WYDZIA! NAUK O "YWNO#CI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH

MATERIA!ÓW OPAKOWANIOWYCH

!"#$%&'"()

!"#$%&#'()*#+,&-.-/"0)123&-4+"))

")123"#&"#)567-3"#'0)

8#9#8:$);;;))

*+,-./)0)!-12+),1345,167)

8.,579)3.:75;.-<)!=#>?)@#'AB@#*&)

!-12+)@1345,167)

!;1CD73;.<)=%:-$()>%?#$:)@:$2#$<))ABC)B0$86030)DEEE)

DDF)G%H-30)")H2&09"'0)?7-&2))

DIF)!0&072)")J-9J2)?7-&-3#)

DKF)!08'0H2)J$6#'06%LM+#)82/&07)

!;1CD73;.<)=%:-$()N#$#92)G#$/<)>%?#$:)@:$2#$<)N-,&)>F)*29-+6'-<)ABC)B0$86030)IOOP)

!-12+)@1345,167)

DIF)>"J"H2)")?7-&2)?"-.-/"+6&#))

DKF)!0&072)")J-9J2)?7-&-3#)

!</16.);)/+2.3;,.)E-12+)FG   !-12+)E;1H1I;CJ27)8M)6-$/0&"6-30&29")30$8:3-329")<,-./.3;)3.,5131H7,<H.52+3;<)

67-Q-&29") /7R3&"#) 6)E;.-7,) ") H;K;/46F) A#7&"M) -&#) S%&'+L#) &"#6?TH&#) H-) Q2+"0F)C0H0LM)'-9R$'-9)"&H23"H%0.&-4U)J$6#6)1//J;7H72;7);CD)1/)L51/16;9,.F)

IF  G7-&2) 8M) 6+91C7) 97H7,:+62+3;) E.5;75.3;) K5J7K<9JCJ.H21LC;<) 0.#) &"#) 8M) +07'-3"+"#)"6-.%LM+29") 4+"0&09"<) J-&"#30Q) 603"#$0LM) 8J#+2V+6&#) '0&072<) J$6#&-4&"'") ") J-9J2F) *#)9+9:73+) :5.29K15:<) 57I<H<MN) 9-.#'%.0$&2) ") L-&-32) 8'70H) 4$-H-3"8'0)3#3&0:$6'-9R$'-3#/-F))

KF  *3-$6M)J.3,2;O:7)K5J7/J;.-+<)':R$29")9-/M)?2+)C.-7),1345,;)H<E)15I.27HH7)3)-?$T?"#)'-9R$'"F) !-9R$'") 7<,.5;1:+CJ27) 603"#$0LM) $R3&"#Q) E-12+) 6762O:5J27<) ':R$#)32:2+60LM)/$0&"+#)-$/0&#.."<):0'"+,)L0')3;:1CD12/5;.P)CDH151KH.9:+);)H;J1913+F))

&<,.5;1:.) ) ) )))))))Q51,.5;1:.)

DF )5,0$0':#$28:2+6&#)R<2,CM7)E-12<):0'"#)L0'()

W)):$0&8J-$:<))

W)J$6#'06230&"#)"&S-$90+L"<)

W)J$6#'86:07+0&"#)#&#$/""))

IF) G7-&2) ,12:51H<MN) K5J7K-+6) ;2R153.CM") 9"#H62) '-9R$'09"<) 603"#$0LM) 8J#+2V+6&#)57C7K:15+) E1/SC46) J762O:5J2+CD<) H6"T'") ':R$29) '-&:$-.%LM) $R3&"#Q) J$6#J723)"&S-$90+L") 9"#H62) '-9R$'0) ") L#L) 4$-H-3"8'"#9) X/#&#$%LM) 82/&072) -) +,0$0':#$6#)CD73;CJ2+3) .%?)7H7,:5+CJ2+3Y) W)&0)J$62'70H)603"#$0LM)$#+#J:-$2),-$9-&R3<):0'"+,)L0');29<H;2.F)

KF) G7-&2) ?"-$M) ?#6J-4$#H&") %H6"07) 3) :0'"+,) K51C79.CD) K5J7,9J:.-C.2;.) 7275I;;<) L0')S-:-82&:#60)")S-8S-$2.0+L0)-'82H0+2L&0F)

T<2,CM7)E-12)

8/MG)Z&#$/"0)43"0:70)6-8:0L#)J$6#'86:07+-&0)3)#&#$/"#)3"M60[)+,#9"+6&2+,)J$6#6)'-9J.#'82)S-:-82&:#:26%LM+#<)%9"#86+6-&#)3):2.0'-"H-32+,)?7-&0+,)+,.-$-J.08:%F)

DF  G7-&2) 8M) 9:5<,:<5.3;) 6.59:616+3;) -) /$%?-4+") -HJ-3"0H0LM+#L) 60.#H3"#) '".'%)+6M8:#+6'-9)X\WDO)&9YF)

IF  G7-&2)6?%H-30&#)8M)/7R3&"#)6)H;K;/46);)E;.-7,<)':R$2+,)8:-8%&#')30/-32)8"T/0)-H).()])H-)]()D)X)603"#$0LM):0'Q#)C<,516C7)J6;NJ.27)J)H;K;/.3;)H<E)E;.-,.3;YF)

KF  )U;K;/+)3+,-H6M+#)3)8'70H)?7-&2)8M)8:-8%&'-3-)90729")+6M8:#+6'09")603"#$0LM+29")$#86:2) ,2H$-S-?-3#) ") ,2H$-V.-3#F) B) 4$-H-3"8'%) 3-H&29) 8J-&:0&"+6&"#) :3-$6M)608'.#J"0LM+#)8"T)3)KOCD75J+,;)6.59:6+)E;31H7,<H.527F))

]F  )B)+,0$0':#$28:2+6&2+,)S%&'+L0+,)?7-&)J-4$#H&"+60)8J#+2V+6&#)?"07'0<)':R$#)H6"070LM)L0'-)K13K+P),.2.-+P)K5J721L2;,;P)57C7K:15+P):5.29R153.:15+)7275I;;);)72J+3+F))

PF  G7-&2)8M)6#8J-709")+6M8:#+6#')2;7)J6;NJ.2+CD),16.H72:2;7F)*3-$6M+#)?7-&T)+6M8:#+6'")?"07#') ") ."J"HR3)8M)J-7M+6-&#)6#) 8-?M)J$6#6) ."+6&#)1//J;.-+6.2;.)2;7,16.H72C+M27)-)+,0$0':#$6#)'--J#$0:23&29F)

\F  )G7-&2)8M).9+37:5+CJ27)")-?"#)L#L)J-3"#$6+,&"#)8M)60386#)-H)8"#?"#)$RQ&#F)

^F  G7-&2) 8M) 8:$%':%$09")K-+22+3;F) 56M8:#+6'") ."J"HR3)9-/M) 862?'-) H2S%&H-30U)36H7%Q)?7-&2<)J-H-?&"#)L0')?"07'0<)L#4.")&"#)8M)60'-:3"+6-&#)8J#+2V+6&29")-HH6"07230&"09"F)

_F  B"T'86-4U) ?7-&) L#8:) 9K1H.5+J16.2.) 7H7,:5+CJ2;7<) 6) -./<2,;73) <M732+3) -H) 8:$-&2)3&T:$60)609'&"T:#/-)J$6#H6"07%)X60632+60L)W)\O)9"."3-.:R3YF))

$7CD+)69K4H27)E-12)E;1H1I;CJ2+CD)

V,-./2;,;)E</<HC167)E-12),1345,16+CD)DF  `7R3&29")$-H60L09")H;K;/46)E-1216+CD)8M)R19R1H;K;/+<)IH;,1H;K;/+)")CD1H79:751HF))

IF  @6'"#.#:)R19R1IH;C75+/46<)&0.#QM+2+,)H-)S-8S-."J"HR3)8:0&-3")IH;C751H<)':R$2)7M+62)8"T)6)H3-90)70[+%+,09"),6.946):-<9JCJ16+CD)")6)R19R15+H16.2+3).H,1D1H73F))

KF  a0[+%+,2),6.946):-<9JCJ16+CD)BW)603"#$0LM)&0L+6T4+"#L)-H)D])H-)I])0:-9R3)3T/.0)")9-/M)?2U)&082+-&#).%?)&"#&082+-&#F))

V,-./2;,;)E</<HC167)E-12),1345,16+CD)+HF)DF  b-) J-386#+,&"#) 328:TJ%LM+2+,) 3) S-8S-/."+#$2H0+,) .H,1D1H;) &0.#QM) $#86:2) 975+2+<)

7:.21H1.3;2+)P)CD1H;2+P)IH;C751H<););21J+:1H<F)))

DF  `7R3&29")R19R1IH;C75+/.3;)8M())

)W)R19R.:+/+H1CD1H;2.P))

)W)R19R.:+/+H1975+2.))

)W)R19R.:+/+H17:.21H1.3;2.F))

T19R1IH;C75+/+)

IF) VX2I13;7H;2.) &0.#QM+0) H-) "&&#/-) $-H60L%) S-8S-."J"HR3) 603"#$0) 609"08:) /."+#$-.%)86'"#.#:)8V&/-62&-32F))) @6'"#.#:) 8V&/-9"#."&2) 8:0&-3"<) 3) 9"#L8+#) /."+#$-.%<) 9X2I1J+2.<) 09"&-) 0.'-,-.)603"#$0LM+2)H7%/"<)&"#&082+-&2)70[+%+,)3T/.-3-H-$-32F)

YG   ZH;,1H;K;/+)8M)J-+,-H&29")9X2I1J+2+<)603"#$0LM+29")579J:+)C<,5167F)0G   $D1H79:751H) :-) 9:751;/) 328:TJ%LM+2) 3) 15I.2;J3.CD) 7<,.5;1:+CJ2+CD<) ?$0') /-)

&0:-9"08:)3)-$/0&"690+,)J$-'0$"-:2+6&2+,)

VX2I13;7H;2.);)ZH;,1H;K;/+)

!</16.)CD73;CJ2.)[9G)6-.LC;61LC;)R191R1H;K;/46)

DF  B8JR.&0)+#+,0)."J"HR3)?7-&-32+,)L#8:).3R1XH16+)CD.5.,:75)"+,)+6M8:#+6#'F)

IF  B)3-H&2+,)$-6:3-$0+,):3-$6M)8J-&:0&"+6&"#)E;31H7,<H.527)6.59:6+)H;K;/167<)J-&"#30Q) "+,) +6M8:#+6'") 603"#$0LM) 60$R3&-) I5<K+) D+/51XH167<) L0') ")D+/51R1E167F))

\615J72;7)E-12),1345,16+CD)

DF  b3%30$8:32) ."J"H-3#) 8M) 6+91C7) 2;7K5J7K<9JCJ.H27) H.0) M1246) ;) 6;O,9J1LC;)CJN9:7CJ7,)K1H.52+CD<)+,-+"0Q)60+,-3%LM)8:0&)3)6&0+6&29)8:-J&"%)J72&&2<)J$6#6)+-)9-/M)J#7&"U)$-.#)$-6J%86+60.&"'0)H.0)?"07#')?7-&-32+,F)

\615J72;7)E-12),1345,16+CD)

Wspó!czynniki przepuszczalno"ci ma!ych cz"steczek wykazuj" korelacje z warto#ci" stosunku rozpuszczalno#ci tych cz"steczek w rozpuszczalnikach niepolarnych oraz w wodzie.)

DF  5,0$0':#$28:2+6&#) S%&'+L#) ?7-&<) :0'"#) L0') :5.29K15:P) K5J7,.J+6.2;7) ;2R153.CM;) ")K5J7,9J:.-C.2;7)7275I;;)J$6#?"#/0LM)6)%H6"07#9)9K7C+XCJ2+CD)E;.-7,F))

]G   "2:7I5.H27) E;.-,.) E-12167) $-6+"M/0LM) 8"T) J$6#6) C.-N) I5<E1L^) /6<6.59:6+<) &0:-9"08:)K75+R75+CJ27)E;.-,.)?7-&-3#)63"M60&#)8M)6)K16;75JCD2;.3;)E-12+)J$6#6)-HH6"07230&"0)#.#':$-8:0:2+6&#)")3"M60&"0)3-H-$-3#F))

KF  G7-&2) 8M) 8:$%':%$0.&"#) ") S%&'+L-&0.&"#) .9+37:5+CJ27<) +6#/-) J$62'70H#9) L#8:)'"#$%&'-3-4U)H6"070&"0)828:#9R3):5.29K15:<)M121_6)")-/$0&"+6#&"#)328:TJ-30&"0)579J:)C<,516+CD)H-)6#3&T:$6&#L):2.'-)J-3"#$6+,&")?7-&2)'-9R$#')880'R3F))

$7CD+)E-12),1345,16+CD)

DF  G7-&2)8M)8:$%':%$09")/+2.3;CJ2+3"<)3)':R$2+,)?"07'0)")."J"H2)J$6#9"#86+60LM)8"T)9J+E,1)36H7%Q) J7086+626&2) ?7-&2) X/+R<JM.) E1CJ2.Y<) L#4.") &"#) 8M) -/$0&"+6-&#) 8J#+2V+6&29")"&:#$0'+L09"F)C0:-9"08:)J$6#9"#86+60&"#)."J"HR3)6)L#H&#L)8:$-&2)?7-&2)&0)H$%/0)X/+R<JM.)K1K5J7CJ2.).%?)!"#$!%#Y)L#8:)&0)-/R.)J$-+#8#9)?0$H6-)K161H2+3F))

IF  cS-$9-30&#) L%Q)E;.-,.)E-12167)&"#)J$6#+,-H6M)3)-/R.#)6) L#H&#L) 8:$-&2)H3%30$8:32)&0) H$%/0<) J$6#6) +-) 60+,-30&0) L#8:) .9+37:5;.) E-12F) V:1K;7`) K-+221LC;) ?7-&) 3) H%Q#L)9"#$6#) 60.#Q2) 1/) /-<I1LC;) ;) 9:1K2;.) 2.9+C72;.) -.`C<CD46) 6OIH161/1516+CD<)3+,-H6M+2+,)3)8'70H)."J"HR3)?7-&-32+,F)

.--~~-- - - ~ ~-" -- .;- --- d- - --~

296 Czesc IIBIALKA

nowego rezonansu spinowego. Badania te wykazaly, ze czasteczkafosfolipiduwykonuje jedno przejscie poprzeczne (flip-flop) w czasie kilku godzin (danedoswiadczalne przedstawiono na s. 309 w zadaniu 5). Tak wiec czasteczkafosfolipidu do pokonania w dyfuzji poprzecznej odleglosci 5,0 nm, od-powiadajacej grubosci blony, wymaga 109razy wiecej czasu, niz do pokonaniatej samej odleglosci w kierunku bocznym. Bariera wolnej energii dla ruchuflip-flop czasteczek bialka jest jeszcze wyzsza niz dla lipidów, poniewazbialka maja bardzo rozlegle regiony polarne. W rzeczywistosci nigdy nieobserwowano przemieszczania czasteczki bialka ruchem typu jlip-flop. Dziekitemu asymetria blony moze byc utrzymana przez dlugi okres.

Blonybiologicznesaplynnamozaikalipidówi bialekW 1972 roku S. Jonathan Singer i Garth Nicolson zaproponowali modelplynnej mozaiki, który podaje zasadniczy schemat organizacji blon bio-logicznych. Model ten zaklada, ze blony sa dwuwymiarowymi roztworami

Rys. 11-32. Model plynnej mozaiki.[Wedlug: SJ. Singer, GL Nicolson. Science175(1972):723. Copyright @ 1972 by theAmerican Association for the Advancementof Science]

przestrzennie zorientowanych lipidów i sferycznych bialek (rys. 11-32).Model ten oparto na szerokim wachlarzu obserwacji doswiadczalnych.Glówne cechy tego modelu sa nastepujace:

l. Wiekszosc czasteczek fosfolipidów i glikolipidów jest uporzadkowanaw dwuwarstwe, która spelnia podwójna role: jest zarówno rozpuszczalnikiemdla integralnych bialek blony, jak i bariera przepuszczalnosci.2. Mala czesc lipidów blon oddzialuje specyficznie z niektórymi bialkami

blon, co moze miec istotne znaczenie dla funkcji tych ostatnich.3. W srodowisku lipidowym bialka blon zdolne sa do dyfuzji bocznej,

jezeli nie sa ograniczone specyficznymi oddzialywaniami, nie maja natomiastmozliwosci przemieszczania sie z jednej strony blony na druga.

~ b/ona; komórkowa

Wszystkieblonybiologicznesaasymetryczne

K+

Blony sa asymetryczne zarówno pod wzgledem strukturalnym, jak i funk-cjonalnym. Kazda powierzchnia blony zawiera inne skladniki i wykazujeodmienna aktywnosc enzymatyczna. Doskonalym przykladem tego jest pompa,która reguluje stezenie jonów Na+ i K+ w komórce (s. 330). Ten ukladtransportujacy wystepuje w blonie plazmatycznej niemal wszystkich komórekorganizmów wyzszych. Pompa Na+ i K+ jest zonentowana w blonieplazmatycznej w ten sposób, ze na zewnatrz pompowane sa jony Na+, a do

Rys. 11-33. Asymetria systemu transportuNa+-K+ w blonie komórkowej

--~ .

~ komórki (~3 J.lm2). Nastepnie w tym wycinku niszczy sie czasteczkifluoryzujace intensywnym pulsem swiatla lasera. Powtórny wzrost fluores-cencji w wybranym odcinku mierzy sie jako funkcje czasu stosujac juz teraz

odzyskfluorescencji

7>

A B c

swiatlo o energii dostatecznie malej, aby nie spowodowac powtórnego jejwygaszenia. Jesli badany skladnik blony jest ruchliwy, to czasteczkio wygaszonej fluorescencji beda opuszczaly mierzony wycinek blony, doktórego beda naplywac czasteczki fluoryzujace, co spowoduje powtórnywzrost intensywnosci fluorescencji w tym naswietlonym wycinku. Szybkosc,z jaka intensywnosc fluorescencji powraca do poprzedniego poziomu, zalezyod bocznej wzgledem blony ruchliwosci oznakowanego fluorescencyjnieskladnika, a która mozna okreslic za pomoca stalej dyfuzji D. Sredniadlugosc drogi s (w centymetrach) pokonywanej przez czasteczke w przestrzenidwuwymiarowej, w czasie t (w sekundach) mozna wyznaczyc ze wzoru

s =(4Dt)1/2Stala dyfuzji dla lipidów w róznych typach blon wynosi okolo l J.lm2S-l.Zatem czasteczka fosfolipidu dyfunduje w ciagu jednej sekundy na odleglosc2 J.lm,co oznacza, ze moze ona w tym czasie przemiescic sie zjednego koncabakterii na drugi. Wielkosc obserwowanego wspólczynnika dyfuzji wskazuje,ze lepkosc blony jest okolo 100 razy wieksza od lepkosci wody, a wiec jestpodobna do lepkosci oliwy.W odróznieniu od lipidów, bialka znacznie róznia sie w swojej bocznej

ruchliwosci. Pewne bialka sa równie ruchliwe jak lipidy, inne natomiast sapraktycznie nieruchome. Na przyklad rodopsyna, bialko fotoreceptorowe, jestbardzo ruchliwa, a jej stala dyfuzji wynosi 0,4 J.lm2S-l. Szybki ruchrodopsyny jest istotny dla sygnalizacji, w której bierze udzial. Skrajnie róznyprzypadek przedstawia fibronektyna, glikoproteina peryferyczna, któraoddzialuje ze srodowiskiem zewnatrzkomórkowym, a jej stala dyfuzji D jestmniejsza niz 10-4 J.lm2S-l. Mala mobilnosc fibronektyny jest wynikiem jejzakotwiczenia poprzez integryny do wlókien aktyny po drugiej stronie blonykomórkowej. Integryna jest bialkiem transblonowym laczacym przestrzenpozakomórkowa ze szkieletem komórkowym.

Lipidyblonowemajaograniczonamozliwoscprzemieszczaniasiew poprzekblony,alebialkablonoweniemajajejwcale

Spontaniczne przemieszczanie sie lipidów z jednej strony blony na druga jestprocesem bardzo powolnym, w przeciwienstwie do ich szybkiego ruchuw kierunku równoleglym do plaszczyzny dwuwarstwy lipidowej. Przejscieczasteczki z jednej powierzchni blony na druga nazywa sie dyfuzja poprzecznalub flip-flop, natomiast dyfuzja w plaszczyznie blony nazywa sie dyfuzjaboczna (lateralna) (rys. 11-31). Dyfuzje poprzeczna czasteczek fosfolipidóww pecherzykach fosfatydylocholiny mierzono bezposrednio metoda elektro-

Rozdzial 11 295BUDOWA I DYNAMIKA BLONY

:6-c:Q)u(/)Q)Ci'";;::

wygaszenie

t

'u'(/)oc:~(/)c:Q)C

D czas

Rys. 11-30. Technika odzyskania fluores-cencji utraconej uprzednim wygaszeniemprzez puls laserowy: A - fluorescencjaoznakowanego skladnika powierzchnikomórki w malym oswietlonym rejoniekomórki. B - fluorescencja czasteczkizostaje wygaszona przez intensywny pulsswiatla. C - intensywnosc fluorescencjipowraca, w miare jak czasteczkiz wygaszona fluorescencja opuszczajadyfuzyjnie oswietlony rejon, a naplywajado niego czasteczki fluoryzujace; szybkoscodzyskiwania fluorescencji - D jestzalezna od wspólczynnika dyfuzji

Fibronektyna -Bialko przylaczone adhezyjnie dopowierzchni komórki.Nazwa pochodzi od lacinskiego fibra"wlókno" i nectere "wiazac" lub"laczyc" .

~TI

)1~

szybka TI~

~~~dyfuzja boczna

~TI

~~

bardzopowolna

TITI

~~::::"

dyfuzja poprzeczna(1Iip-Ilop)

Rys. 11-31. Boczna dyfuzja lipidów jestznacznie szybsza niz dyfuzja poprzeczna(flip-flop)

$7CD+)E-12),1345,16+CD)

*9)=)d))*9)G)

$D1H79:751H)70/-H6")J$6#L4+"0)9"TH62)$RQ&29")8:-J&"09")J.2&&-4+")?7-&2F)

=C*eW'$28:0."60+L0)

FG   Q5J7K<9JCJ.H21L^) /6<6.59:6+) H;K;/167M) 9"#$62) 8"T) 3) H3R+,) 828:#90+,)9-H#.-32+,())

)0Y)JT+,#$62'0+,)."J"H-32+,)X."J-8-90+,Y)))

)?Y)J708'"+,)?7-&'0+,)H3%30$8:3-32+,F)

IF)!"(=@()!=#>#*&)a)K16;75JCD2;167<)"&:#/$0.&#)")86"#.#:-3#)

].G) Q16;75JCD2;167) W) +6M8:#+6'") ,2H$-V.-3#<) 3"MQM) 8"T) 6) ?7-&0M) XJ-.0$&#) S$0/9#&:2)."J"HR3Y)")?"07'09")"&:#/$0.&29")/7R3&"#)J$6#6)-HH6"07230&"0)L-&-3#)

W)XE5127,:+2.)W)&0)6#3&T:$6&#L)J-3"#$6+,&")?7-&2)

$7CD+)E-12),1345,16+CD)

T;E5127,:+2+) $#/%.%LM) -HH6"07230&"0) '-9R$'0W90+"#$6)J$6#6)"&:#$0'+L#)6)"&:#/$2&09"F))

fHH6"07%LM+) 6) 57C7K:1573) ;2:7I5+216+3<)$-6J-+62&0LM) '08'0HT) 6H0$6#[<) ':R$#L) 32&"'"#9)L#8:) J$6#'06) 82/&07R3) 6#) 4$-H-3"8'0)6#3&T:$6&#/-)H-)3&T:$60)'-9R$'"F))

G"-$M) %H6"07) 3) ./D7JM;P) K51H;R75.CM;P)51JK-.9JCJ.2;<) ") 3;I5.CM;) ,13457,<) K51C79.CD)73E5;1I727J+) -$06) 3) :,.2,16+CD) K51C79.CD)2.K5.6CJ+CD)J-)6$0&"#&"0+,)

IF)!"(=@()!=#>#*&)g)J-3"#$6+,&"-3#<);2:7I5.H27);)9J;7H7:167)

]Eb) "2:7I5.H27) W) ,2H$-S-?-3-) 3"MQMh) 8"T) 6) 0J-.0$&29) S$0/9#&:#9) ."J"H-3#L) ?7-&2)'-9R$'-3#L))

IH;,1R15+2.) () W) L#L) $#86:2) +%'$-3+-3#<) -?-') $#86:) +%'$-3+-32+,) /."'-."J"HR3) 8M)$#+#J:-$09")H.0)3"$%80)/$2J2)-$06).#':2&)W)?"07#')83-"4+"#)3"MQMh+2+,)8"T)6)+%'$-3+09")X3)#$2:$-+2:0+,)-HJ-3"0H0)60)+,0$':#$)0&"-&-32)?7-&2)'-9R$'-3#LY)

E;.-,1) Y) 9JCJ+:<) 7H7,:51R157:+CJ27I1) c!YV&b) W) J#7&") S%&'+LT) '0&07%) H.0) :5.29K15:<).2;1246)J$6#6)?7-&T)#$2:$-+2:%)

6.H;213+C+2.W) )?THM+0)+6M8:#+6'M)+2'."+6&0<)K5J7219;)@d)J-J$6#6)?7-&T):3-$6M+)3-'R7)63"M60&#/-)L-&%)-87-&T),2H$-S-?-3MF))

I5.3;C+/+2.) () :3-$62) L0'-) H"9#$) J-$) :$0&8?7-&-32) J$6#J%86+60.&2) H.0) ,.e1246)M7/216.5:1LC;16+CDF)

$7CD+)E-12),1345,16+CD)

]Cb) VJ,;7H7:167) W) :3-$6M) J-H) ?7-&M) ,1345,16N)6+LC;4-,O<) '-:3"+6M) 8"T) H-) &"#':R$2+,)E;.-7,) :5.29E-1216+CD) -$06) 8M) J-3"M60&#) 360L#9&"#) %:$629%LM+) '86:07:) '-9R$'")60J#3&"0LM+)?7-&"#)'-9R$'-3#L)#.08:2+6&-4U)")32:$62907-4U)

9K7,:5+2.)W)H"9#$<)9-&-9#$2)i)")jF)

!-12.),1345,16.)75+:51C+:<)

DF  G7-&0) '-9R$'-30) 75+:51C+:<<) L#H#&) 6) &0L+6T4+"#L) ?0H0&2+,) ") &0L.#J"#L) J-6&0&2+,):2JR3)?7-&2<)603"#$0)H%Q#)".-4+")/64CD)E;.-7,):5.29E-1216+CDF)

]G   @.2.-).2;1216+)J-4$#H&"+62)3)329"0&"#)61/1516OIH.246);)M1246)CDH15,16+CDF))

KF  *#)"&:#/$0.&#)?"07'0)?7-&-3#)3"MQM)8"T)J-J$6#6)E;.-,1)0GF);).2,;5+2O)6)#.08:2+6&0)8"#+"M)6?%H-30&0) /7R3&"#) 6#) 9K7,:5+2+F) *#&) 86'"#.#:) ?7-&-32) %9-Q."3"0) -HJ-$&-4U)#$2:$-+2:%)&0)9#+,0&"+6&#)8"72)-H'86:07+0LM+#F)

k28F)DDW]^F)@+,#90:)J$-J-&-30&#/-)8J-8-?%)63"060&"0)86'"#.#:%)?.-&2)#$2:$-+2:%)H-)?.-&2)'-9R$'-3#L)

FG   Q5J7K-+6) M1246) ;) CJN9:7CJ7,) J$6#6) ?7-&2) ?"-.-/"+6&#) L#8:) '-&:$-.-30&2) J$6#6) H3"#)'.082)E;.-7,):5.29E-1216+CD<),.2.H+)")K13K+F)

IF  !0&072) :3-$6M) C;NIH7) K1H.527) /51I;) 3) J-J$6#') ?7-&2<) ':R$#) %9-Q."3"0LM)J$6#9"#86+60&"#) L-&-l3) JI1/2;7) J) ;CD) I5./;72:.3;) 7H7,:51CD73;CJ2+3;F) !0&0.2)%9-6."3"0L0) 862?'") J$6#J.23) L-&R3) J$6#6) ?.-&2) 3) ,;75<2,<) :7531/+2.3;CJ2;7),15J+9:2+3)X0&/F)!"#$%&''YF))

YG   Q13K+<)6%Q230LM+)m$RH70)83-?-H&#L)#&#$/""<)&JF)=*A).%?)43"0:7-<)J$-30H6M):$0&8J-$:)L-&R3) .%?)+6M8:#+6#')3),;75<2,<)6J5.9:.MNC7I1)9:Of72;.<) 0)3"T+) :7531/+2.3;CJ2;7)2;7,15J+9:2+3F))

@.2.-+);)K13K+)M12167)

A-9J0)C0no!n)!0&072)L-&-3#)

DF  B2H0L&-4U)J$6#J723%)3)'0&070+,)9-Q#)-8"M/&MU)Fgh)M1246)2.)97,<2/OF))

IF  !0&072) %:3-$6-&#) 8M) 6) "H#&:2+6&2+,) .%?) D131H1I;CJ2+CD) K1/M7/219:7,) ?MHm) 6),-9-.-/"+6&2+,) H-9#&) J-L#H2&+6#/-) 70[+%+,0) J-."J#J:2H-3#/-F) *2J-30) ".-4U)J-HL#H&-8:#'):-)0P)i).%?)jF))

KF  A-$) '0&07%) J$6#?"#/0) 36H7%Q) -8") 829#:$"") -."/-9#$%F) B8628:'"#) '0&072) 90L0) 8:0&2)1:6.5:7) ;) J.3,2;O:7P) 0) J#3&#) 6) &"+,) $R3&"#Q) 9:.2) 2;7.,:+62+<) ':R$2) L#8:)'-&:$-.-30&2)J$6#6)3?%H-30&2)3)+6M8:#+6'#)6#/0$F)A$6#L8+"#)9"#H62)S-$90)609'&"#:0)0) -:30$:0) L#8:) 57I<H16.27) .HH19:75+CJ2;7)J$6#6) J-:#&+L07<) 63"M60&"#) "&&#L) +6M8:#+6'").%?)9-H2V'0+L#)'-30.#&+2L&#F))

]F  B28-'")8:-J"#)8J#+2V+6&-4+")3"#.%)'0&07R3)%30$%&'-30&2)L#8:)EH;9,;3;);2:75.,CM.3;)9"#H62):5.29K15:16.2+3)M1273).)579J:.3;)6+LC;7H.MNC+3;)K15)3)-?860$6#)630&29)XH:573)97H7,:+621LC;F))

@.2.-+)M12167)

!0&072)8-H-3#)

DF  !0&07) 57C7K:15.) .C7:+H1CD1H;2167I1) J-4$#H&"+62) 3) J$6#'06230&"%) 9+I2.-46)275616+CD)K5J7J)9+2.K9+F)

IF  !0&0.) M121:51K167I1) 57C7K:15.) .C7:+H1CD1H;2167I1) L#8:) 600&/0Q-30&2) 3)J$6#'0m&"+:3-)82&0J:2+6&#)X'0&07)?$09'-30&2)J$6#6)."/0&HYF))

KF  p3"M60&"#) /64CD) CJ.9:7CJ7,) .C7:+H1CD1H;2+) 1:6;75.) ,.2.-F) @62?'"#) 69&"#L86#&"#)8:TQ#&"0)0+#:2.-+,-."&2)3)86+6#."&"#)82&0J:2+6&#L)323-70&#),2H$-.":2+6&M)0':23&-4+"M)78:75.J+).C7:+H1CD1H;2167M<)J$-30H6")H-)609'&"T+"0)'0&07%F))

]F  `H2) /<f7) 9:Of72;7) .C7:+H1CD1H;2+) %:$629%L#) 8"T) J$6#6) H7%Q862) +608<) '0&07) 6-8:0L#)1/CJ<H12+F)

iG   V7H7,:+621L^),.2.-<)$#+#J:-$0)0+#:2.-+,-."&-3#/-)H.0)'0q-&R3)L#8:)&0$6%+-&0)J$6#6):$62) J"#$4+"#&"#) 3) J-$6#<) %:3-$6-&#) 6) 70[+%+,R3) ?-+6&2+,) &070H-30&2+,) %L#9&"#)X'-.-$)+6#$3-&2YF)

@.2.-+)M12167)

FG   V7H7,:+621L^) M1216.) '0&07%) 8-H-3#/-) +6#4+"-3-) 60.#Q2) -H) CJ+22;,46)9:75+CJ2+CDF) N-&)C0n) ") >"n)3$06) 6) +6M8:#+6'M)3-H2) J08%L0) H-) '0&07%) J-H-?&"#) L0'),2H$-'82.09"&0)"),2H$062&0F)C0:-9"08:)L-&)!n)36"T:2)$06#9)6)+6M8:#+6'M)3-H2)L#8:)60)H%Q2F)

]G   Q1:72CM.-+) CJ+221LC;167) 8M)32&"'"#9)K5J7MLC;16+CD)6J519:46) K5J7K<9JCJ.H21LC;)?7-&2)'-9R$'-3#L)H.0)>.d<)0)&08:TJ&"#)H.0)@dF))

YG   @.2.-)91/16+)-HJ-3"#H6"0.&2)60):0'M)J$6#J%86+60.&-4U)603"#$0)CJ:75+)6762O:5J27)K16:45J72;.) K1/1E27M) 97,672CM;<) ':R$#) %8:03"0LM) 8"T) 36/.TH#9) 8"#?"#)829#:$2+6&"#):3-$6M+)J-$F))

0G   V7H7,:+621L^),.2.-<)61E7C)>.n)J-.#/0)&0)-?#+&-4+")3)J-$6#)'0&07%)K;75LC;72;.)1)3.-+3)K513;72;<)<:615J127I1)6)$#86:)-)%L#9&29)70H%&'%F)

@.2.-)91/16+)

DF  G%H-30&"#) I5./;72:46) M1216+CD) 3) J-J$6#') ?7-&2) '-9R$'-3#L) ") 0'%9%.0+L0)8%?8:$0:R3)#&#$/#:2+6&2+,)60+,-H6")H6"T'")H6"070&"%)9+9:7346).,:+627I1):5.29K15:<<)+62.") K13K<) ':R$#) $RQ&"0) 8"T) 3) 8J-8R?) 6080H&"+62) -H) ,.2.-46<) 8:0&-3"M+2+,) <,./-+):5.29K15:<)E;7527I1F))

IF  A$-+#8) :$0&8J-$:%) L#8:) E;752+<) /H2) 7275I;.) 961E1/2.) kZ) H.0) :$0&8J-$:-30&#L)+6M8:#+6'") .%?) L-&%)90)30$:-4U)%L#9&0<)&0:-9"08:) L#8:).,:+62+<) /H2)kZ)90)30$:-4U)H-H0:&"MF))

YG   \5.29K15:) .,:+62+) 3290/0) 8J$6TQ-&#/-) H-J723%) 961E1/27M) 7275I;;<) ':R$0) 9-Q#)J-+,-H6"U) 6) (\Q<) 7H7,:51CD73;CJ27I1) I5./;72:<) >.d) H<E) %d) X8"70) 8-H-3-W) .%?)J$-:-&-9-:-$2+6&0Y<)0):0'Q#)6#)L6;.:-.F))

0G   Q13K+) $RQ&"M) 8"T)-H) '0&07R3)3) "8:-:&2) 8J-8R?<)&"/H2)?-3"#9)2;7)6+9:OK<M7)3)&"+,)K15)9;OI.MNC+)J)M7/27M)9:512+)E-12+)2.)/5<IMF))

Q13K+)E-12167)

DF  B) J-9J0+,) 60+,-H6") &0:-9"08:) C+,H) K5J7ML^) ,12R153.C+M2+CD<) ':R$#) $R3&-+6#4&"#)69"#&"0LM) -$"#&:0+L#) 9"#L8+0) 3"MQM+#/-) ") L#/-) J-3"&-30+:3-) H-) :$0&8J-$:-30&2+,)+6M8:#+6#') .%?) L-&R3F) r072) S$0/9#&:) :5.29K15:<MNC7I1) E;.-,.) %.#/0) J$6#L4+"-3#L)76759M;)3) +608"#) '0QH#/-) C+,H<) :5.29K15:<<) ':R$2) J$6#?"#/0) L#H&-'"#$%&'-3-) H6"T'")6+/.:,16.2;<)961E1/27M)7275I;;F)r0'8290.&0)862?'-4U):$0&8J-$:%)J$6#6)J-9J2)L#8:)$6TH%)Fg0)M1246)2.)97,<2/O<)0)3"#+)6&0+6&"#)9&"#L860)&"Q)J$6#6)'0&072F)

IF  C0L+6T4+"#L)328:TJ%LM+29)9+9:7373):5.29K15:<)3)'-9R$'0+,)63"#$6T+2+,)L#8:)K13K.)>.dP) @d) <) ':R$0) ,2H$-."6%L#) +6M8:#+6'T) =*A) ") %Q230) #&#$/"#) :#/-) J$-+#8%) H-)6+K13K16.2;.):5J7CD)M1246)>.d)-$06)H-)6K516./J72;.)/64CD)M1246)@dG)

Q13K+)E-12167)

DF  !-9R$'")J-8"0H0LM)H%Q0)J/1H21L^)57.I16.2;.)2.)9+I2.-+)H-+"#$0LM+#)H-)&"+,)J)1:1CJ72;.)X5<CD) E.,:75;;)3) '"#$%&'%) 8%?8:0&+L") -HQ23+62+,<)6+,5+6.2;7) L6;.:-.) J$6#6) '-9R$'")8"0:'R3'"<) <6.H2;.2;7) 9<E9:5.:46) 7275I7:+CJ2+CD) J$6#6) D15312.H2+) 9+I2.-) I-1/<) ")"&H%'+L0)$RQ&"+-30&"0)J$6#6)+62&&"'")36$-8:%YF)

IF  r-.#'%.0$&#)-?3-H2)3)'-9R$'0+,)67-Q-&#)8M)6)57C7K:1543<)72J+346<),.2.-46)")E;.-7,)57I<H.C+M2+CDYF)

KF  fH?"R$) ") J$6#:30$60&"#) ?-Hm+0) 60+,-H6") 60) J-4$#H&"+:3#9) $RQ&#/-) $-H60L%) ,.9,./)K5J7,.J<MNC+CD)9+I2.-F)b3-90)&0L.#J"#L)6$-6%9"0.29")K51C79.3;):5.29R153.CM;)9+I2.H<)80()CD731:.,9M.)<)E.,:75;;)")K51C79)6;/J72;.)<),57I16C46F))

]F  5,#9-:0'8L0) %) ?0':#$"") L#8:) 5<CD73) ,13457,) E.,:75+M2+CD) ,<) .:5.,:.2:19) .%?) 1/)57K7H72:46G))

@.9,./+)K5J7,.J<MNC7)9+I2.-)

Q51M7,CM.)/51I;)J$6#?2:#L)J$6#6)?0':#$"#)%628'0&0)60)J-9-+0)9"'$-8'-J%<)':R$2)4.#H6")0%:-90:2+6&"#)$%+,)?0':#$"")3):$6#+,)329"0$0+,F))

$D731:.,9M.)?0':#$"")8'%J"0L0+0)'-9R$'")J$62)'0J".0$6#)603"#$0L0+#L)0:$0':0&:<)&JF)/.%'-6#)

DF  ;&S-$90+L0)-H#?$0&0)J$6#6)CD73157C7K:15+)3)?7-&"#)'-9R$'-3#L)J$6#'86:07+0&0)L#8:)3)'08'0H6"#) J$6#'06%LM+#L) ") J$6#&-86-&0) H-)31H7,<H.52+CD) 1E51:16+CD) 31:1546) 6;C;)E.,:75;;G) !"#$%&#') -?$-:%) 3"+") 326&0+60&2) L#8:) -'$#8-3-) J$6#6) CJ:75+) 51/J.M7)57C7K:1546)0':23%LM+2+,)'08'0HT)S-8S-$2.0+2L&MG))

]G   #E51:+) 6) ,;75<2,<) J$6#+"3&29) H-) $%+,%) 38'06R3#') 6#/0$0) J-3-H%LM) $R3&-9"#$&#)K-+2;OC;7) E.,:75;;) 6) K5.6;7) K519:7M) H;2;;<) &0:-9"08:) -?$-:2) 3) '"#$%&'%) 6/-H&29) 6)$%+,#9)38'06R3#') 6#/0$0) 323-7%LM) ,1J;1-,16.2;7) X()*%+ *%,"-.*/$.Y<) %9-Q."3"0LM+#)J3;.2+),;75<2,<)5<CD<F))

$D731:.,9M.)<)E.,:75;;))

)A$6#J.23)"&S-$90+L")3)J$6#?"#/%)CD731:.,9M;)E.,:75;;F))

'-6"-7'-30&"#)

DF  `H2) ?0':#$"0) J-$%860) 8"T) 3) '"#$%&'%) .:5.,:.2:<) .%?) -HH0.0) 8"T) -H) 57K7H72:<<)'-6"-7'-30&"#)L#8:)8:7%9"-&#F)@13KH7,9+)57C7K:15W57K7H72:)8:29%.%LM).<:1R19R15+H.CMO)E;.-,.)$D7(F)C08:TJ&"#)I5<K.) R19R15.216.) 6-8:0L#) J$6#&"#8"-&0)&0)$D7e<) 609"#&"0LM+):#&)-8:0:&")3)S-$9T)"&H%'%LM+M)'-6"-7'-30&"#F)(:5.,:.2:+)323"#$0LM)#S#':)J$6#+"3&2F))

IF  fHJ-3"#Hm)'-9R$'")&0)6J519:)9:Of72;.).:5.,:.2:<)H<E)57K7H72:<)L#8:),54:,1:56.-0F))

YG   (/.K:.CM.) %9-Q."3"0) ?0':#$"") 6+CJ<6.2;7) I5./;72:46<) 0) &"#) ?#636/.TH&2+,) 8:TQ#&)0:$0':0&:-l3)")$#J#.#&:R3F)!$2:2+6&0)H.0)0H0J:0+L")L#8:)-H3$0+0.&0)9#:2.0+L0)$#+#J:-$R3)+,#9-:0':2+6&2+,F)

0G   $D731:.,9M.) E.,:75;;) %3"H0+6&"0<) L0') K57R7516.2;7) K5J7E;7I<) L#H&2+,) 6H0$6#[)J$62J0H'-32+,)3)8:-8%&'%)H-)"&&2+,)9-Q#)J$-30H6"U)H-)?0$H6-)+#.-3#/-)60+,-30&"0)8"TF)

$D731:.,9M.)<)E.,:75;;))

Q51C79)6;/J72;.)<),5OI16C46)

DF  B)9;.:,46C7)1,.),5OI16C46)328:TJ%LM)H30)$-H60L#),13457,)R1:157C7K:1516+CD<)630&#)K5OC;,.3;);)CJ1K,.3;F)

]G   $J1K,;)-H?"#$0LM)?-Hm+#)L6;.:-.)-)9;H2+3)2.:Of72;<);)6.5<2,<MN)51J54f2;.2;7) E.56<) &0:-9"08:) 3"H6#&"#) 6) K5J+C;732;12+3)L6;7:H7)60.#Q2)-H)K5OC;,46<)':R$#)&"#)$-6$RQ&"0LM)?0$3F))

YG   @1345,.) K5OC;,16.) 8"0:'R3'") 9-Q#) 6-8:0U) J-?%H6-&0) J$6#6)K1M7/+2CJ+) R1:12<) ':R$2) J.3+,.) 97:,;) ,.2.-46) 8J#+2V+6&2+,)3-?#+) '0q-&R3) ") J-3-H%L#),"J#$J-.0$260+LT)-)-'-.-) .)9s<) +-)L#8:) 6+CJ<6.27) K5J7J) 9+2.K9O) ") J$6#&"#8"-&#) H-) "&&2+,)&#%$-&R3)8"0:'R3'"F)

r"'$-/$0V0)8'0&"&/-3-W#.#':$-&-30)'-9R$#')J$T+"'-32+,)8"0:'R3'"F))

FG   B1/1K9+2.) L#8:) +67-&'"#9) $-H6"&2) 57C7K:1546) E-1216+CD) -) 8"#H9"%) ,#."80+,<)-?#L9%LM+#L) $#+#J:-$) lW./57275I;CJ2+<) 57C7K:15+) 6OCD167) ") 57C7K:15+) CJ+22;,.),12;<I.CM;)/51f/f+F))

Q51C79)6;/J72;.)<),5OI16C46)

'1/7H) E</16+) 51/1K9+2+) W) 8"#H9"-,#."8-32) 9-:23) :#/-) :$0&8?7-&-3#/-) $#+#J:-$0) 328:TJ%L#)$R3&"#Q)3)"&&2+,)57C7K:15.CD)D15312.H2+CD)")CJ<C;16+CD)c972915+CJ2+CDYF))$D5131R15P)HHWC;9W57e2.H)L#8:)%9"#86+6-&2)3)J-?."Q%)L51/,.)/6<6.59:6+F))

DF  5D5131R1573) 51/1K9+2+<) ?"07'0) R1:157C7K:15167I1) L#8:)FFWC;9W57e2.H<) J-+,-H6M+2) 6)C.-,16;C;7W:5.29W57e21H<)X3":09"&2)=YF))

]G   Q1E</J72;7)6J51,167)32630.0&#) L#8:) J$6#6) R1:1;J1375+J.CM7) HHWC;9W57e2.H<)3) S-$9#)+07'-3"+"#):$0&8F))

YG   FFWC;9WB7e2.H)L#8:)63"M60&2)3)51/1K9+2;7)J)E;.-,;73)c1K9+2.b)J-7M+6#&"#9):2J%)6080H2)@+,"t0F) `$%J0) 0.H#,2H-30) FFWC;9W57e2.H<) 3"MQ#) 8"T) 6) 09"&-3M) /$%JM) 8J#+2V+6&#L)$#86:2)."62&-3#LF))

]F  A-?%H6-&0) 83"0:.#9) $-H-J82&0) XkuY) 0':23%L#) '08'0H#) #&6290:2+6&0) J$-30H60+) H-)

Q51C79)6;/J72;.)<),5OI16C46)

@J#':$%9)0?8-$J+2L&#)$-H-J82&2)

DF  B"#.-'$-:&"#)369-+&"-&0)1/K16;7/J;N)J762O:5J27I1)1/C;2,.),1345,;)K5OC;,167M)&0)?-H6"#+)43"#:.&2)L#8:)J.3,2;OC;7),.2.-46)9K7C+XCJ2+CD)61E7C),.e1246<)J-3-H%LM+#),"J#$J-.0$260+LT)'-9R$'"F))

IF  A$6#J723) K12./) 3;H;12.) M1246) 91H%) 6-8:0L#) 60?.-'-30&2) 3) #S#'+"#) 0?8-$J+L")K1M7/+2CJ7I1)R1:12<)J$6#6)'-9R$'T)J$T+"'-30)600H0J:-30&0)H-)+"#9&-4+"F))

KF  B)+"#9&-4+") '0&072) ?7-&2) '-9R$'-3#L) 8J#+2V+6&#)3-?#+) '0q-&R3) 8M)<:5J+3+6.27)1:6.5:7)K5J7J)C+,H;CJ2+)Z'Q<)+2'."+6&2)&%'.#-:2H)J-38:0LM+2)6)`*AF)

Q51C79)6;/J72;.)<),5OI16C46)

$+,H;CJ2+)Z'QP)J-?%H60L0+0)+608:#+6'0)3)J$-+#8"#)3"H6#&"0):3-$6-&0)L#8:)J$6#6)+2'.06T)/%0&2.0&-3M<)0)$-6'.0H0&0)$6#6)8J#+2V+6&M)S-8S-H"#8:$06TF)

43"0:7-)))) ) ) ) )+"#9&-4U) ) ) ) ))))43"0:7-)

B2'70H)P)

!;.-,.m),12R153.CM.P)/+2.3;,.);)R<2,CM.)X+HFY)

W)A$6#+"3+"070)")$#+#J:-$2)."9S-+2:R3))

W)r-.#'%.0$&#)9-:-$2))W)v07H-30&"#)8"T)")J$-L#':-30&"#)?"07#')