1

บทท 1

บทน า

1.1 ความเปนมา

ประเทศไทยเปนประเทศผผลตและสงสนคาเกษตรและอาหารทส าคญของโลก ปญหาสารตกคางในกลมยาปฏชวนะ เปนปญหาส าคญอยางหนงของประเทศไทย เนองจากในอตสาหกรรมการเลยงสตว มการน ายาปฏชวนะหลายชนดมาใชในกระบวนการผลตเพอเรงการเจรญเตบโต เพอปองกนและรกษาโรค แตการใชยาปฏชวนะดงกลาวอาจตกคางในผลตภณฑจากสตว ถาเกษตรกรมการน ายาปฏชวนะมาใชโดยไมมการควบคมทด เชน ขนาดทจะใช ระยะเวลาการใช ระยะเวลาหยดใช พบวาจะน าไปสปญหายาปฏชวนะตกคางและการดอยาของเชอจลนทรยมากขน ซงจะสงผลโดยตรงตอสขภาพของผบรโภคผลตภณฑจากสตวนน ดงนนหนวยงานท รบผดชอบเกยวกบความปลอดภยของผบรโภค จากประเทศตางๆ รวมทงประเทศไทย เชน Codex (Joint FAO/WHO Food Standard Program) EU คณะกรรมการมาตรฐานสนคาเกษตรและอาหารแหงชาต (มกอช .) ไดมการก าหนดคาปรมาณสงสดทสามารถตรวจพบในผลตภณฑอาหาร (Maximum Residue Limits; MRLs) ขน ท าใหผลตภณฑอาหารจากสตวมความปลอดภยตอผบรโภค ไดมาตรฐานและเปนทยอมรบทงในประเทศและระหวางประเทศ

เตตราไซคลน (Tetracycline: TC) เปนหนงในกลมยาปฏชวนะ (antibiotic) ทมการใชอยางกวางขวางในอตสาหกรรมการเลยงสตว (antibiotic) ประกอบดวยสารเชน เตตราไซคลน (TC) ออกซเตตราไซคลน (Oxytetracycline:OTC) และ คลอเตตราไซคลน (Chrotetracycline: CTC) เปนตน มคณสมบตยบย งการเจรญของแบคทเรยทง แกรมบวกและแกรมลบ โดยออกฤทธขดขวางการจบของ tRNA บนไรโบโซมเชอท าใหสามารถยบย งการสงเคราะหโปรตนของเชอแบคทเรยได จงนยมน ามาใชในการปองกนและรกษาโรคตดเชอในสตวอยางแพรหลาย เชน ในสกร โค ไก และผง หรอใชโดยการผสมรวมกบอาหารสตวในปรมาณนอย แตใหสตวกนตดตอกนเปนเวลานานเพอเรงการเจรญเตบ โต ซงมผลท าใหเกดการสะสมของยาและสารเคมในอวยวะตางๆของรางกายสตว เชน ในเนอ ไข น านม หรอน าผง จากการส ารวจของสหรฐอเมรกาเมอป ค.ศ. 1993 ตรวจพบเตตราไซคลนตกคางอยในสตวบอยถง 4% ของสตวทมยาตกคางอย (Lee และคณะ , 2001) การตกคางในเน อสตวและผลตภณฑสตว สงผลกระทบตอผบรโภคผลตภณฑจากสตวนน อาจกอใหเกดการเปนพษหรอการแพในผบรโภค รวมถงการเกดการ ดอยาในเชอกอโรคโดยเฉพาะแบคทเรยแกรมลบได จาก สาเหตดงกลาว ท าใหแตละประเทศหนมาเนนเรองความปลอดภยของอาหารโดยมการตรว จสอบการตกคางของสารเตตราไซคลนในผลตภณฑอาหารเหลาน ส าหรบอาหารทจดไดวาไดมาตรฐานตามประกาศกระทรวงสาธารณสขจะตองพบปรมาณสารเตตราไซคลนปนเปอนในผลตภฑณอาหารจากสตว ไดแก กลามเนอ ตบ ไต ไข และ นม นอยกวา 0.2, 0.6, 1.2, 0.4 และ 0.1 ug/ml ตามล าดบ

2

(กระทรวงสาธารณสข , 2550) และในสหรฐอเมรกาไดก าหนดคาปรมาณทนอยทสดทสามารถตกคางได ส าหรบเตตราไซคลนในกลามเนอ ตบ และ ไต เปน 2, 6 และ 12 ug/ml (Moats, 2000) ดงนนจงจ าเปนตองมการตรวจวเคราะหหาสารตกคางของยาปฏชวนะในเนอสตวแล ะผลตภณฑสตวกอนการสงออกในหองปฏบตการ โดยทวไปนยมใชวธทางเคมดวยเครอง High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (Pena และคณะ, 2005; Zhenfeng และคณะ , 2006; Wang และคณะ , 2008) และ Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS)/LC MS-MS) (Koesukwiwat และคณะ , 2007; Giannett และคณะ , 2010) ซงการตรวจโดยวธเหลานสามารถหาปรมาณสารตกคางไดถกตองและแมนย าสง แตเครองมอมราคาแพง ใชเวลานานในการเตรยมตวอยาง และตองอาศยผเชยวชาญในการวเคราะห นอกจากนยงมชดตรวจสอบทใชหลกการของวธ colorimetric method โดยปฏกรยาการเกดสระหวางน ายาทดสอบกบยาแตละชนดเกดสทแตกตางกน มวธการไมยงยาก ราคาถก ใชงาย ใหผลรวดเรว แตมขอจ ากดคอ ตองอาศยบคลากรทมความช านาญ และปรมาณต าสดทตรวจสอบไดคอนขางสง (ระดบ ug/ml) เมอเทยบกบวธอนๆ

ส าหรบเทคนคการตรวจวเคราะหสารตกคางโดยใชหลกการภมคมกน เชนเทคนค Enzyme-linked

immunosorbent Assay (ELISA) เปนเทคนคทใชกนอยางกวางขวางใ นการตรวจหาสารตกคางในผลตภณฑ

จากสตว (Pastor-Navarro และคณะ, 2007; Zhangและคณะ, 2007; Jeon และคณะ, 2008) โดยอาศยหลกการ

ตรวจวดแอนตเจน โดยการใชแอนตบอดทจ าเพาะกบแอนตเจน ซงวธนเปนวธการทประหยด รวดเรว ม

ความแมนย าสง สามารถหาสารตกคางปรมาณนอยได การตรวจสอบโดยวธ ELISA นเปนวธทไมใช

เครองมอทซบซอน สามารถตรวจสอบตวอย างเบองตนไดเปนจ านวนมากเพอเปนการคดกรองตวอยาง

กอนทจะน าไปตรวจโดยการใชเครองมอ เชน LC-MS จงท าใหตนทนในการตรวจสารนลดลง ตวอยางชด

ตรวจสอบ ELISA ทมจ าหนาย เชน MaxSignalTM Tetracycline ELISA Test Kit ใชตรวจสอบเตตราไซคลน

ทตกคางในผลตภณฑอาหารตางๆ สามารถตรวจสอบความเขมขนทต าทต าสดถง 0.1 ng/ml ทงนคณะผวจย

ไดประสบความส าเรจในการผลตโมโนโคลนอลแอนตบอดตอเตตราไซคลนแลว (รายงานฉบบสมบรณ ทน

รชดา ) และจะน าโมโนโคลนอลแอนตบอดทไดนไปพฒนาเปนชดตรวจสอบเตตราไซคลน ตกคางใน

ผลตภณฑอาหาร โดยวธ ELISA ส าหรบงานวจยนตอไป

1.2 วตถประสงค

พฒนาชดตรวจสอบเตตราไซคลนตนแบบ โดยวธ ELISA

3

1.3 ขอบเขตงานวจย

1 เลยงเซลลไฮบรโดมาทผลตโมโนโคลนอลแอนตบอดตอเตตราไซคลน

2. ท าโมโนโคลนอลแอนตบอดใหบรสทธ

3. เตรยมชดตรวจสอบเตตราไซคลนโดยวธ ELISA แบบตางๆ

4. ประเมนประสทธภาพของชดตรวจสอบเตตราไซคลน

5. วเคราะหเตตราไซคลนดวยชดตรวจสอบตนแบบ ในตวอยางน าผง

1.4 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

สามารถน าชดตรวจสอบเตตราไซคลนตนแบบ โดยวธ ELISA ไปวเคราะหหาเตตราไซคลนตกคางใน

น าผงได

4

บทท 2

แนวคดและเอกสารงานวจยทเกยวของ

2.1 แนวคดและทฤษฎ

2.1.1 ทมาและกลไกการออกฤทธสารกลมเตตราไซคลน

สารกลมเตตราไซคลน (Tetracyclines; TCs) เปนสารทผลตขนเพอใหออกฤทธในวงกวางท าลายแบคทเรยทงแกรมบวกและแกรมลบ สารในกลมนผลตขนมาจาก แบคทเรยในตระกล Streptomyces สารตวแรกทคนพบคอคลอเตตราไซคลน (Chlortetracycline; CTC) คนพบในป ค .ศ. 1048 โดยแยกไดจากStreptomyces aureofaciens อก 2 ปตอมากคนพบออกซเตตราไซคลน (Oxytetracycline; OTC) โดยแยกไดจาก Streptomyces rimosus ตอมาในป 1952 สามารถผลตสารกลมนในรปกงสงเคราะหขนมาได โดยการดงเอาอะตอมของคลอรนออกจาก CTC สารทผลตไดใหมนจะเรยกวาเตตราไซคลน (Tetracycline; TC) เหมอนชอกลมสาร ในปจจบนนไดมการผลตสารในกลมนตวใหมขนมาใชอกหลายตว ไดแกดอกซไซคลน (Doxycycline; DC) ดมคลอไซคลน (Demechlocycline; DMC) เมธาไซคลน (Methacycline; MC) และโรลเตตราไซคลน (Rolitetracycline; RTC) (กมลชย ตรงวานชนาม, 2547)

กลไกการออกฤทธของสารในกลม TC สามารถเกดไดหลายแบบ ดงน 1) Active chelation ของไอออนบวก (cation) โดยจะไปเกาะกบแมกนเซยม แมงกานส และ

แคลเซยม ยบย งการเกด oxidative phosphorylation ในไมโตคอนเดรยของเซลลรางกายสตว

2) ยบย งระบบเอนไซมทจ าเปน โดย CTC จะยบย ง organic nitroreductase ของแบคทเรย 3) ขดขวางการสรางโปรตนของแบคทเรยทก าลงเจรญแบงเซลล ซงเปนการออกฤทธทส าคญ

ของสารกลมน โดยจะไปเกาะกบสวน ไรโบโซมยอย 50s ของ 70s ไรโบโซม ของแบคทเรย ไปขดขวางการขนยายกรดอะมโน จาก aminoacyl t-RNA ไปยงสวนพอลเปปไทด ท าใหแบคทเรยหยดการเจรญและแบงเซลล (bacteriostatic)

5

ขอบเขตการออกฤทธของสารในกลม TCs แบงออกไดดงน 1) ออกฤทธวงกวาง (broad spectrum) ตอแบคทเรยทงแกรมบวกและแกรมลบ โดยสารจะไป

ออกฤทธยบยงการเจรญและแบงเซลลของ แบคทเรย โดยจะออกฤทธไดดตอเ ชอแบคทเรยแกรมบวกมากกวา แบคทเรยแกรมลบ โดยเชอแบคทเรยทไวตอสารในกลมนไดแก β-hemolytic Streptococci, nonhemolytic Streptococci, Clostridium, Brucella, Hemophius และ Klebsiella

2) ออกฤทธท าลาย pathogenic agent บางชนดทสา รปฏชวนะชนดอนท าลายไมได เชน Rickettsiae, ไวรสขนาดใหญ เชน Psittacosis ในสตว และ Lymphogranuloma venereum ในคน

3) ออกฤทธท าลายเชอ Mycoplasma, Spirochete และ Actinomycetes 4) ถาใหปรมาณสงๆจะออกฤทธท าลายเชอโปรโตซวได

สตรโครงสรางทางเคม ลกษณะ และสมบตของสารในกลม TCs

สารทกตวในกลม TCs จะมโครงสรางหลกทเหมอนกนคอ hydronapthacene skeleton หรอเรยกวา Tetracycline nucleus ดงรปท 2.1

รปท 2.1 สตรโครงสรางทางเคมของสารในกลม TCs

NH2

O

N(CH3)2

OOOH

OHCH3

OHOH

OH

NH2

O

N(CH3)2

OOOH

OHCH3

OHOH

OH

OH

Tetracycline (TC) Oxytetracycline (OTC)

NH2

O

N(CH3)2

OOOH

OHCH3

OHOH

OH

Cl

Chlortetracycline (CTC)

NH2

O

N(CH3)2

OOOH

CH3

OHOH

OH

OH

Doxycycline (DC)

)

NNH

O

N(CH3)2

OOOH

OHCH3

OHOH

OH

Rolitetracycline (RTC)

6

สาร TCs ในรปผงผลกจะมสเหลอง ไมมกลน และมรสขมเลกนอย เกบไวไดนาน สารกลมนในรปเปนเบสจะละลายน าไดเลกนอยท pH 7 ละลายไดเพยง 0.25-0.5 มลลกรมตอน า 1 มลลลตร สารในกลม TCs จดเปน amphoteric compound สามารถเกดเปนเกลอกบกรดหรอดาง เชน การ เกดเกลอกบกรดไฮโดรคลอรก เกลอของสารกลมนจะสามารถละลายน าไดด สารกลม TC ในรปเกลอไฮโดรคลอไรดมกนยมใหกนในรปแคปซล แตสารนจะเกดเปนสารประกอบโลหะเชงซอนกบ chelating agent และไอออนของโลหะเชน แคลเซยม แมกนเซยม และเหลก จงอาจเกดสารประกอบเ ชงซอนทไมสามารถถกดดซมในทางเดนอาหารได ฤทธของสารทใหกนจงขนกบสารสวนทไมจบกบไอออนของโลหะเนองจากจะถกดดซมเขาสรางกายโดยตรง ตามปกต pH ของทางเดนอาหารและ pKa ของสารกลมนเหมาะส าหรบการทสารจะถกดดซมเขาไปออกฤทธในรางกาย (กมลชย ตรงวานชนาม, 2547)

พษของยาตกคาง TC

การเกดการตกคางของสาร TCs ในผลตภณฑอาหารตางๆในระดบนอยกวา 1 มลลกรมตอลตร (ug/ml) จะไมเกดผลเฉยบพลนตอผบรโภค แตอาจท าใหเกดอนตรายตอสขภาพของผบรโภคไดในระยะยาว เนองจากการทสารตกคางในเนอสตว และผลตภณฑจากสตวทบรโภคเขาไปมปรมาณนอยไมถงกบขนาดทใชรกษาโรค จงไมท าใหเชอโรคทมในรางการตายแตกลบท าใหเชอโรคนนปรบตวและดอตอยา ท าใหเกดปญหาการรกษาโรคในภายหลงได และถาตรวจพบในระดบ 5-7 มลลกรมตอลตร อาจท าเกดอนตรายตอรา งกายของผบรโภคไดโดยเฉพาะในผปวยโรคเบาหวานหรอผทมภมคมกนบกพรอง โดยจะสามารถท าลาย normal flora จนท าใหเกดการตดเชอแทรกซอนจากเชอรา และแบคทเรยอนๆ ท าใหมอาการทองเดน มไขจากแบคทเรย Staphylococci เกดการตดเชอรา Candida albicans ในชองปาก ล าคอ ชองคลอด หรอทางเดนอาหาร มผลตอกระดกและฟน โดย TC จะไปจบกบแคลเซยมทกระดกและฟน ยบย งการเจรญของกระดกและฟน สารทเกาะบรเวณฟนจะท าใหฟนมสน าตาลและเมอถกแสงสน าตาลจะยงเขมขน เนองจากสารกลมนสามารถผานรกได ดงนนถาใชขณะตงครรภจะท าใหฟนน านมของทารกมสน าตาลแตจะไมมผลกบฟนแท นอกจากนสาร TCs ทกชนดยงท าใหผวหนงแพตอแสง ผวไหม และรสกชาบรเวณทถกแสงเปนตน (ปรญญา มาสวสด, 2550)

2.1.2. มาตรฐานยาสตวตกคางกลม TCs

ตามประกาศกระทรวงสาธารณสข (ฉบบท 303) พ.ศ. 2550 เรอง อาหารทมยาสตวตกคาง ไดใหนยามค าวา ยาสตว หมายความวา สารใดๆทใหแกสตวทใชเปนอาหารส าหรบมนษย เชน สตวทใหเนอหรอนม สตวปก สตวน าและผง เพอวตถประสงคในการรกษา ปองกน หรอวนจฉยโรค หรอเพอวตถประสงคในการเปลยนแปลงทางสรระหรอพฤตกรรมของสตวนน ยาสตวตกคาง หมายความวา ยาสตวทเปนสารประกอบตงตน (Parent drug) สารในกระบวนการสรางและสลายของสตว (Metabolite) และสารอนท

7

ปนมากบยาสตว (Associated impurities) อาหารทมยาสตวตกคาง หมายความวา สวนของเนอเยอ อวยวะหรอผลตผลของสตวทบรโภคได ซงพบยาสตวตกคาง

ตารางท 2.1 ปรมาณยาสตวตกคางกลม TCs สงสดทอนญาตใหตรวจพบไดในอาหาร (Maximum Residues Limits, MRLs)

ชนดของยาสตวตกคาง ชนดของ

สตว ชนดของเนอเยอ หรอ ผลตผลของสตว

ปรมาณตกคางสงสด ( ไมโครกรมตอ 1 กโลกรม หรอตอ 1 ลตรของน านม)

คลอเตตราไซคลน/ออกซเตตราไซคลน/เตตราไซคลน ในรปของคลอเตตราไซคลน/ออกซเตตราไซคลน/เตตราไซคลน อยางหนงอยางใด หรอผลรวมของยาทง 3 ชนด (Chlotetracycline/ Oxytetracycline/Tetracycline, single or in combination)

โค โค โค โค สกร สกร สกร แกะ แกะ แกะ แกะ

สตวปก สตวปก สตวปก สตวปก ปลา*

กงกลาด า*

กลามเนอ ตบ ไต

น านม กลามเนอ

ตบ ไต

กลามเนอ ตบ ไต

น านม กลามเนอ

ตบ ไต ไข

กลามเนอ กลามเนอ

200 600

1,200 100 200 600

1,200 200 600

1,200 100 200 600

1,200 400 200 200

ทมา : ประกาศกระทรวงสาธารณสข (ฉบบท 303) พ.ศ. 2550 เรอง อาหารทมยาสตวตกคาง

หมายเหต * ออกซเตตราไซคลน ชนดเดยว

8

2.1.3 การตรวจวเคราะหเตตราไซคลน

2.1.3.1 การตรวจวเคราะหเตตราไซคลนดวยวธทางเคม เนองจาก TC เปนยาปฏชวนะทมการนยมใชกนอยางแพรหลาย ท าใหเกดการ

ตกคางในผลตภณฑจากสตว จงตองมการตรวจหาการตกคางของ TC ดวยเทคนคตางๆ การตรวจวเคราะห เต

ตราไซคลนโดยวธทางเคมนนสามารถท าไดหลายเทคนคดงแสดงในตาราง 2.4 โดยเทคนคทางเคมทเปนท

นยม คอ เทคนค high performance liquid chromatography (HPLC) เปนเทคนคทมความไวสง ใหผลการ

ตรวจสอบทถกตองแมนย า แตเทคนคนตองใชเวลาในก ารวเคราะหแตละตวอยางนาน จงท าการตรวจ

ตวอยางไดนอย ตนทนในการวเคราะหมราคาสง เนองจากเครองมอและอปกรณทใชมราคาแพง อกทง

จ าเปนตองวเคราะหในหองปฏบตการ และตองอาศยผช านาญการในการวเคราะหอกดวย ท าใหไมเหมาะ

กบการตรวจคดกรองตวอยางจ านวนมาก

ตารางท 2.2 การตรวจวเคราะหเตตราไซคลนดวยวธทางเคม

เทคนค คา LOD (ng/ml) ตวอยาง เอกสารอางอง

HPLC-FL 110

750

น าผง

นมพรองมนเนยและ

นมทมไขมน

นรนทร และคณะ, 2551

Siva และคณะ,2005

HPLC-ESI-TOF-MS 0.05 น าผง Pancorbo และคณะ, 2008

HPLC-UV 50 น าผง Thompson และคณะ, 2005

LC-UV 15 น าผง Vinas และคณะ, 2004

หมายเหต Detector: Fl: fluorescence, ESI-TOF-MS: diode array electrospray time-of-flight- mass

spectrometry, UV: Ultraviolet, LOD: limited of detection

9

2.1.3.2 การตรวจวเคราะหเตตราไซคลนโดยวธทางภมคมกนวทยา

เทคนคทางดานภมคมกนวทยามความสะดวกในการน าไปใชตรวจคดกรองนอกสถานท และประหยดกวาเทคนคทางเคมดงทกลาวไปเบองตน จงท าใหเทคนคทางดานภมคมกนวทยาเปนทนยมใชกน ในปจจบนการวเคราะหทอาศยวธทางอมมโนวทยา (immunological method) ไดแก วธเอนไซมลงคอมมโนซอรเบนตแอสเสย (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) ทเปน immunochromatographic assay (strip test) หรอ sensor chip เทคนคนเปนเทคนคทมความไวสง ใหผลการตรวจสอบทถกตองแมนย า และมความจ าเพาะ (specificity) สง เนองจากอาศยการจบกนของแอนตเจนกบแอนตบอด สามารถตรวจเตตราไซคลน ไดในระดบพโคกรม (picogram) และ นาโนกรม (nanogram)

สวนหลกการของเทคนค ELISA นนอาศยหลกการท าปฎกรยาระหวางแอนตเจน คอ เตตราไซคลน กบแอนตบอดตอ เตตราไซคลน ซงมการตดฉลากดวยเอนไซมแทนสารกมมนตภาพรงส โดยใชแอนตเจนหรอแอนตบอดเคลอบตดกบพนผว (solid support) ท าใหเกดการจบกนระหวางแอน ตเจนและแอนตบอด ตรวจวดการจบกนของเอนไซมทตดฉลากกบแอนตเจนหรอแอนตบอด ซงเอนไซมจะเปนตวชวยในการขยายความสามารถในการตรวจสอบปฏกรยาระหวางแอนตเจนและแอนตบอดทเกดขน จงเปนปฏกรยาทมความไว ความจ าเพาะสง และมการจบกนอยางเหนยวแนน (high affinity) เทคนค ELISA นเปนวธทอาศยปฎกรยาทางภมคมกนมความนยมมากในปจจบน สามารถใชในการวดระดบสารทตองการตรวจวดไดอยางแมนย า มความจ าเพาะและความไวสง สะดวก ใชงานไดงาย ไมเปนพษกบสงแวดลอม ความถกตองสงใหผลการตรวจวดใกลเค ยงกบการตรวจวดดวยวธทางเคม แตใชเวลานอยและวเคราะหตวอยางไดคราวละมากๆ และมการใชอยางแพรหลาย

เนองจากเทคนค ELISA มขอดในการใชตรวจคดกรองตวอยางกอนสงตรวจดวย

เทคนคทางเคม จงมชดตรวจสอบ TC ออกมาจ านวนมาก ซงในประเทศไทยมการน าเขามาจ าหนาย

ตวอยางเชน ชดตรวจวนจฉยส าเรจรปยหอ RIDASCREEN® Tetracycline (รปท 2.2) ทเปน indirect ELISA

ใชตรวจตวอยางเนอสตว น านม และน าผง ราคาชดละประมาณ 20,000 – 30,000 บาท มอายการใชงาน

ประมาณ 6 เดอน ถง 1 ป สามารถตรวจสาร tetracycline และ rolitetracycline ไดในระดบ 1.5 ng/ml ใน

น านม 15 ng/ml ในน าผง และ 6 ng/ml ในเนอสตว เกดการท าปฏกรยาขามกบสารในกลม TCs เทากบ 5-

125% (สถาบนอาหาร, 2553 ; R-Biofarm, 2009)

สวนอกยหอ คอ MaxSignal® Tetracyclinerecovery ทเปน indirect ELISA มอาย

การใชงานประมาณ 1 ปเมอเกบ ทอณหภม 2-8 องศาเซลเซยส ใชตรวจตวอยางเนอสตวและน าผงไดต าสดท

2 และ 2.5 ng/ml เกดการท าปฏกรยาขามกบสารในกลม TCs เทากบ 6-122% (Bioo, 2009)

10

รปท 2.2 ชดตรวจวนจฉยส าเรจรปยหอ RIDASCREEN® Tetracycline

2.1.4 สถานการณและทศทางการพฒนาชดตรวจสอบในประเทศไทย

ประเทศสหรฐอเมรกาและเยอรมน เปนผผลตชดตรวจสอบรายใหญทสดของโลก (ดงตารางท 2.3)

ตารางท 2.3 ประเทศผผลตและผใชชดตรวจวนจฉยทางการแพทยรายใหญของโลก

ประเทศ ตลาดดานการผลตคดเปนรอยละของมลคาตลาดโลก

ตลาดดานการใชคดเปนรอยละของมลคาตลาดโลก

สหรฐอเมรกา 48 45

เยอรมน 29 10

สหภาพยโรป (ยกเวนเยอรมน) 15 22

ประเทศอน 8 23

แหลงขอมล : The Theta reports diagnostic market and technology trends: year 2000 and beyond 2000 (ธารารตน ธารากล, 2545)

11

โดยประเทศไทยกเปนประเทศหนงทสงซอชดตรวจสอบจากตางประเทศรวมมลคามหาศาลในแตละปและมแนวโนมเพมขนอยางตอเนอง ประเทศไทยมการน าเขาชดตรวจสอบรอยละ 95 โดยมการผลตภายในประเทศนอยกวารอยละ 5 ซงสวนใหญใชงานดานการแพทย ดานปศสตว ดานสงแวดลอม และการใชงานทางการเกษตร เพอวนจฉยการปนเปอนของผลตภณฑทางการเกษตร และตรวจสอบสารตกคางในอาหารดวย ปจจบนมความตนตวทจะท าการวจยและพฒนาชดตรวจวนจฉยอยพอสมควร เนองจากชดตรวจวนจฉยโดยหลกการวทย าภมคมกน มการใชกนอยางกวางขวางสามารถน าไปใชงานไดทนท โดยไมตองทดสอบหาสภาวะทเหมาะสมอก โดยระยะทผานมามการพฒนาอยางกาวกระโดดรวมกบเทคโนโลยทางพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพ ท าใหสามารถพฒนาการผลตแอนตบอด และแอนตเจนทใชเปนสวนประกอบส า คญในชดตรวจทมคณภาพดขนอยางชดเจน รวมถงการพฒนาชนด และคณภาพของเทคโนโลยในการวดและตรวจจบสญญาณ (signal detection) ทเกดจากปฏกรยาทเกดระหวางแอนตเจนกบแอนตบอดดวย รวมกบการพฒนาการเพมความไวของการตรวจวดอกดวย [18] ชดตรวจสอบทใชในปจจบนมราคาตอหนวยคอนขางสง (รปท 2.5) จากสถานการณนท าใหมความสนใจทจะท าการพฒนาและผลตชดตรวจวนจฉยมากขนเรอยๆ เนองจากมโอกาสพฒนาผลตภณฑทมราคาเหมาะสมตอการใชงานในสภาวะทเหมาะกบภมภาคและอาจจะสามารถสงออกไปยงตางประเทศได

การวจยและพฒนาชดตรวจสอบอยางเปนระบบ จะท าใหประเทศไทยสามารถทจะวจย พฒนาและผลตชดตรวจสอบคณภาพสงไดในระดบหนง ซงจะเปนผลดตอเศรษฐกจ สขภาพอนามย สงคม รวมทงตอการพฒนาทางวทยาศาสตร และเทคโนโลยของชาต อนจะเปนพนฐานของการวจยและพฒนาเทคโนโลยชวภาพในดานอนๆ ตอไป (ธารารตน ธารากล, 2545)

2.1.5 หลกการ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

การตรวจทอาศยหลกการทางภมคมกนวทยาทนยมใชมากในปจจบน คอ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) หรอ enzyme immunoassay (EIA) ซงใชแอนตเจนหรอแอนตบอดเคลอบตดพนผว และตรวจวดสญญาณจากปฏกรยากบเอนไซมทตดฉลากบนแอนตเจนหรอแอนตบอ ด วธ ELISA ไดพฒนาตอมาจาก radioimmunoassay (RIA) โดยเปลยนจากการตดฉลากดวยสารรงส เปนการตดฉลากดวยเอนไซม แลวตรวจวดปฏกรยาดวยสารทเปนสารตงตนของเอนไซมและเปลยนสไดเมอกลายเปนผลตภณฑ การเปลยนจากสารรงสมาเปนเอนไซมนท าใหการตรว จมความสะดวกมากขน ไมตองใชรงสทมอนตราย ทงของเสยไดงายขน และชดตรวจมอายการใชงานไดนานเพราะไมมการหมดอายของสารรงส การพฒนา ELISA รปแบบตางๆท าใหสามารถใชเทคนคนในการตรวจสอบทงแอนตเจนและแอนตบอดในแงคณภาพหรอปรมาณได การตรวจสอบใน เชงปรมาณสามารถท าไดโดยใชแอนตเจนหรอแอนตบอดททราบปรมาณเตรยมเปนกราฟมาตรฐานส าหรบเปรยบเทยบกบผลทไดจากตวอยาง [18] กลไกการท าปฏกรยา

12

ระหวางแอนตเจนและแอนตบอด แบงไดเปน 2 ประเภท คอ competitive ELISA และ non competitive ELISA

2.1.5.1 non competitive ELISA การทดสอบนสามารถใชตรวจสอบหาแอนตบอดและแอนตเจน โดยอาจแบงไดเปน

2 ประเภทหลก คอ

ก. direct ELISA หลกการแสดงในรปท 2.3 คอเคลอบจานทดสอบ ELISA ชนด 96 หลมดวยแอนตบอด

ทจ าเพาะตอแอนตเจนทตองการตรวจหาในตวอยาง เมอเตมสงสงตรวจทมแอนตเจน พรอมกบเตม

แอนตเจนทตดฉลากดวยเอนไซม แอนตเจนทงสองจะจบกบแอนตบอดดงกลาว จากนนลางสวนทไมท า

ปฏกรยาออก แลวจงเตมแอนตบอด ซงมความจ าเพาะต อแอนตเจน ทตองการตรวจและตดฉลากดวย

เอนไซมลงไปในปรมาณทมากพอ ซงจะไปท าปฏกรยากบแอนตเจนทจบกบแอนตบอดตวแรก จากนนลาง

สวนทไมท าปฏกรยาออก เตมสบสเตรตของเอนไซม แลวน าไปวดปรมาณสทเกดขน การเปลยนแปลงสของ

สบสเตรต จะเปนสดสวนโดยต รงกบปรมาณของแอนตเจนในตวอยางทตรวจสอบ อาจเรยกวธนวา

sandwich ELISA

รปท 2.3 หลกการของ direct ELISA

เคลอบพนผวดวย

แอนตบอด

เตมแอนตบอดตวทสอง

ทตดฉลากกบเอนไซม

เตมสบสเตรต เตมตวอยางทมแอนตเจน

ลาง ลาง ลาง s

P

s

P

13

ข. indirect ELISA หลกการแสดงในรปท 2.6 คอ ดดแปลงวธ direct ELISA ใหมความสะดวกมากขน โดยใชแอนตบอดจ าเพาะทไมไดตดดวยเอนไซม และใชแอนตบอดทจ าเพาะตออมมโนโกลบลนตดฉลากดวยเอนไซม (secondary antibody)โดยแอนตบอดตวทสองน จะจบแบบจ าเพาะกบแอนตบอดตวแรก เพอวดปรมาณของแอนตบอดตวแรกซงจบกบแอนตเจนทตองการตรวจ หลงจากลางสวนทไมท าปฏกรยาออก การเปลยนแปลงสของสบสเตรตจะเปนสดสวนโดยตรงกบปรมาณของแอนตบอดในตวอยางทตรวจสอบ

รปท 2.4 หลกการของ indirect ELISA

2.1.5.2 competitive ELISA

เปนวธการทดสอบทมกจะใชส าหรบการตรวจหาแอนตเจนซงมน าหนกโมเลกล

นอย โดยอาศยการใชแอนตเจนทตดฉลากดวยเอนไซมหรอใชแอนตบอดทตดฉลากดวยเอนไซมเปนตว

กระท าในการทดสอบ

ก. competitive ELISA ซงใชแอนตเจนทตดฉลากดวยเอนไซม

วธการทดสอบนมหลกการดงแสดงในรป 2.5 ก ในการทดสอบจะเคลอบจานทดสอบ

ELISA ชนด 96 หลมดวยแอนตบอด แลวเตมแอนตเจนตดฉลากดวยเอนไซมซงจ าเพาะตอแอนตบอดท

เคลอบอย พรอมกบเตมตวอยางทตองการตรวจสอบหาปรมาณแอนตเจน หรอเตมพรอมกบแอนตเจน

มาตรฐาน ซงจ าเพาะกบแอนตบอดนนแตไมไดตดฉลากดวยเอนไซม หากมแอนตเจนในตวอย างจะเกด

การแยงจบกบแอนตบอดทพนผวระหวางแอนตเจนกบแอนตเจนทตดฉลาก ท าใหแอนตเจนตดฉลากทเตม

ลงไปสวนหนงจบกบแอนตบอดไดนอย แลวลางสวนทไมท าปฏกรยาออก เตมสบสเตรตของเอนไซมแลว

น าไปวดปรมาณสทเกดขน การเปลยนแปลงสของ สบสเตรตจ ะแปรผกผนกบปรมาณของแอนตเจนใน

ตวอยางทตรวจสอบ

ลาง ลาง ลาง

เคลอบพนผวดวย

แอนตเจน

เตมแอนตบอดทจ าเพาะ เตมแอนตบอดตวทสอง

ทตดฉลากกบเอนไซม

เตมสบสเตรต

s

P

s

P

14

ข. competitive ELISA ซงใชแอนตบอดทตดฉลากดวยเอนไซม วธการทดสอบนมหลกการดงแสดงในรป 2.5 ข จะท าการเคลอบจานทดสอบ ELISA

ชนด 96 หลมดวยแอนตเจน แลวเตมแอนตบอดตดฉลากดวย เอนไซมซงจ าเพาะตอแอนตเจนทเคลอบอย

พรอมกบเตมตวอยางทตองการตรวจสอบหาปรมาณแอนตเจน หรอเตมพรอมกบแอนตเจนมาตรฐาน ซง

จ าเพาะกบแอนตบอดนนแตไมไดตดฉลากดวยเอนไซม แอนตบอดทตดฉลากจะเกดการแยงจบระหวาง

แอนตเจนในตวอยางกบแอนตเจนท เคลอบบนพนผว แลวลางสวนทไมท าปฏกรยาออก เตมสบสเตรตของ

เอนไซมแลวน าไปวดปรมาณสทเกดขน การเปลยนแปลงสของสบสเตรตจะแปรผกผนกบปรมาณของ

แอนตเจนในตวอยางทตรวจสอบ

นอกจากนสามารถเตรยมชดตรวจสอบแบบ competitive ELISA โดยอาศยการจบกน

ระหวาง biotin และ streptavidin ซงตดฉลากดวยเอนไซม (รปท 2.5 ค)โดยท าการเคลอบจานทดสอบ

ELISA ชนด 96 หลมดวยแอนตเจน แลวเตมแอนตบอดตดฉลากดวย biotin ซงจ าเพาะตอแอนตเจนทเคลอบ

อย พรอมกบเตมตวอยางทตองการตรวจสอบหาปรมาณแอนตเจน หรอเตมพรอมกบแอนตเจนมาตรฐาน ซง

จ าเพาะกบแอนตบอดนนแตไมไดตดฉลากดวย biotin แอนตบอดทตดฉลากจะเกดการแยงจบระหวาง

แอนตเจนในตวอยางกบแอนตเจนทเคลอบบนพนผว แลวลางสวนทไมท าปฏกรยาออก เตม streptavidin ซง

ตดฉลากดวยเอนไซม แลวลางสวนทไมท าปฏกรยาออก เตม สบสเตรตของเอนไซมแลวน าไปวดปรมาณส

ทเกดขน การเปลยนแปลงสของสบสเตรตจะแปรผกผนกบปรมาณของแอนตเจนในตวอยางทตรวจสอบ

(ก)

(ข)

เคลอบพนผวดวย

แอนตเจน

ลาง ลาง ลาง

เตมสบสเตรต เตมแอนตบอดพรอมกบ

ตวอยางทมแอนตเจน

เตมแอนตบอดตวทสอง

ทตดฉลากดวยเอนไซม

s

P

ลาง ลาง

เคลอบพนผวดวย

แอนตบอด

เตมแอนตเจนทตดฉลากดวยเอนไซม

พรอมกบตวอยางทมแอนตเจน เตมสบสเตรต

s

P

15

(ค)

รปท 2.5 หลกการของ Competitive ELISA (ก) ใชแอนตเจนทตดฉลากดวยเอนไซม (ข) ใชแอนตบอดทตด

ฉลากดวยเอนไซม (ค) ใชแอนตบอดทตดฉลากดวย biotin

(หมายเหต คอแอนตบอด, คอแอนตเจนเชอมโปรตน, คอแอนตเจนอสระ

คอแอนตบอดตวทสองตดฉลากดวยเอนไซม, คอแอนตบอดตดฉลากดวย biotin

คอ streptavidin ทตดฉลากดวยเอนไซม )

2.1.6 องคประกอบทส าคญของชดตรวจ ELISA (ธารารตน ธารากลม, 2545)

2.1.6.1 แอนตเจน (antigen, Ag) แอนตเจนเปนปจจยส าคญทก าหนดความจ าเพาะของการตรวจหาแอนตบอด เนองจากในชดตรวจโดยหลกการวทยาภมคมกนนนอาศยปฏกรยาการจบกนแบบจ าเพาะระหวางแอนตเจนกบแอนตบอดเปนกลไกหลกในการตรวจ ซงจบกบแอนตบอดไดดและสามารถสรางแอนตบอดทจ าเพาะไดงาย คณสมบตของแอนตเจนส าหรบชดตรวจวนจฉยโดยวธทางภมคมกนว ทยา คอ ความจ าเพาะ (specificity) ความบรสทธ (purity) ความคงรปโครงสรางของแอนตเจนใหสามารถจบกบแอนตบอดทตองการได (structural integrity) ความสามารถในการผลตปรมาณมาก (up-scale production) และมคณภาพคงท (sustainability)

2.1.6.2 แอนตบอด (antibody, Ab) แอนตบอดหรออมมโนโกลบลน (immunoglobulin, Ig) เปนไกลโคโปรตนทท า

หนาทจบกบแอนตเจนตรงบรเวณจ าเพาะของโมเลกลแอนตเจน ทเรยกวาอพโทป (epitope) สรางจากเมด

เลอดขาวชนดบ-ลมโฟไซต ทเปลยนแปลงไปท าหนาทหลงแอนต บอดเรยกวา พลาสมาเซลล แอนตบอดท

B

ลาง ลาง

ลาง เคลอบพนผวดวย

แอนตเจน

B

B

เตมแอนตบอดทตดฉลาก

biotin

พรอมตวอยางทมแอนตเจน

B

E S

เตม streptavidin ทตด

ฉลากดวยเอนไซม

B

E S

เตมสบสเตรต

s

P

E S

16

หลงเขาสกระแสเลอดจะท าหนาทเปนตวจกรส าคญของระบบภมคมกนแบบหลงแอนตบอด (humoral

immunity) โครงสรางของแอนตบอด (รปท 2.6) ซงความแตกตางระหวางพอลโคลนอลแอนตบอดและโม

โนโคลนอลแอนตบอดแสดงดงตารางท 2.4

รปท 2.6 โครงสรางพนฐานของอมมโนโกลบลน โปรตนสายสน (light chain) และโปรตนสายยาว (heavy chain) แตละโมเลกลประกอบดวยกรดอะมโนทมความแปรปรวนสง (variable region) ซงมความแตกตางกนในแอนตบอดแตละชนด เปนบรเวณทจบกบแอนตเจน (antigen binding site) สวนบรเวณทเหลอเปนบรเวณคงท (constant region) ซงมความแตกตางกนตามชนดของโปรตน โปรตนสายยาวจะมบรเวณขอพบ (hinge region) (ไพศาล สทธกรกลม, 2548)

ตารางท 2.4 คณสมบตและขอจ ากดในการผลตระหวางพอลโคลนอลแอนตบอดและโมโนโคลนอลแอนตบอด

คณสมบต พอลโคลนอลแอนตบอด โมโนโคลนอลแอนตบอด

ความจ าเพาะ (specificity) ความจ าเพาะต าเกดการท าปฏกรยาขามไดกบสาร

อนๆได

ความจ าเพาะสงเนองจาก

จ าเพาะตออพโทปเดยว

เทานน

สมพรรคภาพ (affinity) จบไดหลายอพโทปตอแอนตเจน จบไดอพโทปเดยว

17

คณสมบต พอลโคลนอลแอนตบอด โมโนโคลนอลแอนตบอด

ความเขมขนแอนตบอดทผลต ประมาณ 1 mg/ml ประมาณ 100-200 µ g/ml

เมอเลยงในถงปฏกรณแบบ

ปนกวน

ปรมาณทผลตได ประมาณ 100 ml จากซรมของกระตาย ขนกบขนาดเครองปฏกรณ

ชวภาพ

ความบรสทธของแอนตบอด

ทผลต

ขนอยกบแอนตเจนทใชกระตนจงจ าเปนตองท า

ใหบรสทธ

จ าเพาะกบอพโทปเดยวจง

ไมจ าเปนตองท าใหบรสทธ

เวลาทใชในการผลต ไมเกน 6 สปดาห อยางนอย 4 เดอน

ตนทนในการผลต ต า สง โดยเฉพาะในเวลา

เรมตน

ขอดหลก ตนทนต า

งายตอการผลต

มความจ าเพาะสง

ขยายขนาดการผลตไดโดย

ปรบภาวะการผลตได

ขอเสยหลก คณภาพแอนตบอดในแตละครงไมเหมอนกน เสยเวลาและแรงงานในการ

ผลตมาก

ทมา : ไพศาล สทธกรกลม, 2548

2.1.6.2.1. แหลงก าเนดและวธการผลต

โมโนโคลนอลแอนตบอด ไมวาจะผลตจากวธ somatic hybridization หรอโดย

วธทางพนธวศวกรรมกตาม ตองอาศยเทคโนโลยจ าเพาะ และตองใชกระบวนการทางหองปฏบตการท

ซบซอน ซงขนตอนเหลานมคาใชจายสงเมอเทยบกบการผลตพอลโคลนอลแอนตบอด ซงผลตโดยกา ร

กระตนระบบภมคมกนของคนหรอสตวทดลองดวยแอนตเจน ใหสรางแอนตบอดทตองการออกมาใน

18

กระแสเลอด หลงจากนนจงแยกแอนตบอดออกจากซรม การผลตพอลโคลนอลแอนตบอด จงมคาใชจาย

นอยกวาและท าไดงายกวา อยางไรกตามพอลโคลนอลแอนตบอดทผลตในสตวตางชน ดหรอแมแตในสตว

ชนดเดยวกนแตคนละตวกนกอาจไดแอนตบอดทแตกตางกนทงในดานปรมาณและคณภาพ นอกจากนพอ

ลโคลนอลแอนตบอดทผลตไดแตละครงจะมปรมาณจ ากดและอาจตองใชคนหรอสตวจ านวนมาก ดงนน

ในการผลตจงตองมวธการควบคมคณภาพของพอลโคลนอลแอน ตบอดทผลตขนทกๆ ครง สวนโมโน

โคลนอลแอนตบอดนน สามารถผลตไดอยางไมจ ากดในดานปรมาณและคณภาพ โดยการเพาะเลยงเซลลน

ไปเรอยๆ รวมทงมความสะดวกในการควบคมคณภาพทดกวา เนองจากทงยนและเซลลทผลตแอนตบอด

นนจะถกเกบรกษาไวไดตลอดไป ใน ระยะยาวคาใชจายในการผลตโมโนโคลนอลแอนตบอดจงอาจจะไม

สงมากนก

2.1.6.2.2. ความจ าเพาะตอแอนตเจน (Antigen specificity)

ชดตรวจวนจฉยสวนใหญใชโมโนโคลนอลแอนตบอดเปนสวนประกอบหลก

เนองจากมความจ าเพาะแอนตเจนสงกวาพอลโคลนอลแอนตบอดมาก เนองจากผลตจากเซลลทมตนก าเนด

จากเซลลเดยวกน จงมโมเลกลของแอนตบอดทสรางขนเหมอนกนทกประการ ท าใหมความจ าเพาะตออพ

โทปเดยว สวนพอลโคลนอลแอนตบอดประกอบดวยแอนตบอดหลายชนดประกอบกน โดยทแตละ

โมเลกลมความจ าเพาะตออ พโทป แตกตางกนได ซงท าใหพอลโคลนอลแอนตบอดทเตรยมจากเลอดของ

มนษยหรอสตว มความจ าเพาะตอหลายอพโทป บนโมเลกลของแอนตเจน เมอเปรยบเทยบความจ าเพาะ

และปฏกรยาขาม (cross reaction) ระหวางพอลโคลนอลแอนตบอดและโมโนโคลนอลแอนตบอดแลวจะ

เหนไดวาพอลโคลนอลแอนตบอดมโอกาสทจะเกดปฏกรยาขามไดมากกวา

2.1.6.2.3 ความเหนยวแนนในการจบกบแอนตเจน (Affinity) และอะวดต (Avidity) ของแอนตบอด

affinity และ avidity เปนคณสมบตของแอนตบอดแตละโมเลกลโดย คา affinity

เปนความเหนยวแนนของการจบ (strength of binding) ระหวางอพโทปของแอนตเจน กบแขนขางหนง

ของแอนตบอด (monovalent binding site) สวน avidity เปนความเหนยวแนนของการจบกนระหวาง

แอนตเจนและแอนตบอดทงโมเลกล (overall strength of binding) คณสมบตภายในของแอนตบอดแตละ

โมเลกล ก าหนดโดยลกษณะโครงสรางของสวนทใชจบกบแอนตเจนของโมเลกลอมมโนโกลบลน ซงก

คอสวนของบรเวณแปรผน (variable region) นนเอง affinity เปนคณลกษณะจ าเพาะของแอนตบอดแตละ

19

ชนดและเปนผลของขบวนการทเกดในธรรมชาต โดยในระหวาง พฒนาการของบลมโฟไซต จะมการ

จดเรยงตวใหม (rearrange) ของยนอมมโนโกลบลนในแบบตางๆ ท าใหเกดแอนตบอดทม affinity มาก

นอยตางกนได

ดงนนการผลตชดตรวจวนจฉยมกจะตองการโมโนโคลนอลแอนตบอดทม

affinity สง เพอใหสามารถจบกบแอนตเจนไดอยางเหนยวแนน ดมากนอยเพยงใดกขนอยกบวธการในการ

คดเลอกเซลลตนก าเนดของโมโนโคนอลแอนตบอดนน นอกจากนวธทางพนธวศวกรรม ท าใหสามารถ

เปลยนแปลง affinity ของแอนตบอดนนๆ ได โดยการเปลยนแปลงทระดบยนของอมมโนโกลบลน ท าให

ไดแอนตบอดทม affinity ดขนกวาโมโนโคลนอลแอนตบอดทไดจาก บลมโฟไซต ทสรางแอนตบอดขน

เองตามธรรมชาต สวนพอลโคลนอลแอนตบอดนน avidity และ affinity นเปนผลเฉลยทเปนผลรวมของ

แอนตบอดแตละโมเลกลทประกอบกนขนมาเปนพอลโคลนอลแอนตบอด ซงกมกอยในระดบปานกลางแต

สามารถเพมใหดได โดยดดแปลงขนตอนการกระตนภมคมกนและขนตอนการท าใหพอลโคลนอล

แอนตบอดมความบรสทธมากขน

2.1.6.2.4 หนาทการท างานของแอนตบอด (Effector function)

หนาทและความสามารถในการท างานของแอนตบอด ขนกบโครงสรางโมเลกล

สวน heavy chain constant region วาเปนชนด class หรอ subclass โดย effector function เปนคณสมบต

ทางชวภาพของแอนตบอดแตละชนด ไดแก ความสามารถในการกระตนคอมพลเมนต การจบกบทรบ

ส าหรบสวน Fc ของผวเซลลชนดตางๆ ซงคณสมบตเหลานแตกต างกนไปในแตละ isotype และ subclass

ของอมมโนโกลบลนนนๆ โมโนโคลนอลแอนตบอดแตละตวจะม effector function ซงมลกษณะเฉพาะตว

โดยมสวน heavy chain ชนดใดชนดหนงเทานน สวนพอลโคลนอลแอนตบอด มกจะมความสามารถใน

ดาน effector function ในระดบปานกลางถงดในทกดานเนองจากอาศยคณสมบตของแอนตบอดหลาย ๆ

ชนดมาเฉลยกน

2.1.6.3 เอนไซมและระบบการตรวจวดปฏกรยา (Detection system)

เอนไซมเปนสารส าคญทใชในชดตรวจโดยหลกการวทยาภมคมกน เปนสวนของ

ระบบการตรวจวดปฏกรยา ใชโดยการเชอม (conjugate) หรอตดฉลาก (label) เอนไซมเขากบแอนตเจนหรอ

แอนตบอดทใชเปนตวตรวจวด เอนไซมทนยมใชกนมากในชดตรวจสอบม 2 ชนด คอ Horseradish

Peroxidase (HRP) และ Alkaline Phosphatase (AP) เนองจากมคณสมบตเหมาะสมกบชดตรวจสอบเกอบทก

20

รปแบบ ชดตรวจโดยหลกการวทยาภมคมกนทใชในปจจบน อาศยการท าปฏกรยาจ าเพาะระหวางแอนตเจน

และแอนตบอด ซงสามารถตรวจสอบปฏกรยาทเกดขนโดยอาศยเอนไซมและสบสเตรต ทท าใหเกดการ

เปลยนแปลงไปจนสามารถตรวจวดได เชน เปลย นสหรอสามารถดดกลนแสงในความยาวคลนจ าเพาะได

การเปลยนสหรอคณสมบตของ สบสเตรต นจงเปนตวบงบอกวาเกดการจบกนระหวางแอนตเจนกบ

แอนตบอด โดยระบบน มกจะตรวจวดสทเกดขน (colorimetry)โดยอานคาเปนการดดกลนแสง

(Absorbance หรอ Optical Density, O.D.) ซงเปนระบบการตรวจวดหลกของวธ ELISA นอกจากนอาจ

สามารถเพมความแรงของสญญาณการตรวจวดปฏกรยาท าใหชดตรวจมความไวสงขน โดยอาศยการจบกน

ระหวาง biotin และ streptavidin ซงตดฉลากดวยเอนไซม เนองจากระบบของ biotin-streptavidin มสม

พรรคภาพสงกวาแอนตบอดกบแอนตเจน นยมใชมากในกรณทตองการเพมความแรงของสญญาณให

สามารถตรวจหาสารทมปรมาณต าได

biotin-streptavidin อาศยคณสมบตของ biotin ทสามารถจบกบ streptavidin ได

อยางแนนมาก (Kd = 10-15 M) ซงมากกวา affinity ของแอนตเจนและแอนตบอดโดยเฉลย จงเปน detection

system ทมความไวสง และใชเวลาในการท าปฏกรยา คอนขางสน (รปท 2.7)

biotin เปนสารขนาดโมเลกลเลกทมอยในธรรมชาต ท าหนาทเปน coenzyme

โดยเปนสวนประกอบของเอนไซม carboxylase โครงสรางโมเลกลประกอบดว ย imidazolinone ring เชอม

กบ thiophan ring ทม valerate side chain สามารถเชอมตอกบ biotin conjugate คอนขางงายและไดผลด

สารกลม streptavidin ทใชในการตรวจวนจฉยในปจจบนไดจากการ คด

แปลงโมเลกลจากสารตงตนทมอยในธรรมชาต 2 แหลง คอ avidin และ streptavidin โดย avidin เปนไกลโค

โปรตนจากไขขาว ประกอบดวย tetramer ทแตละหนวยสามารถจบ biotin 1 โมเลกล ท าให avidin 1

โมเลกล สามรถจบกบ 4 โมเลกล biotin สวน streptavidin เปนโปรตนซงมคณสมบตเปนยาปฏชวนะ

(antibiotics) สรางโดยเชอยสต Streptomyces หลายชนด โดยเฉพาะ Streptomyces avidinii มโครงสรางสาม

มตทคลายกบ avidin และสามารถจบกบ biotin ไดดเชนกน แต streptavidin มคา pI ต ากวาและไมม

carbohydrate group ท าใหม non-specific binding นอยกวา avidin ระบบการตรวจทใช biotin-streptavidin ม

ความไวสง เพราะเกดการขยายสญญาณได เนองจาก biotin ม multiple binding site กบโปรตนและ

streptavidin ม multiple lebeling site นอกจากนยงม non-specific binding ต า ท าให background level ต า

21

รปท 2.7 ตวอยางของ biotin-streptavidin system

2.1.6.4 พนผวส าหรบการยดตรง

ชดตรวจโดยหลกการวทยาภมคมกนทใชในปจจบน นยมใชการเคลอบแอนตเจน

หรอแอนตบอดเขากบพนผวในรปแบบของ solid phase กอน เรยกวา การเคลอบ (coating) หรอ การตรง

(mobilization) หลงจากนนจงท าปฏกรยาตามล าดบขนตอน แลวอานผลของปฏกรยานน การใช solid

phase ยดตรงสามารถชวยใหขนตอนการลางเอาสารเกนออกไดด ท าใหลดการเกด background signal ไดด

และอานผลของปฏกรยาไดสะดวกขน ซงรปแบบการใชผวส าหรบยดตรงในชด ELISA มหลายแบบ ทเปน

มาตรฐานในปจจบน คอ จานทดสอบ ELISA ชนด 96 หลม หรอ microtitre plate หรอ 96 well-plate ท า

จากพลาสตกชนด polystyrene เปน พอลเมอรแบบ organic ทม hydrophobic surface สามารถจบกบ

แอนตเจนและแอนตบอดไดดและคอนขางเกาะ เปนเนอเดยวตลอดพนท การเคลอบทไดมความเสถยร เมอ

ท าใน microtitre plate จะมคณสมบตในการโปรงแสงทด ท าใหสามารถใชกบครองอาน

spectrophotometer ไดสะดวก นอกจากรปแบบทเ ปนเพลทแลว อาจใชหลอด (tube) เมด (bead และ

microsphere) หรอใช membrane ชนดตางๆ

2.1.6.5 สบสเตรต (substrate)

การวดปฎกรยาทเกดขนระหวางแอนตเจนและแอนตบอดทมการตดฉลากดวย

เอนไซม จะตองใชสบสเตรต เปนตววดสามารถเลอกใชได ข นอยกบชนดของเอนไซม ซงมหลายวธ เชน

colorimetry, fluorometry และ chemiluminescence แตวธทไดรบความนยมมากทสด คอ วธ colorimetry วธ

นเปนการวดการเปลยนแปลงสของสบสเตรต ทเกดจากเอนไซม แลวท าการอานผลดวยเครองมอทอานคา

การดดกลนแสง electrophotometer หรอ ELISA reader substrate ทท าใหเกดสนเรยกวา chromogenic

22

substrate ซงเดมไมมสแตเมอท าปฏกรยากบเอนไซมท าใหสเขมขน โดยสบสเตรต แตละชนดจะอานผลคา

การดดกลนแสงทความยาวคลนแตกตางกน และการใชสบสเตรตขนอยกบเอนไซมทใชในการตรวจวดดวย

เชน เมอใชเอนไซม horseradish peroxidase สบสเตรตทใช ไดแก ABTS (2, 2’-azino-di-(3-

ethylbenzthiazoline-6-sulfonate)) เปลยนจากไมมสเปนสเขยว อานผลทคาการดดกลนแสง 415 นาโนเมตร ,

TMB (3, 3’, 5, 5’-tetramethylbenzidine) เปลยนจากไมมสเปนสฟา และเมอหยดปฏกรยาดวยกรดจะมส

เหลอง อานผลทคาการดดกลนแสง 450 นาโนเมตร และ OPD (o-phenylenediamine) เปลยนจากไมมสเปน

สมหรอสน าตาล อานผลทคาการดดกลนแสง 492 นาโนเมตร สวนเอนไซม alkaline phosphatase สบสเตรต

ทใช ไดแก PNP (p-nitrophenyl phosphate) อานผลทคาการดดกลนแสง 405 นาโนเมตร , PMP

(Phenolphthalein monophosphate) อานผลทคาการดดกลนแสง 550 นาโนเมตร และ 1NP (1-napthyl

phosphate) อานผลทคาการดดกลนแสง 405 นาโนเมตร

2.1.6.6 การประเมนประสทธภาพของชดตรวจสอบ (performance)

ขอมลส าคญทแสดงถงประสทธภาพของชดตรวจสอบโดยวธทางดานวทยา

ภมคมกน ประกอบดวย 3 สวน คอ

1. ความไว (sensitivity) บงบอกความสามารถทจะตรวจพบสารในปรมาณต าสด

(lower limit of detection, LOD) ทสามารถวดไดดวยชดตรวจสอบนน

2. ความแมนย า (precision) บงบอกความสามารถทจะใหผลเหมอนกนเมอทดสอบ

หลายๆ ครง โดยทวไปจะระบเปน %CV (percent coefficient of variation) และ SD

(standard deviation)

3. ความถกตอง (accuracy) บงบอกความสามารถทจะใหผลใกลเคยงกบคาจรงหรอ

คามาตรฐาน โดยทวไปจะระบเปน %recovery

2.2 เอกสารและงานวจยทเกยวของ

Faraj และ Ali (1981) ไดผลตแอนตบอดตอ TC โดยท าการเชอม TC-HCl เขากบ BSA โดยปฏกรยา Mannich แลวฉดเขากระตาย หลงจากนนน าพอลโคลนอลแอนตบอดทไดมาตรวจวดสาร TC โดยใชวธ radioimmunoassay (RIA) โดยใชตวแขงขนทเปน [3H]TC พบวาสามารถตรวจสอบสาร TC ได โดยมคาขดจ ากดในการวด และคาความเขมขนของสารทท าใหเกดการยบย งลดลง 50 เปอรเซนต (50% of

23

inhibition concentration; IC50) เทากบ 1 และ 7 นาโนกรมตามล าดบ สามารถเกดปฏกรยาขามกบ OTC และ CTC เทากบ 10 และ 39 เปอรเซนต ตามล าดบ น าไปตรวจสอบ TC ในตวอยางพลาสมาและปสสาวะของสนขพบวาม %recovery อยระหวาง 90 ถง 95 เปอรเซนต

Lee และคณะ (2001) ใชชดตรวจสอบ ELISA ในการตรวจสอบสารเตตราไซคลน TC, OTC และ CTC ทตกคางในพลาสมาของสกรทยงมชวตอยเพอท านายสารเหลานทจะตกคางอยในเนอเยอ โดยปรมาณ TC, OTC และ CTC ทตรวจวดไดนอยทสดของชดตรวจสอบน คอ 0.05, 0.01 และ 0.1 ไมโครกรมตอมลลลตรตามล าดบ ท าการให TC ทางปากสกร 100 มลลกรมตอน า 1 ลตรตอวน ฉด OTC เขาทางกลามเนอสกร 10 มลลกรมตอกโลกรมสกรตอวน และให CTC ทางปากสกร 1.1 กรมตอกโลกรมอาหารสตวตอวน เปนเวลา 5 วน ตรวจสอบโดยน าพลาสมาจากทไดจากเลอดสกรมาท า ELISA พบวาไมสามารถตรวจสอบ TC, OTC และ CTC ทตกคางอยในเลอดเมอเลกใหยา 3, 8 และ 4 วนได

Pena และคณะ (2005) ใชเทคนค HPLC ทมเครองตรวจวดแบบฟลออเรสเซนส เพอตรวจสอบสารเตตราไซคลน TC และ OTC ในน าผงโดยสกดสารตวอยางทตกคางดวย Na2-EDTA-Mcllvaline buffer, pH 4.0 และ solid-phase extraction (SPE) ทแตกตางกน mobile phase ทเหมาะสมคอสารละลาย acetonitrile และ oxalate buffer ในอตราสวน 20:80 pH 2 ความเขมขน 10 มลลโมลาร โดยใชคอลมน C18 Nucleocil ทอณหภมหอง ปรมาณ TC และ OTC ทต าทสดทสามารถตรวจวดไดคอ 0.050 และ 0.049 ไมโครกรมตอมลลลตร ตามล าดบ

Koesukwiwat และคณะ (2007) ไดใชเทคนค LC-MS ส าหรบตรวจสอบการตกคางของสารเตตราไซคลน TC, OTC และ CTC ในน านมโค พบวาปรมาณสารท ต าทสดทสามารถตรวจวดได คอ 0.67, 0.65 และ 2.64 นาโนกรมตอมลลลตร ตามล าดบ และสามารถตรวจสอบแบบปรมาณวเคราะหไดนอยทสดท 0.95, 1.03 และ 8.64 นาโนกรมตอมลลลตร

Pastor-Navarro และคณะ (2007) ไดพฒนาการใชเทคนค ELISA ในการตรวจสอบ TC ในน าผ งโดยใชพอลโคลนอลแอนตบอดทไดจากการกระตนภมคมกนของกระตายดวยสารในกลม TCs ทถกท าใหเปนสารอนพนธของ carboxamido และ diazo กอนจะเชอมตอกบโปรตนพาหะ เมอน าพอลโคลนอลแอนตบอดทไดมาพฒนาเปนชดตรวจสอบโดยวธ indirect competitive ELISA พบวามคาขดจ ากดในการวดทต าทสดถง 0.4 นาโนกรมตอมลลลตร (ng/ml) เกดการท าปฏกรยาขามกบสารในกลม TCs คอ RTC, OTC, MC และ CTC ถง 91, 30, 14 และ 10 เปอรเซนตตามล าดบ และสามารถใชในน าผงตวอยางได %recovery อยระหวาง 79 ถง 108 เปอรเซนต

Zhang และคณะ (2007) ไดพฒนาการใชเทคนค ELISA ในการตรวจสอบ TC ในน านมโดยใชพอลโคลนอลแอนตบอดทไดจากการกระตนภมคมกนของกระตายดวย TC ทใชวธในการเชอมตอกบโปรตนพาหะทแตกตางกน 3 วธ เมอน าพอลโคลนอลแอนตบอดทไดมาพฒนาเปนชดตรวจส อบโดยวธ indirect competitive ELISA พบวาม IC50 เทากบ 3.93 ไมโครกรมตอมลลลตร (ug/ml) เกดการท าปฏกรยา

24

ขามกบสารในกลม TCs คอ CTC ถง 112 เปอรเซนต และ OTC นอยกวา 2 เปอรเซนต และสามารถน าไปตรวจในน านมตวอยางได %recovery อยระหวาง 74 ถง 116 เปอรเซนต

Jeon และ Paeng (2008) ไดใชพอลโคลนอลแอนตบอดตอ TC จากแกะ ในการตรวจหาปรมาณ TC

ในน าผง โดยวธ biotin-avidin mediated ELISA ใช PBS-EDTA buffer pH 7.2 เปนสารละลายสกดและไม

ตองเตรยมตวอยางกอนการทดสอบ (no additional pre-treatment) พบวา ปรมาณสารทต าทสดทสามารถ

ตรวจวดไดคอ 0.19 นาโนกรมตอมลลลตร และชวงความเขมขนทสามารถตรวจได (dynamic range) เทากบ

1.52 -152 นาโนกรมตอมลลลตร และไมเกดปฏกรยาขามกบในในกลม TCs เมอน าไปตรวจในตวอยาง

น าผงได %recovery อยระหวาง 95% ถง 101%

และปเดยวกน Jeon และคณะไดพฒนาวธการการตรวจหาปรมาณ TC ในน านม โดย วธ biotin-avidin

mediated ELISA และใชพอลโคลนอลแอนตบอดตอ TC จากแกะ ใช PBS-EDTA buffer pH 7.2 เปน

สารละลายสกด พบวาปรมาณสารทต า ทสดทสามารถตรวจวดไดคอ 0.048 นาโนกรมตอมลลลตร และชวง

ความเขมขนทสามารถตรวจได (dynamic range) เทากบ 0.316-316 นาโนกรมตอมลลลตร เกดปฏกรยาขาม

กบ CTC, OTC, และ DC เทากบ 13.7%, 10% และนอยกวา 1% ตามล าดบ สามารถน าไปตรวจ TC ในน านม

ได % recovery ประมาณ 90%

Zhoa และคณะ (2008) ไดผลตพอลโคลนอลแอนตบอดตอคลอเตตราไซคลน (Chlortetracycline:

CTC) และพฒนาวธ ELISA เพอวเคราะหหา CTC เนอสตวส าหรบการบรโภค พบวา ไดชวงความเขมขนท

สามารถตรวจวดได 0.1-312.5 ug/kg และใหคา IC50 เทากบ 15+6.0 ug/kg เมอเปรยบเทยบกบวธ HPLC

และ commercial kit พบวา วธ ELISA ทพฒนามประสทธภาพเทยบเทา

Adrian และคณะ (2012) รายงานการผลตพอลโคลนอลแอนตบอดตอ doxycycline เปนครงแรก และ

ไดท าการพฒนาวธ indirect competive ELISA ในการตรวจหา doxycycline ในตวอยางน านม ไดต าถง 5

ug/l

Gao และคณะ (2013) ไดผลตโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ doxycycline และพฒนาวธ indirect

competitive ELISA ส าหรบวเคราะหหายาปฏชวนะกลม TC 7 ชนด ในตวอยางเนอและนมวว พบวา ม

ปฏกรยาขามในกลม TC อยในชวง 47%-102% ปรมาณต าสดทตรวจวดได อยในชวง 1.5-6.9 ng/ml

% recovery อยในชวง 75.3%-106.8% คาความแปรปรวนต ากวา 10.9% ดงนนวธการทพฒนาขนนสามารถ

ใชตดตามการตกคางของยาปฏชวนะกลม TC ในตวอยางเนอและนมววได

25

บทท 3

วธการด าเนนการวจย

3.1 เซลลทใชในงานวจย

เซลลไฮบรโดมาผลตโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ TC รหส 12-3F ทพฒนาจากหนวยปฏบตการ

วจยการผลตแอนตบอด สถาบนเทคโนโลยชวภาพและวศวกรรมพนธศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย

3 .2 เครองมอและอปกรณทใชในงานวจย

ตารางท 3.1 เครองมอและอปกรณทใชในงานวจย

เครองมอและวสดอปกรณ แหลงทมา

1. เครองมอ

- กลองจลทรรศนชนดหวกลบ Nikon Corporation, Japan

- เครองก าเนดเสยงความถสง D.S.C. group Co., Ltd, Taiwan

- เครองกวนแมเหลก Corning, USA

- เครองชงหยาบและละเอยด Mettler Toledo Co., Ltd, Switzerland

- เครองผสมดวยแรงหมน Scientific Industries, Inc, USA

- เครองวดคาการดดกลนแสง BIO-TEK® Instruments, Inc, USA

- เครองวดความเปนกรดเบส Mettler Toledo Co., Ltd, Switzerland

- เครองปนเหวยงชนดตงโตะ

- เครองอานปฏกรยาบนไมโครเพลท

M.S.E. Ltd, England

Titertek multiskan, Finland

26

ตารางท 3.1 เครองมอและอปกรณทใชในงานวจย

เครองมอและวสดอปกรณ แหลงทมา

- ชดเพาะเลยงเซลลพรอมเครองกวน ขนาด 1 ลตร Techne, USA

- ชดอเลกโทรฟอเรซส Bio-Rad, USA

- ถงแชแขงเซลลไนโตรเจนเหลว Tayloy-Wharton, USA

- ตบมบรรยากาศคารบอนไดออกไซด Yamato Scientific Co., Ltd, Japan

- ตปลอดเชอ Scientific Supply Co., Ltd, Thailand

- ตเยน Toshiba, Thailand

- ปมสญญากาศ Iwaki, Japan

- ตแชแขง (-20 องศาเซลเซยส) Sanyo, Thailand

- ตแชแขง (-70 องศาเซลเซยส) Sanyo, Japan

- อางน าควบคมอณหภม Memmert, Germany

2. อปกรณตางๆ

- กระบอกฉดยาขนาด 1 และ 5 มลลลตร

- ขวดแกว

- ขวดเลยงเซลลขนาด 10 และ 250 มลลลตร

- เขมฉดยาขนาด 18G และ 21G

- จานทดสอบ ELISA ชนด 96 หลม

- ทป ขนาด 10, 200, 300, 1000 ไมโครลตร

- ปเปตตแกว ขนาด 10 มลลลตร

Nipro, Thailand

Boro, Germany

Nunc, Denmark

Nipro, Thailand

Costar, USA

Axygen, USA

HBG, Germany

27

- ปเปตตอตโนมต

- ปเปตตมลตชาเนล

ขนาด 300 ไมโครลตร

- หลอดทดลองขนาด 1.5 มลลลตร

- หลอดทดลองขนาด 15 และ 50 มลลลตร

- หลอดส าหรบแชแขงเซลล

Discovery, Poland

Discovery, Poland

Axygen, USA

CLP, USA

Corning Incoporated, Mexico

3.3 สารเคมทใชในงานวจย

ตารางท 3.2 สารเคมทใชในงานวจย

สารเคมทใชในการวจย ลกษณะการใชงาน แหลงทมา

Acetonitrile เฟสเคลอนทใน HPLC Sigma-Aldrich, USA

Acrylamide gel เตรยมเจลในเทคนค SDS PAGE Sigma-Aldrich, USA

Aminohexanoyl-biotin-N- hydroxy succinimide

เชอมตอTC กบแอนตบอด Zymed, USA

Ammoniumpersulfate (APS) เตรยมเจลในเทคนค SDS PAGE Sigma-Aldrich, USA

BCA protein assay kit วเคราะหปรมาณโปรตน Sigma-Aldrich, USA

Bromophenol blue เตรยมตวอยาง SDS-PAGE Sigma-Aldrich, USA

Citric acid เตรยมสารละลายบฟเฟอร Merck, Germany

Clenbuterol ทดสอบปฏกรยาขาม Sigma-Aldrich, USA

Chloramphenicol (CAP) ทดสอบปฏกรยาขาม Sigma-Aldrich, USA

Chlortetracycline hydrochloride (CTC) ทดสอบปฏกรยาขาม Fluka, China

28

ตารางท 3.2 สารเคมทใชในงานวจย

สารเคมทใชในการวจย ลกษณะการใชงาน แหลงทมา

Doxycycline (DC) ทดสอบปฏกรยาขาม Sigma-Aldrich, USA

Ethanol ตวท าละลาย BDH, England

Fetal calf serum (FCS) เตรยมอาหารเลยงเซลล PAA, Austria

Furazolidone (FZD) ทดสอบปฏกรยาขาม Sigma-Aldrich, USA

Hydrogen peroxide เตรยมสบสเตรต Fluka, Switzerland

Hydrochloric acid ใชปรบคากรด-เบส Sigma-Aldrich, USA

L-Glutamine สวนประกอบของ อาหารเลยงเซลล Sigma-Aldrich, USA

Sodium carbonate (Na2CO3) เตรยมอาหารเลยงเซลล Merck, Germany

Sodium chloride (NaCl) เตรยมสารละลายบฟเฟอร Merck, Germany

Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4) เตรยมสารละลายบฟเฟอร Carlo erba, USA

Sodium dodecyl sulphate (SDS) เตรยมเจลในเทคนค

SDS-PAGE Sigma-Aldrich, USA

Coomassie brilliant blue R-250 ยอมเจล SDS-PAGE Pierce, USA

Dimethyl sulfoxide ละลายสบสเตรท TMB Fluka, Switzerland

Disodium hydrogenphosphate สวนประกอบของ

สารละลายบฟเฟอร Carloerba, USA

29

ตารางท 3.2 สารเคมทใชในงานวจย

สารเคมทใชในการวจย ลกษณะการใชงาน แหลงทมา

Sulfuric acid (H2SO4) หยดปฏกรยาของเอนไซม Merck, Germany

RPMI 1640

อาหารเลยงเซลล ไฮบรโดมา

Biochrome , Germany

Tetracycline hydrochloride (TC) ทดสอบปฏกรยาขาม Sigma-Aldrich, USA

3, 3’, 5, 5’- tetramethylbenzidine (TMB) สารท าใหเกดสของปฏกรยา

Sigma-Aldrich, USA

N, N, N, N-Tetramethyl-Ethylenediamine

(TEMED)

เตรยมเจลในเทคนค

SDS-PAGE Pierce, USA

Thimerosal สารปองกนการปนเปอน Sigma-Aldrich, USA

Tris (hydroxymethyl) aminomethane

(Trisma base) เตรยมสารละลายบฟเฟอร Sigma-Aldrich, USA

Tween 20 สารลดแรงตงผว

ส าหรบลางจานหลม

Riedel-de Haën, UK

Sigma-Aldrich, USA

30

3.4 ขนตอนการด าเนนงานวจย 3.4.1 การเพมจ านวนเซลลเลยงเซลลไฮบรโดมาทผลตแอนตบอดตอ TC น าเซลลไฮบร โดมาทผลตแอนตบอดตอ TC รหสโคลน 12-3F ทเกบไวทไนโตรเจนเหลว

ออกมาละลายอยางรวดเรวทอณหภม 37 oC และถายลงในอาหารเลยงเซลลไฮบรโดมา RPMI 1640

ปรมาตร 10 มลลลตร ปนเหวยงท 1500 รอบตอวนาท เปนเวลา 5 นาท เกบสวนเซลลไปเลยงตอในอาหาร

เลยงเซลล RPMI 1640 ทม 10% FCS ในตเลยงเซลลทมคารบอนไดออกไซด 5% และควบคมความชน เมอ

เซลลโฮบรโดมามจ านวนมากพอ ยายลงในขวดเลย งเซลลขนาด 1 ลตร ทมอาหารอาหารเลยงเซลล RPMI

1640 ทม 10% FCS ปนกวนดวยความเรว 20 รอบตอนาท เลยงเซลลไฮบรมาตอไปจนอาหารเลยงเซลล

เปลยนเปนสเหลอง

ท าการเกบอาหารเลยงเซลลซงมโมโนโคลนอลแอนตบอดอย โดยการปนเหวยงทท 1500 รอบ

ตอวนาท เปนเวลา 5 นาท เกบสวนของอาหารเลยงเซลลทมแอนตบอด เพอน าไปท าใหแอนตบอดบรสทธ

ตอไป

3.4.2 การท าโมโนโคลนอลแอนตบอดใหบรสทธ

น าอาหารเลยงเซลลทไดจากการเลยงเซลลไฮบรโดมา มาท าการแยกแอนตบอดใหบรสทธดวยวธ

affinity chromatography โดยการผานคอลมน protein G sepharose ปรบ pH คอลมนดวยโซเดยมฟอสเฟต

บฟเฟอร pH 7.0 ความเขมขน 20 มลลโมลาร ปรมาตร 5 เทาของคอลมน ปรบใหโปรตนจเขาสภาวะสมดล

โดยปรบใหมอตราการไหลเทากบ 1 มลลลตรตอนาท และเตมอาหารเลยงเซลลลงในคอลมน จากนนแยก

สวนทไมจบกบคอลมนออกดวย โซเดยมฟอสเฟตบฟเฟอร pH 7.0 ความเขมขน 20 มลลโมลาร จากนนชะ

สวนทจบคอลมนออกดวย ไกลซนไฮโดรคลอไรดบฟเฟอร (glycine-HCl) pH 2.7 ความเขมขน 0.1 M

จากนนเกบสารละลายทออกมาจากคอลมนใสในหลอดทมทรสไฮโดรคลอไรด (Tris- HCl) pH 9.0 ความ

เขมขน 1 โมลาร ปรมาตร 65 ไมโครลตร เพอปรบใหคาความเปนกรดเบสใหเปนกลาง โดยใหแตละหลอดม

ปรมาตรสดทายเปน 1 มลลลตร แลวน าสารละลายในหลอดทดลองทมแอนตบอดมารวมกน และน ามาท า

dialysis ดวย PBS เปนเวลา 3 วน ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส โดยเปลยนบฟเฟอรวนละ 2 ครง

31

3.4.3 การหาปรมาณแอนตบอด

การหาปรมาณแอนตบอดโดยการวดคาการดดกลนแสงโดยน าแอนตบอด ทผานการไดอะไลซส

แลวไปวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 280 นาโนเมตร ค านวณหาปรมาณแอนตบอดจากสตร

ความเขมขนของแอนตบอด (IgG) (มลลกรมตอมลลลตร) = คาการดดกลนแสงท 280 นาโนเมตร

extinction coefficient ของ IgG

หมายเหต คา extinction coefficient ของสารละลาย IgG 1 มลลกรมตอมลลลตร ทความยาวคลน 280 นาโน

เมตร มคา 1.35 และวดปรมาณโปรตนดวยวธ BCA โดยใช BSA เปนสารมาตรฐาน (Johnstone and

Thrope, 1987)

3.4.4 การเตรยมสารเชอมตอระหวางเตตราไซคนกบ OVA

3.4.4.1 การเชอมตอ TC กบ OVA (TC-OVA)โดยใชปฏกรยา Mannich (Hermanson, 2008)

ท าการเชอมตอ TC กบ OVA โดยเรมจากการน า OVA ความเขมขน 10 มลลกรมตอ

มลลลตร ทละลายอยในสารละลาย 0.1 M MES, pH 4.7 ทม 0.15 M sodium chloride ปรมาตร 1 มลลลตร

ผสมกบสารละลาย TC ทละลายในน ากลนความเขมขน 10 มลลกรมตอมลลลตร ปรมาตร 1 มลลลตร เตม

37 % formaldehyde (v/v) ปรมาตร 250 ไมโครลตร บมทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมงในทมด จากนน

น าไปท าไดอะไลซสดวย PBS เปนเวลา 3 วน ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส โดยเปลยน PBS วนละ 2 ครง

ทกๆ 6 ชวโมง จากนนน ามาวดปรมาณโปรตนดวยวธ BCA

3.4.4.2 การหาอตราสวนโมเลกลการเชอมตดของ TC-OVA โดยวธ MALDI- TOF MS ค านวณหาอตราสวนการเชอมตด ของ TC กบ OVA โดยค านวณจากมวลโมเลกลของ

โปรตนทเปลยนไปโดยวธ Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass

Spectrometry (MALDI-TOF-MS) โดยสงตวอยางวเคราะหทหนวยบรการชวภาพ ศนยพนธวศวกรรมและ

เทคโนโลยชวภาพแหงชาต (BIOTEC) เพอหามวลโมเลกลของสาร

มวลโมเลกลของTC

จ านวนโมเลกลของ TC ทเชอมตด = (มวลโมเลกล TC-OVA) – (มวลโมเลกลของ OVA)

32

3.4.4.3 การวดปรมาณโปรตนของ TC-OVA ท าการหาวเคราะหปรมาณโปรตนของ OVA ทเชอมตอกบ TC โดยใชชดทดสอบ

BCATM protein assay kit (PIERCE) โดยเรมจากเตรยม working reagent ดวยการผสมรเอเจนต A กบรเอ

เจนต B ในอตราสวน 50: 1 จากนนเตรยมสารมาตรฐาน OVA ทความเขมขน 0-1000 ไมโครกรมตอ

มลลลตร และสารตวอยาง (TC- OVA) โดยท าการเจอจางดวย PBS ทความเจอจาง 10 และ 20 เทา แลวเตม

สารมาตรฐานและสารตวอยางแตละความเขมขนลงในจาน ELISA ชนด 96 หลม หลมละ 25 ไมโครลตร

เตม working reagent ลงไปในหลมทมสารมาตรฐานและสารตวอยาง หลมละ 200 ไมโครลตร เขยาจาน

ELISA ชนด 96 หลมเบาๆ ประมาณ 30 วนาท กอนน าไปเขาตบม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท

จากนนน าจาน ELISA ชนด 96 หลมออกมาวางไ วใหเยนลงทอณหภมหอง แลวน าไปวดคาดดกลนแสงท

ความยาวคลน 562 นาโนเมตร ดวยเครอง spectrophotometer

3.4.5 การทดสอบความสามารถของแอนตบอดหลงการท าใหบรสทธตอ TC ในรปอสระ

เตรยมสารTCทความเขมขน ตงแต 0 – 1,000 นาโนกรมตอมลลลตร มาท าการทดสอบดวย

วธ indirect competitive ELISA (ตามขอ 3.4.7.2) โดยท าการเตม TC ทความเขมขน ตงแต 0 - 1000 นาโน

กรมตอมลลลตร และแอนตบอดทผานการท าใหบรสทธ

3.4.6 การทดสอบความบรสทธและการหามวลโมเลกลของแอนตบอดหลงจากท าใหบรสทธ

ดวยเทคนค SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate -Polyacrylamide Gel

Electrophoresis)

3.4.6.1 การเตรยมพอลอะครลาไมดเจลชนดแผน

เตรยม 15% separating gel ทมความกวางไมต ากวา 5 เซนตเมตร ยาว 8 เซนตเมตร

และหนา 0.2 เซนตเมตร ปรบผวหนาเจลใหเรยบโดยเตมน ากลน ตงทงไว 30 นาท เพอใหเจลแขงตว

หลงจากนนเตรยม 5% stacking gel ทดานบนของ separating gel และใสหวเพอเปนแมพมพของหลมเจล ตง

ทงไวเพอใหเจลแขงตว 30 นาท

33

3.4.6.2 การเตรยมสารละลายตวอยาง

เตรยมสารละลายตวอยางใหมปรมาณโปรตน 5 ไมโครกรมตอ 20 ไมโครลตร ผสม

กบสารละลายสยอมทม SDS, ß-mercaptoethanol และ bromophenol blue (SDS staining dye) ในอตราสวน

1: 1 น าไปตมทอณหภม 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท ตงทงไวใหเยนทอณหภมหองกอนน าไปปเปต

ในหลมเจล

3.4.6.3 การท า electrophoresis

ท าการแยกแอนตบอดโดยน าเจลทเตรยมไวไปประกอบเขากบ electrophoresis

chamber ทม SDS ในสารละลายบฟเฟอรไกลซนไฮโดรคลอไรด (Tris-glycine-HCL) (running buffer) ทง

สวนบนและสวนลางของเครอง น าสารละลายตวอยางมาปเปตในหลมเจลไมเกนหลมละ 20 ไมโครลตร

สวนหลมของโปรตนมาตรฐาน ใหปเปตปรมาตร 2 ไมโครลตร ตอขวไฟฟาทมความตางศกย 100 โวลต

เปนเวลา 120 นาท จนแถบสของสยอมเคลอนไปจนถงปลายเจลจงหยดใหกระแสไฟฟาน าเจลทไดไปยอมส

ดวย coomassie blue (staining solution) ขามคนและลางในสารละลายของเอทานอลและกรดอะซตก

(destaining solution) จนกวาเจลจะใสและเหนแถบสของโปรตนชดเจน

3.4.7 การเตรยมชดตรวจสอบ ELISA

ท าการออกแบบชดตรวจสอบทงหมด แบบ คอ

A : การเตรยมชดตรวจสอบแบบ direct competitive ELISA

B : การเตรยมชดตรวจสอบแบบ indirect competitive ELISA

C : การเตรยมชดตรวจสอบแบบ Biotin-indirect competitive ELISA

3.4.7.1 การเตรยมชดตรวจสอบแบบ direct competitive ELISA

ชดตรวจสอบแบบ direct competitive ELISA เตรยมโดยเรม จากการเคลอบ

แอนตบอดตอ TC ในจาน ELISA ชนด 96 หลม หลมละ 100 ไมโครลตร บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

เปนเวลา 12-16 ชวโมง จากนนลางดวย PBS ทม 0.05% Tween-20 จ านวน 3 ครง เตมสารละลายนมพรอง

34

มนเนย 5% หลมละ 300 ไมโครลตร บมทอณหภมหอง เป นเวลา 30 นาท จากนนลางดวย PBS ทม 0.05%

Tween-20 จ านวน 3 ครง เตมTC ในรปอสระทความเขมขนตางๆใน PBS หลมละ 50 ไมโครลตร ลงไป

พรอมกบTCทเชอมตอกบ HRP หลมละ 50 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภมหอง บนเครองเขยา เปนเวลา 2

ชวโมง จากนนน ามาลางดวย PBS ทม 0.05% Tween-20 จ านวน 3 ครง เตมสารละลายสบสเตรทของ

เอนไซม ซงประกอบดวย TMB และ H2O2 ละลายใน 205 mM potassium citrate buffer pH, 4.0 หลมละ

100 ไมโครลตร บมในทมด ทอณหภมหอง เปนเวลา 20 นาท แลวหยดปฏก รยาเอนไซมดวยการเตม 1 M

H2SO4 หลมละ 100 ไมโครลตร จากนนน าไปวดคาดดกลนแสง 450 นาโนเมตร โดยเครอง ELISA

microplate reader

3.4.7.1.1 การเชอม TC กบฮอรสราดชเพอรออกซเดส (TC-HRP) (Hermanson, 2008)

การเชอมตอ TCเ ขากบ HRP โดยเรมจากการน า HRP ความเขมขน 10 มลลกรม

ตอมลลลตร ทละลายอยในสารละลาย MES, pH 4.7 ความเขมขน 0.1 โมลาร ทมโซเดยมคลอไรดเขมขน

0.15 โมลาร ปรมาตร 1 มลลลตร ผสมกบสารละลาย TC ทละลายในน ากลนความเขมขน 10 มลลกรมตอ

มลลลตร ปรมาตร 1 มลลลตร เตมฟอรมลดไฮด (formaldehyde) ความเขมขน 37 % (v/v) ปรมาตร 250

ไมโครลตร บมทอณหภมหองเปนเวลา 24 ชวโมงในทมด จากนนน าไปไดอะไลซดวย PBS เปนเวลา 3 วน

ทอณหภม 4 องศาเซลเซยส โดยเปลยน PBS วนละ 2 ครง จากนนน ามาวดปรมาณโปรตนดวยวธ BCA

3.4.7.1.2 การหาอตราสวนทเหมาะสมของแอนตบอดกบ TC-HRP

เรมจากการเคลอบพนผวในแตละหลมของจาน ELISA ชนด 96 หลม ดวยการแปรความ

เขมขนของแอนตบอดท 0.5, 1, 2.5 และ 5 ไมโครกรมตอมลลลตร และ TC- HRP ทความเขมขน 0.5, 1, 2,

5, 10 และ 20 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยใช PBS แทน TC ในรปอสระ แลวท าการทดลองดวยวธ direct

competitive ELISA และทดสอบหาความไวของชดตรวจสอบตอไป

3.4.7.2 การเตรยมชดตรวจสอบแบบ indirect competitive ELISA

ชดตรวจสอบแบบ indirect competitive ELISA เตรยมโดยเรมจากเคลอบพนผวของ

จาน ELISA ชนด 96 หลม ดวย TC -OVA หลมละ 100 ไมโครลตร แลวบมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปน

เวลา 12-16 ชวโมง น าแตละหลมมาลางดวย PBST 3 ครง เตมสารละลายนมพรองมนเนย 5% หลมละ 300

ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง ลางหลมดวย PBST 3 ครง เตมTCในรป

35

อสระทความเขมขนตางๆ ลงไป 50 ไมโครลตร และแอนตบอด หลมละ 50 ไมโครลตร น าไปบมท

อณหภมหอง บนเครองเขยา นาน 2 ชวโมง ลางแตละหลมดวย PBST 3 ครง เตมแอนตบอดทตยภมทจ าเพาะ

ตอแอนตบอดของหน เชอมอยกบ HRP (Goat anti-mouse-HPR ทเจอจาง 1: 10,000 ใน PBS หลมละ

100 ไมโครลตร แลวน าไปบมทอณหภมหอง บนเครองเขยา 1 ชวโมง ลางห ลมดวย PBST 3 ครง เตม

สารละลายสบสเตรตของเอนไซม ประกอบดวย TMB และ H2O2 ละลายทใน 205 mM potassium citrate

buffer, pH 4.0 หลมละ 100 ไมโครลตร บมในทมดอณหภมหอง เปนเวลา 15 นาท เตม 1 M H2SO4 หลมละ

100 ไมโครลตร เพอหยดปฏกรยาเอนไซม แลวน าไปวดคาดดกลนแสง 450 นาโนเมตร ดวยเครอง ELISA

microplate reader

3.4.7.2.1 การหาอตราสวนทเหมาะสมของ TC-OVA และแอนตบอด

หาอตราสวนทเหมาะสมของแอนตบอดกบ TC- OVA โดยการแปรความเขมขน

ของแอนตบอด 0.005-1.0 ไมโครกรมตอมลลลตร กบ TC- OVA 0.1- 2.5 ไมโครกรมตอมลลลตร โดยใช

PBS แทน TC ในรปอสระ แลวน ามาทดสอบดวยวธ Indirect competive ELISA และทดสอบหาความไวของ

ชดตรวจสอบตอไป

3.4.7.3 การเตรยมชดตรวจสอบแบบ Biotin-indirect competitive ELISA

ท าการเคลอบ TC- OVA บนพนผวในของจาน ELISA ชนด 96 หลมละ 100 ไมโครลตร

บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12-16 ชวโมง แลวลางดวย PBST 3 ครง เตมสารละลายนมพรอง

มนเนย 5% หลมละ 300 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภมหอง เปนเวลา 30 นาท ลางแตละหลมดวย PBST 3

ครง เตม TC ในรปอสระเจอจางทความเขมขนตางๆ ลงไป หลมละ 50 ไมโครลตร พรอมกบแอนตบอดท

เชอมตอกบไบโอตน จากขอ 3.4.7.3.1 หลมละ 50 ไมโครลตร แลวน าไปบมทอณหภมหอง บนเครองเขยา

นาน 2 ชวโมง จากนนลางแตละหลมดวย PBST 3 ครง เตม streptavidin-HRP ซงจ าเพาะตอไบโอตนทความ

เขมขน 1: 4,000 หลมละ 100 ไมโครลตร แลวน าไปบมทอณหภมหอง บนเครองเขยา เปนเวลา 30 นาท ลาง

แตละหลมดวย PBST 3 ครง จากนนน ามาเตมสารละลายสบสเตรตของเอนไซม ประกอบดวย TMB และ

H2O2 ละลายใน 205 mM potassium citrate buffer, pH 4.0 หลมละ 100 ไมโครลตร บมในทมด อณหภมหอง

เปนเวลา 15 นาท เตม 1 M H2SO4 หลมละ 100 ไมโครลตร เพอหยดปฏกรยาเอนไซม แลวท าการวดคา

ดดกลนแสง 450 นาโนเมตร ดวยเครอง ELISA microplate reader

36

3.4.7.3.1 การเชอมตอระหวางแอนตบอดกบไบโอตน (Ab-biotin)

การเชอมตอ Ab-Biotin เรมจากน าแอนตบอด 1.5 มลลกรมไปท าไดอะไลซสใน

0.1 M carbonate buffer, pH 8.4 ขามคน แลวท าการเตมไบโอตน 100 ไมโครกรมตอมลลลตร ทละลายใน

DMSO กวนเบาเปนเวลา 4 ชวโมงทอณหภมหอง จากนนน าไปท าไดอะไลซสดวย PBS เปนเวลา 3 วน ท

อณหภม 4 องศาเซลเซยส โดยเปลยน PBS วนละ 2 ครง ทกๆ 6 ชวโมง จากนนน ามาวดปรมาณโปรตนดวย

วธ BCA

3.4.7.3.2 การหาอตราสวนทเหมาะสมของ TC- OVA กบ Ab-biotin

หาอตราสวนทเหมาะสมระหวาง TC- OVA กบAb-biotin โดยการแปรความเขมขนของ

TC ทเชอมตอกบ OVA 0.1- 5 ไมโครกรมตอมลลลตร และแอนตบอดทเชอมตอกบไบโอตน 0.01-5

ไมโครกรมตอมลลลตร แลวน ามาทดสอบดวยวธ biotin-indirect competitive ELISA และทดสอบหาความ

ไวของชดตรวจสอบตอไป

3.4.8 การสรางกราฟมาตรฐาน

ท าการเคลอบ TC- OVA ความเขมขน 0.125 ไมโครกรมตอมลลลตร บนพนผวในของจาน

ELISA ชนด 96 หลมๆ ละ 100 ไมโครลตร บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 12-16 ชวโมง แลวลาง

ดวย PBST 3 ครง เตมสารละลายนมพรองมนเนย 5% หลมละ 300 ไมโครลตร น าไปบมทอณหภมหองเปน

เวลา 30 นาท ลางแตละหลมดวย PBST 3 ครง เตมTCในรปอสระเจอจางทความเขมขนเทากบ 0, 0.1, 0.25,

0.5, 1, 2.5, 5, 10, 20 และ 40 นาโนกรมตอมลลลตร ลงไปพรอมก บ Ab-biotin ความเขมขน 0.25

ไมโครกรมตอมลลลตรหลมละ 100 ไมโครลตร บมทอณหภมหองเปนเวลา 2 ชวโมง บนเครองเขยา จากนน

ลางแตละหลมดวย PBST 3 ครง เตม streptavidin-HRP ซงจ าเพาะตอไบโอตนทความเขมขน 1: 4,000 หลม

ละ 100 ไมโครลตร บมทอณหภมหองเปนเวลา 30 นาท บนเครองเขยา ลางแตละหลมดวย PBST 3 ครง

จากนนน ามาเตมสารละลายสบสเตรตของเอนไซม ประกอบดวย TMB และ H2O2 ละลายใน 205 mM

potassium citrate buffer pH 4.0 หลมละ 100 ไมโครลตร บมในทมดอณหภมหอง เปนเวลา 15 นาท เตม 1

M H2SO4 หลมละ 100 ไมโครลตร เพอหยดปฏกรยาเอนไซม แลวท าการวดคาดดกลนแสงท 450 นาโน

เมตร ดวยเครอง ELISA microplate reader

37

3.4.9 การเตรยมตวอยาง

การเตรยมตวอยางน า ผงเพอน ามาทดสอบในชดตรวจสอบตนแบบท าโดยชงน าผงปรมาณ 1

กรม ลงในหลอดทดลอง ขนาด 15 มลลลตร จ านวน 10 หลอด แลวเตม TC ใหไดความเขมขนสดทายเทากบ

0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 และ 200 นาโนกรมตอมลลลตร ตามล าดบ มาเจอจางดวย PBST ปรมาณ 9

มลลลตร เขยาใหเขากน จากนนน าไปตรวจสอบกบชดตรวจสอบตนแบบ Biotin-indirect competitive

ELISA เปรยบเทยบความเขมขนของ TC ทไดกบกราฟมาตรฐานฟ

3.4.10 การประเมนประสทธภาพของชดตรวจสอบตนแบบ

3.4.10.1 การหาคาความไว (sensitivity)

น าอตราสวนระหวางแอนตเจนกบแอนตบอดทได จากชดตรวจสอบทง 3 แบบ มา

ทดสอบกบ TCใ นรปอสระตงแต 0-1,000 ng/ml น าคาการดดกลนแสงทไดจากผล ELISA มาค านวณหาคา

IC50 ดวยโปรแกรมส าเรจรป GraphPad Prism 4.03 และค านวณเปนคา LOD และ LOQ โดยคา IC50 หาได

จาก 50% B/B0 คอ

IC50 : 50% B/B0

เมอ B คอ คาการดดกลนแสงจาก ELISA ทม TC ทความเขมขนตางๆ

B0 คอ คาการดดกลนแสงจาก ELISA ทไมม TC

หาคา LOD และ LOQ (Limit of Quantitation) จากการน าคาเฉลยของการดดกลนแสง

ท 450 นาโนเมตร (n = 9) ทไมมเตตราไซคลน (B0) มาลบออกจาก 3 และ 10 เทาของคาเบยงเบนมาตรฐาน

ของ B0 ตามล าดบ โดยน าคาความเขมขนของ TC มาเขยนกราฟโดยใหแกน X เปนคาลอการทมของความ

เขมขนของ TC และแกน Y เปนคา % B/B0

LOD : B0 - 3SD

LOQ : B0 - 10SD

38

โดยท B0 คอ คาการดดกลนแสงท 450 นาโนเมตร โดยทไมม TC

SD คอ คาเบยงเบนมาตรฐานของ B0

LOD คอ ปรมาณต าสดทสามารถวดได

LOQ คอ ปรมาณต าสดทสามารถวดไดอยางถกตอง

3.4.10.2 การทดสอบปฏกรยาขาม (cross reactivity)

ทดสอบการเกดปฏกรยาขามกบสารในกลม TC และนอกกลม TC ของชดตรวจสอบ

ตนแบบ ดวยวธ Biotin-indirect competitive ELISA โดยสารในกลม เตตราไซคลนทน ามาทดสอบ ไดแก

เตตราไซคลนไฮโดรคลอไรด (TC-HCl), คลอเตตราไซคลน ไฮโดรคลอไรด (CTC-HCl), โรลเตตราไซคลน

(RTC), ออกซเตตราไซคลนไฮโดรคลอไรด (OTC-HCl) และดอกซเตตราไซคลน (DC) สวนยา

ปฏชวนะนอกกลมเตตราไซคลนไดแก เพนซลลนจ (penicllin G), ฟราโซลโดล (furasolidole) นอรฟลอกซา

ซน (norfloxacin) และคลอแรมฟนคอล (chloramphenicol) รวมถงเคลนบเทรอล (clenbuterol) ซงเปนสาร

เรงเนอแดง

น าคาการดดกลนแสงทไดจากผล ELISA มาหาคา IC50 ดวยโปรแกรม GraphPad Prism 4.03 โดย

คดจาก 50% B/B0 แลวค านวณเปนเปอรเซนตปฏกรยาขาม (% cross-reactivity) โดยสตรค านวณ ดงน

เปอรเซนตปฏกรยาขาม = IC50 ของ TC x 100

3.4.10.3 การหาคาความถกตอง (accuracy) ของชดตรวจสอบ

น าตวอยางทมการเตม TC ทความเขมขนสดทายเปน 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 และ

200 ng/ml มาหาคา % recovery โดยท าการตรวจหาความเขมขนของ TC ทมอยในตวอยางและน าผลทไดมา

เปรยบเทยบกบความเขมขน TC จากกราฟมาตรฐาน โดยค านวณหาคา % Recovery จากสตรดงน

IC50 ของสารททดสอบ

39

% Recovery = ความเขมขนของ TC ทวเคราะหได X 100

ความเขมขนของ TC ทเตมลงไป

3.4.10.4 การหาคาความแมนย า (precision) ของชดตรวจสอบ

หาไดจากการศกษาความแปรปรวนของการท าการทดลองซ าในครงเดยวกน (intra-

variation assay) และการท าการทดลองซ าระหวางครงการทดลอง (inter-variation assay) ดงน

3.4.10.4.1 intra-variation assay

ท าการหาคาเฉลย standard deviation (SD) และ % coeffecient of variation (%

CV) ของการวเคราะหตวอยาง 9 ซ าจากชดตรวจสอบตนแบบ ซง % CV ค านวณไดจากสตร

% CV = SD x 100

โดยท % CV คอ คารอยละของสมประสทธความแปรปรวน

คอ คาเฉลยของคาการดดกลนแสงท 450 นาโนเมตรโดยวธ

Biotin-indirect competitive ELISA

SD คอ คาเบยงเบนมาตรฐานของคาการดดกลนแสงท 450 นาโนเมตร

3.4.10.4.2 Inter-variation assay

ท าการหาคาเฉลย , คา standard deviation (SD) และ % coeffecient of variation

(% CV) ของการวเคราะหตวอยางเดยวกน 8 ครง ทเวลาตางกนดวยวธ Ab-captured direct competitive

ELISA แตท าการทดสอบโดยทแตละครงท า 9 ซ า เมอท าทกครงรวมกนแลวได 72 ซ า จากนนน าขอมลท

ไดมาหาคา , SD และ % CV

40

3.4.11 การวเคราะหเตตราไซคลนในน าผงทมจ าหนายของไทย

ชงน าผงปรมาณ 1 กรม จาก 9 แหลง ลงในหลอดทดลอง ขนาด 15 มลลลตร จ านวน 9

หลอด มาเจอจางดวย PBST ปรมาณ 9 มลลลตร น าไปปนเหวยงทความเรว 2,500 รอบตอนาท เปนเวลา 10

นาท จากนนน าไปตรวจสอบกบชดตรวจสอบต นแบบ เปรยบเ ทยบความเขมขนของ เตตราไซคลน ทไดกบ

สารละลายมาตรฐานเตตราไซคลน

41

บทท 4

ผลการด าเนนการวจยและอภปราย

4.1 การท าโมโนโคลนอลแอนตบอดใหบรสทธ

จากการน าเซลลไฮบรโดมาทผลตโมโนโคลนอลแอนตบอดตอ TC รหสโคลน 12-3F ทเกบไวใน

ไนโตรเจนเหลว มาเลยงในอาหารเลยง RPMI-1640 ทม 10% FCS และท าการขยายเพมจ านวนเซลลไฮบรโด

มา เกบอาหารเลยงเซลลซงมโมโนโคลนอลแอนตบอดอย และน าอาหารเลยงเซลลทไดผานคอลมน Protein

G affinity chromatography โดยแอนตบอดจะถกจบอยในคอลมน และจะถกชะออกมาโดยใชบฟเฟอรท pH

2.7 โดยเกบทละสวน (fraction) และน ามาตรวจหาปรมาณโปรตน โดยวดคาการดดกลนแสงท 280 นาโน

เมตร พบวา fraction ท 8-12 มคาการดดกลนแสงตงแต 0.4-1.55 (รปท 4.1) ซงแสดงใหเหนวาเปนสวนท

โปรตนหรอแอนตบอดถกชะออกมา

จากนนน าโมโนโคลนอลแอนตบอด ทเกบไดใน fraction ท 8-12 มารวมกนและหาคาปรมาณโปรตน

ดวยวธ BCA โดยใชกราฟมาตรฐานของ BSA พบวาปรมาณโปรตนในอาหารเลยงเซลลโคลน 12-3F กอน

และหลงท าใหบ รสทธมคาเทากบ 5.30 มลลกรมตอมลลลตร และ3.67 มลลกรมตอมลลลตร ซงจะ

สงเกตเหนวาปรมาณโปรตนกอนท าใหบรสทธสงกวาหลงการท าใหบรสทธ เนองจาก ในอาหารเลยงเซลลม

การเตมซรมและสวนผสมอนเพมเตมเขาไปเพอใหเซลลเจรญเตบโตไดด ซงเปนการเพมปรมาณโปรตน

สวนในอาหารเลยงเซลลเมอผานการท าใหบรสทธแลวจะไดเฉพาะแอนตบอด เนองจากโปรตนจนนม

ความจ าเพาะสงในการจบแอนตบอดไวในคอลมน ท าใหปรมาณโปรตนของแอนตบอดหลงท าใหบรสทธม

คาต ากวา ดงตารางท 4.1

42

รปท 4.1 โครมาโตแกรมแสดงล าดบสวน (fraction) และคาการดดกลนแสงท 280 นาโนเมตร

ของโปรตนทชะออกมาจากคอลมนโปรตนจ โดยใชบฟเฟอร pH 2.7 ( )

ตารางท 4.1 ผลการวเคราะหปรมาณโปรตนของอาหารเลยงเซลลกอนและหลงการท า

ใหบรสทธดวยวธ BCA

4.2 การตรวจสอบความบรสทธดวยเทคนค SDS-PAGE ของแอนตบอดหลงจากท าใหบรสทธ

จากการน าแอนตบอดทผานขนตอนการท าใหบรสทธมาวเคราะหดวย SDS-PAGE เทยบกบโปรตน

กอนการท าใหบรสทธ โดยแสดงผลใ นรปท 4.2 จะพบแถบโปรตนอยางชดเจนทบรเวณ 66 กโลดาลตน

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 5 10 15 20 25 30

ค าการดดก

ลนแส

งท 28

0 นาโนเมต

ร

Fraction No.

ปรมาณโปรตน (mg/ml)

กอนท าใหบรสทธ 5.30

หลงท าใหบรสทธ 3.67

43

(kDa) ในตวอยางอาหารเลยงเซลลและแอนตบอดกอนท าใหบรสทธ แต ในตวอยางแอนตบอดทผานการท า

ใหบรสทธจะพบแถบโปรตน 2 แถบ คอท 62 และ 25 กโลดาลตน ทงนเนองมาจากในตวอยางกอนการท า

ใหบรสทธนนจะมโปรตนจากซรมทเตมลงไปในอาหารเลยงเซลลปนอยมาก แตเมอน าตวอยางไปผานการ

ท าใหบรสทธ โปรตนเหลาน จะถกก าจดออกท าใหไมพบแถบของโปรตนดงกลาวในตวอยางทผานการท า

ใหบรสทธ อกทงมการท าลายพนธะไดซลไฟดระหวางโมเลกลของแอนตบอด ท าใหสวน heavy-chain และ

light-chain แยกออกจากกน ดงนนหลงจากการท าใหบรสทธแอนตบอดมความเขมขนขนจงพบแถบโปรตน

ดงกลาว ซงขนาดของโปรตนทงสองแถบ นสอดคลองกบงานวจยของ ชมพนกข กาญจนพงคะ (2008) และ

Harlow และ Lane (1988) ทพบแถบยอย 2 แถบ คอ H-chain และ L-chain ซงเปนหนวยยอยของสายพอล

เพปไทดของแอนตบอด

รปท 4.2 ผลการท า SDS-PAGE ชองหมายเลข 1 คอ โปรตนมาตรฐาน (ปรมาณ 2.5 ไมโครกรม)

ชองหมายเลข 2 คอ FBS (5 ไมโครกรม)

ชองหมายเลข 3 คอ อาหารเลยงเซลลไฮบรโดมา

ชองหมายเลข 4 คอแอนตบอดในอาหารเลยงเซลลทม 10% FBS (5 ไมโครกรม)

ชองหมายเลข 5 คอ แอนตบอดหลงท าใหบรสทธแลว (5 ไมโครกรม)

ชองหมายเลข 6 คอ แอนตบอดหลงท าใหบรสทธแลว (10 ไมโครกรม)

Heavy chain

62 kDa

Light chain

25 kDa

66 kDa

45 kDa

30 kDa

20.1 kDa

97 kDa

44

4.3 การตรวจสอบความสามารถของแอนตบอดหลงการท าใหบรสทธตอ TC ในรปอสระ

น าโมโนโคลนอลแอนตบอดหลงการท าใหบรสทธมาทดสอบความสามารถในการจบกบ TC ใน

รปอสระ ดวย Indirect competitive ELISA โดยมตวควบคมลบ คอ PBS และตวควบคมบวก คอ ความ

เขมขนของเตตราไซคลนท 1,000 ng/ml พบวาคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 450 นาโนเมตร จะลด

ต าลงเมอความเขมขนของเตตราไซคลนในรปอสระสงขน ดงแสดงดง รปท 4.3 แสดงใหเหนวาแอนตบอดท

ผานการท าใหบรสทธนนยงคงมสามารถจบ TC ในรปอสระได

รปท 4.3 กราฟแสดงผลการทดสอบความจ าเพาะของแอนตบอดบรสทธตอ TC ใน

รปอสระดวยวธ Biotin-indirect competitive ELISA โดยเคลอบหลมดวย TC-OVA 5

ug/ml และแอนตบอดความเขมขน 2 ug/ml

4.4 การเชอมตอระหวาง TC กบ OVA (TC-OVA)

เนองจาก TC มขนาดโมโลกลเลก (มวลโมเลกล 444 ดาลตน) ซงไมเหมาะสมส าหรบการเคลอบจาน

ELISA โดยตรง ดงนนจงตองท าการเชอมตอ TC กบโปรตนทมขนาดใหญ ส าหรบการท า ELSA โดยไดท า

การเชอม TC กบ OVA และทดสอบประสทธภาพการเชอมตด โดยการวเคราะหดวยเทคนค MALDI- TOF

MS จากโครมาโทแกรมทได (รปท.4.4.) พบวา OVA มมวลโมเลกล 4,4757.79 ดาลตน และสารเชอมตอท

0.0625

0.1250

0.2500

0.5000

1.0000

2.0000

0.01 0.1 1 10 100 1000

OD

45

0

logarithm concentration of TC (ppb)

45

ไดมมวลโมเลกล 45,319.64 ดาลตน ซงเพมขน 561.85 ดาลตน เนองจาก TC มมวลโมเลกล 444.44 ดาลตน

จงสามารถค านวณหาอตราสวนโมเลกลการเชอมตดของ TC บน OVA ได เทากบ 1.26 โมเลกล

รปท 4.4 โครมาโตแกรมของ OVA (A) และ TC-OVA (B) โดยวธ MALDI-TOF MS

4.5 การเตรยมชดตรวจสอบ ELISA

4.5.1 ชดตรวจสอบแบบ direct competitive ELISA

4.5.1.1 การหาอตราสวนทเหมาะสมระหวางแอนตบอดกบ TC-HRP

ท าการหาอตราสวนทเหมาะสมระหวางแอนตบอดทเคลอบหลมกบ TC-HRP

ส าหรบการเตรยมชดตรวจสอบแบบ direct competitive ELISA โดยท าการแปรคาความเขมขนของ

แอนตบอดท 0.5, 1, 2.5 และ 5 ug/ml และใชความเขมขนของ TC-HRP อยในชวง 0.1-1.0 ug/ml โดยม

เกณฑในการก าหนดอตราสวนทเหมาะสม คอ อตราสวนทใหคาการดดกลนแสงในการท า direct ELISA

ประมาณ 1.0-1.5 ไดผลดงแสดงในตารางท 4.2 พบวาไดความเขมขนของแอนตบอดและแอนตเจนทใหคา

การดดกลนแสงทเหมาะสม 3 อตราสวน โดยแอนตบอดท 5, 2.5 และ 1 ug/ml จะใช TC-HRP ท 0.25, 0.25

และ 2.5 ug/ml ตามล าดบ จงน าความเขมขนทเหมาะสมดงกลาวไปใชในการหาความไวของแอนตบอดตอ

TC ในรปอสระตอไป

ตารางท 4.2 อตราสวนทเหมาะสมระหวางแอนตบอดกบ TC-OVA ดวยวธ direct competive ELISA

45319.64 - 44757.79 = 1.26

โมเลกล

444.44

A

B

46

ความเขมขนของ TC-HRP

(ug/ml)

คาการดดกลนแสงท 450 นาโนเมตร

ความเขมขนของ Ab (ug/ml)

5 2.5 1 0.5

0.10 0.894 0.701 0.411 0.190

0.25 1.435* 1.123* 0.609 0.227

0.50 1.865 1.526 0.818 0.239

1.00 2.209 1.769 0.956 0.356

หมายเหต คาทแสดงโดยตวเลขทบ* คอ คาการดดกลนแสงจากการท า ELISA ทใชแอนตเจนและแอนตบอด

ทมความเขมขนทเลอกส าหรบใชในการทดสอบความสามารถของแอนตบอดในการจบกบ TC รปอสระ

4.5.1.2 การทดสอบหาขดความสามารถในการตรวจของชดตรวจสอบตนแบบ

ทดสอบหาขดความสามารถในการตรวจของชดตรวจสอบตนแบบโดยใชความ

เขมขนทเหมาะสมของแอนตบอดทเคลอบหลม และ TC-HRP ทหาได มาทดสอบกบ TC ในรปอสระท

ความเขมขน 0-1,000 ng/ml น าคาการดดกลนแสงทไดมาสรางกราฟในรปรอยละของอตราสวนระหวาง

B/B0 โดยท B คอคาการดดกลนแสงในภาวะทม TC ในรปอสระทความเขมขนตางๆ และ B0 คอ คาการ

ดดกลนแสงในภาวะทไมม TC จากนนหาคาความไวของแอนตบอดดวยวธนโดยดจากคา IC50 ซงเปนคา

ความเขมขนของ TC อสระทใหคา % B/B0 เทากบ 50% พบวาเมอใชแอนตบอดทความเขมขน 5 ug/ml

และความเขมขนของ TC-HRP ท 0.25 ug/ml ใหคา IC50 เทากบ 20.13 ng/ml เมอใชแอนตบอดทความ

เขมขน 2.5 ug/ml และความเขมขนของ TC-HRP ท 0.25 ug/ml ใหคา IC50 เทากบ 10.73 ng/ml (ผลดงรปท

4.5) จากการเปรยบเทยบคา IC50 ทไดจากทง 2 ภาวะ พบวาความเขมขนของ แอนตบอดท 2.5 ug/ml และ

ความเขมขนของ TC-HRP ท 2.5 ug/ml ใหคา IC50 ต าทสด แสดงวาความเขมขนดงกลาวเปนความ

เขมขนทเหมาะสมทสดทท าใหการตรวจดวยวธ direct competitive ELISA มความไวสงสด

47

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104

0

25

50

75

100

TC-HRP 0.5 g/ml

Ab 2.5 g/ml

TC-HRP 0.25 g/ml

Ab 5 g/ml

LOD IC50

8.03 20.13

2.82 10.73

(ppb) (ppb)

logarithm concentration of TC (ppb)

%B

/B0

TC-HRP and Ab concentration

รปท 4.5 ผลการทดสอบความไวของแอนตบอดกบเตตราไซคลนในรปอสระดวยวธ Ag- captured

direct competitive ELISA โดยแปรอตราสวนระหวางแอนตบอดทเคลอบหลมกบ TC-HRP

ทความเขมขน 5 และ 0.25 ug/ml และความเขมขนท 2.5 และ 0.25 ug/ml ตามล าดบ

4.5.2 ชดตรวจสอบแบบ indirect competitive ELISA

4.5.2.1 การหาอตราสวนทเหมาะสมระหวางแอนตบอดกบ TC-OVA

หาอตราสวนทเหมาะสมระหวางแอนตบอดกบ TC-OVA ดวย indirect competitive

ELISA โดยเคลอบหลมของจาน ELISA ชนด 96 หลมดวย TC-OVA ทความเขมขน 0.5, 1, 1.25, 2.5 และ 5

ug/ml แลวจงท าการแปรความเขมขนของแอนตบอดท 0.01-2 ug/ml แลวเลอกอตราสวนทใหคาการ

ดดกลนแสงประมาณ 1.0-1.5 โดยพบความเขมขนของแอนตบอดและแอนตเจนทใหคาการดดกลนแสงท

เหมาะสม 3 อตราสวน คอ ภาวะทความเขมขนของ TC-OVA ท 1, 1.25 และ 2.5 ug/ml กบความเขมขนของ

แอนตบอดท 0.05, 0.025 และ 0.025 ug/ml ตามล าดบ ดงในตารางท 4.3 แลวน าความเขมขนทเหมาะสม

ดงกลาวไปหาความไวตอ TC ในรปอสระตอไป

48

ตารางท 4.3 ผลการหาอตราสวนทเหมาะสมระหวางแอนตบอดกบ TC-OVA โดยวธ indirect competitive

ELISA

ความเขมขนของแอนตบอด

(ug/ml)

คาการดดกลนแสงท 450 นาโนเมตร

ความเขมขนของ TC-OVA (ug/ml)

0.5 1.00 1.25 2.50 5.0

0.010 0.501 0.605 0.685 0.209 0.661

0.025 0.848 1.113 1.178* 1.209* 1.166

0.050 1.166 1.465* 1.585 1.566 1.504

0.100 1.575 1.841 1.918 2.002 1.977

หมายเหต คาทแสดงโดยตวเลขทบ* คอ คาการดดกลนแสงจากการท า ELISA ทใชแอนตเจนและแอนตบอด

ทมความเขมขนทเลอกส าหรบใชในการทดสอบความสามารถของแอนตบอดในการจบกบ TC ในรปอสระ

4.5.2.2 การทดสอบหาขดความสามารถในการตรวจของชดตรวจสอบตนแบบ

ทดสอบหาขดความสามารถของชดตรวจสอบชนด Indirect competitive ELISA

โดยอตราสวนทเหมาะสมระหวางแอนตบอดกบ TC-OVA 3 อตราสวน มาทดสอบกบ TC ในรปอสระท

ความเขมขน 0-1,000 ng/mlไดผลแสดงในรปท 4.6 พบวาเมอใช TC-OVA 1 ug/ml กบแอนตบอด 0.05

ug/ml ใหคา IC50 เทากบ 1.46 ng/ml เมอใช TC-OVA 1.25 ug/ml กบแอนตบอด 0.025 ug/ml ใหคา IC50

เทากบ 1.13 ng/ml และเมอใช TC-OVA 2.5 ug/ml กบแอนตบอด 0.025 ug/ml ใหคา IC50 เทากบ 2.04 ng/ml

ดงนนอตราสวนทใหความไวสงสด คอ ความเขมขนของ TC-OVA และแอนตบอด ท 1.25 ug/ml และ

0.025 ug/ml ตามล าดบ แสดงดงรปท 4.6

49

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104

0

25

50

75

100

TC-OVA 2.5 g/ml

Ab 0.025 g/ml

TC-OVA 1 g/ml

Ab 0.05 g/ml

TC-OVA 1.25 g/ml

Ab 0.025 g/ml

LOD IC50

0.07 1.46

0.09 1.13

0.20 2.04

(ppb) (ppb)

logarithm concentration of TC (ppb)

%B

/B0

TC-OVA and Ab concentration

รปท 4.6 ผลการทดสอบความไวของแอนตบอดกบ TCในรปอสระโดยแปรอตราสวนระหวางแอนตบอด

กบ TC-OVA ดวยวธ indirect competitive ELISA โดย เคลอบหลมดวย TC-OVA 1, 1.25 และ 2.5 ug/ml

และแอนตบอดความเขมขน 0.05, 0.025 และ 0.025 ug/ml ตามล าดบ

4.5.3 ชดตรวจสอบแบบ Biotin indirect competitive ELISA

4.5.3.1 การหาอตราสวนทเหมาะสมระหวาง TC-OVA กบ Ab-biotin

ท าการหาอตราสวนในการจบทเหมาะสมระหวาง TC-OVA ทเคลอบหลมกบ Ab-

biotin ทเหมาะสมในการเตรยมชดตรวจสอบแบบ biotin-indirect competitive ELISA โดยท าการแปรคา

ความเขมขนของ TC-OVA ในชวง 0.125-1.0 ug/ml และ Ab-biotin ในชวง 0.025-0.25 ug/ml และเมอน า

Ab-biotin ทความเขมขนตางๆ มาทดสอบ ไดความเขมขนของแอนตบอดและแอนตเจนทใหคาการดดกลน

แสงทเหมาะสม 3 อตราสวน คอ TC-OVA 0.125, 0.25 และ 0.5 ug/ml กบ Ab-biotin ท 0.05, 0.1 และ 2.5

ug/ml ตามล าดบ ดงแสดงในตารางท 4.4 น าความเขมขนทเหมาะสมดงกลาวไปใชในการหาความไวตอ TC

ในรปอสระตอไป

50

ตารางท 4.4 ผลการหา อตราสวนทเหมาะสมของ TC-OVA กบ Ab-biotin ดวยวธ Biotin indirect

competitive ELISA

ความเขมขนของ

TC-OVA

(ug/ml)

คาการดดกลนแสงท 450 นาโนเมตร

ความเขมขนของ Ab-biotin (ug/ml)

0.025 0.05 0.1 0.25 0.5

0.125 0.266 0.431 0.746 1.115* 1.615

0.250 0.345 0.678 1.395* 1.959 2.444

0.500 0.665 1.303* 2.303 2.609 2.783

1.000 0.772 1.611 2.639 2.772 1.646

หมายเหต คาทแสดงโดยตวเลขทบ* คอ คาการดดกลนแสงจากการท า ELISA ทใชแอนตเจนและแอนตบอด

ทมความเขมขนทเลอกส าหรบใชในการทดสอบความสามารถของแอนตบอดในการจบกบ TC ในรปอสระ

4.5.3.2 การทดสอบหาขดความสามารถในการตรวจของชดตรวจสอบตนแบบ

ทดสอบหาความสามารถระหวา ง Ab-biotin กบ TC ในรปอสระดวยวธ biotib-indirect

competitive ELISA จากอตราสวนทเหมาะสม 3 อตราสวน มาทดสอบกบTCในรปอสระทความเขมขน 0-

1,000 ng/ml พบวาในภาวะทใช TC-OVA ความเขมขน 0.125 ug/ml และ Ab-biotin ท 0.25 ug/ml ใหคา

IC50 เทากบ 2.63 ng/ml สวนในภาวะทใช TC-OVA ความเขมขน 0.25 ug/ml และแอนตบอดทเชอมตอ

กบไบโอตน 0.1 ug/ml ใหคา IC50 เทากบ 2.83 ng/ml สวนในภาวะทใช TC-OVA ความเขมขน 0.5 ug/ml

และ Ab-biotin ท 0.5 ug/ml ใหคา IC50 เทากบ 4.40 ng/ml ตามล าดบ แสดงใหเหนวาอตราสวนทใหความไว

มากทสดคอ TC-OVA ความเขมขน 0.125 ug/ml และ Ab-biotin ท 0.25 ug/ml ดงแสดงในรป 4.7

51

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104

0

25

50

75

100

TC-OVA 0.5 g/ml

Ab-biotin 0.05 g/ml

TC-OVA 0.25 g/ml

Ab-biotin 0. g/ml

TC-OVA 0.25 g/ml

Ab-biotin 0.25 g/ml

LOD IC50

0.19 2.63

0.43 2.83

0.73 4.40

(ppb) (ppb)

logarithm concentration of TC (ppb)

%B

/B0

TC-OVA and Ab-biotin concentration

รปท 4.7 ผลการทดสอบความไวของแอนตบอดกบ TC ในรปอสระโดยแปรอตราสวน ระหวาง TC-OVA

กบ Ab-biotin ดวยวธ Biotin indirect competitive ELISAโดยเคลอบหลมดวย TC-OVA 0.125, 0.5 และ

0.25 ug/ml และ Ab-biotin ทความเขมขน 0.25, 0.1 และ 0.05 ug/ml ตามล าดบ

4.5.4 การวเคราะหเปรยบเทยบชดตรวจสอบ ELISA แบบตางๆ

เมอวเคราะหชดตรวจสอบ ELISA ทง 3 แบบทพฒนาขน เปรยบเทยบความไวของชด

ตรวจสอบจากคา IC50 และ LOD ไดผลสรปดงแสดงในตาราง 4.5 โดยพบวาชดตรวจสอบแบบ indirect

competitive ELISA มความไวสงสด รองลงมาคอ biotin-indirect competitive ELISA, direct competitive

ELISA ตามล าดบ โดยมคา IC50 เทากบ 1.13, 2.63, และ 10.73 ng/ml

จากการวเคราะหเปรยบเทยบชดตรวจสอบ ELISA แบบตางๆ ทง 3 แบบขางตน จะเหนไดวา

ชดตรวจสอบทกแบบมคา LOD และ IC50 ทต า สามารถน ามาใชตรวจสอบ TCทความเขมขนต ากวาคา

MRL (25 ng/ml)ได แตม 2 วธ คอ indirect competitive ELISA และ biotin-indirect competitive ELISA ท

สามารถน ามาตรวจตวอยางในน าผงได เนองจากในขน ตอนการเตรยมตวอยางตองมการเจอจางอก อยาง

นอย 10 เทา คาLOD ของทงสองวธนกยงสามารถตรวจไดครอบคลมชวง MRL แตในการทดลองครงนจะ

เลอกใช biotin-indirect competitive ELISA ส าหรบเตรยมเปนชดตรวจสอบตนแบบ เพอท าการหา

ประสทธภาพของชดตรวจสอบตอไป เนองจากใชเวลาทนอยกวาวธ indirect competitive ELISA ซงจะชวย

ลดเวลาในการทดสอบ ไดผลการทดสอบรวดเรวขน

52

ตารางท 4.5 สรปผลการเปรยบเทยบชดตรวจสอบ ELISA แบบตางๆ

รปแบบของชดตรวจสอบ อตราสวนทเหมาะสม

เวลาในการ

ทดสอบ

(ชวโมง)

IC50

(ng/ml)

LOD

(ng/ml)

Direct competitive ELISA Ab 1 ug/ml

TC-HRP 2.5 ug/ml

2.15 10.73 2.88

Indirect competitive ELISA TC-OVA 1.25 ug/ml

Ab 0.025 ug/ml

3.15

1.13 0.09

Biotin-indirect competitive

ELISA

TC-OVA 0.125 ug/ml

Ab-biotin 0.25 ug/ml

2.15

2.63 0.19

4.6 การเตรยมชดตรวจสอบตนแบบดวยวธ Biotin-indirect competitive ELISA

4.6.1 การสรางกราฟมาตรฐาน

หลงจากการคดเลอกชดตรวจสอบทมความไวสงสดดงทกลาวขางตน จงท าการเตรยมชด

ตรวจสอบตนแบบดวยวธ biotin-indirect competitive ELISA โดยใชความเขมขนของ TC-OVA เคลอบ

หลมเทากบ 0.125 ug/ml และ Ab-biotin เขมขน 0.25 ug/ml และแปรความเขมขนของ TCใ นรปอสระเปน

ตวแขงขนในชวง 0-1,000 ng/ml และน าขอมลดงกลาวมาสรางกราฟโดยใชโปรแกรม GraphPad Prism 4.03

โดยใหแกน X เปนลอการทมของความเขมขนของTCทมหนวยเปน ng/ml และแกน Y เปนคาการดดกลน

53

แสงทความยาวคลน 450 นาโนเมตร จากนนท าการเลอกชวงกราฟทมลกษณะเปนเสนตรง มาสรางเปน

กราฟมาตรฐาน ซงไดความเขมขนในชวง 0- 20 ng/ml แสดงขอมลดงตารางท 4.6 และรปท4.8

ตารางท 4.6 ผลของคาการดดกลนแสงท 450 นาโนเมตร และคาเบยงเบนมาตรฐาน (SD) ทไดจาก

การท า biotin-indirect competitive ELISA ส าหรบสรางกราฟมาตรฐานของชดตรวจสอบ

TCตนแบบ

ความเขมขนTC

(ng/ml)

คาการดดกลนแสงท

450 นาโนเมตร SD

0 1.387 0.096

0.25 1.392 0.059

0.5 1.259 0.078

1 1.099 0.047

2.5 0.900 0.057

5 0.742 0.003

10 0.589 0.016

20 0.335 0.034

54

รปท 4.8 กราฟมาตรฐานของชดตรวจสอบตนแบบ biotin-indirect competitive ELISA

4.6.2 การศกษาปจจยของเวลาทใชในการบม TC-OVA กบ Ab-biotin และ TC ในรปอสระ

ในการพฒนาชดตรวจสอบสงทเปนปจจยทส าคญอกอยาง คอ เวลาในขนตอนตางๆ ของชด

ตรวจสอบ ดงนนในการพฒนาชดตรวจสอบตนแบบจงตองค านงถงเวลาทสะดวกและงายตอการใชงานมาก

ทสด โดยท าการเตรยมชดตรวจสอบตนแบบดวยวธ biotin-indirect competitive ELISA โดยแปรเวลาใน

การบม 3 ภาวะ คอ 1, 1.5 และ 2 ชวโมง เพอเปรยบเทยบความไว (sensitivity) พบวาคา IC50 ในการบมท 1,

1.5 และ 2 ชวโมง มคาเทากบ 0.92, 1.01 และ 1.23 ng/ml ตามล าดบ (รปท 4.9) โดยบมทเวลา 1 ชวโมง ให

คา IC50 และ LOD ต าทสด แตจะพบวาคาการดดกลนแสงของการบมท 1 ชวโมง มคาต ากวาการบมทเวลา 2

ชวโมงมาก (รปท 4.9) ซงบงบอกไดวาเวลาดงกลาวยงเกดการท าปฏกรยาทไมสมบรณ ดงนนจงเลอกใช

เวลา 1.5 ชวโมง เปนเวลาในการท าปฏกรยา และพฒนาเปนชดตรวจสอบ biotin-indirect competitive

ELISA ตอไป

y = -0.234ln(x) + 1.0945R² = 0.9926

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

0.1 1 10 100

OD

45

0

logarithm concentration of TC (ppb)

55

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104

0

25

50

75

100

2 h

IC50 LOD

0.92

1.01

1.23

0.04

0.04

0.13

1 h

1.5 h

(ppb) (ppb)Time

OD 450

1.122

1.523

1.726

(TC= 0 ppb)

logarithm concentration of TC (ppb)

%B

/B0

รปท 4.9 กราฟแสดงผลการทดสอบความไวของแอนตบอดตอ TC ในรปอสระ ทบม

ดวยเวลาท 1, 1.5 และ 2 ชวโมง ดวยโปรแกรม GraphPad Prism 4.03 โดยเคลอบหลมดวย

TC-OVA 0.125 ug/ml และแอนตบอดความเขมขน 0.25 ug/ml ดวยวธ biotin-indirect

competitive ELISA

4.6.3 การศกษาปจจยของชนดของ blocking solution

เนองจากมรายงานวาชนดของ blocking solution มผลกระทบตอ ELISA ในขนตอนการ

ทดสอบตวอยาง (Jeon and Peang, 2008) จงไดท าการศกษาผลกระทบของ blocking solution โดยท าการ

เตรยมชดตรวจสอบตนแบบดวยวธ biotin-indirect competitive ELISA โดยแปรชนดของ blocking solution

เปน 3 ชนด คอ 5% สารละลายนมพรองมนเนย , 1% BSA และ 1% OVA และเปรยบเทยบความไวของชด

ทดสอบ พบวาไดคา IC50 เทากบ 0.41, 4.75 และ 6.28 ng/ml ตามล าดบ (รปท 4.10) ดงนน 5% นมพรอง

มนเนย จงเปน blocking solution ทเหมาะสมทสด ทน ามาใชกบชดตรวจสอบ TC ตนแบบวธ biotin-

indirect competitive ELISA เพอน าไปใชในการวเคราะหตวอยางตอไป

56

10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102 103 104

0

25

50

75

100

1% OVA

1% BSA

5% skim milk

IC50 LOD

6.28 0.22

4.75 0.19

0.41 0.07

(ppb) (ppb)

logarithm concentration of TC (ppb)

%B

/B0

blockingsolution

รปท 4.10 กราฟแสดงผลการทดสอบความไวของแอนตบอดตอTCในรปอสระ ทใช

blocking solution ตางๆ กนคอ 1% OVA, 1% BSA และ 5% skim milk ดวยโปรแกรม

GraphPad Prism 4.03 โดยเคลอบหลมดวย TC-OVA 0.125 ug/ml และแอนตบอดความ

เขมขน 0.25 ug/ml ดวยวธ biotin-indirect competitive ELISA

4.6.4 การศกษาผลกระทบของตวท าละลายตอการวเคราะหดวยชดตรวจสอบตนแบบ

มรายงานการใช เมทานอล , PBS และ PBST มาใชสกดน าผ ง (Pastor-Navarro, 2007; R-

Biofarm,2009; Bioo, 2009) ดงนนจงใชตว จงเลอกตวท าละลายทง 3 ชนด คอ PBS, PBST และ PBS ทเตม

10% เมทานอล มาใชละลายน าผงทอตราสวน 10 มลลลตรตอน าผง 1 กรม โดยเตรยมความเขมขนของ TC

สดทายเปน 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 และ 200 ng/ml เปรยบเทยบกบกราฟมาตรฐานใน PBS ทไมมน าผง

พบวา PBST เปนตวท าละลาย ทเหมาะสมในการละลายตวอยางน าผงไดดทสด เนองจากแสดงกราฟท

ใกลเคยงกบกราฟมาตรฐานมากทสด แสดงใหเหนวา PBST สามารถลด matrix effect จากตวอยางไดและไม

รบกวนระบบของ biotin-indirect competitive ELISA ท าใหสามารถตรวจสาร TC ในน าผงได จงเลอก

สารละลายน มาใชละลายตวอยาง และใชเพอประเมนประสทธภาพของชดทดสอบตนแบบตอไป (รปท

4.11)

57

รปท 4.11 กราฟของ TC น าผงทละลาย ในสารละลาย PBS, PBST และ PBS ทเตม 10% เมทานอล

เปรยบเทยบกบ TC ใน PBS ทไมมน าผง

4.6.5 การทดสอบปฏกรยาขามของชดตรวจสอบ TC ตนแบบ

จากการทดสอบปฏกรยาขามของชดตรวจสอบ TC จากตารางท 4.7 พบวาเกดปฏกรยาขาม

ตอสารในกลม TC ทน ามาทดสอบ โดยแสดงคาเปอรเซนตปฏกรยาขาม (percent of cross reactivity) ท 100,

86, 27, 23 และ 19% ตามล าดบ และทดสอบปฏกรยาขามกบสารนอกกลม TC ไดแก เพนซลลนจ (penicllin

G), ฟราโซลโดล (FZD), นอรฟลอกซาซน (Norfloxacin) คลอแรมฟนคอล (CAP) และ เคลนบเทรอล

(clenbuterol) พบวาคาเปอรเซนตปฏกรยาขามต ากวา 0.01% (ตารางท 4.11) เนองจากสารในกลม TC ม

โครงสรางทคลายคลงกนกบ TC มาก โดยสารในกลม ทมโครงสรางคลาย TC ไดแก TC ไฮโดรคลอไรด

(TC-HCl), โรลTC (RTC), ดอกซเตตราไซคลน (DC), คลอเตตราไซคลน ไฮโดรคลอไรด (CTC-HCl) และ

ออกซเตตราไซคลนไฮโดรคลอไรด (OTC-HCl) ท าใหแอนตบอดสามารถจดจ าและจบโครงสรางทเหมอน

TC ได แสดงใหเหนวาชดตรวจสอบตนแบบทพฒนาขนมความจ าเพาะตอสารกลม TCสงและไมท าปฏกรยา

กบสารนอกกลมTC

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

0.1 1 10 100

OD

45

0

logarithm concentration of TC (ng/ml)

standard TC

PBS

PBS- Tween-20

10%MeOH in PBS

58

ตารางท 4.7 ผลการท าปฏกรยาขาม (cross-reactivity, CR) ของชดตรวจสอบตนแบบตอสารใน

กลมและนอกกลมTC

สารทดสอบ CR (%)

สารในกลม

TC

สารนอกกลม

TC

เตตราไซคลน ไฮโดรคลอไรด (TC-HCl) 100

โรลเตตราไซคลน (RTC) 86

ดอกซเตตราไซคลน (DC) 27

คลอเตตราไซคลน ไฮโดรคลอไรด (CTC-HCl) 23

ออกซเตตราไซคลน ไฮโดรคลอไรด (OTC-HCl) 19

เพนซลลนจ (penicllin G) <0.01

ฟราโซลโดล (FZD) <0.01

นอรฟลอกซาซน (norfloxacin) <0.01

คลอแรมฟนคอล (CAP) <0.01

เคลนบเทรอล (clenbuterol) <0.01

4.7 การวเคราะหTCในตวอยางน าผงดวยชดตรวจสอบตนแบบ

4.7.1 การวเคราะห TC ในตวอยางน าผง

ท าการวเคราะหหาปรมาณ TCทเตมลงในตวอยางน าผงโดยใหความเขมขนสดทายเปน 0, 2.5, 5, 10,

25, 50, และ100 ng/ml ท าการหาความเขมขน ทวดได โดยน าผลทไดไปเทยบกบกราฟมาตรฐาน รปท 4.12

ค านวณหา %recovery และ %CV พบวา ความเขมขนของ TC ทวเคราะหไดใกลเคยงกบทเตมลงในตวอยาง

%recovery อยในชวง ทยอมรบได (80-120%) และ %CV ทไดจากการท า intra-variation assay และ inter-

variation assay พบวา มคาอยในชวงทยอมรบไดเชนกน ซงไมเกน20% แสดงดงตารางท 4.8 และ 4.9 ดงนน

59

จากขอมลทงหมดสามารถสรปผลไดวา ชดตรวจสอบตนแบบมความสามารถวดTCในตวอยางน าผงไดอยาง

ถกตอง

รปท 4.12 กราฟมาตรฐานของ TC ทใชในการวเคราะหหา TC จากน าผง

ตารางท 4.8 ผลการวเคราะห intra-variation assay ในตวอยางน าผง

ปรมาณ TCทเตมลงใน

ตวอยางน าผง

(ng/ml)

intra-variation assay (n=8)

ปรมาณ TC ทวดได

± SD

(ng/ml)

%recovery %CV

2.5 2.13±0.08 85.34 3.43

5 4.97±0.28 99.35 5.64

10 9.94±0.50 99.38 5.06

25 24.68±1.57 98.72 6.51

y = -0.322ln(x) + 1.2275R² = 0.9946

0.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

0.1 1 10 100

OD

45

0

logarithm concentration of TC (ppb)

60

50 45.82±3.03 91.63 7.11

100 91.74±4.18 91.74 4.72

หมายเหต n คอ จ านวนซ าของตวอยาง 8 ซ า

ตารางท 4.9 ผลการวเคราะห inter-variation assay ในตวอยางน าผง

ปรมาณ TCทเตมลงใน

ตวอยางน าผง

(ng/ml)

inter-variation assay (N=4)

ปรมาณ TC ทวดได

± SD

(ng/ml)

%recovery %CV

2.5 2.45±0.40 97.84 16.58

5 4.97±0.64 99.36 12.95

10 9.94±1.32 99.39 13.3

25 24.68±3.14 98.72 12.75

50 45.82±8.24 91.64 17.94

100 91.74±13.25 91.74 14.44

หมายเหต N คอ จ านวนครงของการทดลอง โดยในแตละครงของการทดลองจะท า 4 ซ า

4.7.2 ผลการวเคราะห TC จากน าผงทมจ าหนายของไทย โดยวธ biotin-in direct ELISA

จากการน าน าผงทวางจ าหนายในไทย 9 ตวอยาง มาท าการทดสอบดวยชดตรวจสอบ TC ตนแบบ

โดยเปรยบเทยบกบ กราฟมาตรฐาน TC พบวามน าผง 2 ยหอทตรวจพบสาร TC เกนกวาคา MRL ทก าหนด

61

คอ น าผงยหอ H5 และ H8 ตรวจพบ TC ในปรมาณ 49.50 และ 28.78 ng/ml ตามล าดบ สวนยหออนๆ ท

เหลอตรวจพบ TC อยท 6.7- 16.90 ng/ml ซงต ากวาคา MRL ทงสน แสดงผลดงตาราง 4.10

ตารางท 4.10 แสดงผลการวเคราะห TC จากน าผงทมจ าหนายของไทย

น าผง OD 450 ปรมาณ TC ทพบ (ng/ml)

H1 1.197 11.00

H2 1.067 16.48

H3 1.245 10.56

H4 1.355 6.70

H5 0.710 49.50

H6 1.059 16.90

H7 1.234 9.80

H8 0.887 28.78

H9 1.251 9.30

หมายเหต H คอสญลกษณใชแทนน าผงแตละยหอ

62

บทท 5

สรปผลการวจยและขอเสนอแนะ

หลงจากเตร ยมโมโนโคลนอลแอนตใหบรสทธ แล ะน ามาพฒนาเปนชดตรวจสอบ TC โดยวธ

ELISA 3 แบบ พบวา ชดตรวจสอบทใหความไวมากทสดคอชดตรวจสอบแบบ indirect competitive

ELISA โดยมคา IC50 และ LOD เทากบ 1.13 และ 0.09 ng/ml ตามล าดบ รองลงมาคอ biotin-indirect

competitive ELISA ใหคา IC50 และ LOD เทากบ 2.63 และ 0.19 ng/ml ตามล าดบ และชดตรวจสอบทม

ความไวนอยทสด ชดตรวจสอบแบบ direct competitive ELISA ใหคา IC50 และ LOD เทากบ 10.73 และ

2.88 ng/ml ตามล าดบ

ชดตรวจสอบ แบบ biotin-indirect competitive ELISA เปนชดตรวจสอบทเลอกมาเปนชด

ตรวจสอบตนแบบ สามารถสรางกราฟมาตรฐานตรวจTCไดในชวงความเขมขน 0.25 – 20 ng/ml โดยใชTC

ทเชอมตอกบ OVA เคลอบหลมทความเขมขน 0.125 ug/ml และแอนตบอดทเชอมตอกบไบโอตนเขมขน

0.25 ug/ml โดยพบวามความไวในการตรวจวดความเขมขนของ TCต าทสดเทากบ 0.19 ng/ml และสามารถ

ตรวจวดTCไดอยางถกตองทความเขมขน 0.63 ng/ml มปฏกรยาขามกบสารในกลม TC อยในชวง 19-86%

และไมเกดปฏกรยาขามกบสารนอกกลม TC ทน ามาทดสอบ จากการทดสอบความถกตองและแมนย าของ

ชดตรวจสอบ พบวา % recovery และ %CVอยในชวงทยอมรบได และจากการน าชดตรวจสอบมาวเคราะห

หา TC ตกคางในน าผงทมจ าหนาย 9 ยหอ พบมน าผง 2 ยหอทตรวจพบสาร TC เกนกวาคา MRL ทก าหนด

ในปรมาณ 49.50 และ 28.78 ng/ml ตามล าดบ ดงนนจากงานวจยนสรปไดวาชดตรวจสอบ TC ตกคาง โดย

วธ biotin-indirect competitive ELISA ทพฒนาขน สามารถน าไปใชในการตรวจหา TC ตกคางในน าผงได

อยางมประสทธภาพ

ขอเสนอแนะ

สามารถประยกตใชชดตรวจสอบ TC ตนแบบ ไปวเคราะหหา TC ตกคางในผลตภณฑอาหารอน

เชน ในน านม เนอไก ได แตตองศกษาถงวธสกด และผลของ matrix ตอระบบของ ELISA ดวย

63

เอกสารอางอางอง

กมลชย ตรงวานชนาม. 2547. การใชยาตานจลชพในสตว. พมพครงท 5. กรงเทพมหานคร: ส านกพมพ

มหาวทยาลยเกษตรศาตร.

กระทรวงสาธารณสข. 2550. ประกาศกระทรวงสาธารณสข (ฉบบท 303) พ.ศ. 2550 เรอง อาหารทมยาสตวตกคาง [ออนไลน], แหลงทมา: http://www.fda.moph.go.th/ fdanet/html/product/food/ntfmoph/ntf231.htm. [2552, มกราคม 6]

ชมพนกข กาญจนพงคะ. 2551. การผลตและลกษณะสมบตของโมโนโคลนอลแอนตบอดตอเททระไซคลน . วทยานพนธ ปรญญามหาบณฑต . หลกสตรเทคโนโลยชวภาพ คณะวทยาศาสตร จฬาลงกรณมหาวทยาลย .

ธารารตน ธารากล . 2545. ชดตรวจสอบวนจฉยโดยหลกการวทยาภมคมกน : การวจยและ พฒนาชดตรวจส าเรจรป. คณะแพทยศาสตรศรราชพยาบาล กรงเทพฯ.

นรนทร ทาวแกนจนทรและสภาพร แสงศรจนทร . การวเคราะหยาปฎชวนะในกลมเตตราไซ - คลนทตกคางในน าผงของภาคเหนอโดยวธโครมาโทกราฟของเหลว สมรรถภาพสง . ในงานประชมวชาการ วทยาศาสตรและเทคโน โลยแหงประเทศไทย ครงท 34, 31 ตลาคม 2551 ณ ศนยการประชมแหงชาตสรกต กรงเทพฯ.

ปรญญา มาสวสด . 2550. การพฒนาวธวเคราะหยาปฏชวนะกลมเตตราซยคลนทตกคางในนมโดยวธ On-line SPE-FIA. LAB.TODAY 6 (สงหาคม): 41-48.

ไพศาล สทธกรกล. 2548. วทยาภมคมกนส าหรบการสอนและการวจย. กรงเทพฯ: ศนยสอเสรมกรงเทพ. สถาบนอาหาร . 2553 .Thailand: Food safety testing equipment [ออนไลน ], แหลงทมา :

http://www.nfi.or.th/our-services/our-services-thai6.html. [2552, มกราคม] Adrian, J., Fernandez, F., Sanchez-Baeza, F. and Marco, M.P. 2012. Preparation of antibodies and

development kof an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for the determination of doxycycline antibiotic in milk sample. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 60: 3837-3846.

Capezzuto, A., Chelini, M.O., Felippe, E.C., and Oliveira C.A. 2006. Correlation between serum and fecal concentrations of reproductive steroids throughout gestation in goats. Animal Reproductive Science. (11): 001.

64

Faraj, B.A., and Ali, F.M. 1981. Development and application of a radioimmunoassay for tetracycline. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 127: 10-14.

Gao, F., Zhao, G.X., Zhang, H.C., Wang, P. and Wang, J.P. 2013. Production of monoclonal antibodies against doxycycline for immunoassay of seven tetracyclines in bovine muscle and milk. Journal of environmental Science and Health, Part B: Pesticides, Food contaminants, and Agricultural Wastes. 48(2), 92-100.

Giannetti, L.; Longo, F.B.; Russo, M.V.; and Neri, B. 2010. Tetracycline residues in royal jelly and honey by liquid chromatography tandem mass spectrometry: validation study according tocommiss decision 2002/657/EC. Analytical Bioanalytical Chemistry. 398: 1017-1023.

Hermanson, G.T. 2008. Bioconjugate techniques. U.K: Academic Press. Jeon, M.; and Paeng, I.R. 2008. Quantitative detection of tetracycline residues in honey by a simple

sentitive immunoassay. Analytica Chimica Acta 626: 180-185. Jeon, M., Kim, J., Paeng, K.J., Park, S.W. and Paeng, I.R. 2008. Biotin-avidin mediated competitive

enzyme-linked immunosorbent assay to detect residues of tetracyclines in milk. Microchemical Journal 88:26-31.

Johnstone, A.,and Thrope, R. 1987. Immunochemistry in practice. Cambridge: Cambridge University Press.

Koesukwiwat, U.; Jayanta, S.; and Leepipatpiboon, N. 2007. Validation of a liquid chromatography-mass spectrometry multi-residue method for the simultaneous determination of sulfonamides, tetracycline, and pyrimethamine in milk. Journal of Chromatography A. 1140:147-156.

Lee, H.; Lee, M.; Ryu, P.; Lee, H.; and Cho, M. 2001. Enzyme-linked immunosorbent assays for screening the plasma residue of tetracycline antibiotics in pigs. Journal of Veterinary and Medical Science. 63(5): 553-556.

Moats, W.A. 2000. Determination of tetracycline antibiotics in beef and pork tissues using ion- paired liquid chromatography. Journal of Agriculture and Food Chemistry 48: 2244-2248.

Pancorbo, A.C., Terrones, S.C., Carretero, A.S., and Gutierrez, A.F. 2008. Reversed- phase high-performance liquid chromatography coupled to ultraviolet and electrospray time-of-flight mass spectrometry on-line detection for the separation of eight tetracyclines in honey samples. Journal of Chromatography A. 1195: 107-116.

Pastor-Navarro, N.; Morais, S.; Maquieira, A.; and Puchades, R. 2007. Synthesis of haptens and development of a sensitive immunoassay for tetracycline residues Application to honey samples. Analytica Chemica Acta. 594, 211-218.

65

Pena, A.; Pelantova, C.; Lino, C.M.; Silveira, M.I.N.; and Solich, P. 2005. Validation of an analytical methodology for detection of oxytetracycline and tetracycline residues in honey by HPLC with fluorescence detection. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 53: 3784-3788.

R-Biofarm. RIDASCREEN® Tetracycline [online], source:http://www.biokits.com/productinfo/912/RIDASCREEN-reg-Tetracycline .html. [2009 , january 6] Silva, L.S., Trevisan, M.G., Rath, S., Poppi, R. J., and Reyes, FG. R. 2005. Chromatographic determination of riboflavin in the presence of tetracyclines in and full cream milk using fluorescence detection.Journal of Brazilian Chemical Society 16(6A): 1174-1178. Unisensor, S.A. Tetrasensor [online], source: http://www.thaibees.com/papers/paper005.php. [2009 ,

January 6]

Vinas, P., Balsalobre, N., Lopez-Erroz, C., and Herndez-Cardoba, M. 2004.Liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection for the analysis of tetracycline residues in honey. Journal of Chromatography A. 1022(1-2): 125-129.

Wang, L.F.; Peng, J.D.; and Lui, M.L. 2008. A reversed-phase high performance liquid chromatography coupled with resonance rayleigh scattering detection for the determination of four tetracycline antibiotic. Analytica Chimica Acta 630: 101-106.

Zhang, Y.; Lu, S.; Lui, W.; Zhao, C.; and Xi, R. 2007. Preparation of anti-tetracycline antibodies and development of an indirect heterologous competitive enzyme-linked immunosorbent assay to detect residues of tetracycline in milk. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 55: 211-218.

Zhao, C.B., Peng, D.P., Wang, Y.L., Huang, L.L., Chen, D.M., Tao, Y.F. and Yuan, Z.H. 2008. Preparation and validation of the polyclonal antibodies for detection of chlortetracycline residues. Food and Agricultural Immunology. 19(2): 163-174.

Zhenfeng, y.; Yueming, Q.; Xiuyum, L.; and Caini, J. 2006. Determination of muti-residues of tetracycline and their metabolites in milk by high performance liquid chromatography-tandem positive-ion electrospray ionization mass spectrometry. Chinese Journal of Analytical Chemistry 34(9): 1255-1259.

66

ภาคผนวก

การเตรยมสารละลาย 1. การเตรยมอาหารเลยงเซลล RPMI 1640 ชง RPMI 1640 10.4 กรม NaHCO3 2 กรม L-glutamin 0.1 กรม glucose 2 กรม pyruvic acid 0.11 กรม น ากลน 1 ลตร ละลายสารทกอยางในน ากลน ผสมใหเขากน แลวน าไปกรองดวย Millipore ขนาด 0.22 ไมโครเมตร แบงใสขวดๆ ละ 100 มลลลตร แลวเกบไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส 2. การเตรยมน ายาเกบเซลลอยางถาวรในสภาวะแชแขง (freezing medium) อาหารเลยงเซลล RPMI 1640 65 มลลลตร fetal bovine serum 25 มลลลตร dimethyl sulfoxide ( DMSO ) 10 มลลลตร ผสมใหเขากน แลวน าไปแชทอณหภม 0 องศาเซลเซยส (ขณะทใชงานควรแชในน าแขง) 3. การเตรยมสารละลายทใชวเคราะห BCA protein assay สารละลายโปรตนมาตรฐาน bovine serum albumin (BSA) 1 มลลกรม น ากลน 1 มลลลตร น ามาเจอจางทความเขมขนตางๆ กอนน าไปวเคราะห BCA protein assay เพอท ากราฟ มาตรฐาน BCATM reagent A และ BCATM reagent B (BCATM protein assay kit ของบรษท Pierce) กอนใชผสม Reagent A: B ในอตราสวน 50: 1 4. การเตรยมสารละลาย ส าหรบใชในการท าแอนตบอดใหบรสทธ

1. 0.1 M citrate buffer, pH 6, 4.5, 3.5 และ 3 citric acid 0.1 โมลลาร (M) Na2HPO4 0.1 โมลลาร (M)

67

ไตเตรตกรดดวยดางจนได pH 6, 4.5, 3.5 และ 3 แลวจงน าไปกรองดวย millipore ขนาด 0.22 ไมโครเมตร

2. 0.1 M phosphate buffer, pH 8 ชง NaH2PO4 13.8 กรม ละลายดวยน ากลน 1,000 มลลลตร ชง Na2HPO4 35.8 กรม ละลายดวยน ากลน 1,000 มลลลตร ไตเตรตดางดวยกรด จนได pH 8 แลวจงน าไปกรองดวย millipore ขนาด 0.22

ไมโครเมตร 3. 1 M Tris HCl buffer, pH 9

Tris (hydroxymethyl) aminomethane 121 กรม ละลายดวยน ากลน 1000 มลลลตร hydrochloric acid (HCl) 1 M ไตเตรตดางดวยกรด จนได pH 9.0 แลวจงน าไปกรองดวย millipore ขนาด 0.22 ไมโครเมตร 5. การเตรยมสารส าหรบการท า SDS-PAGE

1. stracking gel and separating gel reagent stacking gel

(5%) separation gel

(10%) sterile distilled water (ml) 40% acrylamide gel (ml) 1.5 M Tris, pH 8.8 (ml) 1.0 M Tris, pH 6.8 (ml) 10% SDS (ml) 10% APS (ml) TEMED (ml) final volume (ml)

1.46 0.25

- 0.25 0.02 0.02

0.002 2

3.84 2.0 2.0 -

0.08 0.08

0.0032 8

2. sample buffer

SDS 2% 60 mM Tris (pH 6.8) bromophenol blue 0.01% glycerol 10% beta-mercaptoethanol 10%

68

3. running buffer (1X) 1 L Tris 3.02 กรม glycine 18.8 กรม SDS 1.0 กรม

4. coomassie brilliant blue (250 ml) coomassie brilliant blue R-250 0.25% methanol 50% acetic acid 10%

5. destaining solution (1 L) methanol 5% acetic acid 10%

6. การเตรยมสารละลายส าหรบใชในเทคนค ELISA

1. 0.2 M phosphate buffer, pH 7.4 (stock reagent) ชง NaH2PO4 27.6 กรม ละลายดวยน ากลน 1,000 มลลลตร ชง Na2HPO4 71.63 กรม ละลายดวยน ากลน 1,000 มลลลตร ไตเตรตดางดวยกรด จนได pH 7.4 แลวเกบเปน stock

2. 0.01 M phosphate buffer saline ( PBS), pH 7.4 0.2 M phosphate buffer, pH 7.4 1,000 มลลลตร NaCl 175.2 กรม น ากลน 18 ลตร ผสมใหเขากน

3. PBS-Tween 20 ( ใช Tween 20 ความเขมขน 0.05% ) Tween 20 500 ไมโครลตร PBS 1000 มลลลตร

4. 5% นมพรองมนเนย นมพรองมนเนย ยหอแอนลน 5 กรม PBS 100 มลลลตร ละลายนมพรองมนเนยใน PBS (เตรยมใหมกอนใชงาน) 5. 0.1 M sodium acetate buffer, pH 6.0 C2H3O2 Na.3H2O 27.2 กรม ละลายดวยน ากลน 1000 มลลลตร

ไตเตรตดวย glacial acetic acid จนได pH 6.0 แลวเกบใสขวดสชา เกบทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

69

6. substrate TMB 3, 3’, 5, 5’- tetramethylbenzidine 1 มลลกรม 0.15 M phosphate citrate buffer 10 มลลลตร DMSO 100 ไมโครลตร 30% H2O2 3.4 ไมโครลตร ผสมใหเขากนในขวดสชา (เตรยมใหมกอนใชทกครง)

7. 1 M H2SO4 ( stopping reagent ) H2SO4 (96%) 102 มลลลตร น ากลน 898 มลลลตร คอยๆ เทกรดลงในน ากลน ผสมใหเขากน หมายเหต ควรน าขวดไปแชในน าประปาจนกวาจะหายรอน (เนองจากจะเกดความรอนเมอกรดผสมกบน า)