P. R., (1967), Biochem. J., 102, 33—43.7. F 1 a n g a s A. L., B o w m a n R. E., (1968), Science, 161, 1025—T027.

http://rcin.org.pl

434 J. UEiAS [18]

8. H a m b e r g e r A., E r i k s s o n O., N o r r b y K., (1971), Expt. Cell Res., 67, 380—388.

9. I q b a l K., T e l l e z - N a g e l I., (1972), Brain Res., 45, 296—301.10. N o r t o n W. T., P o d u s l o S. E., (1970), Science, 167, 1144—1145.11. G i o r g i P. P., (1971), Exp. Cell Res., 68, 273—282.12. K u e n z l e C. C., P e l l o n i R. R., K i s t l e r G. S., (1972), J. Neurochem., 19,

2333—2339.13. P o d u s l o S. E., N o r t o n W. T., (1972), J. Neurochem., 19, 727—736.14. R o s e S. P. R., S i n h a A. K., (1970), Life Sei., 9, 907—915.15. K o r e y S. R., O r c h e n M., B r o z M., (1958), J. Neuropathotl. Exp. Neurol.,

17, 430—438.16. B l o m s t r a n d C., H a m b e r g e r A., (1970), J. Neurochem., 17, 1187—1195.17. H y d e n H., (1959), Nature, 184, 433—435.18. S e l l i n g e r O. Z., A z c u r r a J. M., J o h a n s o n D. E., O h l s s o n W. G.,

L o d i n Z., (1971), Nature Nevo Biol., 230, 253—256.19. N a g a t a Y., M i k o s h i b a K., T s u k a d a Y., (1974), J. Neurochem., 22,

493—503.20. H a z a m a H., U c h i m u r a H., (1973), Exp. Cell Res., 82, 452—455.21. T a k a h a s h . i Y., H s u C. S., H o n m a S., (1970), Brain Res., 23, 284—287.22. F e w s t e r M. E., S c h e i b e l A. B., M e a d J. F., (1967), Brain Res. 6,

401—408.23. S a t a k e M., H a s e g a w a S., A b e S., T a n a k a R., (1968), Brain Res., 11,

246—250.24. R o s e S. P. R., (1968), J. Neurochem., 15, 1415—1429.25. S e l l i n g e r O. Z., L e g r a n d J., C l o s J., O h l s s o n W. G., (1974),

J. Neurochem., 23, 1137—1144.26. S e l l i n g e r O. Z., A z c u r r a J. M., (1974), w Research Methods in Neuro

chemistry, red. Marks N., Rodnight R., t. 2, str. 3—39, Plenum Press, New York, London.

27. S i n h a A. K., R o s e S. P. R., S i n h a L., S p e a r s D., (1978), J. Neurochem., 30, 1513—1524.

28. B e n - D a v i d A., G a v e n d o S., (1972), Cryobiology, 9, 192—197.29. S i n h a A. K., R o s e S. P. R., (1971), Brain Res., 33, 205—217.30. H e m m i n k i K., H o l m i l a E., (1971), Acta Physiol. Scand., 82, 135—142.31. H e . m m i n k i K., H u t t u n e n M. O., J a r n e f e l t J., (1970), Brain Res.,

23, 23—34.32. J o n e s J. P., R a m s e y R. B., N i c h o l a s H. J., (1971), Life Sei., 10, 997—

1003.33. S a t a k e M., A b e S., (1966), J. Biochem., 59. 72—75.34. R o s e S. P. R., S i n h a A. K., (1969), J. Neurochem., 16, 1319—1328.35. R a p p a p o r t C., H o w z e G. B., (1966), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 121,

1016—1021.36. R o s e S. P. R., (1965), Nature, 206, 621—622.37. M a h a l e y M. S. j r, W i l f o n g R. F., (1969), J. Neurosurg., 30, 250—259.38. A l t h a u s H. H., H ü t t n e r W. B., N e u h o f f V., (1977), Hoppe-Seyler's

Z. Physiöl. Chem., 358, 1155—1159.39. M c l l w a i n H., (1954), Proc. Univ. Otago Med. School, 32, 17—18.40. J o h n s t o n P. V., R o o t s B. J., (1970), Int. Rev. Cytol., 29, 265—280.41. G u a r n i e r i M., C o h e n S. R., G i n n s E., (1976), J. Neurochem., 26, 41—44.42. P o d u s l o S. E., M c F a r l a n d H. F., K r o e n C., M i l l e r K., M c K h a n n

G. M., (1975), 5 th Int. Mtg. Inter. Soc. Neurochem., Barcelona, Spain, Abstracts str. 147.

http://rcin.org.pl

[19] M ETODY R O Z D ZIA ŁU KOM ÓREK NERW OW YCH 435

43. P o d u s l o S. E., M i l l e r K., K r o e n C., M c K h a n n G. M., (1975), Trans. Amer. Soc. Neurochem., 6, 97.

44. P o d u s l o S. E., M c K h a n n G. M., (1976), Neurosci. Lett., 2, 267—271.45. H a m b e r g e r A., S e i l s t r ö m A., (1975), w Metabolie Compartmentation

and Neurotransmission, red. Berl S., Clarke D. D., Schneider D., str. 145—166, Plenum Press, New York, London.

46. F a r o o q M., F e r s z t R., M o o r e C. L., N o r t o n W. T., (1977), Brain Res., 124, 69—81.

47. J o h n s o n D. E., S e l l i n g e r O. Z., (1971), J. Neurochem., 18, 1445—1460.48. M e d z i h r a d s k y F., S e l l i n g e r O. Z., N a n d h a s r i P. S., S a n t i a g o

J. C., (1972), J. Neurochem., 19, 543—545.49. I d o y a g a - V a r g a s V., S a n t i a g o J. C., P e t i e t P. D., S e l l i n g e r

0 . Z., (1972), J. Neurochem., 19, 2533—2545.50. J o h n s o n D. E., S e l l i n g e r O. Z., (1973), Neurobiology, 3, 113'—124.51. S e l l i n g e r O . Z., S a n t i a g o J. C., (1972), Neurobiology, 2, 133—146.52. S e l l i n g e r O. Z., A z c u r r a J. M., (1970), Trans. Amer. Soc. Neurochem.,

1, 22.53. N a g a t a Y., N a n b a T., A n d o M., (1976), Neurochem. Res., 1, 299—312.54. G i a c o b i n i E., (1961), Science, 134, 1524—1525.55. G i a c o b i n i E., (1964), w Morphological and Biochemical Correlates of Neural

Activity, red. Cohen M. M., Snider R. S., str. 15—38, Harper Row, New York.56. K i m e l b e r g H. K., B i d d i e c o m e S., N a r u m i S., B o u r k e R. S.,

(1978), Brain Res., 141, 305—323.57. S i n h a A. K., R o s e S. P. R., (1972), Brain Res., 39, 181—196.58. R a d in N. S., B r e n k e r t A., A r o v a ' R. C., S e l l i n g e r O. Z., F l a n g a s

A. L., (1972), Brain Res., 39, 163—169.59. A n c h o r s J. M., K a r n o v s k y M. L., (1975), J. Biol. Chem., 250, 6408—6416.60. K u r i h a r a T., T s u k a d a Y., (1967), J. Neurochem., 14, 1167—1174.61. R a i n e C. S., P o d u s l o S. E., N o r t o n W. T., (1971), Brain Res., 27, 11—24.62. P o d u s l o S. E., N o r t o n W. T., (1975), w Methods in Enzymology, red. Co-

lowick S. P., Kaplan N., t. 35, str. 561—579, Academic Press, New York.63. M e d z i h r a d s k y F., N a n d h a s r i P. S., I d o y a g a - V a r g a s V., S e l

l i n g e r O. Z., (1971), J. Neurochem., 18, 1599—1603.64. K o h l H. H., S e l l i n g e r O. Z., (1972), J. Neurochem., 19, 699—711.65. H a m b e r g e r A., H a n s s o n H. A., S e i l s t r ö m A., (1975), Exp. Cell Res.,

92, 1—10.66. M e d z i h r a d s k y F., M a r k s M. J., (1975), Biochem. Med., 13, 164—177.67. B h u y a n B. K., L o u g h m a n B. E., F r a s e r T. J., D a y K. J., (1976), Exp.

Cell Res., 97, 275—280.68. C r e m e r J. N., J o h n s t o n P. V., R o o t s B. J., T r e v o r A. J., (1968),

J. Neurochem., 15, 1361—1370.69. N a g a t a Y., M i k o s h i b a K., T s u k a d a Y., (1976), Asian Med. J., 19,

13—43.70. B o c k E., H a m b e r g e r A., (Î976) Brain Res., 112, 329—335.71. L u , d w i n S. K., K o s e k J. C., E n g L. F., (1976), J. Comp. Neurol., 165,

197—208.72. M o o r e B. W., C i m i n o M., H a r t m a n B. K., (1977), Proc. Int. Soc. Neuro

chem., 6, 31.73. P a c k m a n P. M. , B l o m s t r a n d C., H a m b e r g e r A., (1971), J. Neurochem.,

18, 479—487.74. P i c k e l V. M., R e i s D. J., M a r a n g o s P. J., Z o m z e l y - N e u r a t h C.,

(1976), Brain Res., 105, 184—187.

http://rcin.org.pl

436 J. U L A S [20]

75. M a r a n g o s P. J., Z o m z e l y - N e z r a t h C., Y o r k C., (1976), Biochem. Biophys. Res. Commun., 68, 1309—1316.

76. M a r a n g o s P. J., P a r m a A. M., G o o d w i n F. K., (1978), J. Neurochem.,31, 727—732.

77. R o s e S. P. R., (1968), w Applied Neurochemistry, red. Davison A. N., Dobbing J., str. 332—335, Blackwell Scientific Publishers, Oxford.

78. T i p l a d y B., R o s e S. P. R., (1971), J. Neurochem., 18, 549—558.78a. Y a n a g i h a r a T., (1979), J. Neurochem., 32, 169—179.79. J o h n s o n D. E., S e 11 i n g e r O. Z., (1973), Brain Res., 54, 129—142.80. B l o m s t r a n d C., H a m b e r g e r A., (1969), J. Neurochem., 16, 1401—1407.81. R o s e S. P. R., (1976), w Perspectives in Brain Research, Progress in Brain

Research, red. Corner M. A., Swaab D. F., t. 45, str. 67—82, Elsevier-North-Hol- land Biomedical Press.

82. R o s e S. P. R., (1975), J. Neurosci. Res., 1, 19—30.83. H a m b e r g e r A., (1971), Brain Res., 31, 169—178.84. H e n n F., H a m b e r g e r A., (1971), Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 68, 2686—2690.85. V e r n a d a k i s A., (1974), w Drugs and the Developing Brain, reed. Vernadakis

A., Weiner N., str. 133—148, New York, Plenum.86. B r a d f o r d H. F., R o s e S. P. R., (1967), J. Neurochem., 14, 373—375.87. H a l j a m a e H., H a m b e r g e r A., (1971), J. Neurochem., 18, 1903—1912.88. G a i n e r H., (1978), Trends in Neurosciences, 1, 93—96.89. L a s e k R. J., G a i n e r H., B a r k e r J. L., (1977), J. Cell Biol., 74, 501—523.90. L i n g E. A., P a t e r s o n J. A., P r i v a t A., M o r i s S., L e b l o n d C. P.,

(1973), J. Comp. Neurol., 149, 43—73.91. V e r n a d a k i s A., (1973), Prog. Brain Res., 40, 231—243.92. V e r n a d a k i s A., G i b s o n D. A., (1973), 4th Int. Mtg. Intern. Soc. Neuro

chem., Tokyo, Japan, Abstracts str. 26—31.93. P o d u s 1 o S. E., M c K h a n n G. M., (1977), Brain Res., 132, 107—120.94. N a g a t a Y . , T s u k a d a Y., (1978), w Reviews of Neuroscience, red. Ehren

preis S., Kopin I. J., t. 3, str. 195—221, Raven Press, New York.

http://rcin.org.pl

RECENZJE

The Molecular Biology of Membranes

Red. S. Fleischer, Y. Hatefi, D. H. MacLennan i A. Tzagoloff,

Plenum Press, 1978, New York, London, 351 stron

Przełom lat czterdziestych i pięćdziesiątych był okresem szczególnie burzliwego rozwoju biochemii na kontynencie amerykańskim. W tym czasie wyodrębniło się szereg nowych kierunków badawczych. Ich twórcy, wówczas ludzie 30—40-letni, obecnie dobiegają wieku emerytalnego, choć wielu z nich jest nadal w pełni czynnych naukowo. Takimi pionierami współczesnej bioenergetyki byli David E. Green, Britton Chance, A. L. Lehninger, Efraim Racker i w Europie E. C. Slater. Obserwuje się obecnie serię „jubileuszowych” sympozjów poświęconych tym właśnie lu dziom, organizowanych w ich sześćdziesiąte, sześćdziesiąte piąte i inne, mniej okrągłe rocznice urodzin. Sympozjum ku czci Davida Greena, zorganizowane przez jego uczniów oraz byłych i aktualnych współpracowników, odbyło się w lutym 1977 r., a materiały w postaci pełnych tekstów wygłoszonych lub nadesłanych z tej okazji referatów ukazały się w rok później w postaci omawianej tu książki.

Zawiera ona 17 rozdziałów napisanych przez ludzi, którzy na swej drodze naukowej zetknęli się w taki czy inny sposób z D. E. Greenem. Polskiego czytelnika może zainteresować fakt, że wśród autorów jest dwoje Polaków: Jerzy Popinigis (Gdańsk) napisał rozdział III o zależnościach między ultrastrukturą a funkcją oddechową mitochondriów, a Elżbieta Zubrzycka (Warszawa) jest wraz z D. H. MacLenna- nem i innymi współautorką rozdziału XV o sarkoplazmatycznym retikulum. Książka zawiera również krótkie wspomnienia o Greenie napisane przez jego opiekunów naukowych, kolegów i uczniów, a sięgające wstecz aż po rok 1930, oraz wypowiedź samego Greena na temat przeszłych i obecnych a także perspektyw przyszłych badań nad mitochondriami. Green wraz z G. A. Blondinem jest również autorem jednego z rozdziałów, w którym daje wyraz swym poglądom na bioenergetykę mitochondriów.

Trzynaście spośród siedemnastu rozdziałów poświęcone jest specyficznym zagadnieniom „mitochondriologii”, a więc między innymi ultrastrukturze mitochondriów, transportowi jonów, poszczególnym składnikom łańcucha oddechowego i kompleksom enzymatycznym transportującym elektrony oraz syntetyzującym ATP, koncepcjom „sprzężenia energetycznego”, a także biogenezie mitochondriów. Pozostałe rozdziały omawiają ogólne problemy struktury błon biologicznych, rolę lipidów w błonach, mikrosomalne oksydazy i sarkoplazmatyczne retikulum.

Ogólnie biorąc, książka stanowi ciekawy i cenny zbiór informacji z zakresu bioenergetyki i błon biologicznych, choć przyznać trzeba, że niektórzy spośród autorów podobne przeglądy publikowali już w ostatnich latach także w innych wydawnictwach. Czytelnika mniej wprowadzonego w istniejące na terenie bioenergetyki różnice poglądów warto również uprzedzić, że pewne zagadnienia, w szczególności

http://rcin.org.pl

438 RECENZJE [2]

sprawy współzależności między strukturą a funkcją mitochondriów i poglądy na istotę sprzężenia energetycznego reprezentują w znacznej mierze poglądy szkołyD. E. Greena, nie zawsze podzielane przez innych badaczy.

L. Wojtczak

Advances in Neurochemistry, tom III.

Red. B. W. Agranoff i M. H. Aprison,

Plenum Press, 1978, New York, London, stron 317, cena $ 39.—

Kolejny tom „Advances in Neurochemistry” zawiera artykuły przeglądowe na tematy z dziedziny neurochemii. Są to:1. 3-fosfodiesteraza 2,3-cyklicznego nukleotydu (N. R. Sims i P. R. Carnegie)2. Immunohistochemia antygenów specyficznych dla układu nerwowego (L. F. Eng

i J. W. Bigbee)3. Skład i funkcjonalna organizacja struktur synaptycznych (S. P. Mahadik, H. Ta-

mir, M. Rapport)4. Wieloraka rola glutaminianu i asparaginianu w tkance nerwowej (R. P. Shank

i L. T. Graham, Jr.)5. Biochemiczne aspekty neurotransmisji w synapsach hamulcowych — rola glicyny

(M. H. Aprison i E. C. Dały).Jak widać z zamieszczonego spisu treści poruszana problematyka dotyczy za

równo zagadnień ogólnych jak i szczegółowych. Redaktorzy tej serii wydawniczej zostawiają poszczególnym autorom całkowitą swobodę jeśli chodzi o sposób przedstawiania poruszanych zagadnień.

Niektóre artykuły są bardzo trudne w odbiorze, dotyczy to przede wszystkim rozdziału pt.: „Makromolekularny skład i funkcjonalna organizacja struktur synaptycznych”, ze względu na zwartą formę i olbrzymi ładunek informacji (398 pozycji piśmiennictwa) a równocześnie bardzo ubogi materiał ilustracyjny, artykuł ten spełnia, według mnie rolę katalogu haseł.

Jedynie dwa artykuły w recenzowanym tomie łączą się ze sobą tematycznie (Rozdziały IV i V). Omówiono w nich rolę aminokwasów jako substancji neuro- transmiterowych w układzie nerwowym kręgowców. Aminokwasy (kwas glutaminowy i asparaginowy oraz glicyna) pełnią rolę w ogólnym metabolizmie i przez wiele lat ich pobudzające lub hamujące działanie na układ nerwowy traktowano jako efekt niespecyficzny. W ostatnim dziesięcioleciu nagromadziło się jednak szereg danych neurochemicznych, neurofizjologicznych jak i neurofarmakologicznych, które w skazują, że aminokwasy te spełniają kryteria stawiane substancjom neurotransmitero- wym. Autorzy omawiają istniejące jeszcze wątpliwości co do trafności interpretacji niektórych faktów oraz zwracają uwagę na kierunki przyszłych badań. W artykule poświęconym roli glicyny jako neurotransmitera podkreślono konieczność powiązania badań podstawowych z badaniami klinicznymi zwłaszcza w przypadku tężca, hyper- glicynemii i skurczów spastycznych.

Zastosowanie technik immunohistochemicznych do badań antygenów charakterystycznych dla układu nerwowego jest przedmiotem artykułu L. Enga i J. Bigbee. Należy żałować, że autorzy ograniczyli się jedynie do przytoczenia wyników prac eksperymentalnych bez próby ich oceny. Brak też jest sugestii autorów na temat

http://rcin.org.pl

[31 RECENZJE 439

dalszych możliwości wykorzystania tych technik. Zainteresowanym tą problematyką polecam artykuł W. Stallcupa i M. Cohn — „Celi — specific antisera as reagents for studying the N. S.” opublikowany w styczniowym numerze TINS (1979 r.).

Recenzowany tom „Advances in Neurochemistry”, podobnie jak i poprzednie tomy tej serii zainteresuje nie tylko neurochemików, ale i neurobiologów oraz lekarzy.

J. Skangiel-Kramska

Contemporary Topics In Molecular Immunology, Tom 7

Red. R. A. Reisfeld i F. P. Inman

Plenum Press, 1978, New York, London, stron 438, cena $ 47,40

Przedstawiona do oceny książka jest 7-ym z kolei tomem bardzo interesującego, periodycznego wydawnictwa poświęconego problemom współczesnej immunologii. Immunologia stanowi obecnie jedną z najbardziej rozwijających się gałęzi nauki. Ilość uzyskiwanych informacji jest bardzo duża, a wyniki często sprzeczne i trudne do interpretacji. Z tego względu bardzo ważną rolę spełnia seryjne wydawnictwo pt.: „Contemporary topics in molecular immunology", zamieszczające krytyczne artykuły przeglądowe, napisane przez wybitnych specjalistów z różnych dziedzin immunologii.

7 tom omawianej serii zawiera 11 rozdziałów: 1. Structure and function of serum and membrane immunoglobulin D/IgD — G. A. Leslie i L. N. Martin; 2. Analysis of biclonal immunoglobulins and their contributions to understanding the developmental aspects of the antibody response — D. S. ^Fair i R. G. Krueger; 3. Conformational flexibility in immunoglobulins — A. B. Edmundson, K. R. Ely i E. E. Abola;4. The effect of antigen on antibodies: Recent studies — H. Metzger; 5. Molecular interactions of cells with antibody and complement: influence if metabolic and physical properties of the target on the outcome of humoral immune attack — S. H. Ohanian, S. I. Schlager i T. Borsos; 6. Chemical aspects of the serum anaphylato- xius — T. E. Hugli: 7. Hapten-sandwich labeling of cell-surface antigens — L. Wofsy, C. Henry i S. Cammisuli; 8. Human DR (la-like) antigens: biological and molecular profile — S. Ferrone, J. P. Allison i M. A. Pellegrino; 9. The molecular structure and interrelationship of murine T lymphoid cell-surface antigens — F. Hunter, J. E. Mole i J. C. Bennett; 10. Functional and structural considerations in the recognition of virus-infected cells by cytotoxic T lymphocytes — T. J. Braciale, G. L. Ada i K. L Yap; 11. Molecular events in lymphocyte activation: role of nonhistone chromosomal proteins in regulating gene expression — J. M. Decker i J. J. Marchalonis.

W rozdziale 1 Leslie i Martin omawiają osiągnięcia ostatnich lat w zakresie badania biologicznej roli IgD.

Fair i Krueger wyjaśniają, w 2-gim rozdziale, że biklonalna gamopatia jest odzwierciedleniem normalnego różnicowania się komórek produkujących przeciwciała. W rozdziale napisanym przez Edmundsorna i wsp. (rozdział 3) omówione jest zagadnienie konformacyjnej elastyczności drobin immunoglobulin. Na podstawie badań rentgenograficznych autorzy omawiają wzajemne położenie regionów Fab i Fc

http://rcin.org.pl

440 RECENZJE [4]

i wpływ antygenów i haptenów na konformację przeciwciał. Podobne zagadnienia poruszane są przez Metzgera w rozdziale 4. Autor dyskutuje w sposób krytyczny z poglądami na temat allosteryczności przeciwciał.

Ohanian i wsp. w rozdziale 5, przedstawiają hipotezy na temat oddziaływań komórek z przeciwciałami i dopełniaczem. Autorzy wyjaśniają w jaki sposób składniki dopełniacza reagują między sobą i z membranami, powodując uszkodzenie membran i śmierć komórek. Zagadnienie roli składników dopełniacza, C3a i C5a, znanych jako anafilatoksyny dyskutowane jest przez Hugli w rozdziale 6. Autor wyjaśnia wpływ tych składników na uwolnienie histaminy z komórek, na skurcze mięśni gładkich, wzrost przepuszczalności naczyń, oraz wpływ na wielojądrzaste leukocyty i makrofagi.

Korzyści stosowania metody piętnowania haptenami do badania antygenów ko- ->* mórkowych opisywane są przez Wofsy i wsp. w rozdziale 7.

W rozdziale 8, Ferrone i wsp. omawiają strukturę i funkcję antygenów la na ludzkich limfocytach B oraz pokrewieństwo tych antygenów do antygenu HLA-D.

Rola antygenów H-2 w oddziaływaniach międzykomórkowych, mechaniźmie odpowiedzi immunologicznej omawiana jest w rozdziale 9 przez Hunter i wsp. oraz w 10 przez Braciale i wsp.

Decker i Marchalonis opisują procesy aktywacji limfocytów, a w szczególności rolę niehistonowych chromosomalnych białek w regulacji ekspresji antygenowej limfocytów. Autorzy sugerują, że aktywacja genu jest najbardziej istotnym etapem w różnicowaniu się komórek i w funkcji komórek.

Wszystkie rozdziały napisane są w sposób jasny, krytyczny i zaopatrzone w najnowsze odnośniki literaturowe. Wiadomości przedstawione w poszczególnych rozdziałach będą interesujące nie tylko dla specjalistów, ale również dla badaczy z dziedzin pokrewnych: biologów, biochemików.

E. Lisowska

Advances in Experimental Medicine and Biology, Vol. 98 Immunobiology of Proteins and Peptides — I.

Red. M. Z. Atassi i A. B. Stavitsky

Plenum Press, 1978, New York, London, stron 524, cena $ 54.

Jednym z centralnych zagadnień immunologii jest zrozumienie molekularnych podstaw oddziaływań antygen—przeciwciało oraz rozpoznawanie antygenów przez komórki. Jakkolwiek zagadnienie to jest względnie łatwe do opracowywania w odniesieniu do bardzo prostych substancji o znanej strukturze chemicznej, duże trudności nastręczają badania z zastosowaniem antygenów złożonych, wysokocząstecz- kowych, np. białek. Dopiero w ostatnich latach udało się określić determinanty antygenowe myoglobiny i lizozymu. Badania nad innymi białkami są prowadzone obecnie w wielu ośrodkach na świecie. Badania te są bardzo istotne dla w yjaśnienia swoistości komórek rozpoznających dane antygeny oraz dla wyjaśnienia genetycznej kontroli procesu rozpoznawania antygenów. Przedstawiona do oceny książka stanowi 1 tom sprawozdania z Międzynarodowego Sympozjum na temat immu- nobiologii białek i peptydów, które odbyło się we wrześniu 1977 r. w Minneapolis. Książka podzielona jest na 5 głównych rozdziałów: Antigenic structure of proteins,

http://rcin.org.pl

[5] RECENZJE 441

lmmunobiology of proteins and peptides, Immunoresponse to synthetic polymers and to proteins, oraz Lymphocyte membrane structure. W obrębie tych głównych rozdziałów zamieszczone są poszczególne artykuły napisane przez najwybitniejszych badaczy tych zagadnień, jak np. Atassi, Schechter, Benjamin, Feldman, Mozes, Schlossman i wielu innych. Głównymi poruszanymi problemami są: a) regulacja syntezy przeciwciał — wydzielanie przeciwciał, ich powinowactwo oraz oddziaływanie antygenów z komórkami B, b) genetyczna kontrola odpowiedzi immunologicznej przeciw białkom, c) funkcje subpolucji limfocytów, d) markery na błonach lim focytów, e) właściwości rozpuszczalnych stymulatorów i supresorów, f) immuno- chemia i immunobiologia układów hapten-nośnik i polimerów aminokwasowych. Zamieszczone w książce artykuły pozwalają na zrozumienie różnic i podobieństw między antygenami oraz wskazują na nowe kierunki badań w tej dziedzinie.

Przedstawiona książka wyczerpująco informuje o dotychczasowych wynikach badań i może stanowić doskonałe źródło dla badaczy pragnących rozpocząć prace na zależnością między strukturą i antygenowością białek.

Książka przeznaczona jest raczej dla osób posiadających opanowane podstawy immunologii.

E. Lisowska

E. Beutler

Hemolytic Anemia in Disorders of Red Cell Metabolism

Plenum Medical Book Company, 1978, stron 266, cena $ 28,20.

Recenzowana książka została wydana w serii monografii „Topics in Hemato- logy”, której głównym celem jest przedstawienie w zwięzłej formie swpółczesnego stanu wiedzy na temat podstawowych zagadnień dotyczących metabolizmu komórek krwi i zaburzeń metabolicznych w chorobach krwi. Monografia Ernesta Beutlera, znakomitego znawcy enzymologii krwinki czerwonej, biochemika i klinicysty, w ypełnia lukę istniejącą od dawna w piśmiennictwie hematologicznym dotyczącym niedokrwistości hemolitycznych.

Z czterech rozdziałów, na które podzielona jest książka, pierwszy — zatytułowany „Krwinka czerwona” — zawiera niezwykle przejrzysty opis cyklów metabolicznych zachodzących w erytrocycie. Opis ten poprzedzony jest krótkim zarysem wiadomości o budowie błony komórkowej krwinki czerwonej, uwzględniającym najnowsze dane o poszczególnych częściach składowych tej specyficznej struktury: poszczególnych warstw lipidowych , i białkowych (spektryny, glikoforyny, białka aktyno-podobnego i innych), ułożeniu przestrzennym tych warstw w stosunku do siebie, co zapewnia niezwykle selektywną przepuszczalność błony dla różnych jonów.

Występująca w krwince przemiana glukozy w cyklu reakcji Embdena-Meyer- hoffa prowadzi do nagromadzenia związków bogatych w energię, i przy udziale reakcji NAD+-*NADH do podstawowej dla funkcji erytrocyta przemiany kwasu 1,3-dwufosfoglicerynowego w kwas 2,3-dwufosfoglicerynowy regulujący krzywą dysocjacji tlenowej hemoglobiny. Natomiast tzw. cykl pentozowy przy udziale przemiany NADP+->NADHP i redukcji glutationu dostarcza substratów dla syntezy nukleotydów. Cykl ten charakterystyczny dla krwinki czerwonej — poza rolą w syn

http://rcin.org.pl

442 RECENZJE [6]

tezie nukleotydów zabezpiecza krwinkę przez utrzymywanie glutationu w formie zredukowanej przed uszkodzeniem przez niekontrolowaną reakcję peroksydazową. Opis przemian metabolicznych dodatkowo zaopatrzony jest w tablicę zawierającą szczegółową charakterystykę 25 enzymów krwinki czerwonej.

Na tym tle stają się zrozumiałe zjawiska patologiczne występujące w krwince czerwonej w przypadkach defektów dotyczących poszczególnych enzymów, doprowadzające do hemolizy.

W następnych 3 rozdziałach omówione zostały kolejno:1. Niedobór dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, co stanowi najobszerniejszy roz

dział ze względu na największą częstość występowania tego defektu genetycznego (stwierdzono ten defekt u ie°/o populacji murzyńskiej Stanów Zjednoczonych), ciężkie objawy kliniczne i możliwość prowokowania hemolizy przez podanie niektórych leków. Autor szczegółowo omawia strukturę dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu, jej własności kinetyczne oraz warianty. W tablicach zestawiona jest częstość występowania defektu w różnych populacjach ludności w niemal wszystkich krajach świata, jak i częstość występowania oraz własności bio- i fizykochemiczne poszczególnych wariantów tego enzymu. Objawy patologiczne wyjaśnione są przejrzyście mechanizmami biochemicznymi prowadzącymi do określonych zmian funkcji komórki. Wiele uwagi autor poświęca omówieniu wszystkich czynników, które mogą wyzwalać kryzys hemolityczny u ludzi z tym defektem enzymatycznym, a więc: infekcjom, kwasicy, zetknięciu z bobem (favizm), a przede wszystkim lekom. Poza skrupulatnym wyliczeniem leków, które mogą prowokować objawy choroby, przedstawione są również leki, które można bez obawy podawać w tej wadzie wrodzonej. Takie ujęcie stanowi o dużej wartości praktycznej omawianej książki.

2. Niedobór kinazy kwasu pirogronowego — drugi co do częstości występowania defekt enzymatyczny krwinki prowadzący do hemolizy.

3. Inne niedobory enzymatyczne, rzadsze, o mniejszym znaczeniu klinicznym, jednakże ciekawe, czy to z punktu widzenia genetycznego, czy też biochemicznego, jak: niedobory heksokinazy, fosfofruktokinazy, aldolazy, enzymów biorących udział w przemianie gliceraldehydu i redukcji i syntezy glutationu. Stosunkowo obszerną część ostatniego rozdziału stanowią zaburzenia metabolizmu nukleotydów w krwince czerwonej, a wśród nich bardzo interesujący „High ATP Syn- drome” i stosunkowo niedawno opisany niedobór nukleotydazy pirymidynowej.Diagnostyka biochemiczna zaburzeń aktywności każdego z omawianych enzy

mów podana jest szczegółowo z krytycznym ustosunkowaniem się autora do poszczególnych metod.

Każdy rozdział opatrzony jest bogatym spisem pozycji bibliograficznych, doprowadzonym do końca 1977 roku. Jeden tylko rozdział o niedoborze dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej zawiera 833 pozycje. Już sama bibliografia stanowić by mogłao niezwykłej wartości tej książki.

Książka E. Beutlera „Niedokrwistość hemolityczna w zaburzeniach metabolizmu krwinki czerwonej” stanowi przykład nowoczesnej monografii klinicznej opartejo rzetelną wiedzę biochemiczną. Książka ta uczy współczesnego, biochemicznego podejścia do zjawisk patologicznych w ustroju. Niedarmo też prof. M axwel Wintro- be — redaktor serii „Topics in Hematology” — światowej sławy hematolog i autor najlepszych podręczników hematologii — w krótkiej przedmowie do książki napisał: ...” monografia dr Ernesta Beutlera długo będzie służyć jako model dla monografii z podstawowych dziedzin nauk medycznych... Powstał tom, który może być uznany naprawdę za ostatnie słowo w tej ważnej dziedzinie”.

Z. Kuratowska

http://rcin.org.pl

[7] RECENZJE 443

A. S. Prasad

Trace Elements and Iron in Human Metabolism

Plenum Press, Medical Book Company, 1978, New York, London, stron 392, cena 35,40 $.

Książka stanowi jedną z trzech pozycji serii wydawniczej „Topics in Hematology” (red. M. M. Wintrobe). Pozostałe dwie to: „The respiratory Functions of Blood” — L. Gorby i J. Meldon oraz „Hemolytic Anemia in Disorders of Red Cell Metabolism” — E. Beautler.

Książka A. S. Prasad jest obszernym przeglądem piśmiennictwa z zakresu biochemii, fizjologii, patologii i toksykologii żelaza oraz najważniejszych pierwiastków śladowych występujących w organizmie człowieka. W pierwszej części zatytułowanej „Essential Elements” (330 stron, około 1500 pozycji piśmiennictwa) omówione zostały pierwiastki niezbędne dla ustroju; takie jak miedź, żelazo, cynk, magnez, mangan, selen, fluor, jod, chrom, a także nikiel, wanad, krzem i cyna. W drugiej części — „Toxic Elements” — kadm, ołów i rtęć (32 strony, 115 pozycji piśmiennictwa). W książce najwięcej uwagi poświęcono cynkowi, żelazu i miedzi zapewne w związku z osobistymi zainteresowaniami autorki, która opublikowała szereg prac z zakresu biochemii i fizjologii tych pierwiastków.

Zgodnie z przyjętym schematem podrozdziałów, przedstawiając w książce kolejne pierwiastki autorka omawiała ich wiązanie narządowe ze szczególnym uwzględnieniem wiązania we krwi, wiązanie z białkami, wchłanianie, metabolizm i wydalanie, rolę danego pierwiastka w ustroju. Bardzo szczegółowo przedstawiła też zmiany biochemiczne oraz objawy kliniczne towarzyszące niedoborom pierwiastków śladowych, a także niektóre jednostki chorobowe związane z zaburzeniami przemiany lub niedoborem metali niezbędnych.

Dla przykładu: w przeglądzie na temat miedzi można znaleźć wiele szczegółów dotyczących zaburzeń związanych z jej niedoborem a charakteryzujących się uszkodzeniem kośćca, tkanki łącznej, schorzeniami naczyniowymi, uszkodzeniem układu nerwowego itp. Po omówieniu najważniejszych enzymów zawierających w cząsteczce miedź (oksydaza cytochromu c, dysmutaza ponad nadtlenkowa, urykaza, oksydazy aminowe) przedstawiono rolę miedzi w metabolizmie żelaza, a następnie metabolizm miedzi (wchłanianie, wiązanie, transport, wydalanie). W punkcie traktującym o podwyższonych poziomach miedzi autorka przedstawiła objawy zatruć związkami miedzi, jak również biochemiczne i patologiczne zmiany występujące w chorobie Wilsona. Informacje dotyczące ceruloplazminy, jej budowy, roli, poziomów we krwi są rozproszone i dość trudne do uchwycenia. Autorka nie wspomina o zmianach w subkomórkowym rozmieszczeniu miedzi w wątrobie zależnych od jej poziomu narządowego. Nieścisłe i niepełne są dane o niskocząsteczkowych białkach miedziowych występujących w dużych ilościach w wątrobach zarówno noworodków jak i ludzi cierpiących na chorobę Wilsona. Mitochondrokupreina, o której autorka wspomina, została zidentyfikowana jako metalotioneina w 1974 roku, a rola meta- lotioneiny w gospodarce miedzią w ustroju była postulowana przez Evansa już w 1973 r.

Poruszenie ogromnej liczby problemów w jednej książce nie pozwoliło uniknąć pobieżnego naświetlenia niektórych z nich. Czytającemu ją biochemikowi zabraknie w wielu miejscach istotnych informacji na temat sposobu wiązania metalu z białkiem (lub inną substancją endogenną) jak również bardziej szczegółowych danycho budowie chemicznej czy mechanizmie działania omawianej metaloproteiny. Lekarz

http://rcin.org.pl

444 RECENZJE [8]

klinicysta znajdzie niewątpliwie znacznie dokładniejsze dane na temat patologii, patogenezy lub etiologii niektórych schorzeń w fachowym piśmiennictwie medycznym. Zbyt ubogo także opisane są zagadnienia toksykologiczne choć wiadomo, że pierwiastki fizjologicznie niezbędne mogą powodować poważne zatrucia w przypadku nadmiernego obciążenia organizmu.

Ta wybitnie interdyscyplinarna książka może jednak służyć jako źródło bogato cytowanego piśmiennictwa (szczególnie część pierwsza) tym bardziej, że autorka podaje tytuły wszystkich cytowanych prac. Pewne utrudnienie stanowi jednak fakt, że przytaczając nowsze dane autorka odwołuje się często nie do prac oryginalnych lecz przytacza źródła książkowe z lat 1976 i 1977. Są to:

1. Trace Elements in Human Health and Disease, tom I i II, red. A. S. Prasad, Academic Press, N. Y., 1976.

2. Underwood E. J. Trace Elements in Human and Animal Nutrition, wyd. 4, Academic Press, N. Y., 1977.

Bardzo wąski, w porównaniu z pierwszą częścią książki, przegląd zagadnień związanych z biochemią i toksykologią kadmu, ołowiu i rtęci oparty jest również na dwóch wymienionych pozycjach. W tej części autorka przytacza dodatkowo obszerną monografię Friberg L. i wsp. Cadmium in the Environment, CRC Press, Cleveland, Ohio, 1974. W świetle powyższego zdziwienie może budzić brak odnośnika do drugiej podobnej monografii dotyczącej rtęci: Friberg L. i Vostal I. Mercury in the Environment, CRC Press, 1972.

Druga część książki budzi znacznie więcej zastrzeżeń niż pierwsza. W chwili obecnej jednak, gdy zanieczyszczenie środowiska staje się coraz poważniejszym problemem i gdy ukazują się setki prac z zakresu biochemii i toksykologii metali ciężkich, gdy trudno jest opracować przegląd tych zagadnień w tak wielkim skrócie.

Niezależnie jednak od wszystkich wymienionych zastrzeżeń książka może stanowić użyteczną pozycję w bibliotece zarówno lekarza i biochemika, jak i toksykologa.

E. Mogilnicka

Superoxide and Superoxide Dismutases

Red. A. M. Michelson, J. M. McCord i I. Fridovich

Academic Press, 1977, London, New York, stron 568, cena £ 12,5.

Odkrycie w 1969 przez McCorda i Fridovicha aktywności enzymatycznej erytrokupreiny — jako dysmutazy ponadtlenkowej (wg EC, oksydoreduktaza ponadtlenek: ponadtlenek, stosowany skrót SOD) było w znacznym stopniu następstwem szczęśliwego przypadku. Dzisiaj, w niespełna 10 lat od tego wydarzenia, rozmiar wiedzy o dysmutazach ponadtlenkowych i ich roli w metabolizmie tlenu jest tak duży, że — jak pisze Michelson w przedmowie — może być porównywany nawet z takimi osiągnięciami w historii biochemii jak odkrycie struktury DNA przez Watsona i Cricka w 1953.

Recenzowana książka jest wynikiem prac pierwszego seminarium na temat „Superoxide and Superoxide Dismutase”, zorganizowanego przez Europejską Organizację Biologii Molekularnej (EMBO) w 1976, w Banyuls, Francja. Stanowi ona reprezentatywne podsumowanie wiadomości o roli rodniko-jonu ponadtlenkowego

http://rcin.org.pl

in RECENZJE 445

i dysmutaz ponadtlenkowych w metabolizmie komórki, zarysowując jednocześnie perspektywy rozwoju tej dyscypliny nauki i ewentualnego jej zastosowania w praktyce. Pozycja ta jest, jak dotychczas jedynym, poświęconym w całości tej tematyce wydawnictwem książkowym i dobrze się stało, że zadbano w niej by prezentowane problemy były możliwie bogato udokumentowane graficznie i zaopatrzone we współczesne piśmiennictwo.

Zebrany w książce materiał podzielony jest z konieczności na 45 krótkich rozdziałów, będących w większości pracami eksperymentalnymi. Można je jednak połączyć w pięć spójnych tematycznie grup. A oto poruszana w nich tematyka:

1. Metodyka badania reakcji katalizowanej przez SOD,2. Rodniko-jon ponadtlenkowy jako substrat SOD,3. Przegląd właściwości różnych form SOD, ze szczególnym uwzględnieniem

relacji między strukturą a ich funkcją,4. Rola SOD i jej substratu w metabolizmie komórki,5. Zastosowanie kliniczne SOD.Część pierwszą (2 rozdziały) poświęcono przeglądowi metod stosowanych do

oznaczania aktywności SOD. Zwrócono szczególną uwagę na trudności w porównaniu wyników otrzymywanych różnymi metodami oraz na konieczność wprowadzenia możliwie uniwersalnej jednostki aktywności tego enzymu, niezbędnej chociażby przy diagnostycznej ocenie zmian aktywności.

Część druga książki obejmuje 11 rozdziałów i omawia właściwości fizyko-chemiczne oraz możliwości powstawania (wytwarzania) rodniko-jonu ponadtlenkowego w układach „in vivo” i „In vitro”. Zaakcentowano w niej także toksyczny charakter tego związku dla struktur biologicznych.

W kolejnej, trzeciej części (13 rozdziałów), przedstawiono dane dotyczące struktury oczyszczonego enzymu — erytrokupreiny oraz wyjaśniono mechanizm oddziaływania enzymu z substratem oparty na rezultatach badań kinetyki katalizowanej przez ten enzym reakcji. Ponadto omówiono wszystkie znane formy dysmutaz ponadtlenkowych, enzymów — jak się okazuje — charakterystycznych dla wszystkich organizmów tlenowych.

Część czwartą recenzowanej książki (13 rozdziałów) poświęcono wynikom badań funkcji metabolicznych SOD. Zaproponowano, częściowo hipotetyczny, mechanizm działania SOD w procesie fagocytozy bakterii przez leukocyty wielojądrowe ssaków, a także w procesach zabezpieczania mitochondriów i chloroplastów przed toksycznym działaniem rodniko-jonu ponadtlenkowego.

W części piątej (4 rozdziały) zasygnalizowano możliwości diagnozowania niektórych stanów patologicznych u ssaków (także u człowieka), opierając się na pomiarach aktywności SOD w surowicy krwi, a także zastosowania SOD lub jej „analogów” (orgoteina) jako leków przeciwzapaleniowych.

Recenzowana książka zawiera ponadto dwa rozdziały uzupełniające: pierwszy poświęcony historii odkrycia reakcji dysmutacji katalizowanej przez SOD i drugi krótko podsumowujący zawarty w książce materiał. Jednocześnie, jakkolwiek większość autorów dyskutuje prezentowane wyniki z danymi już opublikowanymi, szkoda, że w tej bogatej w kontrowersje publikacji zabrakło części poświęconej głosom w dyskusji uczestników seminarium.

W sumie, książka ta zawiera bardzo bogaty materiał eksperymentalny nierzadko poparty przejrzystymi wywodami teoretycznymi i stanowi przez to istotną pozycję w bieżącej literaturze naukowej. Z uwagi jednak na interdyscyplinarny charakter poruszanych zagadnień, przeznaczona jest ona raczej dla pracowników nauki, niekoniecznie biochemików, z pewnym stażem naukowym.

W. P . Michalski

http://rcin.org.pl

446 RECENZJE [10]

Dietary Fats and Oils in Human Nutrition FAO Food and Nutrition Paper, Report of an Expert

Consultation FAO/WHO, Rzym, 21—30.09.1977, stron 94.

We wrześniu 1977 r. w Rzymie odbyła się konferencja ekspertów FAO i WHO poświęcona problematyce tłuszczów i olejów jadalnych w wyniku której opublikowano raport liczący 94 strony.

Jest to oficjalny dokument FAO i WHO odnośnie roli tłuszczów i olejów jadalnych w żywieniu człowieka. Znaczenie tych obrad jest bardzo doniosłe ze względu na fakt, że nawet w krajach wysoce rozwiniętych gospodarczo szerzą się choroby związane z niewłaściwym żywieniem. Tłuszcze w żywieniu człowieka stanowią problem złożony i kontrowersyjny.

W ciągu ostatnich lat poczyniono znaczne postępy w badaniach nad wpływem spożywanych tłuszczów na organizm człowieka w wyniku których powstała potrzeba rewizji dotychczasowych poglądów odnośnie wartości tłuszczów jadalnych. Przy czym rysują się tu dwa podstawowe zagadnienia: znaczenie tłuszczów w żywieniu człowieka i aspekty bezpieczeństwa dla zdrowia człowieka. Opracowanie ekspertów FAO/ /WHO jest syntezą referatów przedstawionych na konferencji, zawiera dziesięć zasadniczych rozdziałów i wnioski.

Po wprowadzeniu w rozdziale pierwszym, rozdział drugi omawia podstawowe pojęcia i definicje dotyczące tłuszczów, olejów, ich klasyfikację oraz nomenklaturę niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT). Kolejne rozdziały zajmują się następującymi problemami: 1) tłuszcze jako źródło energii, 2)‘ zastosowanie tłuszczów w żywieniu dorosłych i dzieci, 3) niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe, 4) rola NNKT we wczesnym rozwoju człowieka, 5) rola tłuszczów w prewencji i leczeniu choroby wieńcowej, otyłości i cukrzycy, 6) wpływ procesów technologicznych na wartość żywieniową tłuszczów i olejów, 7) uwagi ogólne ze szczególnym uwzględnieniem oleju rzepakowego oraz częściowo utwardzonego tłuszczu ryb morskich zawierającego długołańcuchowe wielonienasycone kwasy tłuszczowe, 8) ostatnie tendencje produkcji, handlu i konsumpcji tłuszczów i olejów, 9) wpływ hodowli zw ierząt i uprawy roślin na jakość i skład tłuszczów zwierzęcych i roślinnych.

Opracowanie zamykają wnioski końcowe zawierające sugerujące kierunki dalszych badań w tej dziedzinie.

Szczególnie interesujące wydają się uwagi zawarte w rozdziałach dotyczących

Do niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych zaliczane są kwas linolowy (Ci8:2, n_e) i kwas a-linolenowy (Ci8.-3, n-s) oraz powstające ich metabolity o dłuższych łańcuchach węglowych np. kwas arachidonowy (C2o:4, n_6) i kwas y lin o lenow y (Ci8:3, n-e) powstające z kwasu linolowego:

NNKT.

' linolowy 18:2, n-6 arachidonowy

20:4, n-6

a-linolenowyeikozapentaenowy 20:5, n—3

Y-linolenowy 18:3, n-6 22:4, n-6

18:4, n—322:5, n—3

20:4, n—3 j

dihom o-Y -linolenow y 22:5 n-6 20:3, n-6

dokozaheksaenowy 22:6, n—3

(n — oznacza numer atomu węgla przy którym występuje pierwsze podwójne w iązanie licząc kolejność węgli od grupy metylowej CH3).

http://rcin.org.pl

[11] RECENZJE 447

W wyniku ostatnich badań stwierdzono, że minimalne zapotrzebowanie na niezbędne nienasycone kwasy tłuszczowe (NNKT) u człowieka zdrowego jest pokryte jeżeli dostarczają one 3% ogólnej kaloryczności całodziennego pożywienia.

W okresie ciąży i karmienia niemowląt przez kobietę zalecane są większe ilości NNKT w pożywieniu. W okresie ciąży procent energii pochodzącej z NNKT powinien wynosić 4,5%, a dla matek karmiących 5—7% energii pochodzącej z NNKT.

Preparaty mleczne dla niemowląt powinny zawierać te same ilości NNKT co mleko dobrze odżywionej matki zawierające niezbędne nienasycone długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, a stosunek kwasów z rodziny n-6 do kwasów z rodziny n-3 powinien wynosić 5:1.

Stwierdzono ostatnio, że w mleku zdrowej dobrze odżywionej kobiety kwasy nienasycone długołańcuchowe C 20 :3, « - e , C 2o:4 , «_6 , C 2 2 :4 , » _ 6 i C 22 :5 , n_e stanowią około !% ogólnej ilości kwasów tłuszczowych, a kwasy C 2 0 :s, n_3, C 2 2 :2 ,n _ 3 , i C 2 2:6, „ _ 3 około 1,3% przy ogólnej zawartości wszystkich NNKT wynoszącej około 12,4% wszystkich kwasów tłuszczowych. NNKT zawarte w mleku zdrowej dobrze odżywionej matki dostarczają dziecku 5—6% ogólnej ilości Kalorii z tego 4—5% Kalorii pochodzi z kwasu linolowego Ci8:2, n_6 i z kwasu a-linolenowego Ci8:3, « _ 3 , a 1% Kalorii z kwasów tłuszczowych o dłuższych łańcuchach (C 2 0 i C22). W ustroju kobiety podczas przemiany kwasów C ig ;2 , n -e i C i8 :3 , n -3 do kwasów o dłuższych łańcuchach (C20 i C22) następują straty stanowiące 1—2% energii, co uwzględnia się przy zwiększonych zaleceniach ilości NNKT dla kobiety karmiącej (5—7% ogólnej ilości Kalorii).

Stwierdzono również występowanie dużych ilości kwasów nienasyconych C20:4, n_6 i C22:6, n—3 w łożysku i tkankach płodu, głównie w fosfolipidach mózgu i wątroby. W związku z rozwojem płodu wzrasta zapotrzebowanie na NNKT i dlatego u kobiet ciężarnych zwiększono zalecaną ilość NNKT o 1,5% (w przeliczeniu na Kalorie) ponad zapotrzebowanie podstawowe.

W wyniku doświadczeń przeprowadzonych na zwierzętach stwierdzono, że niedobory NNKT w pożywieniu samic ciężarnych obok niedoborów białkowych powodowały upośledzenie rozwoju mózgu płodu oraz wpływały na zwiększenie ilości martwych płodów.

Racja pokarmowa ludzi wykazujących ryzyko choroby wieńcowej, w otyłości lub cukrzycy powinna dostarczać 10—15% energii z białka, 30—39% z tłuszczu z obniżoną zawartością nasyconych kwasów tłuszczowych przy poziomie kwasu linolowego stanowiącego 1/3 wszystkich kwasów tłuszczowych. Zawartość cholesterolu nie powinna przekraczać 300 mg dziennie.

W ciągu ostatnich dziesięciu lat rola i znaczenie NNKT stały się przedmiotem wielu prac badawczych. Dotychczas głównie zwracano uwagę na znaczenie kwasu linolowego (Cig:2, n-s)- Ostatnie badania wykazały, że kwas a-linolenowy (Ci8:3, n-j) i jego metabolity 20 i 22 węglowe (C2o:s, »_3 i C22:5, « -3) odgrywają specyficzną rolę w rozwoju i funkcjonowaniu niektórych tkanek głównie mózgu i siatkówki oka. Dlatego należy uważać kwas a-linolenowy za niezbędny składnik pożywienia.

Ostatnio jako kryterium niedoborów NNKT w ustroju przyjmuje się stosunek kwasów C20:3, n-9*0 do C2o-.4, »_6 w fosfolipidach surowicy krwi zamiast przyjętego w 1964 r. kryterium wyrażonego stosunkiem całkowitej ilości kwasów trójnienasy- conych do czteronienasyconych. Według ostatnich poglądów stosunek ten nie powinien przekraczać 0,2.

Ponadto przyjęto kilka innych parametrów opartych na analizie kwasów tłuszczowych lipidów surowicy krwi. W niedoborze NNKT podnosi się poziom C i8:i, n_ 7 ,

Ci8:i, n—9 i C20:3, n-9 przy jednoczesnym zmniejszeniu poziomu kwasów z rodziny n-6.Zawartość kwasu linolowego (Ci8:2j »-e) w estrach cholesterolu surowicy krwi

może być także używana jako wskaźnik zapotrzebowania ustroju na NNKT.

*) K w as e ik o z a tr ie n o w y , m e ta b o lit k w a su o le in o w e g o (C n :i, n_9).

http://rcin.org.pl

448 RECENZJE [ 1 2 ]

Również znając zawartość kwasów tłuszczowych fosfolipidów surowicy krwi można obliczyć procent Kalorii pochodzących z kwasu linolowego z wzoru:

logio kwasu linolowego = 0 ,0 7 9 ( C l 8 :2 , n_6 + c20:4, n_6 — C20:3, n-ę)—1,9 (I)

w którym kwas linolowy jest wyrażony w procentach ogólnej kaloryczności spożytej racji pokarmowej, a trzy pozostałe kwasy tłuszczowe są wyrażone w procentach ogólnej ilości kwasów tłuszczowych fosfolipidów surowicy krwi u dzieci. Dla zdrowych dzieci karmionych piersią otrzymano wynik 5,1% Kalorii stosując wzór I a stosując wzór II otrzymano wynik 4, 8% Kalorii:

logio kwasu linolowego ~ 5,8 (logio wszystkich kw. n-6)—8,5 (II)

Nieprawidłowość w przemianie kwasu linolowego C i8:2, n-6 do C2o=4, n~e może być wykryta przez wyliczenie stosunku C i8:2, n_6 do C2o:4, n-6. Normalnie u dzieci ten stosunek wynosi 1,67±0,62 podczas gdy w ostrym niedoborze NNKT około 1,2.

Spośród przedstawionych w niniejszym opracowaniu 19 kierunków przyszłych badań, na szczególną uwagę zasługują następujące problemy:

— Badania nad zapotrzebowaniem na NNKT ze szczególnym uwzględnieniem roli tych kwasów w ustroju oraz ich ilości niezbędnych dla wzrostu, regeneracji tkanek i biosyntezy prostaglandyn.

— Poszukiwania nowych kryteriów oceny niedoborów NNKT u ludzi.— Badania mające na celu określenie optymalnego zapotrzebowania ustroju na

NNKT z uwzględnieniem wieku oraz różnych stanów fizjologicznych (ciąża, laktacja).

— Wpływ dodatkowego pożywienia zawierającego NNKT na stan zdrowia i stan odżywiania dzieci karmionych piersią przez źle odżywione matki i dzieci wcześnie odstawionych od piersi.

— Badania nad wpływem zmian składu kwasów tłuszczowych w pożywieniu na skład lipidów surowicy krwi u dzieci.

— Dalsze badania nad rolą tłuszczów w etiopatogenezie choroby wieńcowej.— Zastosowanie ulepszonych bardziej precyzyjnych metod analitycznych ozna

czania zawartości witaminy E w pożywieniu.— Wpływ przeciwutleniaczy na metabolizm NNKT.— Dalsze badania nad olejem rzepakowym mające na celu znalezienie innej

substancji poza kwasem erukowym — odpowiedzialnej za zmiany w sercu u zwierząt.

— Opracowanie bardziej nowoczesnych metod analitycznych oznaczania kwasów tłuszczowych cis i izomerów trans w pożywieniu.

Omawiana publikacja ta jest niezwykle cenna, bardzo zwięźle przedstawiono rolę tłuszczu w żywieniu człowieka. Jednocześnie dość bogato uzupełniona jest materiałem tabelarycznym zawierającym dane o składzie tłuszczów, ich produkcji i dystrybucji. Zwraca również uwagę na pożądane zmiany w stosowanych procesach technologicznych.

G. Okolska

http://rcin.org.pl

[131 RECENZJE 449

Nutritional Improvement of Food and Feed Proteins

Red. Mendel Friedman

Plenum Press, 1978, New York, London, stron 882, cena $ 83,40.

Książka stanowi zbiór 40 głównych referatów przedstawionych na Sympozjum pt.: „Improvement of Protein Nutritive Quality of Foods and Feeds”, w Chicago 1977 r.

Według szacunkowych danych ponad 500 milionów ludzi cierpi obecnie na niedobór białka w pożywieniu. Liczba osób cierpiących na niedożywienie białkowe narasta z każdym rokiem w miarę przyrostu naturalnego ludności, za którym niestety nie podąża odpowiedni przyrost ilości żywności. Istnieje zatem konieczność szybkiego zwiększenia produkcji żywności a szczególnie pełnowartościowego białka zarówno na zaspokojenie bezpośrednich potrzeb konsumpcyjnych ludności oraz pośrednio na pokrycie potrzeb żywienia zwierząt hodowlanych.

Wartość biologiczna białka tj. wartość żywieniowa zależy od jego składu aminokwasowego, a szczególnie od zawartości aminokwasów egzogennych. Wiele produktów spożywczych, szczególnie pochodzenia roślinnego, wykazuje mniejszą wartość biologiczną białka, ze względu na niską zawartość wielu aminokwasów egzogennych. Szczególnie odnosi się to do białek zbożowych wykazujących mniejszą zawartość takich aminokwasów jak izoleucyna, lizyna, treonina i tryptofan oraz roślin strączkowych, które są często ubogim źródłem metioniny.

W celu dostarczenia właściwego białka wzrastającej stale na kuli ziemskiej ludności (ok. 24)/o rocznie) należy podjąć wielokierunkową akcję w dziedzinie rolnictwa, hodowli oraz przetwórstwa żywności. Trzeba zmobilizować w większym stopniu niż dotychczas środki w dziedzinie uzyskiwania nowych odmian roślin i zwierząt hodowlanych oraz w przetwórstwie żywności. Należy w tym celu zaangażować genetyków, chemików i technologów żywności oraz biochemików, żywieniowców, dietetyków, lekarzy, toksykologów żywności a także ekonomistów zajmujących się zagadnieniami produkcji żywności i wyżywienia.

W związku z tym została zorganizowana międzynarodowa konferencja celem kompleksowego omówienia problemów związanych z produkcją żywności zawierającej pełnowartościowe białko (nowe odmiany wysokobiałkowych roślin, nowe odmiany zwierząt hodowlanych), nowoczesnym przetwórstwem żywności i wytwarzaniem pełnowartościowych produktów spożywczych o najkorzystniejszym składzie aminokwasowym białek, łącznie ze wzbogacaniem w odpowiednie aminokwasy produktów niepełnowartościowych. Szczególną uwagę zwrócono na omówienie nowoczesnych procesów technologicznych w przetwórstwie żywności, mających na celu jak największą ochronę białka w procesie obróbki chemicznej i termicznej. Uwzględniono także chemiczną i mikrobiologiczną syntezę egzogennych aminokwasów a także zagadnienia interreakcji pomiędzy aminokwasami lub białkiem a innymi skład- ikami żywności w procesie jej produkcji i magazynowania. Osobnym tematem obrad były aspekty gospodarcze dotyczące kosztów wytwarzania oraz wzbogacania żyw ności. Przeprowadzono także weryfikację metod dotyczących biologicznej oceny białek ze szczególnym uwzględnieniem procesów przyswajania białka wzbogaconego w aminokwasy a także zagadnienia antagonizmu pomiędzy poszczególnymi aminokwasami w procesie przemian metabolicznych.

Dużo miejsca poświęcono specjalnym preparatom białkowym stosowanym w dożywianiu dzieci i młodzieży w krajach rozwijających się. Poruszone zostały także zagadnienia norm zapotrzebowania na białko i aminokwasy. Zagadnienia te zostały

11 P o s tę p y B io ch e m ii http://rcin.org.pl

450 RECENZJE [14]

przedstawione w referatach, z których ponad połowa zamówiona została specjalnie przez komitet organizacyjny sympozjum.

Monografia ta jest w ięc zbiorem doniesień z prac doświadczalnych oraz specjalnie zamówionych referatów wodących. Ogółem zawiera ona 40 referatów opracowanych przez wybitnych specjalistów — genetyków, chemików, biochemików, technologów, fizjologów i żywieniowców.

Warto zwrócić szczególną uwagę na następujące prace:1. R. P. Abernathy i S. J. Ritchey: Position paper on RDA for protein for chil

dren. W pracy tej poruszono zagadnienia norm zapotrzebowania na białko dla dzieci. Podkreślono, że Recommended dietary Allowances (RDA) ulegają co 5 lat rewizji w celu określenia zapotrzebowania na białko zgodnie z aktualnym stanem wiedzy. Podkreślono, że w 1958 r. zalecane normy na białko dla dzieci w wieku 7—9 lat wynosiły 60 g/dzień i uległy obniżeniu do 36 g w roku 1974, tj. uległy zmniejszeniu0 około 40%. W pracy tej wykazano, że przy typowym mieszanym pożywieniu amerykańskim, należy zabezpieczyć spożycie około 45 g białka/dzień. Jeżeli uwzględnimy margines bezpieczeństwa wynoszący 30%, wówczas norma spożycia wyniesie około 58,5 g białka/dzień.

Warto nadmienić, że w nowszym piśmiennictwie światowym przestawiono poglądy, świadczące o konieczności rewizji zbyt niskich norm spożycia białka, proponowanych przez ekspertów FAO/WHO. Zagadnienia te zostały ostatnio przedstawione w polskim piśmiennictwie („Białko i tłuszcze w żywieniu człowieka”, red. S. Ziemiański, Wyd. Wszechnica Polskiej Akademii Nauk. Problemy Naukowe Współczesności. Ossolineum — Wrocław 1979).

2. Helen E. Clark, Marie F. Brewer, Lynn B. Bailey: Effect on nitrogen retention by adults of different proportions of indispensable amino acids in isonitrogenous cereal-based diets. W pracy tej przedstawiono wyniki różnorodnych badań przeprowadzonych na młodych dorosłych mężczyznach, którym podawano w pożywieniu białka roślinne wzbogacane w aminokwasy w różnych zestawieniach. Zaproponowano najkorzystniejszy zestaw produktów białkowych, zawierających niepełnowar- tościowe białko.

3. Hamish N. Munro: Nutritional Consequences of excess amino acid intake. W pracy poruszono możliwe niekorzystne następstwa nadmiernego spożycia aminokwasów i niebezpieczeństwa związanego z niekontrolowanym wzbogacaniem żywności w aminokwasy.

4. Gene A. Spiller, Joan E. Gates: Defining dietary plant fibers in human nutrition. Autorzy przedstawiali w iele cennych danych odnośnie błonnika pożywienia łącznie z definicją chemiczną i kliniczną a także metodami oznaczania tego ważnego składnika pożywienia. Jak wiadomo błonnik nie jest trawiony i wykorzystany przez człowieka lecz jest niezbędny w pożywieniu ze względu na jego rolę w regulacji czynności motorycznej przewodu pokarmowego.

Wiele prac poświęcono wzbogacaniu białka i jego produkcji łącznie z możliwością wykorzystania niekonwencjonalnych źródeł białka z zastosowaniem nowych metod chemicznych i mikrobiologicznych oraz współczesnych metod oznaczania aminokwasów i białka.

Bardzo cennym uzupełnieniem 39 prac, przedstawionych w omawianej monografii jest praca M. Friedmana pt.: Glossary of abréviations and definitions of nutritional terms, w której przedstawiono alfabetycznie skróty terminów i ich w ytłumaczenie, stosowanych w piśmiennictwie żywieniowym w zakresie białek i aminokwasów.

Monografia jest cennym źródłem współczesnej informacji nt. aminokwasów1 białka w żywieniu człowieka i zwierząt hodowlanych.

S. Ziemiański

http://rcin.org.pl

[ 15] RECENZJE 451

D. De Nettancourt

Incompatibility in angiosperms,

Monographs on theoretical and applied genetics, 3,

Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, XIV + 230 stron.

Zjawiska niezgodności odgrywają wielką rolę w życiu roślin, wpływając na strukturę genetyczną ich populacji. W ujęciu autora omawianej książki terminem niezgodność należy obejmować tylko te przypadki, w których ziarno pyłku padające na znamię albo zupełnie nie kiełkuje, albo łagiewka pyłkowa degeneruje w trakcie penetracji znamienia lub szyjki słupka. Mówimy więc o niezgodności tylko wówczas, gdy niemożliwe jest dokonanie zapłodnienia. Tak zdefiniowana niezgodność może zapobiegać wsobności przez niedopuszczenie do samozapłodnienia (tzw. samoniezgod- ność) lub ograniczać krzyżowanie pomiędzy organizmami o bardzo różnych genotypach i stanowi wówczas jedną z barier izolacyjnych (niezgodność międzygatun- kowa *).

Większą część książki poświęcono samoniezgodności, jako zjawisku znacznie lepiej i wszechstronniej poznanemu. Dużą zasługą autora jest zebranie rozproszonych w trudno często dostępnych źródłach wyników badań dotyczących najróżnorodniejszych aspektów tego zjawiska. Obraz, który się w czasie czytania książki wyłania, jest niejednokrotnie intrygujący a zawsze interesujący. Istotą zjawiska samoniezgodności wydaje się być rozpoznanie ziarna pyłku o odpowiednim fenotypie przez znamię lub szyjkę słupka. To rozpoznanie przypomina zjawiska immunologiczne u zwierząt, ale tutaj wynikiem jest odrzucenie pyłków mających ten sam fenotyp co słupek. Mowa tu o fenotypie, ponieważ zdolność rozpoznania warunkują substancje białkowe produkowane albo przez roślinę macierzystą, albo przez ziarno pyłku, a znajdujące się w ścianie ziarna pyłku. W pierwszym przypadku tworzą się one w tapetum pylników i odkładane są w zewnętrznych warstwach ścian. Reprezentują wówczas jeden fenotyp niezależnie od genotypu ziarna (które to genotypy segregują, w przypadku heterozygot, w stosunku 1:1). Gdy omawiane substancje wytwarzane są przez samo ziarno pyłku, odkładają się w wewnętrznych warstwach ściany i wówczas fenotyp ziarna zgodny jest z jego genotypem. W pierwszym przypadku mówimyo sporofitowym, w drugim zaś o gametofitowym systemie samoniezgodności. Rozpoznanie pyłku uruchamia następnie słabo poznane procesy metaboliczne warunkujące albo normalny wzrost łagiewki lub też jego wyraźne zahamowanie. Nasze w iadomości na temat mechanizmu takiego hamowania są bardzo nikłe: z pięknych obrazów ultrastrukturalnych otrzymanych przy pomocy mikroskopu elektronowego wynika jednak niedwuznacznie, że zmiany w metaboliźmie hamowanych łagiewek są bardzo daleko idące.

Szczegółowo przedstawiono także w monografii podłoże genetyczne samoniezgodności. Jak to od dosyć dawna wiadomo, mechanizmy genetyczne są tutaj na ogół dosyć proste. Osobliwością, znaną także dosyć powszechnie, jest fakt, że niektóre geny (zwane genami S) występują w niespotykanej gdzie indziej liczbie alleli — może ich być nawet kilkadziesiąt w obrębie jednej, niewielkiej nawet populacji

*> T o p o d k r eś len ie d e f in ic j i z ja w isk a n iez g o d n o śc i w y d a je s ię k o n iec z n e , p o n iew a ż term in te n s to so w a n y je s t w r ó żn y ch zn a cze n ia ch . Z je d n ej s tr o n y b o w ie m u ży w a s ię go (n a jczę śc ie j) je d y n ie d la p rzy p a d k ó w u n iem o ż liw ien ia sa m o z a p ło d n ien ia ) a w ię c w s e n s ie s e l f - i n c o m - p a t i b i l i t y — sa m o n iezg o d n o ść w u ję c iu de N e tta n o o u r t’a), z d ru g ie j zaś w łą cza s ię tyi ta k ż e z a k łó c e n ie w r o zw o ju u tw o r z o n y c h z y g o t ( p o s t f e r t i l i s a t i o n i n c o m p a t i b i l i t y — por. n p . S ło w n ik te r m in ó w g e n e ty c z n y ch , P W N , 1974).

U* http://rcin.org.pl

452 RECENZJE [16]

roślinnej. Każdy z tych alleli produkuje oczywiście odmienne białko, które można odróżnić za pomocą reakcji immunochemicznych. Niezwykłą właściwością locus S jest dalej i to, że dotychczas nie udało się, mimo wielokrotnych prób, otrzymanie nowych alleli tego genu na drodze stosowania środków mutagennych (zarówno promieniowania jak i mutagenów chemicznych), choć allele takie tworzą się często samorzutnie w trakcie stosowania chowu wsobnego. Jest to zagadnienie, które może rzucić wg autora nowe światło na mechanizmy działania sztucznych mutagenów u roślin.

Jak powiedziano wyżej, autor zalicza do zjawisk niezgodności także uniemożliwianie zapłodnienia komórki jajowej przez ziarna pyłku wyprodukowane przez inny gatunek, nazywając zjawisko takie niezgodnością międzygatunkową. Choć zjawisko niezgodności międzygatunkowej poznano znacznie słabiej niż samoniezgodność, to jednak zdaje się nie ulegać wątpliwości, że zasadnicze mechanizmy są w obu przypadkach bardzo podobne i polegają na chemicznym rozpoznawaniu ziarn pyłku. W przj^padku jednak niezgodności międzygatunkowej odrzucane są ziarna obce. Tak więc ten sam podstawowy mechanizm rozpoznawania białek służy z jednej strony jako środek zapobiegający nadmiernej wsobności, z drugiej jako bariera uniemożliwiająca przepływ genów między populacjami należącymi do różnych gatunków. Tę część książki potraktowano bardziej pobieżnie i nie tak przekonywująco jak pierwszą mówiącą o samoniezgodności. Wszystko to zapewne z faktu bardzo słabego poznania zagadnień niezgodności międzygatunkowej.

Książkę kończy rozdział ukazujący perspektywy badań nad niezgodnością. Mają one z jednej strony aspekt wybitnie praktyczny, służący, jak to autor określił „udoskonaleniu naszych umiejętności udomowienia systemu rozmnażania roślin wyższych” („The improvement of our capacity to domesticate the breeding system of higher plants”). Z drugiej zaś strony mogą służyć jako model w szeregu badań podstawowych, takich jak: wyjaśnienie działania genów i jego regulacji u organizmów eukariotycznych, oraz mechanizmów biochemicznych dominacji, epistazy i innych interakcji między genami; rola białek jako sygnałów biologicznych — może to mieć znaczenie dla zagadnień odporności immunologicznej a także biologii układu żywi- ciel-pasożyt. Można by jeszcze dodać, że badania niezgodności mogą mieć ogromne znaczenie dla poznania procesów morfogenetycznych u roślin. Jest bowiem coraz bardziej oczywiste, że w przekazywaniu informacji z komórki do komórki obok stosunkowo wolno działających hormonów roślinnych muszą grać rolę zjawiska przebiegające na powierzchni komórki, analogicznie jak to się dzieje u zwierząt. Ten aspekt naświetlony jest doskonale w niedawno opublikowanym artykule przeglądowym innego wybitnego znawcy zjawisk niezgodności, J. Heslopa-Harrisona (Genetics and physiology of angiosperma incompatibility systems, Proc. R. Soc., Lond. B 202, 73—92, 1978). Artykuł ten polecić można jako znakomite uzupełnienie recenzowanej książki. Nie ulega wątpliwości, że niezgodność może być atrakcyjną dziedziną badań biochemicznych.

Książkę napisano jasno, wydana na kredowym papierze, zawiera szereg doskonałych zdjęć z mikroskopu elektronowego. Autor zamieszcza szereg pomysłowych diagramów ułatwiających zrozumienie nie zawsze przecież prostych zagadnień. Książka może być niewątpliwie wzorem monografii naukowej — łączy bowiem wszechstronność opracowania z syntetycznym, oszczędnym przedstawieniem wszsytkich zagadnień — cały tekst liczy zaledwie 200 stron. Bogaty (liczący ponad 500 pozycji) spis literatury oryginalnej pozwala na szczegółowe zapoznanie się z poszczególnymi zagadnieniami. Z zauważonych usterek najpoważniejszą jest mylne objaśnienie ryciny 12 na stronie 60. Fotografie a i b są niewątpliwie obrazami całych ziarn pyłku, natomiast c i d fragmentami powierzchni ścian komórkowych.

J. Szweykowski

http://rcin.org.pl

[17J RECENZJE 453

G. R. Waller, E. K. Nowacki

Alkaloid Biology and Metabolism in Plants

Plenum Press 1978, New York, stron 294, cena $ 27.

Ogromny postęp w dziedzinie biochemii i fizjologii alkaloidów przyczynił się do możliwości bliższego ich scharakteryzowania nie tylko jako szeroko stosowanych w medycynie leków, ale również do poznania takich zagadnień jak: miejsce i drogi ich powstawania, wpływ na te pfocesy czynników genetycznych czy środowiska, rola w roślinie oraz powiązanie z innymi związkami. Omówienie tych problemów znaleźć można w książce Wallera i Nowackiego. Zawiera ona 249 stron treści, 24 strony piśmiennictwa i 20 stron indeksu autorskiego. Jest bogato ilustrowana rysunkami, fotografiami, tabelami, schematami, wzorami i wykresami. Treść podzielona jest na wstęp i sześć rozdziałów. Każdy rozdział zakończony jest krótkim podsumowaniem i wnioskami.

We wstępie autorzy omawiają powody, dla których problemy związane z badaniami alkaloidów są wciąż w centrum uwagi wielu nauk farmaceutycznych, medycznych, biologicznych, chemicznych i rolniczych.

Rozdział pierwszy poświęcony jest zagadnieniom możliwości wykorzystania alkaloidów w badaniach taksonomicznych, jako wskaźnika pokrewieństwa filogenetycznego. Autorzy omawiają występowanie analogicznych alkaloidów w blisko spokrewnionych taksonach oraz w znajdujących się bardzo odległych od siebie jednostkach systematycznych. Zwracają uwagę na konieczność poznania drogi powstawania alkaloidów, na możliwość znalezienia nie tylko wspólnych dla alkaloidów prekursorów, ale i związków zbliżonych bardzo budową do alkaloidów np. amino- alkoholi, które mogą mieć bardziej istotne znaczenie z punktu widzenia taksonomii niż alkaloidy. Podkreślają też, że alkaloidy mają mniejsze znaczenie jako wskaźniki filogenetycznego pokrewieństwa w przypadku dużych jednostek systematycznych, natomiast w obrębie małych mogą mieć ogromne znaczenie.

W rozdziale drugim autorzy szeroko omawiają szereg doświadczeń, które wskazują na wpływ genów dominujących i recesywnych na powstawanie alkaloidów. Na przykładach głównie alkaloidów chinolizydynowych, pirydylopirolowych, bądź pochodnych morfanu wyjaśniają powstawanie krzyżówek o różnych zawartościachi różnym składzie zespołu alkaloidów.

Rozdział trzeci poświęcono zagadnieniom wpływu czynników środowiska takich jak światło, woda, klimat, rodzaj i zasobność gleby na powstawanie alkaloidów.

Rozdział czwarty omawia miejsce powstawania oraz nagromadzania się alkaloidów. Najczęściej powstają one w młodych szybko rosnących tkankach przy czym w określonych gatunkach synteza zachodzi w różnych organach jako korzeń czy część nadziemna rośliny w innych we wszystkich częściach. Młode owoce i nasiona są zwykle bogate w alkaloidy, przy czym niektóre owoce tracą te zdolności w miarę dojrzewania. Procesy, które przyspieszają wzrost roślinny zwykle wpływają na zwiększenie produkcji alkaloidów.

W rozdziale piątym omawiana jest rola alkaloidów. Autorzy dyskutują 5 znanych hipotez niekiedy kontrowersyjnych. I tak przytaczają przykłady kiedy alkaloidy działają stymulująco, bądź hamują wzrost innych roślin — nie mogą jednak być uważane za regulatory wzrostu. Niektóre alkaloidy wykazują wyraźne działanie fungistatyczne, inne jednak działają stymulująco na wzrost grzybów, które mogą je nawet wykorzystywać jako źródła węgla do swego wzrostu. Przegląd doświadczeń wskazuje raczej na pewną rolę jaką odgrywać mogą alkaloidy w ochronie roślin

http://rcin.org.pl

454 RECENZJE [18]

przed infekcją bakterii bądź grzybów. Autorzy przytaczają również szereg przykładów i doświadczeń, z których wynika niewielka rola alkaloidów jako związków chroniących rośliny przed owadami. Najbardziej powszechnym jest pogląd, że alkaloidy są końcowymi produktami przemiany materii, których roślina nie usuwa ze względu na brak odpowiednich narządów. Autorzy nie podzielają tego poglądu. Gdyby alkaloidy były produktami, których roślina nie potrzebuje byłyby gromadzone np. w opadających liściach. Tymczasem są one z liści odprowadzane a gromadzone na przykład w nasionach. Zdaniem autorów — może niedostatecznie jeszcze udokumentowanym — alkaloidy mają dla niektórych roślin znaczenie ochronne, biorą też udział w przemianach o czym mowa w rozdziale 6. Autorzy obszernie omawiają tu procesy odbudowy i przekształceń alkaloidów — podobnie jak i w poprzednich rozdziałach przytaczają zarówno wyniki badań własnych jak i innych naukowców.

Książka jest napisana żywo, bardzo interesująco i świadczy o istotnym zaangażowaniu autorów w problemy biochemii i fizjologii alkaloidów. Zawiera też bogate informacje z tych dziedzin. Obszerne, podane w każdym rozdziale osobno piśm iennictwo obejmuje prace do 1975 r.

Książka G. R. Wallera i E. K. Nowackiego przeznaczona jest w zasadzie dla pracowników naukowych zajmujących się problemami alkaloidów. Mogą z niej również korzystać studenci wyższych lat wydziałów Biochemii, Biologii, Farmacji oraz niektórych wydziałów Akademii Rolniczych pod warunkiem dobrego opanowania podstaw biochemii i biologii. Książka jest z pewnością cenną pozycją z dziedziny badań alkaloidów. Dotychczasowe obejmowały raczej problemy chemizmu alkaloidów, technologii ich otrzymywania, a ostatnio biosyntezy. Brak było opracowania, które w sposób syntetyczny podsumowałoby dorobek kilku dziesiątków lat w dziedzinie biologii, a zwłaszcza metabolizmu alkaloidów w roślinach. Rolę tę spełnia recenzowana książka. Przetłumaczenie jej na język polski zwiększyłoby znacznie możliwość korzystania przez studentów.

H. Strzelecka

Wolfgang Fritsche

Biochemische Grundlagen der Industriellen Mikrobiologie,

1978, VEB Gustav Fischer, Jena, stron 191, cena M. 38.

Tytuł książki Wolfganga Fritscha „Biochemische Grundlagen der Industriellen Mikrobiologie” można przetłumaczyć jako „Biochemiczne podstawy mikrobiologii przemysłowej”. Autor jest pracownikiem Uniwersytetu Marcina Luthra w Halle — Wittenberg. Wydawnictwo VEB Gustav Fischer, Verlag, Jena, NRD. Recenzent książki dr Roland Itterheim.

Całość książki podzielono na 10 dość rzeczowo powiązanych rozdziałów. Treścią książki jest opis przemian i procesów biochemicznych zachodzących przy udziale mikroorganizmów. Autor przedstawia te trudne procesy dość oryginalnie rozpoczynając od problemów ogólnych a następnie jasno omawia problemy szczegółowe. Sposób prezentacji problemów jest zarówno precyzyjny i jasny. Autor korzystał z bardzo bogatej literatury z tego zakresu, głównie publikowanej w latach 1966—1977.

Cechą charakterystyczną tej książki jest omawianie biochemicznego podłoża zjawisk mikrobiologicznych. Podobny sposób omawiania i wyjaśniania procesów znaleźć

http://rcin.org.pl

[19] RECENZJE 455

można w książce J. Paluch „Podstawy mikrobiologii przemysłowej”, czy też S. Aiba,H. Humphrey i N. F. Milbsa pt.: „Inżynieria biochemiczna”. W książce opracowanej przez Wolfganga Fritsche przedstawiono bardziej szczegółowo i wyjątkowo zrozumiale procesy biochemiczne z pośrednimi etapami biosyntezy lub degradacji. Świadczą o tym chociażby licznie zamieszczone schematy poszczególnych cykli biochemicznych.

W książce omówiono szeroki zakres procesów wywoływanych przez mikroorganizmy jak procesy związane z wytwarzaniem witamin, aminokwasów, enzymów, antybiotyków, kwasów organicznych i innych metabolitów. Zaprezentowano przy tym nie tylko zjawiska wytwarzania i wydzielania metabolitów pierwotnych i wtórnych, ale również omówiono kierunki i możliwości regulacji tych procesów, na przykład przyspieszanie, hamowanie. Omówiono też chyba po raz pierwszy możliwości optymalizacji zachodzących procesów i zjawisk.

Autor starał się omówić wszystkie lepiej poznane bakterie, drożdże, grzybyi promieniowce. Jest to najbardziej kompleksowe zebranie i usystematyzowanie osiągnięć nauki w tym zakresie.

Pewnym niedociągnięciem książki jest wykaz piśmiennictwa, który został zamieszczony na końcu książki. Byłoby znacznie korzystniej gdyby piśmiennictwo zamieszczono po każdym rozdziale.

Układ książki i zawarta w niej treść jest bardziej przydatna mikrobiologom niż biochemikom, chociaż i dla nich zawiera wartościowy materiał poznawczy. Jest ona również wartościową pozycją dla pracowników przemysłu spożywczego, farmaceutycznego i toksykologów. Może służyć jako cenny podręcznik dla studentów wydziałów biologii, technologii żywności, niektórych kierunków medycyny i weterynarii a nawet wydziałów rolniczych.

Książka stanowi wartościową pozycję i winna być przetłumaczona na język polski i wydana możliwie szybko.

S. Poznański

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

SPRAWOZDANIE\

Konferencja Cogene, Committee on Genetic Experimentation n.t. Rekombinacji DNA in vitro

Wye k/Ashford (Anglia) 1—i kwiecień 1979

W kwietniu odbyła się w Anglii konferencja Cogenu poświęcona rekombinacji DNA in vitro. Cogene powołany został w 1977 roku przez International Council of Scientific Unions (ISCU), organizację zrzeszającą 18 międzynarodowych Towarzystw naukowych oraz ponad 60 organizacji narodowych, takich jak akademie nauk, rady naukowe itp. Cogene stanowi interdyscyplinarną, międzynarodową radę naukową w zakresie badań rekombinacji DNA in vitro, ma służyć radą rządom, międzynarodowym agencjom, grupom naukowym. W szczególności Cogene zajmuje się przygotowywaniem aktualnych raportów o naukowej i praktycznej stronie takich badań, korzyściach, które mogą z nich wynikać, o bezpieczeństwie badań i dostępności bezpiecznych laboratoriów biologicznych, rozważa też konsekwencje, które mogą w yniknąć z niekontrolowanego rozprzestrzenienia się organizmów zawierających zre- kombinowany DNA, ułatwia ponadto kontakty międzynarodowe naukowców, pomaga w organizacji szkolenia w technikach rekombinacji in vitro, organizuje konferencje poświęcone tej tematyce. Takim właśnie spotkaniem była konferencja w Wye. Porównywano ją z często cytowaną konferencją w Asilomar (1975 r.), w czasie której po raz pierwszy rozważano korzyści i zagrożenia płynące ze stosowania technik rekombinacji DNA in vitro. Około 30% uczestników konferencji w Wye była na konferencji w Asilomar.

Do Wye, maleńkiej osady, której nie ma nawet na mniej szczegółowych mapach, zjechało około 160 osób: z USA, Kanady, Australii, Nowej Zelandii, Taiwanu, Afryki Płd., Kenii, Malazji, Japonii, ZSRR, Wielkiej Brytanii, RFN, Francji, Włoch, Hiszpanii, Norwegii, Portugalii, Finlandii, Węgier, Szwecji, Danii, Belgii, Szwajcarii, Holandii, Jugosławii, NRD, Czechosłowacji, Bułgarii, Polski — można zatem bez przesady powiedzieć, że obecny był „cały św iat”. Program konferencji podzielono na dwie części: w pierwszej wybitni przedstawiciele nauki, aktywnie zaangażowani w badaniu rekombinacji DNA in vitro, podsumowali stan badań i najważniejsze osiągnięcia w tej dziedzinie, a także przedstawili perspektywy na przyszłość. O tym kierunku mówią tytuły referatów: G. Bernardi — Organizacja i ewolucja genomu eukariotów; A. Campbell — Naturalne sposoby wym iany i zmiany materiału genetycznego; P. Star- linger — Transpozony i IS; N. S. Cohen — Techniki rekombinacji DNA; K. Murray — Nowe dane o genetyce molekularnej prokariotów; J. Sambrook — Nowe dane o genetyce molekularnej wirusów; J. Schell — Nowe dane o genetyce molekularnej grzybów i roślin; S. Ehrlich — Ekspresja obcych genów; R. Rutter — Produkcja pożytecznych białek; C. Weissmann — Inne potencjalne zastosowania rekombinacji genetycznej in vitro. '

W drugiej części konferencji przedstawiono historię (do Wye zaproszono profesora C. Wienera z MIT, historyka, dla którego rekombinacja DNA in vitro stanowi

http://rcin.org.pl

POSTĘPY BIOCHEMII

September 1979

ARTICLES IN POLISH

Volume 25

Number 3

L. K l y s z e j k o - S t e f a n o w i c z — Heterogenity and Specificity of Nonhistone Proteins Contents (Dept. Biochem., Inst., Biochem. Biophys., Universityof Łódź, Ł ó d ź ) ........................................................................................................................K. T a y l o r , A. T a y l o r — The Use of Bacteriophage X Fragments in the Construction of Plasmid Vectors for Gene Cloning. Included: Restriction Mapof X DNA (Dept. Biochem., University of Gdańsk, G d a ń s k ) ...................................I. S k r z y p e k - O s i e c k a — Receptors of Peptide hormones (Dept. Biochem.,Inst. Biopharmacy, School of Medicine, W a r s z a w a ) ..........................................A. P o t e m p s k a — Biochemical Characteristics of Neurotubules (Dept. Biochem. Nervous System and Muscle, Nencki Inst. Exp. Biol., Pol. Acad.Sci, W a r s z a w a ) ........................................................................................................................J. U l a s — Methods of Separation of Neuronal and Glial Cells: their Application for Biochemical Investigation (Dept. Biochem. Nervous System and Muscle, Nencki Inst. Exp. Biol., Pol. Acad. Sci., W a r s z a w a ) ............................

Book r e v ie w s ...............................................................................................................................Meeting Report ..................................................................................... .A n n o u n c e m e n t .......................................................................................................... 372,

287

351

373

401

417

437457460

http://rcin.org.pl

POSTĘPY BIOCHEMII

— kwartalnik

WARUNKI PRENUMERATY

Cena prenumeraty krajowej

rocznie zł 80.— półrocznie zł 40.—

Prenumeratę n a k r a j przyjmują Oddziały RSW „Prasa-Książka-Ruch” oraz urzędy pocztowe i doręczyciele w terminach:— do dnia 25 listopada na styczeń, I-szy kwartał, I-sze półrocze roku

następnego i na cały rok następny,— do dnia 10 miesiąca, poprzedzającego okres prenumeraty na pozostałe

okresy roku bieżącego.Jednostki gospodarki uspołecznionej, instytucje i organizacje społeczno- polityczne składają zamówienia w miejscowych Oddziałach RSW „Prasa- Książka-Ruch”.Zakłady pracy w miejscowościach, w których nie* ma Oddziałów RSW oraz prenumeratorzy indywidualni, zamawiają prenumeratę w urzędach pocztowych lub u doręczycieli.Prenumeratę ze zleceniem wysyłki z a g r a n i c ę , która jest o SO /o droższa od prenumeraty krajowej, przyjmuje RSW „Prasa-Książka-Ruch”, Centrala Kolportażu Prasy i Wydawnictw, ul. Towarowa 28, 00-958 Warszawa, konto PKO nr 1531-71 — w terminach podanych -dla prenumeraty krajowej.Bieżące i archiwalne numery można nabyć lub zamówić we Wzorcowni Wydawnictw Naukowych PAN-Ossolineum-PWN, Pałac Kultury i Nauki (wysoki parter) 00-901 Warszawa oraz w księgarniach naukowych „Domu Książki”.

A subscription order stating the period of time, along with the subscriber’s name and address can be sent to your subscription agent or directly to Foreign Trade Enterprise Ars Polona-Ruch, 00-068 Warszawa, 7 Krakowskie Przedmieście, P.O. Box 1001, Poland. Please send payments to the account of Ars Polona-Ruch in Bank Handlowy S.A., 7 Traugutt Street, 00-067 Warszawa, Poland.

http://rcin.org.pl

http://rcin.org.pl

Redakcja zastrzega sobie możność skrócenia tekstu i wprowadzania poprawek nie wpływających na treść pracy.

Piśmiennictwo: w artykule należy cytować prace oryginalne z ostatnich kilku lat oraz najważniejsze artykuły przeglądowe omawiające przedstawioną dziedzinę z uwzględnieniem artykułów opublikowanych w „Postępach Biochemii”. W tekście należy podawać jedynie nazwiska badaczy, których prace mają podstawowe znaczenie w przedstawionej dziedzinie. Omawiane prace trzeba numerować w kolejności ich cytowania w tekście. Wykaz piśmiennictwa zatem obejmuje prace opatrzone kolejnymi numerami, ale nieuporządkowane alfabetycznie. Odnośniki bibliograficzne w inny mieć formę zalecaną przez Komisję Wydawców Czasopism Biochemicznych Międzynarodowej Unii Biochemików (IUB) według Biochim. Biophys. Acta, (1972), 276, (1) np.

Pipa J. P., Buchanan F. M., (1971), Biochim. Biophys. Acta, 247, 181—184.Cytując wydawnictwa książkowe podawać należy kolejno: nazwisko(a) inicjały autora(ów), rok wydania, tytuł książki, nazwisko(a) i inicjały jej redaktorów(a), tom, pierwszą i ostatnią stronę cytowanej publikacji, nazwę wydawnictwa oraz miejsce wydania, np.

Dixon M., Webb E. C., (1964), Enzymes, 2 wyd., str. 565, Longmans Green and Co., London;

Grant J. K., (1969) w Essays in Biochemistry, red. Campbell P. N., Greville G. D., t. 5, str. 1—58; Academic Press, London.

Załączniki: każdy załącznik należy sporządzić w 2 egz. na oddzielnych kartkachi opatrzyć kolejnym numerem odpowiadającym numerowi użytemu w tekście, oraz oznaczyć (na górze stronicy ołówkiem) nazwiskiem pierwszego autora i początkowymi wyrazami tytułu pracy.

Tabele należy kolejno numerować cyframi arabskimi. Tytuł tabeli i nagłówki rubryk powinny jasno opisywać ich treść zaznaczając, z jakich (jakiej) prac(y) pochodzą informacje podane w tabeli.

Ryciny, tj. wykresy, rysunki, schematy lub fotografie należy opatrzyć numeracją w kolejności ich omówienia w tekście. Przyjmuje się zasadę numeracji rycin cyframi arabskimi, a wzory cyframi rzymskimi. Fotografie czarno-białe (kontrastowe) powinny być wykonane na papierze matowym. Pozostałe ryciny należy wykonać tuszem na białym papierze lub na kalce technicznej. Wymiar ryciny nie powinien być mniejszy niż 10X15 cm, a naniesione linie nie powinny być cieńsze niż 1 mm. Ramki ujmujące wykresy można wykonać linią cieńszą niż linie właściwe wykresu. Cyfryi litery służące do opisu rysunku powinny mieć wysokość nie mniejszą niż 5 mm. Na rysunkach nie należy umieszczać opisów słownych, lecz posługiwać się skrótami. Osie wykresów natomiast winny być opatrzone napisem łatwo zrozumiałym. Dla oznaczenia punktów doświadczalnych można stosować następujące symbole: O □ A • H A . Rycinę należy opatrzyć na odwrocie oznaczeniem „góra” i „dół” (ołówkiem). Decyzję0 stopniu zmniejszenia ryciny podejmuje wydawca.

Podpisy i objaśnienia pod rycinami powinny być dołączone na oddzielnej kartce. Oznaczenia, których nie można wpisać na maszynie, należy wyraźnie nanieść czarnym tuszem.

Ze względu na wewnętrzną spoistość artykułu zaleca się autorom konstruowanie oryginalnych rysunków i zbiorczych tabel na podstawie danych z piśmiennictwa. Prawie wszystkie czasopisma zastrzegają sobie wyłączność druku prac wraz z ich dokumentacją (Copyright). Przed włączeniem tabel, wykresów czy schematów do artykułu przeznaczonego do publikacji w Postępach Biochemii należy uzyskać zgodę na przedruk i przedłożyć ją Redakcji.

Redakcja prosi o właściwe pakowanie artykułów, aby zabezpieczyć maszynopisy1 ilustracje przed pogięciem.

http://rcin.org.pl

Cena zł 20.—

SPIS TREŚCI

L. K ł y s z e j k o - S t e f a n o w i e z — Niejednorodność i specyficzność białek niehistonowych — Referat sympozjalny wygłoszony 8.09,1978 podczas XVI Zjazdu PTBioch. ............................................................................................................................287K. T a y l o r , A. T a y l o r — Wykorzystanie fragmentów DNA bakteriofaga l w konstrukcji wektorów plazmidowych dla klonowania genów. Mapa restrykcyjna Â DNA ............................................................................. ..............................................351I. S k r z y p e k - O s i e c k a — Receptory hormonów peptydowych 373 A. P o t e m p s k a — Biochemiczna charakterystyka neurotubuli 401 J. U ł a s — Metody rozdziału komórek neuronalnych i glejowych: ich wykorzystanie w badaniach biochemicznych 417

Recenzje książek:

The Molecular Biology of Membranes 437Advances in Neurochemistry, t. 3 . . . . . . . . . . . . 438Contemporary Topics in Molecular Immunology, t. 7 439Advances in Experimental Medicine and Biology, t. 98 440Hemolytic Anemia in Dsirders of Red Cell Metabolism 441Trace Elements and Iron in Human Metabolism 443Superoxide and Superoxide Dismutases 444Dietary Fats and Oils in Human Nutrition 446Nutritional Improvement of Food and Feed Proteins . . 449Incompatibility in Angiosperms . . . . . . . . 451Alkaloid Biology and Metabolism in Plants ............................................................. 453Biochemische Grundlagen der Industriellen Microbiologie 454Sprawozdanie: Konferencja Cogene n.t. Rekombinacji DNA in vitro (M Fikus) 457

Komunikaty 372 , 46Û

Post. Blochem. 25, z. 3, 285—464 Indeks 26969

http://rcin.org.pl

1979 tom 25 nr 3 - rcin.org.plrcin.org.pl/Content/27288/WA488_23953_P939_T25-z3-PB.pdf · LEOKADIA...

Documents

Transcript of 1979 tom 25 nr 3 - rcin.org.plrcin.org.pl/Content/27288/WA488_23953_P939_T25-z3-PB.pdf · LEOKADIA...