PRAKTYCZNY PRZEWODNIK po diagnostyce mutacji FLT3 u chorych z OBSZ

wg protokołu PALG/RATIFY

Jan Kowalski

STANDARD OPERATING PROCEDURE DLA BADACZY KLINICZNYCH PALG

Opracowany w trakcie realizacji projektu„Standaryzacja Badań Mutacji FLT3”realizowanego w pracowniach referencyjnychd/s diagnostyki OBSz PALG -SHM PTgCz

1. badanie przesiewowe FLT3–ITD. oraz TKD

2. oznaczenie allelic ratio FLT3-ITD.:WT

2

1. Laboratoria refrencyjne PALG d/s diagnostyki OBSz w Polse ................................................................................. 4

2. Schemat aspiracji diagnostycznej szpiku w OBSz -workflow ..................................................................................................... 4

3. Preparatyka materiału w OBSZ – workflow .................................................................................................................. 4

4. Schemat diagnostyki molekularnej w OBSZ wg ELN2017/RATIFY, NCCN, AMLSG/HOVON ...................................................... 4

5. Schemat diagnostyki mutacji FLT3 wg PALG/RATIFY ......................................... 4

6. Metodologia badania mutacji FLT3: ITD & TKD – workflow .................................................................................................................. 4

7. WYNIK badania FLT3: ITD & TKD – przykład ........................................................ 4

8. Badanie allelic ratio FLT3-ITD:wt ............................................................................ 4 1. Aspekt kliniczny i biologiczny AR .............................................................................................................................. 4 2. Aspekt metodologiczny badań AR .......................................................................................................................... 4

9. WYNIK i INTERPRETACJA badań AR FLT3-ITD:wt – przykłady ................................................................................................................. 4

PLAN PRZEWODNIKA

4

STANDARYZACJA BADAŃ MUTACJI FLT3112 PRACOWNI PALG-SHM/PTGCz

– REFERENCYJNYCH d/s. DIAGNOSTYKI OBSZ W PL

Bydgoszcz

Poznań

Łódź

Wrocław Lublin

Kielce

Kraków

KatowiceGliwice

Gdańsk

Warszawa

5

1LISTA REFERENCYJNYCH PRACOWNI DLA DIAGNOSYKI OBSZ W PL

BIORĄCYCH UDZIAŁ W STANDARYZACJI BADAŃ MUTACJI FLT3

L.p.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Ośrodek

BANACH WARSZAWA Laboratorium koordynujące

SU CMUJ KRAKÓW

CM UMK BYDGOSZCZ

UŚ KATOWICE

IHIT WARSZAWA

SK WROCŁAW

SKPP POZNAŃ

UM ŁÓDŹ

UCK GDAŃSK

COI KIELCE

SPSK LUBLIN

GLIWICE

Badacz PALG

Pracownia Diagnostyki Molekularnej Klinika Hematologii Onkologii i Chorów Wewnętrznych USK-WUM

Pracownia Diagnostyki Molekularnej Zakłąd Diagnostyki Hematologicznej Szpital Uniwersytecki w Krakowie

Katedra i Zakład Genetyki Klinicznej

Pracownia Biologii Molekularnej Laboratorium Hemato-logiczne Klinika Hematologii i Transplantacji Szpiku w Katowicach

Pracownia Biologii Molekularnej, Zakłąd Diagnostyki Hematologicznej, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie

Pracownia Biologii Molekularnej, Specjalistyczne Labora-torium Diagnostyki Hematologicznej i Transplantacyjnej, Szpital Kliniczny nr 1 we Wrocławiu

Pracownia Biologii Molekularnej Klinika Hematologii i Transplantacji Szpiku UM w Poznaniu

Pracownia Immunologii Klinicznej, Transplantacyjnej i Genetyki. Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. Mikołaja Kopernika w Łodzi

Laboratorium Hematologii Uniwersyteckie Centrum Kliniczne Pracownia Diagnostyki Molekularnej

Zakład Diagnostyki Molekularnej, Świętokrzyskie Centrum Onkologii

Laboratorium Diagnostyki Molekularnej

Kierownik Laboratorium / Koordynator Kliniczny

Dr n. med. Marta Libura koordynator d.s. biobanku PALG-AML1/2016/standaryzacji badań FLT31-szy badacz: Mgr Albert Moskowicz2-gi badacz: Bartłomiej Sankowski

1-szy badzacz Dr n.med. Magdalena Zawada2-gi badacz: Dr n. med. Sylwia CzekalskaDr hab. n. med. Tomasz Sacha

1-szy badzacz Mgr inż. Karolina Matiakowska2-gi badacz: Alicja Bartoszewska-KubiakProf. Olga Haus

1-szy badacz: Mgr Agnieszka Karolczyk2-gi badacz: Dr n. med. Małgorzata StachowiczMgr Joanna Dziaczkowska-Suszek

1-szy badacz: Dr n. med. Iwona Solarska2-gi badacz: Dr n. biol. Magdalena WojtasProf. Przemysław Juszczyński

1-szy badacz: Mgr inż. Bożena Jaźwiec2-gi badacz: Mgr Joanna WójtowiczDr Iwona Prajs/Prof. Tomasz Wróbel

1-szy badacz: Dr n. med. Marzena Wojtaszewska2-gi badacz: Dr n. med. Michał Gniot Prof. Krzysztof Lewandowski

1-szy badacz: Mgr Katarzyna Wasilewska2-gi badacz: Mgr Joanna KamińskaDr n. med. Aleksandra Kaczmarek/ Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak

1-szy badacz: Dr n. med. Aleksandra Leszczyńska2-gi badacz: Dr n. biol. Urszula CharmuszkoProf. Andrzej Hellmann/ Dr hab. M. Bieniaszewska

1-szy badacz: Dr Artur Kowalik2-gi badacz: Mgr Łukasz MadejProf. Marcin Pasiarski

1-szy badacz: Dr hab. Agata Filip

6

SCHEMAT ASPIRACJI DIAGNOSTYCZNEJ SZPIKUREKOMENDACJE PALG2

SZPIK1-sza

aspiracja

1 x strzykawka0,5-1 ml rozmaz

SZPIK2-ga

aspiracja

1 x strzykawka6 ml aspiratu

cytofluorymetria 1 ml (EDTA)cytogenetyka 5 ml (heparyna)

DGN MOLEKULARNA EDTABadania MINI PANEL

DGN MOLEKULARNA EDTAArchiwizacja met. gen.

SZPIK3-cia

aspiracja

1 x strzykawka5 ml aspiratu

SZPIK4-ta

aspiracja

1 x strzykawka5 ml aspiratu

7

SCHEMAT PREPARATYKI MATERIAŁU DO BADANIA MUTACJI FLT3WORK FLOW 3

POBRANIEsZPIKU

10 ml (2 x 5 ml)

Preparatykakomórek

Izolacja i liczenie komórek

mononuklarnych

Izolacjamateriału

genetycznego

DNAMutacje FLT3

Inne mutacje, NGS

Geny FuzyjneRNA

ArchiwizacjaBiobank

Layers before

Ficoll spin

Layers after

Ficoll spin

Blood Plasma

FicollGranulocytes

RBCs

PBMCs (interphase)

Ficoll

}

8

Pakiet minimum1

– wyniki do 48-72 godz2.

Geny fuzyjne: PML-RARA, RUNX1-RUNXT1, CBFb-MYH11, BCR-ABL1, MLLT3-KMT2A

Mutacje wewnątrzgenowe3: NPM1, CEBPA, IDH1/2, FLT3-ITD oraz FLT3 TKD

Pakiet rozszerzony wg ELN2017 – wyniki do 5-10 dni (1 cyklu indukcji)

mutacje wewnątrzgenowe: RUNX1, ASXL1, TP533

Allelic ratio FLT3-ITD:wt4

NGS – pakiet mieloidalny (minimum)– 3-6 tygodni

Koncentrat do sporządzania roztworu do infuzji.

Przezroczysty do lekko opalizującego bezbarwny do bladożółtego płyn.

1.

2.

3.

1. W porównaniu do „Pakietu Minimum” proponowanego w chwili rozpoczęcia badania PALG-AML1/2016 –włączono mutacje IDH1/2, gen fuzyjny MLLT3-KMT2A;2. UWAGA w ramach PALG czas 48-72 godz obowiązuje jedynie dla badań mutacji FLT3!3. Mutacje w wymienionych genach mogą być przebadane w ramach badania NGS pakietu mieloidalnego minimum; analiza tyh genów powinna mieć miejsce jako pierwsza przed innymi genami, tak aby respektować czaswyniku.4. Nieliczne laboratoria referencyjne PALG wykonują badania allelic ratio już w momencie diagnozy.

4SCHEMAT DIAGN. MOLEKULARNEJ W OBSZ

wg REKOMENDACJI ELN2017/RATIFY, NCCN ORAZ AMLSG/HOVON

9

1.

2.

Przesiewowe – jakościowe badanie mutacji FLT3

ITDTKD } Czułość i specyficzność

Czas: 48-72 godz

Czynnik rokowniczy

Wynik pozytywny:Kwalifikacja doMidostauryny

Wynik AR <0.5 NPM1(+)brak rekomendacjido alloHSCT

Półilościowe badanie allelic ratio FLT3-ITD:wt1

1 Nieliczne laboratoria referencyjne PALG wykonują badania allelic ratio już w momencie diagnozy.

5SCHEMAT DIAGNOSTYKI MUTACJI FLT3

WG ELN2017/RATIFY

10

6PRZESIEWOWE BADANIE MUTACJI FLT3

ASPEKT METODOLOGICZNY

REKOMENDACJE Materiał wyjściowy: DNA1

Protokół PCR: warunki jakościowe2

Primery: • ITD: e.g Thiede et al 2001, Huang et al, Nakao Met al 1996 • TKD: e.g. Murphy et al. 2003

ZALECENIA OBLIGATORYJNE

Czułość badania obu mutacji: = lub < 5% komórek FLT3(+)Wizualizacja produktów PCR: elektroforeza kapilarna z analizą fragmentówWynik: w ciągu 48-72 godz

1. Jako material wyjściowy można użyć RNA (badanie jest czulsze) jednak prptokół jest bardziej czasochłonny i angażujący diagnostę (tj. przygotowanie matrycy RNA jest dłuższe: izolacja + reakcja odwrotnej transkrypcji).2. Nieliczne laboratoria referencyjne PALG wykonują badania allelic ratio już w momencie diagnozy.

11

6BADANIE FLT3-ITD

WORK FLOW

PCRPrimery

znakowane Fluo Egzon 14-15

Przykład: A). Fragment bez duplikacji (dziki wt)

330 par zasad

B). Fragment z duplikacją (ITD)

330 bp + np. 20 bp

Ad A.) 330 bp wt

Ad B.) 330 bp wt + 20 bp ITD=350 bp

Wizualizacja produktuPCR

Elektroforeza kapilarna – analiza fragmentów

Inte

nsyw

ność

fluo

resc

encj

i

Długość produktu PCR

12

6BADANIE MUTACJI FLT3 TKD

WORK FLOW

PCRPrimery

znakowane Fluo Egzon 20

Wizualizacja produktuPCR

Trawienie enzymamirestrykcyjnymi produktu PCR

Elektroforeza kapilarna – analiza fragmentów

Inte

nsyw

ność

fluo

resc

encj

i

Długość produktu PCR

Ad A.) 80 bp wt

Ad B.) 129 bp tKD

Produktytrawienia

Przykład: A). Fragment bez mutacji (wt)

B). Fragment z mutacją TKD

A). 80 bp wt

B). 129 bp - mutacja TKD – brak trwienia

EcoRV

13

7WYNIK BADANIA MUTACJI FLT3wg PROTOKOŁU PALG/RATIFY

WYNIK FLT3-ITD:

POZYTYWNY

WYNIK FLT3 TKD:

NEGATYWNY

INTERPRETACJA wg RATIFY

Obecność FLT3-ITD w badanym materiale jest wskazaniem do podania inhibitora FLT3

14

8BADANIE ALLELIC RATIO FLT3-ITD:WT

OCENA RYZYKA W GRUPIE PACJENTÓW Z OBSZ FLT3-ITD(+)

WYSOKIE AR

WIĘKSZE RYZYKO CHOROBY BIALLELICZNEJ

GORSZE ROKOWANIE

AR – aspekt biologiczny i kliniczny

Kottaridis PD et al 2001

15

8BADANIE ALLELIC RATIO FLT3-ITD:WT

AR 0.5 -CUT OFF WG ELN2017

0,0 0,5

RYZYKO:• Choroby biallelicznej

• Nawrotu białaczki

AR 0,13 AR 0,88

AR 21,4

AR 0,85

1 i więcejNiższe Wyższe

349 bp 394 bp

394 bp

397 bp358 bp355 bp328 bp

wt-FLT3

16

8BADANIE ALLELIC RATIO FLT3-ITD:WT

WPŁYW ALLOHSCT NA PRZEŻYCIE W GRUPACH < I > AR 0.5

0,0 0,5

PRAWDOPODOBIEŃSTWO dłuższego przeżycia po alloHSCT

AR < 0,5 AR > 0,5

1 i więcejBez zmian Większe

17

8BADANIE ALLELIC RATIO FLT3-ITD:WT

AR -ASPEKT METODOLOGICZNY

WYJĄTKOWO DUŻE

ROZBIEŻNOŚCI W WYNIKACH AR FLT3-ITD:WT*

* Dane wg UK NQAS - międzynarodowej organizacji akredytującej laboratoria w UK.

AR – aspekt metodologiczny

18

8BADANIE ALLELIC RATIO FLT3-ITD:WT

KRTYCZNE PARAMETRY BADANIA WG RATIFY

PROTOKÓŁ PCR – WARUNKI PÓŁILOŚCIOWE

LICZBA CYKLI PCR : 29 CYKLI

ILOŚĆ DNA: 50 NG

PCR OBJĘTOŚĆ REAKCJI: 50 UL

LICZBA PRÓBEK BADANCH : TRIPLIKATY !!!

LICZBA CYKLI PCR : 29 CYKLI

ILOŚĆ DNA: 50 NG

PCR OBJĘTOŚĆ REAKCJI: 50 UL

LICZBA PRÓBEK BADANCH : TRIPLIKATY !!!

19

STANDARYZACJA ALLELIC RATIOFLT3-ITD:WT

PORÓWNANIE WYNIKÓW ARUZYSKANYCH W 12 PRACOWNIACH

REFERENCYJNYCH DLA OBSZW POLSCE

2020

5%

10%

20%

50%

WSPÓŁCZYNNIK ZMIENNOŚCIMIARA HETEROGENNOŚCI WYNIKÓW AR

DLA 1 PRÓBKI PACJENTA90,0

SD: 0,025 AR: 0,475 –0,525

SD: 0,05 AR: 0,45 –0,55

SD: 0,1 AR: 0,4 –0,6

SD: 0,25 AR: 0,25 –0,75

Pre

cyzj

a b

adan

ia0,5

CV

1 i więcej

Im wyższy CV tym mniejsza precyzja badaniaIm wyższy CV tym mniejsza precyzja badania

21

PORÓWNANIE WYNIKÓW AR W PRACOWNIACH REFERENCYJNYCH

KRYTERIA AKCEPTACJI BADANIA WG THIEDE 90,0 0,5

Współczynnik zmienności dla 12 pracowni

CV = 6.4%1,2

1 i więcej

1. Wynik jest akceptowalny jeśli CV dla tripliketu jest <10% wg kryteriów prof Thiede.2. Wynik może jeszcze ulec zmianie do końca roku 2019.

22

INTERPRETACJA WYNIKU BADANIA ARNA PODSTAWIE STANDARYZACJI PALG WG RATIFY9

0,0 0,468 0,532

INTERPRETACJA wg ELN2017 -PALG:

AR > 0,532 Wskazanie do alloHSCT wg ELN2017

AR 0,46-0,52 Przedział niepewności metody dla Pracowni Referencyjnych PALG Do indywidualnej decyzji terapeutycznej lekarza

AR < 0,46 i NPM1(+) Brak wskazania do alloHSCT wg ELN2017

1 i więcej

23

WYNIK BADANIA ALLELIC RATIO AR FLT3-ITD:WTwg PROTOKOŁU PALG/RATIFY – PRZYKŁAD NR 1 9

WYNIK (średnia z trzech powtórzeń):

AR = 0,53

INTERPRETACJA KLINICZNA wg ELN2017-PALG

Wynik stanowi wskazanie do alloHSCT

KOMENTARZ – INTERPRETACJA WYNIKU wg ELN2017/PALG:

AR > 0,52 Wskazanie do alloHSCT

AR 0,46-0,52 Przedział niepewności metody dla pracowni PALG Kwalifikacja do alloHSCT –do indywidualnej decyzji lekarza

AR < 0,46 i NPM1(+) Brak wskazań do alloHSCT

24

WYNIK BADANIA ALLELIC RATIO AR FLT3-ITD:WTwg PROTOKOŁU PALG/RATIFY – PRZYKŁAD NR 29

WYNIK (średnia z trzech powtórzeń):

AR = 0,51Wynik w przedziale niepewności metody dla pracowni

ref. PALG: AR 0,46-0,52

INTERPRETACJA KLINICZNA wg ELN2017-PALG

Kwalifikacja do alloHSCT– do indywidualnej decyzji lekarza

KOMENTARZ – INTERPRETACJA WYNIKU wg ELN2017/PALG:

AR > 0,52 Wskazanie do alloHSCT

AR 0,46-0,52 Przedział niepewności metody dla pracowni PALG Kwalifikacja do alloHSCT –do indywidualnej decyzji lekarza

AR < 0,46 i NPM1(+) Brak wskazań do alloHSCT

25

WYNIK BADANIA ALLELIC RATIO AR FLT3-ITD:WTwg PROTOKOŁU PALG/RATIFY – PRZYKŁAD NR 3 9

WYNIK (średnia z trzech powtórzeń):

AR = 0,47Wynik w przedziale niepewności metody dla pracowni

ref. PALG: AR 0,46-0,52

INTERPRETACJA KLINICZNA wg ELN2017-PALG

Kwalifikacja do alloHSCT– do indywidualnej decyzji lekarza

KOMENTARZ – INTERPRETACJA WYNIKU wg ELN2017/PALG:

AR > 0,52 Wskazanie do alloHSCT

AR 0,46-0,52 Przedział niepewności metody dla pracowni PALG Kwalifikacja do alloHSCT –do indywidualnej decyzji lekarza

AR < 0,46 i NPM1(+) Brak wskazań do alloHSCT

26

WYNIK BADANIA ALLELIC RATIO AR FLT3-ITD:WTwg PROTOKOŁU PALG/RATIFY – PRZYKŁAD NR 49

WYNIK (średnia z trzech powtórzeń):

AR = 0,45

Mut NPM1 +

INTERPRETACJA KLINICZNA wg ELN2017-PALG

Wynik nie stanowi wskazania do alloHSCT

KOMENTARZ – INTERPRETACJA WYNIKU wg ELN2017/PALG:

AR > 0,52 Wskazanie do alloHSCT

AR 0,46-0,52 Przedział niepewności metody dla pracowni PALG Kwalifikacja do alloHSCT –do indywidualnej decyzji lekarza

AR < 0,46 i NPM1(+) Brak wskazań do alloHSCT

27

NOTATKI

28

NOTATKI

29

NOTATKI

Novartis Poland Sp. z o.o.ul. Marynarska 15, 02-674 Warszawa, PolskaTel: +48 22 375 48 88; Fax: +48 22 375 47 00Email: kontakt.polska@novartis.comwww.novartis.pl