UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

Jéssica Christina Lois de Oliveira Campos

Interações entre as Isoformas Alfa e Beta dos Receptores de Hormônios Tireoidianos (TR) e outras

Proteínas Celulares

CAMPINAS

2016

JÉSSICA CHRISTINA LOIS DE OLIVEIRA CAMPOS

Interações entre as Isoformas Alfa e Beta dos Receptores de Hormônios Tireoidianos (TR) e outras Proteínas Celulares

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Ciências, na área de concentração em Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.

Orientadora: Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira

CAMPINAS

2016

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JÉSSICA CHRISTINA LOIS DE OLIVEIRA CAMPOS E ORIENTADA PELA DRA. ANA CAROLINA MIGLIORINI FIGUEIRA.

Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2011/23659-2

Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de Biologia

Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972

Campos, Jéssica Christina Lóis de Oliveira, 1989-

C157i CamInterações entre as isoformas alfa e beta dos receptores de hormônios

tireoidianos (TR) e outras proteínas celulares / Jéssica Christina Lóis de

Oliveira Campos. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.

CamOrientador: Ana Carolina Migliorini Figueira.

CamTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Biologia.

Cam1. Receptores dos hormônios tireóideos. 2. Interação proteína-proteína. 3.

Técnicas do sistema de duplo-híbrido. 4. Espectrometria de massas. I.

Figueira, Ana Carolina Migliorini. II. Universidade Estadual de Campinas.

Instituto de Biologia. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Interactions among isoforms alpha and beta of thyroid hormone

receptor (TR) and other cellular proteins

Palavras-chave em inglês:

Receptors, Thyroid hormone

Protein-protein interaction

Two-hybrid system techniques

Mass spectrometry

Área de concentração: Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde

Titulação: Doutora em Ciências

Banca examinadora:

Ana Carolina Migliorini Figueira [Orientador]

Sandra Martha Gomes Dias

Francisco de Assis Rocha Neves

Fernanda Aparecida Helena Batista

Célia Regina Nogueira

Data de defesa: 31-08-2016

Programa de Pós-Graduação: Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Campinas, 31 de agosto de 2016.

COMISSÃO EXAMINADORA

Dra. Ana Carolina Migliorini Figueira (Orientadora)

Dra. Sandra Martha Gomes Dias

Prof. Dr. Franscisco de Assis Rocha Neves

Dra. Fernanda Aparecida Helena Batista

Prof. Dra. Célia Regina Nogueira Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

A tese de doutorado aqui apresentada recebeu apoio de agência de fomento

a pesquisa científica e tecnológica, conforme descrito abaixo,

Agência: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo

Linha de Fomento: Doutorado Direto

Número do Processo: 2011/23659-2

Beneficiário: Jéssica Christina Lois de Oliveira Campos

Agência: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo

Linha de Fomento: Bolsa Estágio de Pesquisa no Exterior - Doutorado

Número do Processo: 2014/22215-1

Beneficiário: Jéssica Christina Lois de Oliveira Campos

Agência: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo

Linha de Fomento: Projeto

Número do Processo: 2013/08743-2

Beneficiário: Dra. Ana Carolina M. Figueira

Dedicatória:

Aos meus avós, pais e padrinhos: Cleusa Pereira de

Souza & Wilson Maffei Lois. Pelo amor incondicional, - e café - todas as manhãs.

A Molly, por me ensinar que tudo acontece em seu

tempo.

Agradecimentos “Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu não teria saído do lugar... As facilidades nos impedem de caminhar. Mesmo as críticas nos auxiliam muito.” (Chico Xavier) A minha família Lois. Fabiana (Mãe), Cleusa & Wilson (avós), por todo o apoio e amor. Sem vocês eu não chegaria até aqui. A minha segunda família, Scozzafave, tão acolhedora e sempre pronta a me ajudar: Maria, João, Cassio & Sanny. Ao Marcio, e ao meu irmão, Bruno, pelo apoio e carinho. Aos amigos e irmãos que a vida me deu. Daniela Bertelli, Bianca Assunção, Rebeka Melo, Carolina Mantovani, Marina Cabral ... Desde 2001 juntas pra vida toda. Aos meus amigos da ‘Rep33’: Andre Godoy, Danielle Pini, Gabriela Vitcosque, Flavia Facchini, Marina Ramia, Carla Codima. Desde 2007 me fazendo crescer e evoluir como pessoa. Obrigada pelas risadas, por ouvirem meus dramas, pela sinceridade. A minha Sis, Bruna Tullio, você além de ser minha confidente e irmã, me ensinou que amizade não tem barreiras de tempo e distância. A minha 'ermã', Bárbara Pires, obrigada por me ensinar a ser forte, e por me mostrar como ser uma pessoa melhor. As minhas eternas ‘LECas’ (Aline Bridi, Juliana Fattori, Tábata Doratioto, Michelle Assis, Nathalia Indolfo, Natalia Videira). Crescemos juntas profissionalmente e aprendemos a ser mais fortes. Vocês foram essenciais nessa trajetória. As 'macaca-véia' da dança, pelos happy-hours e lembranças maravilhosas. A todos amigos que fiz em Houston. Aos colegas e amigos do LNBio que de uma forma ou outra contribuiram para o desenvolvimento dessa pesquisa. Obrigada: Marcel Nakahira pela ajuda no desenvolvimento dos ensaios de duplo-híbrido. LECas que também me ajudaram. Beatriz Alves pelas clonagens, Gabriela Meirelles pela ajuda na construção das redes de interação. Helder Veras pela construção dos modelos de docking e mutagenese. Juliana Fattori pela ajuda com a produção das proteínas e ensaios biofísicos. A minha orientadora, Dra. Ana Carolina, pela oportunidade e orientação. Ao Dr. Paul Webb e todos que conheci no Houston Methodist Research Institute. Durante 6 meses aprendi e cresci muito como cientista. A FAPESP pelo financiamento dos projetos de Doutorado e Pesquisa no Exterior. Ao LNBio e a todas as instalações utilizadas nesse projeto: LEC, LPP, MAS, LBC e LVV. E por último e nunca menos importante, a você Caio. Obrigada pelo amor, amizade, apoio, otimismo. Não consigo enumerar aqui o tamanho da sua importância para o desenvolvimento e finalização desse projeto. Obrigada por me tornar uma pessoa melhor. Sempre.

“Continue a nadar... Para achar a solução

...continue a nadar...”

Dory

Resumo Receptores Nucleares (RNs) são proteínas ativas na presença de moléculas pequenas

e hidrofóbicas, os quais atuam na regulação direta sobre a transcrição de genes. Os

Receptores de Hormônios Tireoidianos (TRs) são RNs que possuem efeitos na taxa

metabólica e consumo de oxigênio, e também funções únicas em diversos órgãos. Os

TRs possuem duas isoformas: TR e TR, e sua expressão é diferenciada em vários

tecidos. Os hormônios que se ligam aos TRs são a tiroxina (T4) e a triiodotironina

(T3). Atualmente, um melhor entendimento sobre a regulação da transcrição por

estes receptores tem se tornado uma necessidade para o mapeamento de

diferenças que poderiam resultar em novos alvos para a regulação de diversas

patologias. Para isso, usamos screenings de duplo-hibrido (y2h) e imunoprecipitação

(IP) seguida de espectrometria de massas (LC-MS/MS) para identificar o maior

número possível de parceiros de interação, buscando diferenças entre suas

isoformas e a influência do T3 nestas interações. Primeiramente, concluímos que

TR faz mais interações com outras proteínas, se comparado à isoforma . Em

segundo lugar, observamos a diminuição da expressão de TRs após tratamento com

T3. Em terceiro lugar, foram montadas redes de interação nas quais foram

evidenciados os processos biológicos nos quais os candidatos participam. Em

seguida, algumas interações encontradas com proteínas reguladoras de ciclo celular

foram confirmadas por co-imunoprecipitação (Co-IP), sendo uma delas formada por

TR e a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Esta interação foi investigada mais

profundamente e nossos resultados demonstram que a PDI é capaz de interferir na

expressão regulada por TR, sendo que o knockdown de PDI revelou a alteração na

expressão de alguns genes. Este complexo foi caracterizado através de ensaios

biofísicos e observamos que a formação do complexo não altera o recrutamento de

coativadores por TR. Por fim, modelos in silico demonstraram as possíveis interfaces

de interação do complexo. Com isso, sugerimos que TRs podem ter um papel muito

importante em vias pouco estudadas como ciclo celular, e que mecanismos redox

podem ser importantes para alterar a regulação gênica mediada por TR.

Abstract

Nuclear Receptors (NRs) are proteins activated by small hydrophobic molecules that

act directly in regulation of gene expression. Thyroid Hormone Receptors (TRs) are

NRs involved in maintaining metabolic rates, oxygen consumption and have unique

functions in different organs. There are two isoforms of TRs: TR and TR, each one

has different expression among human tissues. The small hydrophobic molecules

responsible for TRs regulation are triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4)

hormones. Nowadays, a deeply understanding of indirect non-classical transcription

regulation by TRs could lead to a better mapping of the main differences between

normal and pathological states of the cell. To do so, we performed screenings in

yeast two-hybrid system (y2h) and immunoprecipitation (IP) followed by Mass

Spectrometry (LC-MS/MS) to identify novel interactors for TRs and to elucidate

possible differences between both isoforms plus and minus T3. The results showed

TR binding a superior number of interactors in comparison with TR. In second

place, treatment with T3 decreases TR expression. In third place, we build

interactomes for TRs and we classified the protein candidates by biological process

(BP). Following, important candidates from cell cycle regulation BP were confirmed

by Co-immunoprecipitation (Co-IP) with TRs. One of those interactions, TR and

protein disulfide isomerase (PDI) was further investigated and our results showed

that PDI changes TR-gene regulation in reporter gene assays. In addition, PDI

knockdown alters expression of some genes. In Biophysical Assays we characterized

TR-PDI complex and measure binding affinities (Kd). We observed that complex

formation do not change coactivator recruitment. Finally, we built in silico models in

order to elucidate TR-PDI possible interfaces of interaction. Overall, we suggest that

TRs have important roles in less studied pathways, as cell cycle regulation, and TRs

could be regulated by redox mechanism to change gene expression.

Lista de Figuras FIGURA 1. Ilustração esquemática da organização estrutural e funcional dos receptores nucleares. As regiões mais bem conservadas C e E estão representadas por um retângulo cinza, e as barras coloridas são as regiões divergentes A/B, D e F. AF-1 e AF-2 representam os domínios de ativação da transcrição (Activation Function, AF). ____________________________________________________________ 21 FIGURA 2. Esquema dos três estados conformacionais do LBD dos RNs. (a) Forma apo (sem ligante) do RXR LBD. (b) Forma holo - ligante agonista - do LBD do RAR. (c) Forma holo – ligante antagonista – do LBD do RAR. A superfície de dimerização está mostrada em verde, os sítios de ligação a correpressores e coativadores está em laranja, e a hélice H12 que contém a AF-2 está em vermelho. LBP – Bolsão de ligação ao ligante (BOURGUET; GERMAIN; GRONEMEYER, 2000)._______________ 23 FIGURA 3. Mecanismo de ação clássico dos RNs. Quando na forma apo (sem ligante), os RNs podem ser encontrados no citoplasma ou no núcleo ligados a correpressores e deacetilases de histonas. Esse estado reprime a transcrição do gene. Uma vez que o ligante chega e se liga ao RN (forma holo), muda sua conformação de forma a recrutar coativadores, acetilases de histona e toda a maquinaria da transcrição, ativando a expressão do gene [Figura adaptada de (ARANDA; PASCUAL, 2001)]. ___ 25 FIGURA 4. Ligação do RNs nos HREs. As diversas orientações dos motivos hexaméricos: Pal (palíndromo) - para ligação de homodímeros; A/T (sequência rica em A/T+) - motivo hexamérico para a ligação de monômeros; e heterodímeros são formados tanto em Pal, quanto em DR (Repetição Direta) ou IP (palíndromo invertido) (ARANDA; PASCUAL, 2001). _____________________________ 27 FIGURA 5. Hormônios da Tireoide A. Hormônios Tireoidianos, T3 e T4, diferença de um iodo a mais na posição 5’. B. Eixo Hipotálamo Glândula Pituitária Tireóide. Hipotálamo produz TRH que estimula a pituitária a produzir TSH, que por sua vez, estimula a tireoide a produzir T3/T4. Estes últimos regulam negativamente a produção de TSH e TRH pela pituitária e hipotálamo, respectivamente. [Modificado de (BRENT, 2012)]. _________________________________________ 29 FIGURA 6. Representação esquemática das isoformas de TR. TRs são codificados pelos genes THRA e THRB localizados em cromossomos diferentes. O splicing alternativo dos transcritos primários resultam em diferentes isoformas. TRs compartilham de uma alta homologia no domínio C (DBD - Domínio de Ligação ao DNA, barra sólida) e Domínio D/E (LBD – Domínio de Ligação ao Ligante). Os domínios amino-terminais A/B são variáveis em sequencia e tamanho. [Modificada de (CHENG; LEONARD; DAVIS, 2010)]. ____________________________________________________________ 30 FIGURA 7. Um exemplo de ação genômica (1) e indiretamente genômica (2) dos Hormônios da Tireóide (TH). A ação genômica acontece de forma clássica e requer regulação direta da transcrição pelos elementos responsivos à TR (TREs). No caso da ação não-genômica, o inicio acontece pela ativação de PI3K através dos THs. Essa ativação leva à ativação em sequência da cascata Akt/PKB-mTOR-p70S6K. Ainda pouco entendido, esse mecanismo leva ao aumento da expressão de genes como ZAKI-4α e HIF-1α. GTF: Fatores de Transcrição Genéricos. Modificado de (MOELLER et al., 2006). _________________________________________________________________________________ 32 FIGURA 8. Mecanismo de funcionamento do screeening de duplo-hibrido (y2h). Os genes lacZ e HIS3 estão sob regulação do promotor da LexA. Dentre as presas (fusionadas ao Domínio de Ativação da Gal4) encontradas na biblioteca de cDNA de HeLa, temos duas situação possíveis: (1) não existe interação com a isca (que fusionada ao Domínio de Ligação ao DNA da LexA), e então os domínios de ativação e ligação ao DNA não ficam próximos o suficiente para reconstituir a maquinaria de transcrição e transcrever os genes repórteres; (2) existe interação com a isca, e então os domínios de ativação e ligação ao DNA ficam próximos o suficiente para reconstituir a maquinaria de transcrição e transcrever os genes repórteres. Dessa forma a levedura consegue crescer em meio restritivo de histidina (SD-WLH) e consegue quebrar a x-gal e produzir o substrato azul (teste da -galactosidase). _________________________________________________________________________________ 42 FIGURA 9. Teste da auto-ativação das presas do duplo-hibrido. A. Transformação e plaqueamento em gotas. Colônia de L40 é transformada com a isca (ou controles) e plaqueada em meio restritivo. B. Esquema de plaqueamento dos controles e iscas no teste da auto-ativação. C. Teste da auto-ativação (Crescimento da colônia em meio restritivo seguido por teste da beta-galactosidase. Nesse teste é verificado se a isca sozinha é capaz de auto-ativar o promotor e transcrever o gene repórter lacZ (coloração azul). As colônias transformadas são retiradas da placa através de um papel filtro, lisadas e submetidas à imersão em solução contendo x-gal (z-buffer). A quebra da x-gal pela enzima beta-galactosidade produz um substrato de coloração azul. Detalhes na Tabela 3. ___________________ 44

FIGURA 10. Western Blot anti-flag confirmando a Expressão de TRs em HepG2. 1. Celulas parentais HepG2; 2. HepG2 infectadas com lentivirus controle; 3. HepG2 infectadas com lentivirus expressando TRα; 4. HepG2 infectadas com lentivirus expressando TRβ. Clones estáveis de HepG2 gentilmente doados pelo grupo do Pesquisador Dr. Paul Webb. Figura retirada de (LIN et al., 2013). __________ 50 FIGURA 11. Árvore de Ontologias da plataforma Gene Ontology. Em negrito “regulation of gene expression” e considerado um ramo superior indicando um processo biológico. Abaixo deste, estão os ramos inferiores, ou seja, processos biológicos que estão contidos dentro do ramo superior. ______ 60 FIGURA 12. Subclonagens no vetor pBTM-116kQ’. O vetor ampliado mostra a localização dos genes TRs subclonados. Destacamos as regiões mais importantes do vetor: KanR, que fornece resistência à kanamicina quando expresso em E. coli; TRP1, gene que permite o crescimento da levedura em meio sem triptofano (SD-W); LexA-DBD, Domínio de ligação ao DNA da lexA, clonado em fusão ao gene da isca. ______________________________________________________________________________ 77 FIGURA 13. Subclonagens no vetor Lentiviral pLVIG. O vetor mostra a região em que o genes TRs foram subclonados. Destacamos as regiões mais importantes do vetor: LTR, regiões que codificam genes necessários à formação do lentivírus; Promotor Ubiquitina, que dirige a expressão dos genes, AMP, gene que confere resistência à ampicilina quando expresso em E. coli.; IRES-GFP, região de transcrição policistrônica do gene da proteína GFP. _______________________________________ 78 FIGURA 14. Teste da auto-ativação (5mM 3-AT): As placas SD-W (sem triptofano) permitem o crescimento das colônias que possuem o vetor pBTM116-KQ’. E placas SD-WL (sem triptofano; sem leucina) permitem o crescimento de colônias com pBTM116-KQ’ e pACT2. Com isso, o teste da beta-galactosidade mostra a não-transcrição do gene repórter lacZ nos casos de controle negativo (vetores vazios) e a auto-ativação (azul) nas condições de controle positivo (FEZ; interação NDR:YA4). Felizmente ambas isoformas de TR não auto-ativaram (cor da colônia rosa claro), portanto seguimos o screening com esses RNs. ____________________________________________________________ 79 FIGURA 15. Teste da beta-galactosidade nas colônias resultantes do screening. Aqui mostramos uma placa de cada isca, porém esse mesmo teste foi aplicado em todas as colônias encontradas. Após repique e crescimento das colônias, as mesmas foram retiradas com papel filtro e incubadas com buffer-Z (que possui o substrato da beta-gal, x-gal). A figura mostra a grande maioria de colônias azuis presentes, onde houve transcrição do gene repórter lacZ. Os destaques em rosa mostram colônias que não apresentaram interação e, portanto, o gene lacZ não foi transcrito, sendo consideradas ‘falso-positivas’. _________________________________________________________ 80 FIGURA 16. Teste da co-transformação das presas encontradas no screening de TR. OS CONTROLES: (a) pBTM vazio + pACT vazio; (b) pBTM-FEZ full + pACT vazio; (c) pBTM-YA4 + pACT-NRD; (d) FEZ (truncada) + pACT vazio. PRESAS EM CO-TRASNFORMAÇÃO: Colônias 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + presa (controle negativo); Colônias 4 a 6, triplicata de pBTM-TR + presa. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina (SD-WLH); Quadrante azul: teste da -galactosidase (transcrição do lacZ – halos azuis). Os controles negativos (a e d) e controles positivos (b e c) estão de acordo com o esperado. Aqui ilustramos apenas algumas das interações que foram confirmadas via co-transformação e teste dos genes repórteres. Como esperado a triplicata 1-3, é o controle sem TR (espera-se um crescimento baixo ou nulo em SD-WLH, e no teste da -gal uma cor de colônia rosa claro, sem halos azuis) , e a triplicata 4-6, onde temos a confirmação da interação isca-presa (espera-se um crescimento alto ou maior em SD-WLH, e no tese da -gal uma colônia com halos azuis). ___ 82 FIGURA 17. Teste da co-transformação das presas encontradas no screening de TR. OS CONTROLES: (a) pBTM vazio + pACT vazio; (b) pBTM-FEZ full + pACT vazio; (c) pBTM-YA4 + pACT-NRD; (d) FEZ (truncada) + pACT vazio. PRESAS EM CO-TRANSFORMAÇÃO: Colônias 1 a 3, triplicata de pBTM vazio +

presa (controle negativo); Colônias 4 a 6, triplicata de pBTM-TR + presa. Quadrante preto: teste de

crescimento em meio restritivo sem Histidina (SD-WLH); Quadrante azul: teste da -galactosidase (transcrição do lacZ – halos azuis). Os controles negativos (a e d) e controles positivos (b e c) estão de acordo com o esperado. Aqui ilustramos apenas algumas das interações que foram confirmadas via co-transformação e teste dos genes repórteres. Como esperado, a triplicata 1-3 é o controle sem TR

(espera-se um crescimento baixo ou nulo em SD-WLH, e no teste da -gal, colônia rosa claro, sem halos azuis), a triplicata 4-6, confirma a interação isca-presa (espera-se um crescimento alto ou maior

em SD-WLH, e no tese da -gal uma colônia com halos azuis). _______________________________ 83 FIGURA 18. Interactoma dos parceiros de TR encontrados no duplo-híbrido (y2h), analisados pela plataforma IIS e visualizados no Cytoscape. Em verde, os parceiros já descritos na literatura como interactores de TR, e em azul os parceiros inéditos. ________________________________________ 85

FIGURA 19. Células 293T transfectadas (ou sem transfectar) com flag-TRs ou GFP-flag. Imagens obtidas com microscópio de fluorescência (FITC). Em verde, GFP expresso nas células 293T indicando que o plasmídeo que contém o gene do TR foi transcrito juntamente com GFP. _________________ 91 FIGURA 20. Transfecção de flag-TR em 293T, com e sem T3. A presença de T3, após 36h de tratamento, diminui a expressão de TRs. A. Western Blot mostrando os TRs fusionados a flag (WB anti-flag) e a proteina controle de ‘loading’ (WB anti-beta actina). B. Quantificação da intensidade das

bandas (ImageStudio, LI-COR) em relação ao controle ( -actina). ____________________________ 92 FIGURA 21. Ensaios de Gene Repórter em células 293T – Transativação de TRα (acima) e TRβ (abaixo). Os gráficos mostram a ativação de cada receptor após a adição do hormônio T3 (1 μM). Em todas as condições houve uma ativação significativa após a adição do hormônio, se comparada com a ativação basal (TR sem T3 = 1). A quantidade de luminescência se apresenta normalizada e representa apenas o sinal proveniente de flag-TRs transfectados (TRs endógenos foram subtraídos). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni (p ≤0.05; n=3). __________________________________________________________ 94 FIGURA 22. Imunoprecipitação (IP) de flag-TRs e GFP-flag usando a resina anti-flag. A. Transfecção transiente de flag-TRs em 293T. O input mostra flag-TRs presentes antes da IP. As IPs são alíquotas da eluição onde também verificamos a presença de flag-TRs. O TR aparece com um tamanho menor que o TR, como esperado. B. Transfecção transiente de flag-GFP em 293T. O input mostra flag-GFP presente antes da IP. As IPs são alíquotas da eluição onde também verificamos a presença de flag-GFP. _____________________________________________________________________________ 95 FIGURA 23. Rede de interações (y2h+IP) de TR sem T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology).

Em roxo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em

vermelho, todos os parceiros do y2h de TR. _____________________________________________ 97 FIGURA 24. Rede de interações (y2h+IP) de TR com T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology).

Em roxo, nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em

vermelho, todos os parceiros do y2h de TR. _____________________________________________ 98 FIGURA 25. Rede de interações (y2h+IP) de TR sem T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology).

Em amarelo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em

vermelho, todos os parceiros do y2h de TR. _____________________________________________ 99 FIGURA 26. Rede de interações (y2h+IP) de TR com T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology).

Em amarelo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em

vermelho, todos os parceiros do y2h de TR. ____________________________________________ 100 FIGURA 27. METACORE – ‘Pathway Maps’ – Análise das 10 vias mais enriquecidas (junho de 2016). As setas evidenciam tanto vias já bem estudadas como “transcrição”, como vias ineditas (ex. Dano ao DNA e apoptose). __________________________________________________________________ 104 FIGURA 28. METACORE – Pathway Maps. Via da apoptose relacionada à fosforilação BAD. Encontrada

em TR+T3. Apoptosis/Survival_BAD phosphorylation.. LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]:

1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs. __________________________________________ 106 FIGURA 29. METACORE – Pathway Maps. Via de dano ao DNA com DSBs ligada à reparo por NHEJ.

Encontrada em TR+T3, TR+T3, TR-T3. DNA damage_NHEJ/DSB; LEGENDA das Amostras

analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs. _______________________ 107 FIGURA 30. METACORE – Pathway Maps. Via de reparo de DNA ligada à proteínas BRCA1/BRCA2. Encontrada nas 4 amostras analisadas. Brca1/Brca2 DNA Repair. LEGENDA das Amostras analisadas

[IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs. _______________________________ 108

FIGURA 31. METACORE – ‘Disease Biomarker Networks’ – Análise das 10 vias mais enriquecidas (junho de 2016). Sem T3 – Laranja, Com T3 – Azul. _____________________________________________ 109 FIGURA 32. Diagrama de Venn comparando peptídeos/presas encontrados en nossos screenings versus peptídeos encontrados em screening feito por PRIVALSKY (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014). ___________________________________________________________________________ 111 FIGURA 33. GENECODIS – ‘GoSlim’ Processes – Dados de IP+y2h. Os números representam a quantidade de presas/peptídeos por anotação. __________________________________________ 113 FIGURA 34. GENECODIS – ‘GoSlim’ Processes – Dados de Privalsky (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY,

2014). As proteínas encontradas em TR estão incluídas na lista do TR por isso realizamos apenas uma análise. Os números representam a quantidade de presas/peptídeos por anotação. ________ 114 FIGURA 35. Co-Imunoprecipitação flag-TR e RXR. O input é uma alíquota do extrato proteico (lisado) da célula 293T, e indica a presença de RXR. O controle negativo (-ctrl) é o extrato proteico de 293T sem superexpressão de flag-TRs, imunoprecipitado em resina anti-flag. Parte da membrana foi

incubada com anti-RXR e parte com anti-flag. Na primeira parte vemos bandas de RXR nas 4 amostras, e não observamos quantidades significativas de RXR no controle negativo, mostrando que existe RXR interagindo com ambos TRs na presença ou ausência de T3. Na segunda parte da membrana observamos alíquotas das amostras de IP anti-flag. Escolhemos apenas 2 das 4 amostras pra análise em WB. A IP das 4 amostras juntas já foi apresentada na FIGURA 21. ______________ 116 FIGURA 36. Co-IP de EBP1. Extratos proteicos de celulas 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui EBP1 (ou PA2G4, Abcam #33613) interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, não houve imunoprecipitação inespecífica visto que não existem bandas no controle negativo. _________________________________________________ 117 FIGURA 37. Co-IP de SRPK1. Extratos proteicos de celulas 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui SRPK1 (BD #611072), interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, não houve imunoprecipitação inespecífica visto que não existem bandas no controle negativo. _________________________________________________________________ 118 FIGURA 38. Co-IP de CKII. Extratos proteicos de células 293T com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. As bandas de CKII alpha (Cell signaling, #2656) observadas sugerem que esta proteína interage com as diferentes isoformas de TR, na ausência de T3. Observamos também que para essas proteínas, houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso, testamos um controle negativo diferente: Extrato de 293T superexpressando TRs, imuprecipitado por resina de proteína A/G agarose conjugadas a normal IgG. _____________ 119 FIGURA 39. Co-IP de ERK3 com TR. Extratos proteicos de celulas 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui ERK3 (ou

MAPK6, cell signaling #4067), interagindo com TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso a co-IP precisa ser otimizada. _______________________________ 121 FIGURA 40. Co-IP de PRMT5. Extratos proteicos de celulas 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui PRMT5 (Millipore #07-405) interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso a co-IP precisa ser otimizada. _______________________________ 122 FIGURA 41. Esquema mostrando uma estrutura conhecida de PDI (baseada na PDI de levedura) composta pelos a-b-b′-x-a′-c, as quatro cisteínas redox (esferas cinzas) e o dominio C-terminal com a sequencia KDEL. Retirada de (LAURINDO; PESCATORE; DE CASTRO FERNANDES, 2012). _________ 127 FIGURA 42. Interação TR e PDI encontrada na IP-LC/MS/MS de TR sem T3, encontrada e confirmada

em y2h de TR. A. Rede de interações de TR alpha sem T3, anotada e criada pela plataforma IIS, visualizada no Software Cytoscape (organic layout). Em azul, proteínas encontradas na IP consideradas inéditas; em verde, proteínas do banco de dados de interação do TR alpha, interações já

descritas na literatura. Em destaque abaixo da rede, as interações já descritas encontradas pela LC-MS/MS, aumentam a confiabilidade do método. E em destaque na parte superior, a P4HB (ou PDI); B. Ensaio de confirmação de y2h. 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + P4HB (controle negativo); 4 a 6, triplicata de pBTM-TR beta + P4HB. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina; Quadrante azul: teste da beta-galactosidase. ___________________________________ 130 FIGURA 43. Co-imunoprecipitação de TR e PDI. A. Extratos de 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3) foram imunoprecipitados com resina A/G agarose conjugada a anti-P4HB (anticorpo #MAB4236, R&D Systems). Input corresponde ao extrato de 293T com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3), antes da IP. WB anti-flag mostra TRs nas amostras nas quais PDI foi imunoprecipitada. Os gráficos ao lado da figura mostram a quantificação das bandas pelo software Li-Cor. Os números de intensidade são dados pelo software e calculamos usando o controle como intensidade basal (=1); B. Extratos de 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T sem T3, antes da IP. _____________________________________ 131 FIGURA 44. Purificação por afinidade a His-tag das proteínas em resina de cobalto. SDS-PAGE 12%

acrilamida mostrando o TRFULL (A) de 47 kDa, a PDI (B) de 57 kDa e TRDL (C) de 42kDa. MW= marcador molecular; E1-E6 são as eluições da purificação. O destaque em vermelho mostra o tamanho das bandas da proteínas purificada. ___________________________________________ 133 FIGURA 45. Purificação por gel filtração (GF, exclusão por tamanho molecular, em coluna Superdex 200 16/60) de TRs e PDI. MW= marcador molecular. A. Perfis da Gel filtração em coluna Superdex 200

16/60 de TRFULL, TRDL e PDI; B. TRFULL – SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de

eluição retiradas da Gel filtração; C. TRDL – SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de eluição retiradas da Gel filtração; D. PDIFULL - SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de eluição retiradas da Gel filtração. _____________________________________________________ 135 FIGURA 46. Gel Filtração analítica do complexo em Coluna Superdex 200 10/300. A. Perfil da gel filtração analítica na qual observamos o pico de eluição do complexo. B. SDS-PAGE 12% com frações da PDI ___________________________________________________________________________ 136 FIGURA 47. Medidas de DLS das proteínas sozinhas e em complexo (TR:PDI). A Tabela ao lado indica os valores dos Rh encontrados. _______________________________________________________ 138 FIGURA 48. Espectros de Dicroismo Circular (CD) das proteinas: PDI em preto, TRβ-AB em vermelho e

do complexo TRβ-AB:PDI em azul. ___________________________________________________ 140 FIGURA 49. Curvas de desnaturação termica monitorando o sinal de CD em 208nm: A. TRβ-AB; B.

PDI; C. TRβ-AB:PDI, na qual observamos 2 platôs indicados pelas setas. _____________________ 141 FIGURA 50. Thermal-Shift Assays das proteínas sozinhas e em complexo. A. Curvas médias da

desnaturação de TR, TR, PDI, TR:PDI e TR:PDI, sem T3. B. Curvas médias da desnaturação de

TR, TR, PDI , TR:PDI e TR:PDI, com T3. O perfil de desnaturação de PDI sozinha e em complexo com TRs possui 2 duas temperaturas de melting (Tm) diferentes. ____________________________ 143 FIGURA 51. Curvas de Anisotropia de Fluorescência da formação do complexo TR-PDI com e sem T3. A.

Curva de anisotropia de TR DL com e sem T3, titulado em PDI marcada com FITC. A tabela mostra o

constante de dissociação (Kd) médio encontrado.; B. Curva de anisotropia de PDI titulada em TR marcado com FITC, na presença e ausência de T3. A tabela mostra o constante de dissociação (Kd) médio encontrado. As curvas são a representação média da triplicata experimental. ___________ 145 FIGURA 52. Gene Repórter Luciferase – Ensaios de Transativação em celulas Hek 293T. Plasmideos com o gene TRα ou TRβ, PDI e elementos responsivos (HREs) para TR, F2-Luc ou AP1-Luc, foram transfectados em celulas 293T (com ou sem 1μM T3). Após 36h a atividade da luciferase foi medida. Todos os valores de ativação foram normalizados pela condição controle (pBlue), portanto todo sinal de RNs endógenos foi descontado. A. TRα e PDI em F2-Luc. A condição TRα+T3:PDI mostra PDI aumentando a transcrição em 3 vezes (TRα+T3 vs.TRα+T3:PDI); B. TRα e PDI em AP1-Luc, elemento de resposta negativo. Aqui a presença de PDI parece não alterar a transcrição. Nenhuma diferença significativa foi observada; C. TRβ e PDI em F2-Luc. Como mostrado para a isoforma TRα, PDI aumenta em 2.5 vezes a transcrição, se compararmos TRβ+T3 vs.TRβ+T3:PDI; D. TRβ e PDI em AP1-Luc, elemento de resposta negativo. Aqui a presença de PDI promove desrepressão da transcrição, na condição sem T3, diferentemente do que acontece com a isoforma TRα. (*, P <0.05). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni. ____________________________________________________________________ 147

FIGURA 53. Anisotropia de Fluorescência de TR alpha+T3 com e sem PDI titulado em peptídeo coativador SRC1 marcado. Representação média das triplicatas. A tabela mostra o coeficiente de dissociação (Kd) médio encontrado. ___________________________________________________ 149 FIGURA 54. Knockdown de PDI em linhagem celular Hep-TR com e sem T3. A. Western blot anti-P4HB

e anti-beta actina. Linhagens Hep-TR e Hep-TR foram transfectadas com siRNA controle e P4HB siRNA. Após duas transfecções consecutivas seguidas de novos plaqueamentos, aguardamos 72h para coletar e lisar as células para avaliar a presença de PDI por WB. O knockdown se mostrou muito efetivo em nível proteico. Não observamos bandas de PDI nas amostras que sofreram o knockdown. Para as amostras tratadas com T3, adicionamos o hormônio 12h antes da coleta; B. Gráfico mostra a quantificação das bandas de WB de PDI em relação à beta-actina. Essa quantificação foi feita usando como base o WB das células Hep-TRs sem T3. ___________________________________________ 151 FIGURA 55. Knockdown de PDI seguido de qPCR em Células Hep-TR (Hep-G2 transduzidas com TR ou

TR). A. Gene Hif2a. Em condições de knockdown de PDI (PDI siRNA), existe um aumento na transcrição do gene. PDI parece reprimir a transcrição do gene quando presente. Isso acontece em ambas isoformas de TR; B. Gene Myh6. Em condições de knockdown de PDI (PDI siRNA), existe um aumento na transcrição do gene. PDI atua de forma similar à Hif2a, reprimindo a transcrição do gene para ambas isoformas de TR; C. Gene Furin. O knockdown da PDI não afeta de forma significativa a expressão deste gene. (*, P <0.05), Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes ). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni. ___________________________________________________ 153 FIGURA 56. Docking TR:PDI. A. Modelo de PDI humana com os quatro dominio a, b, b’, e a’, mostrando

em vermelho as cisteínas catalíticas. B. Modelo I de docking entre PDI (cinza) e TRLBD (verde). Em

azul está indicado parte do hinge do TR, fazendo contato direto com o dominio b’ da PDI. C. Modelo

II de docking entre PDI (cinza) e TRLBD (verde). Em vermelho, as cisteínas do domínio a da PDI

fazendo contato com a cisteína das hélices H3 e H4 do TR. D. Modelo II de docking entre PDI (cinza) e

TRLBD (amarelo). Em vermelho, as cisteínas do domínio a da PDI fazendo contato com as cisteínas

das hélices H3 e H4 do TR. D. Aproximação do ponto de contato entre PDI (cinza) e TRLBD (amarelo). O modelo II de docking mostra as cisteínas 53 e 56 (vemelho) do domínio a de PDI próximas

das cisteínas 294 e 298 (vemelho) de TR. ______________________________________________ 156

Lista de Tabelas

Tabela 1. Lista de clones utilizados. ____________________________________________________ 39 Tabela 2. Lista de primers e enzimas utilizados. (F)= Forward; (R)= Reverse; Núcleotídeos em itálico = sítio da enzima de restrição. __________________________________________________________ 39 Tabela 3. Lista de transformações usadas no teste de auto-ativação. _________________________ 44 Tabela 4. Lista de primers utilizados no qPCR _____________________________________________ 63 Tabela 5. Proteínas utilizadas no projeto e seus respectivos coeficientes de extinção molar e massa em kDa. _____________________________________________________________________________ 66 Tabela 6. Número de colônias encontradas para cada isca em cada dia de crescimento. __________ 80 Tabela 7. Presas encontradas no screening para cada isoforma de TR. As siglas representam os GENE SYMBOLS (UniprotKB). _______________________________________________________________ 81 Tabela 8. Duplo-híbrido em números ___________________________________________________ 84 Tabela 9. Número de proteínas encontradas na IP-LC-MS/MS dos TRs. ________________________ 95 Tabela 10. Construções das proteínas utilizadas no projeto. ________________________________ 133 Tabela 11. Raios hidrodinâmicos calculados através de Purificação por Exclusão Molecular e GF Analítica. ________________________________________________________________________ 137 Tabela 12. Raios calculados à partir da GF e DLS. ________________________________________ 139 Tabela 13. Os resultados da deconvolução dos espectros no programa DichroWeb (ANDRADE et al., 1993; MERELO et al., 1994). _________________________________________________________ 140 Tabela 14. Temperaturas de melting (Tm) calculadas a partir das curvas de desnaturação térmica obtidas no CD (FIGURA 53). __________________________________________________________ 142 Tabela 15. Temperaturas de melting (Tm) encontradas no Thermal-shift ______________________ 143

Tabela 16. Porcentagem de knockdown do gene P4HB em linhagens Hep-TR. __________________ 151 Tabela 17. Genes regulados por TR+T3 utilizados no qPCR e sua respectivas funções segundo GeneCards (SAFRAN et al., 2010; SAFRAN; SOLOMON, 2002). ______________________________ 152 Tabela 18. Genes e elementos responsivos regulados por TR e um resumo da ação do complexo PDI-TR nestes mesmos promotores __________________________________________________________ 158

Lista de Abreviaturas e Siglas AF-1 – Activation Function-1; Função de Ativação-1. AF-2 – Activation Function-2; Função de Ativação-2. CD - Dicroísmo Circular. Co-IP - Co-Imunoprecipitação. CoA – Coativador Transcricional. CoR – Correpressor Transcricional. DBD – DNA-binding Domain; Domínio de Ligação ao DNA. DLS – Espalhamento de Luz Dinâmico. DSB – Quebra de Dupla-fita. ERE – Elemento Responsivo ao ER. GF – Cromatografia de Gel Filtração. GH – Hormônio de Crescimento. HREs – Hormone Response Elements; Elementos Responsivos a Hormônios. IMAC – Cromatografia de Afinidade por Íons Metálicos Imobilizados. IP – Imunoprecipitação. Kd – Coeficiente de Dissociação. LBD – Lingand-binding Domain; Domínio de Ligação ao Ligante. LBP – Ligand Binding Pocket; Bolsão de Ligação ao Ligante. LC-MS/MS - Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas. MW – Marcador de Peso Molecular. NHEJ – Junção de Extremidades não-Homólogas. NLS – Nuclear Localization Signal; Sinal de Localização Nuclear. PCR – Reação em Cadeia da Polimerase. PDB – Protein Data Bank. Proteína AP-1 – Proteína Ativadora-1. Proteína BRCA – Proteína de susceptibilidade ao cancer de mama. Proteína ER – Receptor de Estrógeno. Proteína GFP – Proteína Verde Fluorescente. Proteína GR – Receptor de Glicocorticóides. Proteína GRIP – Proteína Interactora do Receptor de Glutamato. Proteína HAT – Histona Acetil-Transferase. Proteína HDAC – Histona Deacetilase. Proteína HSP – Proteínas do Choque-Térmico. Proteína N-CoR – Correpressor de Receptores Nucleares. Proteína PDI – Proteína Dissulfeto Isomerase. Proteína PPAR – Receptor Ativador da Proliferação de Peroxissomos. Proteína PR – Receptor de Progesterona. Proteína RAR – Receptor de Ácido Retinóide. Proteína Ref-1 – Fator (de Transcrição) Redox-1. Proteína RXR – Receptor X Retinóide. Proteína SMRT – Mediador de Silenciamento dos Receptores Retinóides e Receptors de Hormônios Tireoidianos. Proteína SRC – Coativador de Receptores de Esteróides. Proteína TR – Receptor de Hormônios Tireoidianos. Proteína TRBP – Proteína Ligante de TR. Proteína VDR – Receptor de Vitamina D.

qPCR – PCR quantitativo em Tempo Real. RN – Receptor Nuclear. SDS-PAGE – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida contendo Dodecil Sulfato de Sódio. T3 – Triiodotironina; 3,5,3’-triiodo-L-tironina. T4 – Tiroxina; 3,5,3’,5’-tetraiodo-L-tironina. TEBP – Top Enriched Biological Process. TH – Hormônios Tireoidianos (T3 e T4). Tm – Temperatura de Melting. TRE – Elemento Responsivo ao TR. TRH – Hormônio Estimulador da Tireotropina. TSH – Hormônio Estimulante da Tireóide. WB – Western Blotting. Y2h – Yeast Two-Hybrid; Duplo-Híbrido em Leveduras.

Sumário

Capítulo 1. Introdução e Justificativa 19 1.1 Receptores Nucleares – Características Gerais e Domínios 20 1.2 Mecanismo de Ação 24 1.3 Os Receptores de Hormônios Tireoidianos - TRs 28 1.4 Justificativa 36 1.5. Objetivos 37

Capítulo 2. Material e Métodos 38 2.1. Clones utilizados e subclonagens 39 2.2 Duplo-hibrido em Levedura (y2h) 40 2.3 Cultura de Células de Mamífero 49 2.4 Transfecção e expressão em células de mamífero 51 2.5 Imunoprecipitação (IP) em 293T 54 2.6 Análise dos dados de IP-LC-MS/MS 56 2.7 Análise dos dados de IP+y2h 58 2.8 Análise da Regulação da Transcrição 61 2.9 Expressão e Purificação de Proteínas 64 2.10 Caracterização Biofísica das proteínas e complexos 67 2.11 Afinidade e termo-estabilidade do complexo 69 2.12 Estudos estruturais do complexo in silico 72

Capítulo 3. Screening de novas interações entre TRs e outras proteínas 74 3.1 Introdução 75 3.2 Subclonagens 76 3.3 Duplo-Híbrido em Levedura (y2h) 78 3.4 Imunoprecipitação de flag-TR seguida de LC-MS/MS 91 3.5 MetaCore (Thomson Reuters®) 103 3.6 Comparação com dados da Literatura 110 3.7 Genecodis 112 3.7 Co-imunoprecipitação (Co-IP) de TR com proteínas de Ciclo Celular 115 3.7.1 RXR – controle positivo 115 3.7.2 Proteinas do ‘Ciclo Celular’ 117 3.8 Discussão e Conclusão dos Screenings 122

Capítulo 4. A interação inédita entre TR e PDI 126 4.1 Introdução 127 4.2 Co-IP de TR e PDI em 293T 130 4.3 Expressão e Purificação das proteínas 132 4.4 Caracterização Biofísica 135 4.5 Estudos da Interação TR:PDI 144 4.6 Discussão e Conclusões sobre a regulação de genes por TR e PDI 157

Capítulo 5. Conclusões e Perspectivas 161 5.1 Conclusões 162 5.2 Perspectivas 164

Capítulo 6. Elementos Pós-textuais 165 6.1 Referências 166 6.2 Termo de aprovação da pesquisa pela Comissão de Bioética e/ou Biossegurança 175 6.3 Declaração de que a dissertação ou tese não infringe os dispositivos da lei nº 9610/98, nem o direito autoral de qualquer editora 176

19

Capítulo 1. Introdução e Justificativa

20

1.1 Receptores Nucleares – Características Gerais e Domínios

As diferentes células que compõe um organismo multicelular executam

diversas funções nesses organismos, mas para que isso ocorra corretamente, se faz

necessário um sistema de comunicação intra e intercelular organizado. Esse sistema

é responsável pela organização de diversos eventos como a embriogênese e a

manutenção de propriedades e funções fisiológicas. Tudo isso constitui a rede

complexa de sinalização celular existente nos metazoários. Os sinais, representados

por diversas moléculas como proteínas, peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos,

esteróides, retinóides, derivados de ácidos graxos e gases, se ligam à

macromoléculas específicas chamadas receptores, desencadeando eventos de

resposta (LAUDET, VINCENT; GRONEMEYER, 2001; YEN, 2001).

Essa sinalização abrange desde a detecção dos sinais, enviados a moléculas

receptoras, até a conversão (transdução) destes sinais em respostas moleculares,

uma propriedade universal das células vivas (NELSON; COX, 2008). Neste contexto,

os Receptores Nucleares (RNs), ou receptores de resposta rápida, são proteínas

ativas na presença de moléculas pequenas e hidrofóbicas, as quais podem ser

hormônios estereoidais, vitaminas ou intermediários metabólicos; que após

penetrarem na célula-alvo, chegam ao núcleo para iniciar a resposta celular.

Sendo assim, os RNs estão envolvidos em muitas das funções fisiológicas de

um organismo regulando o desenvolvimento, inflamação, homeostase,

metabolismo, divisão e diferenciação celular (GIGUÈRE, 1999; SCHWABE;

TEICHMANN, 2004), sendo considerados importantes alvos para o tratamento de

doenças, pois estão intimamente relacionados com diversas patologias metabólicas

e vários tipos de câncer. Além disso, os ligantes desses receptores (glicocorticóides,

estrógenos, vitamina D, antiandrogênios, retinóides, tiroxina, etc.) constituem a

classe de fármacos mais procurada e estudada atualmente pois servem de modelo

para o desenvolvimento de novos medicamentos (CHEN, 2008).

Até o momento, foram encontrados 65 RNs em todo o reino animal, desde os

nematódeos até o homem. Esses RNs constituem uma superfamília de fatores de

transcrição com uma estrutura molecular em comum, composta de 5 a 6 domínios

bem conservados e responsáveis por funções específicas (FIGURA 1). A classificação

21

desses RNs é feita de acordo com a homologia encontrada entre os membros da

família, ou seja, pelos domínios mais conservados, C (Domínio de Ligação ao DNA –

DBD) e E (Domínio de Ligação ao Ligante – LBD) (FIGURA 1).

FIGURA 1. Ilustração esquemática da organização estrutural e funcional dos receptores nucleares. As regiões mais bem conservadas C e E estão representadas por um retângulo cinza, e as barras coloridas são as regiões divergentes A/B, D e F. AF-1 e AF-2 representam os domínios de ativação da transcrição (Activation Function, AF).

Foi proposto que os RNs evoluíram por uma diversificação precoce de um

receptor órfão ancestral sem ligante conhecido, o qual só mais tarde adquiriu a

ligação ao ligante. Esse conceito é bem aceito juntamente com a hipótese de que

alguns receptores órfãos funcionam exclusivamente como repressores constitutivos

ou ativadores de transcrição. Um exemplo é o repressor constitutivo Rev-Erb, capaz

de recrutar correpressores ou ativadores mesmo sem a presença de um ligante

(LAUDET; GRONEMEYER, 2002).

Na região N-terminal ou A/B (FIGURA 1) se encontra a região AF-1 (Activation

Function-1), que atua como ativadora constitutiva da transcrição (ARANDA;

PASCUAL, 2001). A comparação da região A/B de subfamílias diferentes demonstra

que esta é a região mais fracamente conservada entre os RNs. Seu tamanho pode

variar de 23 (Receptor da vitamina D) a 550 aminoácidos (Receptor de

Glicocorticóides). A nomenclatura dupla A/B se deve ao fato de que a divisão entre

as duas regiões não é sempre evidente. A principal função da AF-1 é conferir

especificidade à célula, ao DNA e aos promotores (KRAICHELY; NAKAI; MACDONALD,

1999; REICHARDT et al., 1998). Além disso, a região N-terminal dos RNs pode sofrer

modificações pós-traducionais como fosforilação, que aumenta a probabilidade de

transativacao da AF-1, assim como a sinergia e cooperatividade do AF-1 com o AF-2

(REICHARDT et al., 1998; SHAO; LAZAR, 1999).

A região C abriga o domínio de ligação ao DNA (DBD) e é responsável pelo

reconhecimento de sequências específicas de DNA (HREs, Elementos Responsivos a

Hormônios) (FIGURA 1). Além disso, o DBD é composto por dois motivos em dedos

22

de zinco; sendo que em cada um deles 4 resíduos de cisteína fazem interação com

um íon de Zn2+. Além disso, possui 4 sub-regiões, P-, D-, T- e A- boxes, as quais foram

caracterizadas por definir ou contribuir diretamente em diversos fatores como: (1)

na especificidade aos elementos responsivos; (2) na formação de uma interface de

dimerização entre os DBDs e (3) no contato com o esqueleto do DNA (CHAMBON,

1996; LAUDET; GRONEMEYER, 2002). A seletividade de reconhecimento dos HREs e

as propriedades de dimerização e estruturas tridimensionais deste domínio já foram

bem estudadas e muitas se encontram depositadas no Protein Data Bank (PDB)

(BERMAN; HENRICK; NAKAMURA, 2003).

Já a região D é menos conservada que as regiões que a cercam (C e E) e

funciona como uma “dobradica” (hinge) que permite que os domínios de ligação ao

ligante e ao DNA adotem diversas conformações. Esta região também contém um

sinal de localização nuclear (NLS) ou pelo menos uma parte funcional dele (CHEN et

al., 1994).

A região E, que engloba o domínio de ligação ao ligante (LBD) e o AF-2, é uma

das regiões mais bem estruturadas e possui diversas funções reguladas pela ligação

de moléculas lipofílicas. Entre elas estão a liberação do receptor do complexo de

proteínas de choque térmico, translocação para o núcleo, homo ou

heterodimerização, recrutamento de correguladores e ativação da transcrição de

genes-alvo (ARANDA; PASCUAL, 2001). Sua associação com proteínas

correguladoras, como correpressores (HEERY et al., 1997; HÖRLEIN et al., 1995) e

coativadores (FENG et al., 1998; RIBEIRO; KUSHNER; BAXTER, 1995), são

respectivamente essenciais para repressão e ativação de genes pelos receptores. A

função ativadora dependente de ligante, AF-2, presente nesta região é a responsável

pelo recrutamento de coativadores, embora às vezes, possa ter função repressora.

As primeiras estruturas tridimensionais de LBDs de RNs foram: Receptor X Retinóide

(RXR; sem ligante), Receptor de Ácido Retinóico (RAR; com ligante) e Receptor

de Hormônios Tireoidianos (TR; com ligante), estas e outras estruturas revelaram

que é no LBD que agem os agonistas e antagonistas, ativando ou reprimindo a

transcrição (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).

Por último, temos a região F, presente na posição C-terminal de apenas

alguns receptores como o Receptor de Progesterona (PR), Receptor de Estrógeno

23

(ER), e RXR. Esta região é um domínio pouco conservado com tamanho variável e

função desconhecida. Porém estudos mostram que a região F possa ter um papel no

recrutamento de coativadores pela região E, além de determinar a especificidade do

coativador com o LBD (ARANDA; PASCUAL, 2001).

Após a resolução de várias estruturas cristalográficas de domínios LBD dos

RNs, observou-se um enovelamento comum entre eles, devido ao alinhamento e

sequência dos aminoácidos. Esse enovelamento padrão consiste em um sanduíche

de 3 camadas de -hélices, além de um “-hairpin” e diversas alcas de tamanhos

variados. As hélices são numeradas de 1 a 12, sendo que a primeira está na região N-

terminal, e juntamente com H3, H5, H6 e H11, forma uma cavidade hidrofóbica que

acomoda os ligantes hidrofóbicos (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).

As estruturas cristalográficas da região E na forma apo e holo (sem e com

ligantes) são muito distintas, o que indica que existe uma grande mudança

conformacional após a acomodação do ligante. Esse mecanismo foi descrito como

‘ratoeira’ (mouse-trap) (FIGURA 2): a hélice H11 é empurrada pelo ligante, e

reposicionada em continuidade com a H10; então, o balanço da hélice H12 libera o

ômega-loop, que gira abaixo da H6, trazendo consigo a região N-terminal da H3; na

posicao final, a H12 sela a “tampa” do bolsao de ligacao ao ligante, criando um

ambiente hidrofóbico para estabilizar a ligação, podendo até fazer contatos

adicionais com o próprio ligante (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).

FIGURA 2. Esquema dos três estados conformacionais do LBD dos RNs. (a) Forma apo (sem ligante) do RXR LBD. (b) Forma holo - ligante agonista - do LBD do RAR. (c) Forma holo – ligante antagonista – do LBD do RAR. A superfície de dimerização está mostrada em verde, os sítios de ligação a correpressores e coativadores está em laranja, e a hélice H12 que contém a AF-2 está em vermelho. LBP – Bolsão de ligação ao ligante (BOURGUET; GERMAIN; GRONEMEYER, 2000).

24

Estudos apontam que os receptores nucleares são capazes de formar

homodímeros (como os Receptores de Hormônios Esteróides), ou seja, um complexo

com dois RNs iguais. Outros RNs formam heterodímeros com o RXR, como RAR-RXR,

TR-RXR, VDR-RXR (Receptor da Vitamina D-RXR), PPAR-RXR (Receptor Ativador da

Proliferação de Peroxissomos-RXR) (BOURGUET et al., 1995; LAUDET; GRONEMEYER,

2002). Segundo os mesmos autores, a ligação de um ligante pode afetar as

propriedades de dimerização dos RNs in vitro. Para os TRs e para o VDR, os quais

formam tanto homodímeros, quanto heterodímeros com o RXR, e a ligação do

ligante parece favorecer a heterodimerização (LAUDET; GRONEMEYER, 2002).

Posteriormente, foi demonstrada a existência de heterodímeros não-usuais

(sem o RXR), que podem ser formados entre diferentes RNs, regulando a transcrição,

e até mesmo com outras proteínas, em um mecanismo chamado cross-talk. Um

exemplo é a heterodimerização dos receptores TR-PPAR e TR-ER, como uma forma

adicional de regulação positiva e negativa da transcrição de determinados genes (LIU

et al., 2007). A formação do complexo entre TR e a proteína GATA, é outro exemplo

cross-talk presente na regulação do Hormônio Estimulante da Tireóide

(TSH) (FIGUEIRA et al., 2010b). Estas formações não usuais de oligômeros levam,

então, a uma regulação diferenciada da transcrição.

1.2 Mecanismo de Ação

Os RNs em sua forma apo podem ser encontrados tanto no citoplasma

(subfamília dos receptores esteróides), quanto no núcleo celular (receptores da

subfamília dos TRs). Quando ligados ao DNA, atuam reprimindo a transcrição dos

genes-alvo (FIGURA 3), sendo que, nas duas subfamílias, os RNs estão ligados à

proteínas correpressoras, como por exemplo os receptores esteróides que são

usualmente encontrados ligados a proteínas de choque-térmico (HSP90, 80 e 70)

(COUETTE et al., 1998) e os receptores da subfamília do TR, ligados a correpressores

específicos como SMRT e N-CoR (PRIVALSKY, 2004).

25

FIGURA 3. Mecanismo de ação clássico dos RNs. Quando na forma apo (sem ligante), os RNs podem ser encontrados no citoplasma ou no núcleo ligados a correpressores e deacetilases de histonas. Esse estado reprime a transcrição do gene. Uma vez que o ligante chega e se liga ao RN (forma holo), muda sua conformação de forma a recrutar coativadores, acetilases de histona e toda a maquinaria da transcrição, ativando a expressão do gene [Figura adaptada de (ARANDA; PASCUAL, 2001)].

Os ligantes esteróides são hidrofóbicos e difundem livremente pela

membrana plasmática até atingirem seus receptores no citoplasma. Já o hormônio

triiodotironina (T3), por exemplo, necessita de transportadores como os NTCP

(Polipeptídeo Co-transportador Sódio/Taurocolato), OATP1 (Transportador de

ânions orgânicos 1), LAT (Transportador de Aminoácidos de tipo L) e TAT

(Transportador de Aminoácidos de tipo T) e proteína MCT8 (FRIESEMA et al., 2005;

NASCIMENTO, 2009).

Como descrito anteriormente (FIGURA 2), o ligante, ao encontrar o seu

receptor, se adapta ao bolsão de ligação ao ligante (ligand binding pocket – LBP) e

provoca uma mudança conformacional na proteína. A superfície hidrofóbica

formadas pelas hélices H12, H3 e H4 e H5 (ou também chamada de AF-2) constitui o

sítio de ancoragem das proteínas coativadoras (FIGURA 3). Apesar da alta

similaridade de resíduos que formam essa região (WURTZ et al., 1996) o mecanismo

de ativação dos RNs continua incompleto, já que foram identificadas estruturas

cristalográficas de receptores em forma apo com a H12 em posição ativa e na forma

holo com a H12 na posição inativa (FLAIG et al., 2005; NOLTE et al., 1998).

Apesar das variações encontradas, o mecanismo clássico de ativação

continua com a chegada dos coativadores e o recrutamento da maquinaria de

transcrição basal (FIGURA 3), incluindo a TBP (TATA box-binding protein) e o fator de

transcrição IIB (TFIIB) (NASCIMENTO, 2009).

26

A família p160 – GRIP-1, TRBP-1 e SRC-1 contém exemplos de coativadores

que se ligam aos RNs através do motivo LXXLL (RN-box, onde L é o aminoácido

leucina e X é um aminoácido qualquer), repetido de 3 a 4 vezes em cada coativador.

Os coativadores também formam complexos com outras proteínas como as histonas

acetil-trasferases (HATs), que através do relaxamento e modificação da cromatina

próxima à região promotora, recrutam outras moléculas para o local, as quais,

estabilizam a ligação da RNA polimerase II (NASCIMENTO, 2009; WEBB et al., 2002).

Entretanto, quando os ligantes estão ausentes, os RNs recrutam

correpressores inibindo a transcrição. Alien, N-CoR e SMRT, são correpressores que

contém sequências hidrofóbicas conservadas (IDs, motivo L/IXXIIXXL, onde L é o

aminoácido leucina, I é isoleucina e X é um aminoácido qualquer) por onde se ligam

aos RNs. Essas sequências podem aparecer repetidas 3 vezes no N-CoR e 2 vezes no

SMRT. Esses correpressores ligam-se à região hidrofóbica formada pelas hélices 3, 4

e 5 dos receptores. Além disso, os correpressores apresentam-se complexados com

histonas deacetilases (HDACs), que condensam a cromatina nas regiões próximas

aos promotores onde se ligam os RNs, impedindo a maquinaria transcricional de ser

ativada (SANTOS; FAIRALL; SCHWABE, 2011).

Ainda existe uma gama de fatores, geralmente componentes de complexos

transcricionais multiprotéicos, que coordenam a função dos RNs. Entre eles estão a

família de proteínas associadas à arginina metiltransferase-1 (CARM); o complexo

formado pelo fator de transcrição p160, coativador de receptor nuclear e coativador

de receptor de esteróides (TIF/NCoA/SRC); a proteína E1A de ligação a proteína p300

(ou CBP); o fator associado a p300 (PCAF); e as histonas acetiltransferases (HATs)

(SANTOS; FAIRALL; SCHWABE, 2011). Estas proteínas formam complexos estáveis em

promotores responsivos, quando ancoradas no DNA. Pesquisas sobre outras

proteínas que podem atuar nos modelos da regulação da transcrição através da

ligação aos receptores têm aumentado continuamente desde então, com o objetivo

de entender toda a complexidade existente nesse processo (DIAS, 2004).

Sendo estes RNs fatores de transcrição, eles se ligam no DNA a sequências

promotoras específicas. Nestes promotores (FIGURA 4) encontram-se os HREs,

elementos responsivos a hormônios, que são formados pelo motivo hexamérico 5’-

PuGGTCA-3’ (Pu = A ou G). Estes podem estar separados por um número variável de

27

nucleotídeos e organizados em diversas orientações, como: repetições diretas (DR),

palindrômicas (Pal) ou palindrômicas invertidas (IP) (LAUDET; GRONEMEYER, 2002)

(FIGURA 4). As interações RN-DNA podem ocorrer com o receptor em seu estado

monomérico, homodimérico, ou heterodimérico com o RXR, por exemplo (GLASS,

1994; WEBB et al., 2002).

FIGURA 4. Ligação do RNs nos HREs. As diversas orientações dos motivos hexaméricos: Pal (palíndromo) - para ligação de homodímeros; A/T (sequência rica em A/T+) - motivo hexamérico para a ligação de monômeros; e heterodímeros são formados tanto em Pal, quanto em DR (Repetição Direta) ou IP (palíndromo invertido) (ARANDA; PASCUAL, 2001).

Além da regulação direta da transcrição, existe também um mecanismo

chamado regulação indireta. Nele, os RNs podem interagir com outros fatores de

transcrição, bloqueando ou ativando a produção de diferentes proteínas, atuando

em diversas rotas de sinalização celular. Os RNs podem agir nos mecanismos de

transrepressão e transativação quando reprimem ou ativam a expressão de genes

regulados por outros fatores de transcrição. Isso pode ocorrer através da

competição por correguladores, ou pela ligação direta dos RNs com os outros fatores

de transcrição. Este é o caso da interação entre o receptor de glicocorticóides (GR),

ER, ou TR e a proteína ativadora 1 (AP-1); entre RAR e a proteína GATA-1; e da

ligação entre outros RNs à proteína supressora de tumor p53 (CAELLES; GONZÁLEZ-

SANCHO; MUÑOZ, 1997; DE BOSSCHER; VANDEN BERGHE; HAEGEMAN, 2001; MOLL;

MARCHENKO; ZHANG, 2006; OGAWA et al., 2005; TSUZUKI et al., 2004; ZHOU; SHEN;

SHEMSHEDINI, 1999).

Homodímeros Monômeros

Heterodímeros

28

As ações dessas proteínas vão além de somente causar mudanças na

expressão de genes de forma indireta, muitas vezes não não é observada nenhuma

mudança na expressão. Nesse caso, os efeitos são chamados não-genômicos e são

caracterizados por abertura/fechamento de canais iônicos, função quinase, fosfatase

ou outras funções enzimáticas em vias de sinalização em geral que podem, ou não,

resultar na transcrição de genes (ORDÓÑEZ-MORÁN; MUÑOZ, 2014).

Outro mecanismo importante que modula a ação dos RNs e outros fatores de

transcrição são as modificações pós-traducionais como a fosforilação. Neste último,

correguladores que migram do citoplasma para o núcleo são fosforilados, e isso

resulta em um aumento da atividade de coativadores e repressão da atividade de

correpressores, resultando em alterações na transcrição de genes regulados por RNs

(HERMANSON; GLASS; ROSENFELD, 2002). O mecanismo de fosforilação de RNs é

essencial em situações de cross-talk entre vias de sinalização celular (DIAS, 2004).

Como exemplo de quinases reguladoras dessa via temos as dependentes de cAMP,

caseína quinases, GSKs, Jun quinases, CDKs e MAPKs. Por fim, as regulações das

funções de RNs por quinases resultam em modificações na ligação ao DNA e

dimerização, na atividade transcricional, na interação com cofatores, e na afinidade

por ligantes (SHAO; LAZAR, 1999).

Estes mecanismos de transrepressao, cross-talk e fosforilação, vêm sendo

altamente estudados para o desenvolvimento de fármacos, na busca de moléculas

que possam regular receptores nucleares em regiões e interações específicas. O

melhor entendimento sobre esses complexos menos comuns entre RNs e outras

proteínas poderia levar a proposição de novos modelos e mais específicos no

controle de diversas patologias.

1.3 Os Receptores de Hormônios Tireoidianos - TRs

Os Receptores de Hormônios Tireoidianos (TRs) são fatores de transcrição,

pertencentes à família dos receptores nucleares. Estes receptores possuem efeitos

na taxa metabólica, consumo de oxigênio, e também, funções únicas em diversos

órgãos como o coração, fígado e glândula pituitária (YEN, 2001).

29

Os hormônios que se ligam aos TRs são secretados por uma das maiores

glândulas endócrinas do organismo, a tireóide. Sao eles, a tiroxina (3,5,3’,5’-

tetraiodo-L-tironina, T4) e a triiodotironina (3,5,3’- triiodo-L-tironina, T3) (FIGURA 5-

A). Os hormônios tireoidianos (THs) são essenciais para o desenvolvimento normal,

crescimento, diferenciação neuronal e regulação metabólica nos mamíferos (CHENG;

LEONARD; DAVIS, 2010); além de serem necessários e muito importantes na

metamorfose de anfíbios (SACHS, 2015).

FIGURA 5. Hormônios da Tireoide A. Hormônios Tireoidianos, T3 e T4, diferença de um iodo a mais na posição 5’. B. Eixo Hipotálamo Glândula Pituitária Tireóide. Hipotálamo produz TRH que estimula a pituitária a produzir TSH, que por sua vez, estimula a tireoide a produzir T3/T4. Estes últimos regulam negativamente a produção de TSH e TRH pela pituitária e hipotálamo, respectivamente. [Modificado de (BRENT, 2012)].

A regulação da síntese e secreção desses hormônios é controlada pelo eixo

Hipotálamo-Pituitária-Tireóide (FIGURA 5-B). O Hormônio estimulante da

tireotropina (Thyrotropin Releasing Hormone, TRH) é sintetizado no hipotálamo e

chega até seus receptores na glândula pituitária. Esse sinal resulta na produção e

liberação do Hormônio Estimulante da Tireoide (Thyroid Stimulating Hormone, TSH)

pela glândula pituitária. Uma vez que esse hormônio chega a tireoide, estimula a

produção de T3/T4. Estes, por sua vez, regulam negativamente a produção de TRH e

TSH (BRENT, 2012; YEN, 2001).

Cerca de 90% dos hormônios metabolicamente ativos secretados por esta

glândula consistem em T4 e, 10% em T3. Portanto, no sangue a concentração de T4

(90 nM) é cerca de 45 vezes maior que a de T3 (2 nM) (WU; XU; KOENIG, 2001).

Entretanto, quase toda a tiroxina é convertida em triiodotironina nos tecidos, visto

que, geralmente, ocorre a perda de um iodo toda vez que o T4 é transportado para o

interior das células (BRENT, 2012).

A. B.

Hipotálamo

Pituitária

Tireoide

30

Os TRs são codificados por dois genes no genoma humano, um deles, que

codifica o TR, está localizado no cromossomo 17 e é chamado NR1A1; e o outro

que codifica o TR, está localizado no cromossomo 3, chamado NR1A2 (FIGURA 6).

FIGURA 6. Representação esquemática das isoformas de TR. TRs são codificados pelos genes THRA e THRB localizados em cromossomos diferentes. O splicing alternativo dos transcritos primários resultam em diferentes isoformas. TRs compartilham de uma alta homologia no domínio C (DBD - Domínio de Ligação ao DNA, barra sólida) e Domínio D/E (LBD – Domínio de Ligação ao Ligante). Os domínios amino-terminais A/B são variáveis em sequencia e tamanho. [Modificada de (CHENG; LEONARD; DAVIS, 2010)].

Cada um destes genes resulta em dois ou mais principais produtos (TR1 e 2;

TR1 e 2), os quais diferem na sequência das extremidades amino (TR1 e 2) e

carboxi-terminal (TR1 e 2) e são gerados pelo processamento diferencial que

ocorre no RNA mensageiro. A expressão destas isoformas é diferenciada em vários

tecidos, o que sugere funções diferentes para as mesmas. O TR1 representa um

receptor funcional e responde ao hormônio T3, relacionado ao controle da taxa

cardíaca. O TR2 não responde ao T3 e se comporta como um inibidor dominante

negativo do TR1. Ambos são expressos no cérebro, rins, coração, entre outros

durante a embriogênese. Além disso, observa-se grande expressão de TR1 na

musculatura esquelética, tecido gorduroso marrom e cérebro, e o TR2 é

predominantemente encontrado no cérebro (FORREST et al., 1991; IZUMO;

MAHDAVI, 1988; WAGNER et al., 1995).

As isoformas TR1 e 2 ligam-se e respondem ao hormônio com alta

especificidade. Além de estarem relacionadas com a supressão da liberação do TSH,

Domínios

LBD DBD

31

as mutações do TR1 e 2 podem ocasionar a síndrome de resistência aos hormônios

tireoidianos. Em contraste à ampla expressão do TR, o TR é mais restrito ao

cérebro, olhos, pulmões e rins, sendo a expressão regulada durante o

desenvolvimento do cérebro (FORREST et al., 1991; IZUMO; MAHDAVI, 1988).

Os TRs são responsáveis por controlar as ações dos hormônios tireoidianos,

predominantemente o T3, mas também podem ser ativos transcricionalmente sem

ligantes, pois conseguem ligar constitutivamente à cromatina. Nessa interação com

o DNA, heterodímeros com o RXR são comuns (RASTINEJAD et al., 1995). O T3, como

a maioria dos hormônios reguladores de RNs, modula a transcrição de genes porque

altera a conformação do LBD do TR que, por sua vez, altera a interação entre seus

correguladores (GLASS; ROSENFELD, 2000; LAUDET; GRONEMEYER, 2002; RIBEIRO et

al., 1992).

Quanto à localização subcelular, os TRs podem estar localizados no núcleo

celular, na ausência ou presença de ligantes (BUNN et al., 2001). Entretanto, alguns

estudos demonstraram que uma porção significativa de TR1 pode se localizar no

citoplasma na ausência de T3 e quando este encontra o TR1, ambos se direcionam

ao núcleo (NICOLL et al., 2003). Estudos realizados com a isoforma 1, mostraram

que esta proteína se acumula no núcleo na presença de T3, mas também é capaz de

se movimentar rapidamente entre núcleo e citoplasma (BUNN et al., 2001). Outro

fator importante que mantém esta isoforma no núcleo, é a fosforilação, como

descrito por Nicoll e colaboradores (2003).

1.3.1 Mecanismos de ação dos TRs e interação com outras proteínas

Através desse shuttle entre diferentes compartimentos celulares, os TRs e

seus THs executam diversas funções genômicas diretas (FIGURA 7 - parte 1) e

indiretas (FIGURA 7 – parte 2) (ARANDA et al., 2009; MOELLER et al., 2006).

32

FIGURA 7. Um exemplo de ação genômica direta (1) e genômica indireta (2) dos Hormônios da Tireóide (TH). A ação genômica acontece de forma clássica e requer regulação direta da transcrição pelos elementos responsivos à TR (TREs). No caso da ação não-genômica, o inicio acontece pela ativação de PI3K através dos THs. Essa ativação leva à ativação em sequência da cascata Akt/PKB-mTOR-p70S6K. Ainda pouco entendido, esse mecanismo leva ao aumento da expressão de genes como ZAKI-4α e HIF-1α. GTF: Fatores de Transcrição Genéricos. Modificado de (MOELLER et al., 2006).

O exemplo clássico de ação dos TRs requer regulação direta da transcrição de

genes através de TREs (Elementos Responsivos a TRs) (parte 1 - FIGURA 7). Dentre

esses TREs, os TRs se ligam em sequências palíndromo sem espaçamento de

nucleotídeos (Pal-0), repetições diretas espaçadas por quatro nucleotídeos (DR-4), e

palíndromos invertidos, com 6 nucleotídeos de espaçamento (IP-6 ou F2) (YEN,

2001). Também foram descritos monômeros de TR ligados à meia sequência

consenso contendo oito nucleotídeos (KATZ; KOENIG, 1994). Além disso, a isoforma

TR parece ter uma tendência maior a formar homodímeros em diferentes TREs, se

comparado à isoforma (ZHU et al., 1997).

A regulação dos TRs envolve interações com uma rede complexa de proteínas

correguladoras que podem aumentar (coativadores) ou reprimir (correpressores) a

transcrição (MOORE; GUY, 2005). Os coativadores mais bem estudados pertencem

a família p160 de coativadores de receptores esteroides (SRCs). Alguns exemplos de

membros desta família são o SRC1, SRC2 (GRIP1/TIF2), e SRC3

(AIB1/TRAM1/RAC3/ACTR). Outros exemplos de coativadores de TRs estão descritos

em Moore e Guy (2005), como TRAP1 e PCG-1. Por outro lado, para reprimir a

33

expressão de genes, TRs se apresentam ligados à proteínas correpressoras como

NCoR e SMRT (HU; LAZAR, 2000).

Entretanto, TRs possuem a capacidade de ativar a transcrição de genes

quando T3 está ausente. Em um estudo avaliando a produção do hormônio de

crescimento em linhagens de células da glândula pituitária de ratos (rGH), o TR foi

capaz de aumentar a produção de rGH, atuando através de TREs, sem a presença de

seu hormônio (RIBEIRO et al., 1998). Um caso semelhante também foi observado na

regulação de genes que codificam as subunidades e do TSH e e TRH, onde

TRs atuaram aumentando a transcrição sem T3 (LEZOUALC’H et al., 1992). Esse

mecanismo resulta no feedback negativo da regulação do eixo hipotálamo-pituitária-

tireóide, como já mencionado anteriormente (RIBEIRO et al., 1998).

TRs também conseguem atuar na expressão de genes que não contém TREs

através de interferência negativa ou positiva em outros fatores de transcrição e vias

de sinalização. Esse mecanismo é chamado de cross-talk transcricional (ARANDA et

al., 2009). Por exemplo, TRs podem regular negativamente promotores de genes

alvo com sítios de AP-1 (Proteína Ativadora 1) ou CRE (Elemento Responsivo cAMP).

Nesse caso, os TRs não ligam diretamente ao DNA mas atuam no promotor através

de interações proteína-proteína com outros fatores de transcrição (LOPEZ et al.,

1993; MÉNDEZ-PERTUZ; SÁNCHEZ-PACHECO; ARANDA, 2003).

No caso das ações não-genômicas, THs podem atuar através de receptores

de hormônios localizados na membrana, que rapidamente ativam cascatas de

sinalização. Um exemplo de receptor de membrana é a integrina v3 que é capaz

de regular o tráfego de proteínas específicas do citoplasma para o núcleo (CAO et al.,

2009; HAMMES; DAVIS, 2015). Uma dessas cascatas envolve a regulação de MAPKs

(MAP quinases), ou PI3K, e é capaz de induzir mobilização celular de Ca2+ (ARANDA

et al., 2009).

Moeller e colaboradores (2006) também descreveram um exemplo de

mecanismo não-genômico (parte 2 da FIGURA 7) para o TR ligado ao T3. Este,

interage com PI3K (p85) no citoplasma (CAO et al., 2005), o que leva à ativação da

PI3K, liberando uma sinalização que acontece ao longo de uma cascata seguida de

34

fosforilações e ativação da serina/treonina quinase Akt, da mTOR e do substrato

p70S6K (MOELLER et al., 2006).

1.3.2 Patologias relacionadas aos THs

Como mencionado anteriormente, os RNs regulam diversos processos

biológicos e são considerados alvos para a terapia de diversas doenças. Dentre as

patologias relacionadas especificamente aos THs, a mais bem estudada é a síndrome

de resistência ao hormônio tireoidiano. Essa síndrome é caracterizada pela reduzida

resposta dos tecidos-alvo aos hormônios tireoidianos, apesar das elevadas

concentrações séricas de T3 e T4 livres (CARVALHO; RAMOS, 2004). Além dessa

característica, observa-se nos pacientes: bócio, estatura baixa, peso abaixo do

normal, déficit de atenção, hiperatividade, dislexia e níveis normais ou elevados de

TSH (BECK-PECCOZ; CHATTERJEE, 1994; CHENG; LEONARD; DAVIS, 2010). Após anos

de pesquisa elucidaram a base molecular da doença, sendo que esta envolvia

anormalidades no TR.

Entretanto, existem várias outras doenças associadas a distúrbios causados

pelos THs, como a doença de Graves, desenvolvimento de tumores, síndrome de

Hashimoto, cretinismo, hipo e hipertireoidismo, e até mesmo obesidade (FIGUEIRA,

2008; LIU; BRENT, 2010). Mais especificamente, uma forma de hipertireoidismo

pode ser causado pela doença de Graves, entidade autoimune associada à

imunoglobulina G, que se liga e estimula o receptor de TSH, produzindo uma

hiperatividade permanente da tiróide com alta produção de hormônios T3/T4 (LIU;

BRENT, 2010). Desse modo, a disfunção tiroidiana é a expressão clínica da perda de

tolerância imunológica com característica hereditária, podendo ser desencadeada

por fatores ambientais e estresse (ROMALDINI, 2001).

Dentre as patologias que ocorrem a partir do desequilíbrio das quantidades

de THs, o câncer pode ser uma delas, sendo que vários estudos evidenciaram

estreita relação entre THs e a doença. De fato, foi sugerido que altas quantidades de

TH estão associadas ao avanço do câncer de mama e próstata. Em modelos de

roedores, TH estimularam o crescimento e metástase de tumores transplantados,

35

sendo observado que o hipotireoidismo levou a um efeito contrário (MOELLER;

FÜHRER, 2013).

E ainda, a partir de um camundongo mutante para o TR (TRPV/PV) que

desenvolveu espotaneamente carcinoma de tireóide (SUZUKI; WILLINGHAM;

CHENG, 2002), juntamente com modelos de camundongos knockin com mutações

em TR, a relação entre TRs, THs e o desenvolvimento de câncer se tornou mais clara.

Foi observado que essas mutações em TRs levam a anormalidades além da síndrome

de resistência ao hormônio, incluindo o câncer de tireóide, tumores pituitários,

nanismo, e síndrome metabólica (CHENG; LEONARD; DAVIS, 2010). Outro estudo

mostrou que a reinserção e expressão de TR1 em linhagens de câncer de mama e

hepatocarcinoma que perderam esse receptores, levou a um retardo no crescimento

do tumor e uma inibição na ação invasiva das células (MARTÍNEZ-IGLESIAS et al.,

2009).

É interessante ressaltar que os TRs possuem uma dualidade de papéis no que

diz repeito ao desenvolvimento de doenças. Uma vez que cada isoforma possui um

nível de expressão e uma função diferente em cada tecido, é esperado que o

desbalanço hormonal, mutações e outras anormalidades, resultem em diferenças

nas interações proteína-proteína que ocorrem dentro de uma célula. Com base

nessas funções e regulações executadas pelos TRs e seus hormônios, nesta tese,

buscamos investigar outras interações que não foram descritas para o TR. Essa busca

por novas interações proteína-proteína que ocorrem em nível celular nos ajudam a

entender melhor as doenças nas quais os TRs estão envolvidos e também possíveis

efeitos colaterais decorrentes de tratamentos.

36

1.4 Justificativa

Sabe-se que a principal forma de atuação dos RNs ocorre pela regulação

direta sobre a transcrição de genes. Esta regulação direta envolve a ligação dos

receptores a Elementos Responsivos a Hormônios (HREs), recrutamento de

coativadores e correpressores e, consequente recrutamento da maquinaria

transcricional, sendo este processo bastante conhecido. Entretanto, nos últimos

anos, os estudos sobre mecanismos de cross-talk e transrepressao tem se tornado

um foco crucial no campo desses receptores. O melhor entendimento sobre a

regulação da transcrição de forma não direta tem se tornado um novo desafio na

tentativa de se mapear nuances diferenciais, as quais poderiam resultar em novos

alvos para a regulação de diversas patologias, por exemplo. Desta forma, sabendo-se

quais complexos protéicos serao formados na regulacao da transcricao de um gene,

esta poderia ser manipulada apenas pelo impedimento da formação deste

complexo. Com isso, muitos dos efeitos indesejáveis advindos de uma regulação

comum, poderiam ser evitados.

37

1.5. Objetivos

O objetivo geral deste projeto foi:

“Mapear as interações que ocorrem entre os TRs e quaisquer outras proteínas

presentes no núcleo e citoplasma da célula, nos mecanismos de transativação e

transrepressão.”

Para alcançar tal objetivo, os seguintes objetivos específicos tiveram de ser

obtidos :

Subclonagens de TRs em vetores de expressão em levedura (pBTM-116KQ’);

Screening de duplo-hibrido (y2h) para buscar novos parceiros de interação

para os TRs;

Confirmação em levedura dos parceiros encontrados no y2h – co-

transformação;

Subclonagens de TRs em vetores de expressão para células de mamíferos

(pLVIG);

Imunoprecipitação (IP) em células 293T dos complexos formados entre TRs e

outras proteínas celulares e, posteriormente, identificação dos peptídeos por

espectrometria de massas (IP-LC-MS/MS);

Construção de redes de interação (plataforma IIS e Cytoscape) entre TRs e

peptídeos e presas encontrados em IP-LC-MS/MS e y2h, respectivamente;

Análise dos parceiros de interação quanto aos processos biológicos e vias nas

quais são encontrados (Software GeneCodis, MetaCore e GeneOntology);

Confirmação dos complexos mais promissores via Co-IP em células 293T;

Estudos de transativacao em células de mamíferos, que proporcionaram

respostas fisiológicas sobre o comportamento dessas proteínas

separadamente ou complexadas;

Knockdown do parceiros de interação seguido de qPCR para avaliar a

regulação de genes;

Estudos do ponto de vista bioquímico, biofísico e estrutural do complexo

mais promissor, através de gel-filtração analítica, DLS, CD, anisotropia de

fluorescência, Thermal-shift e docking molecular.

38

Capítulo 2. Material e Métodos

39

2.1. Clones utilizados e subclonagens

Alguns dos clones utilizados neste trabalho estavam disponíveis em nosso

laboratório, inseridos em vetores de expressão pET28a ou pcDNA3.1, sendo que

foram doados pelo Prof. Dr. Igor Polikarpov (IFSC-USP), Prof. Dr. Francisco de Assis

da Rocha Neves (UnB), Prof. Dr. Francisco M. R. Laurindo (Incor, São Paulo) e Dr. Paul

Webb (Houston Methodist Research Institute, Houston, Texas). Os outros clones

utilizados no trabalho foram subclonados em nosso laboratório. A lista apresentada

na Tabela 1 mostra todos os clones usados ao longe deste trabalho.

Tabela 1. Lista de clones utilizados.

Nome Gene Vetor Tag/HRE/Fusão Linhagem de

expressão

Flag-TR TR1 full pLVIG Flag Células de mamífero

Flag-TR TR1 full pLVIG Flag Células de mamífero

CMV-TR TR1 full pcDNA3.1 - Células de mamífero

CMV-TR TR1 full pcDNA3.1 - Células de mamífero

CMV-PDI PDIA1 full pcDNA3.1 - Células de mamífero

pBlue - pBlueScript - Células de mamífero

DR-4 Luc Firefly Luciferase pGL3 TR-HRE Células de mamífero

F2 Luc Firefly Luciferase pGL3 TR-HRE Células de mamífero

pRL Renilla Luciferase pRL-CMV - Células de mamífero

pBTM-TR TR1 full pBTM116-KQ’ LexA-DBD L40

pBTM-TR TR1 full pBTM116-KQ’ LexA-DBD L40

TR full TR1 full pET28a Histidina E. coli (BL21 DE3)

TR DL TR-ΔAB pET28a Histidina E. coli (BL21 DE3)

PDI full PDIA1 full pET28a Histidina E. coli (BL21 DE3)

Com o objetivo de trocar os insertos de vetores foram realizadas

subclonagens. Para isso foram desenhados primers (com a ajuda do Software Serial

Cloner v2.5) e reações de PCR foram realizadas de acordo com protocolos já

estabelecidos (SAMBROOK; RUSSELL, 2001). As enzimas e primers utilizados nessas

reações estão descritos na Tabela 2.

Tabela 2. Lista de primers e enzimas utilizados. (F)= Forward; (R)= Reverse; Núcleotídeos em itálico = sítio da enzima de restrição.

Gene Vetor final Primer Enzima

TR1

pBTM116-KQ’ F: GAATTC ATGGAACAGAAGCCAAG Eco RI

R: GCGGCCGC TTAGACTTCCTGATCCT Not I

pLVIG F: GCTAGC ATGGATTACAAGG Nhe I

R: GAATTC ATATTAGACTTCCTG Eco RI

40

TR1

pBTM116-KQ’ F: GAATTC ATGACTCCCAACAGTATGA Eco RI

R: GCGGCCGC CTAATCCTCGAACACTT Not I

pLVIG F: GCTAGC ATGGATTACAAGG Nhe I

R: GAATTC ATACTAATCCTCGAA Eco RI

Para as reações de PCR utilizou-se Taq HiFi Platinum (5 U/μl - Invitrogen) de

acordo com instruções do fabricante. Os produtos do PCR foram verificados em gel

de agarose 0,8% e as bandas, cujo tamanho era esperado para os produtos de PCR

dos genes, foram cuidadosamente recortadas do gel e submetidas a extração e

purificação de seu DNA através do uso do kit QIAquick Gel Extraction Kit, conforme

protocolo (QIAGEN). Em seguida, os insertos foram ligados no vetor pGEM-T

(Promega) overnight e os produtos da ligação foram transformados em Escherichia

coli DH5 e plaqueadas overnight. As colônias foram testadas pela técnica de PCR de

colônia e posteriormente, as mesmas tiveram seus plasmídeos extraídos (Wizard

Plus Minipreps; Promega) e sequenciados. Após avaliar o sequenciamento, seguimos

com os vetores para testes nos respectivos sistemas de expressão.

2.2 Duplo-hibrido em Levedura (y2h)

O ensaio de duplo-hibrido (y2h) tem por objetivo buscar interações entre a

“isca” (ou proteina de interesse) e diversas “presas” (ou parceiros de interacao)

existentes em uma biblioteca de um tecido celular específico. Estes ensaios foram

feitos com o auxílio do Dr. Marcel Nakahira.

Para encontrar novas interações pelo sistema duplo-híbrido, são seguidas as

seguintes etapas: 1. Subclonagem das proteínas-isca em vetor de expressão de

leveduras; 2. Teste da Auto-ativação com as construções das iscas; 3. Amplificação

da biblioteca de cDNA a ser utilizada no screening; 4. Screening de interações entre

as iscas e a biblioteca de cDNA; 5. Identificação das presas que interagiram com as

iscas através da técnica de extraçãoo de DNA plasmidial e sequenciamento; 6.

Confirmação das interações uma a uma em levedura.

No sistema utilizado nesse projeto, as iscas foram clonadas no vetor de

expressão de leveduras pBTM-116KQ’, onde são transcritas em fusão com o domínio

de ligação ao DNA da proteína LexA, resultando no produto isca+LexADBD. Além

41

disso, este vetor contém um gene (TRP1) que permite o crescimento da levedura em

meio sem o aminoácido triptofano (SD-W). Já a biblioteca de cDNA possui genes das

presas clonados em fusão com o domínio de ativação da proteína GAL4 no vetor

pACT2. O produto proteico resultante é chamado de presa+GAL4AD. Este vetor possui

o gene LEU2 que permite que a levedura cresça em meio deficiente do aminoácido

Leucina (SD-L).

A célula de levedura usada nesse projeto (linhagem L40) possui em seu

genoma um sítio no DNA para ligação específica da proteína lexA. Este sítio é

responsável pela regulação da transcrição de dois genes repórteres: (1) Gene lacZ,

que permite a produção da proteína -galactosidase capaz de quebrar o substrato x-

gal resultando em um produto azul; (2) Gene HIS3, que produz uma proteína

essencial da via de produção de histidina, que ao ser transcrito, permite à levedura

crescer em meio sem histidina (SD-H).

Quando ambos produtos, isca+LexADBD e uma das presas+GAL4AD, são

expressos em uma mesma célula de levedura verificamos duas situações possíveis

(FIGURA 8). Na primeira situação (parte superior da FIGURA 8), a isca+LexADBD não

interage com a presa+GAL4AD. Dessa forma a maquinaria de transcrição que seria

recrutada pela proximidade de LexA e GAL4 não é recrutada, e nenhum gene

repórter é transcrito. Na segunda situação (parte inferior da FIGURA 8), a

isca+LexADBD interage com a presa+GAL4AD. Com isso, lexA está próxima o suficiente

de GAL4 e a maquinaria de transcrição é recrutada. Os genes repórteres lacZ e HIS3

são transcritos.

42

FIGURA 8. Mecanismo de funcionamento do screeening de duplo-hibrido (y2h). Os genes lacZ e HIS3 esta o sob regulação do promotor da LexA. Dentre as presas (fusionadas ao Domínio de Ativação da Gal4) encontradas na biblioteca de cDNA de HeLa, temos duas situação possíveis: (1) não existe interação com a isca (que fusionada ao Domínio de Ligação ao DNA da LexA), e então os domínios de ativação e ligação ao DNA não ficam próximos o suficiente para reconstituir a maquinaria de transcrição e transcrever os genes repórteres; (2) existe interação com a isca, e então os domínios de ativação e ligação ao DNA ficam próximos o suficiente para reconstituir a maquinaria de transcrição e transcrever os genes repórteres. Dessa forma a levedura consegue crescer em meio restritivo de histidina (SD-WLH) e consegue quebrar a x-gal e produzir o substrato azul (teste da -galactosidase).

Porém, para que o ensaio seja realizado, existem algumas etapas de teste

que devem ser realizadas antes do screening. Primeiramente, deve-se certificar que

as subclonagens das iscas nos vetores de expressão estão corretas, via

sequenciamento. Em seguida, deve-se realizar testes para verificar se a construção

isca+LexADBD é capaz de transcrever sozinha os genes repórteres HIS3 e lacZ, no

chamado Teste da Auto-ativação. Em caso positivo, a construção deverá ser

descartada. E por último, deve-se amplificar a biblioteca de cDNA contendo as

presas+GAL4AD, através de crescimento em E. coli DH5 seguido de isolamento

plasmidial com ajuda de kit comercial (Maxi-prep, QIAGEN).

2.2.1 Subclonagens em pBTM116-KQ’

Primeiramente foi realizada a subclonagem da sequência codificadora das

proteinas “iscas” fusionada à lexA em um plasmídeo de expressão em leveduras, o

vetor pBTM-116KQ’. Os genes dos TRs foram inseridos em um sítio múltiplo de

43

clonagem do vetor, para permitir a produção da proteína de fusão "lexA-RN" (vetor

de "isca") nas células de levedura. O vetor contém o gene TRP1 como marcador para

seleção e, por isso, a linhagem de levedura utilizada ("L40", genótipo: trp1, his3,

leu2-3, ura3, ade2) cresce em um meio deficiente em triptofano (SD-W) somente

quando transformada com este plasmídeo.

2.2.2 Transformação em L40 e Teste da Auto-ativação

Foi realizado sequenciamento para verificar se as iscas estavam na mesma

fase aberta de leitura do LexADBD no vetor. Em seguida foi realizada a transformação

da colônia L40 com esses vetores. A colônia de L40 foi cedida pelo grupo do Prof. Dr.

Jörg Kobarg, e crescida em meio YPD (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de

peptona e 20 g/L de dextrose).

Realizamos, então, os testes de auto-ativação do sistema, analisando a

expressão dos genes repórteres. Nesse teste, avaliamos se a construção lexA-RN é

capaz de sozinha ativar a transcrição, ou seja, sem a presença de nenhuma presa na

mesma célula de levedura. Se a atividade destes genes repórteres for observada,

descarta-se esta construção de DNA e iniciam-se outras clonagens usando

construções parciais da isca, a fim de obter um domínio que não auto-ative o

sistema. Caso a proteína isca não auto-ative o sistema, a construção poderá ser

usada como isca no screening contra biblioteca de cDNA. Todo o processo foi

realizado em ambiente estéril. Foi semeada uma colônia de levedura (L40) em 50 mL

de meio líquido YPD e incubada por aproximadamente 24 horas, a 30oC, por 200 rpm

até a fase estacionária. Após o crescimento, 1 mL desse inóculo (1 mL para cada

transformação) foi centrifugada a 2.200 g, por 5 minutos, em temperatura ambiente.

O sobrenadante foi retirado e o pellet ressuspendido com 200 µL de tampão de

transformação (34% PEG 3350; 200 mM Acetato de lítio; 10 mM Tris; 1 mM EDTA;

100 mM DTT).

Para cada condição de transformação foram acrescentados 50 g de ssDNA

(salmon sperm DNA) previamente desnaturado (95oC por 10 minutos, e 3 minutos no

gelo) e 500 ng do DNA plasmidial da isca (LexA-RN) e então incubado por 40 minutos

44

a 45oC, com agitações eventuais. Após a incubação, a amostra foi centrifugada

(950 g, 5 minutos, temperatura ambiente) e então plaqueada em placa de petri de

10 cm contendo meio de cultura seletivo sólido SD-W (Meio de crescimento de

levedura com Adenina, Leucina e Histidina e sem triptofano), e foi incubada a 30oC

entre 24-48 horas (FIGURA 9-A).

FIGURA 9. Teste da auto-ativaça o das presas do duplo-hibrido. A. Transformaça o e plaqueamento em gotas. Colônia de L40 é transformada com a isca (ou controles) e plaqueada em meio restritivo. B. Esquema de plaqueamento dos controles e iscas no teste da auto-ativação. C. Teste da auto-ativação (Crescimento da colônia em meio restritivo seguido por teste da beta-galactosidase. Nesse teste é verificado se a isca sozinha é capaz de auto-ativar o promotor e transcrever o gene repórter lacZ (coloração azul). As colônias transformadas são retiradas da placa através de um papel filtro, lisadas e submetidas à imersão em solução contendo x-gal (z-buffer). A quebra da x-gal pela enzima beta-galactosidade produz um substrato de coloração azul. Detalhes na Tabela 3.

Após o crescimento, foram escolhidas 3 colônias de cada transformação e

ressuspendidas em 50 µL de água ultrapura estéril (FIGURA 9-A). Aproximadamente

4 µL dessa solução foram repicados em placas de meio de cultura sólidos SD-W (Sem

Triptofano) e SD-WL (Sem Triptofano e Leucina) e as placas foram incubadas entre

24-48 horas, a 30oC (FIGURA 9-B). Ao mesmo tempo foram feitos vários controles

com os vetores vazios e vetores com insertos conhecidos (Tabela 3); neste caso as

células foram crescidas em meio apropriado.

Tabela 3. Lista de transformações usadas no teste de auto-ativação.

Sigla Plasmídeo 1 Plasmídeo 2 Restrição de aminoácido

1 pBTM vazio - -W

2 pBTM-FEZ (controle +) - -W

6 pBTM-TR - -W

45

7 pBTM-TR - -W

A pBTM-FEZ (controle +) pACT vazio -WL

B pBTM-NRD pACT-YA4 -WL

C pBTM vazio pACT vazio -WL

D pBTM-TR pACT vazio -WL

E pBTM-TR pACT vazio -WL

Para o teste da Auto-ativação (também chamado de teste da -

galactosidase), foi colocado um papel de filtro sobre a placa de meio de cultura

contendo as colônias, com o objetivo de transferir as colônias da placa para o papel

(FIGURA 9-C). Este foi submerso em nitrogênio líquido por 3 minutos para a lise

celular e colocado em uma placa contendo um papel cromatográfico embebido com

solução de revelação Z-buffer (87 mM Na2HPO4, 47 mM NaH2PO4, 19 mM KCl,

1,38 mM MgSO4, 800 g de X-gal, 38mM β-mercaptoetanol), em seguida foi

incubado por 3 horas, a 37oC. O Z-buffer contém o substrato da -galactosidase (X-

gal) e revela quais colônias foram capazes de produzir esta enzima, resultando em

um halo azul, e quais não produziram, mantendo sua coloração rosa-claro.

Como controle positivo foram utilizados: (I) a construção pBTMKQ-FEZ

inteira, a qual sabe-se que, por si só, é capaz de ativar o gene repórter; (II)

construção onde proteína e isca interagem, como já havia sido descrito – NRD e YA4

(NRD: domínio regulatório da NEK1; YA4: 14-3-3 proteína beta) (SURPILI; DELBEN;

KOBARG, 2003). Estas construções foram cedidas pelo grupo do Dr. Jörg Kobarg.

Além disso, as leveduras transformadas foram plaqueadas nas respectivas

placas com meio sólido contendo reagente chamado 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol) na

concentração 5 mM. O 3-AT é um inibidor competitivo da enzima biossintética HIS,

dessa forma, existe uma inibição das interações mais fracas ou falso-positivas entre

as duas proteínas.

2.2.3 Amplificação e isolamento da biblioteca de cDNA de HeLa

A biblioteca de cDNA contém as sequências que codificam proteínas

presentes em determinado tecido ou linhagem celular. No ensaio de duplo-hibrido,

46

essas proteínas encontram-se fundidas ao domínio de ativação da transcrição (AD)

da GAL4 (vetor pACT2).

Uma alíquota biblioteca de cDNA de HeLa (Clontech) foi gentilmente cedida

pelo Prof. Dr. Jörg Kobarg (Unicamp, SP) e amplificada em E. coli DH5 para que se

obtivesse o maior número de clones. As placas com meio de crescimento sólido (LB-

ágar) foram incubadas a 37oC, overnight. As colônias foram coletadas

acrescentando-se 5 mL de meio LB com Glicerol 20% por placa de 150 mm de

diâmetro, e foram posteriormente homogeneizadas e aliquotadas em tubos que

foram estocados em freezer –80oC. As alíquotas foram utilizadas para extração dos

plasmídeos por maxi-prep de acordo com as especificações do fabricante do QIAgen

Plasmid – Maxi-Purification (QIAGEN).

2.2.4 Screening de Duplo-híbrido (y2h)

O Screening foi realizado a partir da transformação da levedura L40 com

DBD-isca seguida da co-transformação das colônias expressando LexA-RN com a

biblioteca de cDNA (AD-presa) em meio seletivo.

Foi retirada da placa SD-W a colônia contendo o lexA-RN e colocada em

150 mL de meio de cultura SD-W líquido. A cultura foi incubada sob agitação de

200 rpm a 30o C, por aproximadamente 16 horas. Quando a amostra apresentava

uma absorbância (A600) maior que 1,5, a mesma foi centrifugada (5 minutos, 2.200 g,

temperatura ambiente) e o pellet foi ressuspendido em meio de cultura YPD líquido

(2 frascos contendo 500 mL cada um) e incubado a 30oC, 200 rpm. A absorbância foi

monitorada até atingir o valor de D. O. entre 0,4 – 0,6. O meio de cultura foi

centrifugado (10 minutos, 2.200 g, temperatura ambiente) e o pellet lavado com

400 mL de TE (10 mM Tris; 1 mM EDTA) sendo novamente centrifugado. Em seguida,

foi ressuspendido com 8 mL de TE/LiAc (1 mM EDTA; 10 mM Tris; 100 mM Acetato

de Lítio) e dividido em tubos para cada isca.

A cada tubo foram acrescentados 500 µg de ssDNA previamente desnaturado

(como descrito anteriormente), 200 µg de biblioteca de cDNA (para cada tubo),

30 mL de PEG/LiAc (40% PEG3350; 10 mM Tris; 1 mM EDTA; 100 mM Acetato de

47

lítio) em seguida os tubos foram agitados vigorosamente (vórtex). Nas alíquotas

controles foram acrescentados 50 µg de ssDNA, 3 mL PEG/LiAc e 10 µL de água

estéril em uma alíquota, e 500 ng de pACT2 vazio em outra alíquota. As amostras

foram incubadas por 30 minutos, a 30oC, a 200 rpm. Após a incubação foi realizado o

choque térmico (15 – 20 minutos, a 42oC e 3 minutos no gelo) e então, as amostras

foram centrifugadas. O pellet foi ressuspendido com 5 mL de TE 1X (100 mM Tris-

HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) em cada tubo (para os controles foram 250 µL) e então

plaqueado em meio SD-WLH contendo 5 mM de 3-AT (250 µL por placa).

As placas foram incubadas a 30oC e monitoradas, após o terceiro dia, quando

começaram a crescer as colônias. Estas foram coletadas do terceiro ao sexto dia,

repicadas e seus plasmídeos foram isolados através da técnica de miniprep de

levedura (descrita a seguir) para obtenção do cDNA da presa.

Nas placas SD-WL (FIGURA 8), todos os transformantes individuais de

levedura continham o vetor isca (LexA-RN) e um vetor contendo uma presa da

biblioteca. O screening foi realizado em meio mínimo (SD-WLH) que permite que

cresçam apenas as células onde a interação entre a "isca" e a "presa" ocorra (FIGURA

9). As células de levedura com o fator de transcrição reconstituído (isto é: aqueles

em que a interação ocorreu) induz a síntese de uma enzima que permite que as

células cresçam em um meio mínimo sem histidina (-H). As células nas quais houve

interação entre as proteínas foram identificadas através da transcrição do gene lacZ.

2.2.5 Extração de plasmídeos de Levedura

Após identificar as colônias com interação, seja pelo crescimento em meio

restritivo (SD-WLH) ou pelo teste da -galactosidase (produzindo um halo azul), as

mesmas foram coletadas com o objetivo de isolar o plasmídeo da presa (pACT2-

presa) existente na levedura.

A colônia de interesse foi inoculada em meio seletivo líquido SD-L e incubada

a 30oC, 200 rpm, por 48 horas. O crescimento da colônia em meio SD-L permite que

a levedura se mantenha transformada com o vetor pACT2 em detrimento do vetor

pBTM, pois é esse o vetor que fornece capacidade de crescimento em meio restritivo

48

sem leucina. Em seguida, o meio de cultura foi centrifugado a 950 g, por 1 minuto e

os pellets foram estocados em Freezer -20oC para posterior extração de DNA.

Cada colônia foi ressuspendida em Rescue Buffer (RB: 50 mM Tris pH7,5,

10 mM EDTA e 0,3% de -mercaptoetanol) e teve um terço do volume transferido

para uma placa de 96 poços (Masterblock, 2ml, fundo cônico). Após centrifugar e

retirar o sobrenadante, foi adicionado o tampão de Lise (2 mg/mL de zymoliase, 0,2

mg/mL de RNAse em RB) e a placa foi incubada sobre agitação a 37oC por 1 hora.

Em seguida foi adicionado SDS 10% (25L por poço) e a placa foi incubada a

temperatura ambiente por 5 minutos e logo após foi congelada em freezer -80oC.

Após descongelar, foi adicionado 100 L/poço de solução Acetato de Potássio 3M, a

placa foi vortexada e centrifugada. O sobrenadante foi retirado e transferido para

placa MicroAmp de 96 poços. O DNA plasmidial foi precipitado com a ajuda de

isopropanol seguido de centrifugação, sendo o pellet lavado com etanol 80%. Uma

vez que o pellet estava seco, este foi ressuspendido em 10 L de água ultrapura e

congelado para ser utilizado no dia seguinte.

Foram feitas as transformações com 5 L desse DNA em DH5

termocompetente que foram, em seguida, plaqueadas e incubadas overnight a 37oC.

O vetor pACT2 também confere resistência ao antibiótico ampicilina. Por isso, uma

colônia de cada transformação foi crescida em LB+Ampicilina overnight para

posterior extração de DNA plasmidial bacteriano com ajuda de QIAGEN Plasmid –

Mini-Purification Kit (QIAGEN). Em seguida, o DNA plasmidial das presas foi

submetido à reação sequenciamento. Após a análise dos dados, foram selecionados

os plasmídeos para próxima etapa.

2.2.6 Confirmação das presas encontradas – Co-transformação 1 a 1

Nessa etapa, após a identificação de todos os possíveis parceiros de

interação, estes passam por uma etapa de confirmação por co-transformação em

levedura. Um a um, todos os candidatos são co-transformados com suas respectivas

iscas e controles negativos (pBTM vazio) para avaliar se existe alguma interação

falso-positiva entre eles.

49

Para isso, foi semeada uma colônia de levedura (L40) em 50 mL de meio

líquido YPD, a qual foi incubada por aproximadamente 24 horas, 30oC, 200 rpm até a

fase estacionária. Após o crescimento, 1 mL desse inóculo (1 mL para cada

transformação) foi centrifugado a temperatura ambiente. O sobrenadante foi

retirado e o pellet ressuspendido com 200 µL de tampão de transformação (34% PEG

3350; Acetato de lítio 200 mM; 10 mM Tris; 1 mM EDTA; 100 mM DTT).

Para a co-transformação foram acrescentados 50 g de ssDNA previamente

desnaturado (95oC 10 minutos e 3 minutos no gelo), 500 ng de DNA da isca mais

500 ng de DNA da presa, e então incubados com o pellet de leveduras por

40 minutos, a 45oC, com agitações eventuais. Após a incubação a amostra foi

centrifugada e plaqueada em meio de cultura seletivo SD-WL (placa de 10 cm) sendo

incubada a 30oC entre 48h-72h.

Após o crescimento, 3 colônias de cada transformação foram selecionadas e

ressuspendidas em 50 µL de água ultrapura estéril. Aproximadamente 4 µL dessa

solução foram colocados em placas de meio de cultura sólido e incubados entre 48-

72h horas, a 30oC. Ao mesmo tempo foram feitos vários controles com os vetores

vazios e vetores com insertos conhecidos; neste caso as células foram crescidas em

meio apropriado. Os meios sólidos utilizados nesse repique foram: SD-WL (Sem

Triptofano e Leucina) e SD-WLH com 5 mM 3-AT (sem Triptofano, Leucina e

Histidina). Com as colônias formadas, foi feito o teste da -galactosidase como

descrito anteriormente. Dessa forma, obteve-se as interações obtidas no screening,

confirmadas par a par com a sua isca de interação.

2.3 Cultura de Células de Mamífero

Células de mamíferos foram cultivadas com o objetivo de realizar ensaios de

imunoprecipitacao e transativacao (no caso da linhagem 293T), e knockdown

seguido de qPCR (no caso da linhagem Hep-TR).

50

2.3.1 Linhagem 293T (ATCC® CRL-3216™)

Originalmente derivada de rins de embriões humanos, modificada com a

adição do antígeno-T SV40, a linhagem celular escolhida para realizar a

imunoprecipitação foi a 293T, pela sua facilidade de cultivo e transfecção. Esta

linhagem foi cultivada em DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium – Sigma)

suplementado com bicarbonato de sódio (3,7 g), 10% de soro fetal bovino, e 1% de

antibióticos (penicilina e estreptomicina) e mantida em estufa a 37oC e 5% CO2.

2.3.2 Linhagem HepG2 (ATCC® HB-8065TM) com expressão estável de TR

A HepG2 é uma linhagem derivada de carcinoma hepatocelular de fígado.

Entretanto, no grupo de pesquisa do Dr. Webb (Houston Methodist Research

Institute, Texas, EUA) foram criadas linhagens estáveis expressando

constitutivamente as proteínas TR alfa e beta fusionadas à cauda Flag (FIGURA 10)

(LIN et al., 2013). Esta linhagem, gentilmente cedida pelo grupo do pesquisador, foi

cultivada em meio DMEM suplementado com 10% v/v de Soro Fetal Bovino, 100

U/mL de antibióticos (penicilina e estreptomicina) e, incubadas a 37oC e 5% CO2.

Esta linhagem celular foi escolhida para a realização de knockdown de PDI

seguido de qPCR de genes regulados pelos TRs de acordo com o artigo publicado por

Lin e colaboradores (2013).

FIGURA 10. Western Blot anti-flag confirmando a Expressa o de TRs em HepG2. 1. Celulas parentais HepG2; 2. HepG2 infectadas com lentivirus controle; 3. HepG2 infectadas com lentivirus expressando TRα; 4. HepG2 infectadas com lentivirus expressando TRβ. Clones estaveis de HepG2 gentilmente doados pelo grupo do Pesquisador Dr. Paul Webb. Figura retirada de (LIN et al., 2013).

51

2.4 Transfecção e expressão em células de mamífero

Os métodos de transfecção de DNA plasmidial foram empregados para se

obter uma superexpressão transiente do RNs utilizados nesse trabalho. Seja para

ensaios de transativacao (gene repórter luciferase), seja para ensaios de

Imunoprecipitação (IP) e Co-IP em células 293T. No primeiro caso, desejamos

aumentar a expressão de proteínas de interesse e verificar a regulação no promotor

do gene Luciferase. No segundo caso, o objetivo foi superexpressar proteínas com

um tag (Flag) para se obter o maior número de interações possíveis e ainda, pela

facilidade de se imunoprecipitar com um anticorpo anti-flag (kit comercial Sigma,

mais detalhes serão dados na sessão “Imunoprecipitacao (IP) em 293T”).

Para isso, utilizamos métodos diferentes de transfecção. No caso de

transfecções em poços menos (placas de 24 poços) para ensaios de gene repórter,

utilizamos o reagente Lipofectamina. Já para ensaios de IP e Co-IP, onde usamos

placas de petri de 100 mm, utilizamos a técnica de fosfato de cálcio.

2.4.1 Transfecção por Lipofectamina

As células foram plaqueadas nas placas adequadas e foi aguardado até que

atingissem a confluência ideal (70-90%). A transfeccao por lipofectamina foi utilizada

em ensaios de transativacao em placas de 24 poços. Durante o período de

transfecção, o meio DMEM completo (com soro e antibióticos) é retirado e

substituído por DMEM incompleto (sem soro e antibióticos). O precedimento de

diluição de DNA e lipofectamina foi feito de acordo com instruções do fabricante do

reagente (Lipofectamine 2000 - Thermo Fisher). A razão DNA(μg):lipofectamina(μL)

utilizada foi 1,5:2. Após 4 horas de transfecção, o meio foi trocado novamente para

meio completo e aguardou-se 24-48 horas para a análise da expressão das proteínas

ou genes repórteres.

52

2.4.2 Transfecção por Fosfato de Cálcio

O método de transfecção por fosfato de cálcio exige uma confluência em

torno de 60%. No dia da transfecção, o meio foi trocado antes da transfecção (para o

mesmo meio completo). Após 4-6 horas, transfectou-se o plasmídeo de interesse.

Para as placas de 100 mm, o DNA plasmidial na concentração final de

40 g/L, foi misturado a uma solução de Tris-EDTA diluída 0,1x pH 8 (1 mM Tris HCl;

0,1 mM EDTA) no volume final de 611 L. Em seguida, adicionou-se solução HBS 2x

pH6,95 (280 mM NaCl; 10 mM KCl; 1,5 mM Na2HPO4.2H2O; 12 mM dextrose; 50 mM

HEPES) na contração 1x e, por último, CaCl2 na concentração final 125 M. Após

23 minutos de incubação, o mix foi adicionado às células. Essa reação precipita o

DNA de forma a facilitar a sua entrada na célula por mecanismos ainda pouco

conhecidos. O DNA só vai atravessar a membrana durante a mitose, por isso é

importante a confluência média da placa. Após 16 horas da transfecção, o meio foi

trocado novamente e aguardou-se 24-48 horas para a análise da expressão das

proteínas de interesse.

2.4.3 Confirmação da expressão via GFP (pLVIG)

Clonamos os genes de TRs, fusionados a cauda N-terminal chamada ‘FLAG’ no

plasmídeo lentiviral Ires-GFP (cedido pelo laboratório de vetores virais – LVV,

coordenado pelo Dr. Marcio Chaim Bajgelman), seguido da sequência IRES (Sítio

Interno de Entrada de Ribossomo) e do gene GFP (Green Fluorescent Protein). Dessa

forma, quando o promotor está ativo, dois RNAs mensageiros são transcritos

separadamente, um contendo o flag-TR e o outro, GFP. Ou seja, se for observado

GFP intracelular pelo microscópio de fluorescência, então flag-TR também foi

produzido. Este é um plasmídeo muito útil no caso da transfecção transiente, de

forma que se observamos GFP visível por microscopia de fluorescência temos a

certeza que TRs também foram produzidos, sem a necessidade de checar esta etapa

por Western Blotting (WB).

53

2.4.4 Confirmação da expressão via Western Blotting (WB)

Em experimentos nos quais desejamos avaliar presença de proteínas

específicas em uma amostra (extrato de células), seja a proteína de origem

endógena ou superexpressa, utilizamos a técnica de Western Blotting (WB).

Primeiramente preparamos o extrato proteico. As células, seja da linhagem

293T ou Hep-TRs, foram ressuspendidas em PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM

Na2HPO4; 1,8 mM KH2PO4) e transferidas para um tubo cônico. As células foram

lavadas 3 vezes com PBS por centrifugação a 450 g, 3 minutos, 4oC. Em seguida o

pellet de células foi lisado com tampão de lise RIPA (50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0,5%

deoxicolato de sódio; 0,1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50 mM NaF) com 1x

coquetel inibidor de proteases (cOmplete™, Roche) e 12,5 mM -glicerofosfato

(inibidor de fosfatases), por 20 minutos, a 4oC. Após a lise, centrifugamos os tubos a

20.000 g, 10 minutos, 4oC. Um novo pellet se formou, contendo restos celulares

como DNA e membranas, enquanto as proteínas permaneceram no sobrenadante.

Ao retirar esse sobrenadante e isolá-lo em um novo tubo, obtemos o que chamamos

de extrato de proteínas.

Os extratos foram então quantificados via kit BCA Assay (PIERCE), e cerca de

40 g desse extrato foi separado por eletroforese em gel SDS-PAGE (12% ou

gradiente 4-20%). Em seguida, as proteínas foram transferidas para uma membrana

de PVDF através do sistema semi-seco (Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell, BIO-

RAD) durante 1 hora e 20 minutos, a 100 mA. Para a transferência foi utilizado um

tampão contendo 39 mM glicina, 48 mM Tris-base, 0,037% SDS e 20% metanol. A

membrana foi bloqueada com solução de bloqueio [5% Leite desnatado em pó

diluído em tampão TBS-T (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; 150 mM NaCl; 0,05% Tween-20)]

durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida foi lavada 3 vezes de 5 minutos

com TBS-T e incubada overnight a 4oC com o anticorpo primário (diluído em solução

de bloqueio).

No dia seguinte a membrana foi lavada 3 vezes por 5 minutos com TBS-T e

adicionamos o anticorpo secundário específico fusionado à peroxidase (diluído em

solução de bloqueio), por 1 hora, à temperatura ambiente. Em seguida, a membrana

54

foi lavada 3 vezes por 10 minutos e incubada com Kit Amersham ECL Prime Western

Blot Detection Reagent (GE Life sciences) de acordo com instruções do fabricante.

Utilizou-se câmera CCD ou filme para detectar a quimiluminescência

proveniente do anticorpo secundário. Para a quantificação das bandas utilizamos o

software ImageStudio Lite (LI-COR). Nessa quantificação é atribuído um valor de

intensidade para cada banda de WB. Para as IPs e Co-IPs normalizamos todas as

bandas pelo controle negativo, considerando a intensidade deste controle como 1, e

para analisar expressão de uma proteína na célula, normalizamos pelo controle de

loading (GAPDH ou -actina).

2.5 Imunoprecipitação (IP) em 293T

Após cultivar as células 293T e transfectá-las de forma transiente com vetor

pLVIG contendo flag-TRs ou flag-GFP (GFP foi utilizado como controle experimental),

confirmamos a presença destas proteínas por microscopia de fluorescência e WB.

Em seguida, realizamos ensaios de imunoprecipitação das proteínas com a ajuda de

um kit comercial que tem afinidade pela cauda flag. Além disso, foram feitas IPs de

uma proteína encontrada como parceira de interação de TR, a PDI endógena, em

293T com superexpressão de flag-TRs, usando anticorpo anti-PDI conjugado à resina

de agarose. Ambas IPs necessitam confirmação via WB tanto para a presença das

proteínas imunoprecipitadas, quanto para a presença das proteínas interactoras das

mesmas.

2.5.1 Imunoprecipitação (IP) via anti-Flag M2 affinity gel (Sigma)

Realizamos três experimentos independentes de IP. Para cada experimento

foram usadas 6 placas de petri 100 mm, transfectadas com pLVIG-TRs ou flag-GFP.

Sendo que usamos 10 placas expressando flag-TR (sendo 5 tratadas com T3), 10

expressando flag-TR (sendo 5 tratadas com T3), e, para controle, usamos 6 placas

expressando flag-GFP (sendo 3 tratadas com T3). Essas quantidades aumentaram

nossa chance de encontrar mais complexos proteicos interagindo com TRs, até os

55

menos abundantes. As placas GFP foram usadas como controle negativo, para

identificar todas as ligações inespecíficas que ocorrem entre as proteínas da célula e

a resina utilizada na IP. As células foram transfectadas por fosfato de cálcio e 4h

após, foram tratadas com T3. Passadas 36h da transfecção, a expressão de GFP foi

confirmada pela pela microscopia de fluorescência e então, as células foram

coletadas.

Para a coleta, as células foram lavadas três vezes com PBS e em seguida,

lisadas com Tampão de Lise RIPA por 20 minutos, a 4oC. As células lisadas foram,

então centrifugadas a 20.000 g, 4oC, por 20 minutos e o sobrenadante foi coletado

(extrato proteico). Deste sobrenadante, foi separada uma alíquota para análise por

WB (chamada de input) e outra para quantificação com ajuda do kit BCA Assay

(PIERCE).

O restante foi adicionado a 80 L resina (aproximadamente 40 L de resina

empacotada) M2 anti-flag (Sigma), de acordo com as instruções do fabricante, por

16h em rotação suave, a 4oC. No dia seguinte, o flowthrough foi retirado e a resina

anti-flag-RN foi lavada três vezes com Tampão de Lise RIPA.

No caso de IP seguida de espectrometria de massas (LC-MS/MS), cada

amostra de resina foi incubada com 100 g/mL peptídeo flag, diluído em 100 L TBS,

a 4oC, por 2 horas, para a eluição dos complexos formados entre os RNs e outras

proteínas. Desta eluição foi guardada uma alíquota (15 L) para análise em SDS-

PAGE e o restante estocado em freezer -80oC para posterior análise em LC/MS/MS.

Na Co-IP, para confirmação das interações (onde a eluição não é levada para

a LC-MS/MS), incubamos a resina com Tampão Laemli, por 30 minutos, a 95oC. O

sobrenadante foi separado por centrifugação e aplicado em gel SDS-PAGE para

análise por WB.

2.5.2 Imunoprecipitação (IP) via resina de Proteina A/G agarose conjugada a

anticorpos específicos

No caso de Co-IP com objetivo de confirmar as interações, podemos

imunoprecipitar os complexos tanto via anti-flag, quanto via resina de agarose

56

conjugada à anticorpos específicos. O protocolo foi adaptado com a ajuda da Dra.

Aleksandra Cvoro (Grupo de Pesquisa do Dr. Webb, HMRI, EUA) no qual extratos de

células transfectadas com flag-TRs foram lisados com tampão RIPA e preparados

como descrito anteriormente.

Em paralelo, cerca de 50 μL de Resina (~25 μL de resina empacotada) de

Proteína A/G agarose (SantaCruz) foi lavada por centrifugação 3 vezes com 500 μL de

tampão RIPA (centrifugação e retirada de sobrenadante – 100 g, 1 minuto, 4oC). Na

etapa é chamada de pre-clear, o extrato proteico foi então incubado por 1 hora (em

câmara fria sob leve rotação) com a resina. Esse passo é importante para retirar as

ligações inespecíficas que podem ocorrer entre as proteínas e a resina. Em seguida,

as amostras foram centrifugadas em velocidade máxima por 1 minuto, a 4oC, e

coletamos apenas o sobrenadante.

Os anticorpos específicos são adicionados a este extrato limpo e incubados

overnight, 4oC, sob rotação suave. Usamos a concentração indicada no manual de

cada anticorpo, e, para o controle negativo, usamos a mesma quantidade de

proteína IgG não-imune de coelho ou rato (SantaCruz, sc-2027 e sc-2025). No dia

seguinte, imunoprecipitamos os complexos com 50 μL de resina (pré-lavadas 3 vezes

com RIPA) por 2-3h sob rotação em câmara fria. A resina foi então lavada três vezes

com 500 μL de RIPA (centrifugacao e retirada de sobrenadante – 100 g, 1 minuto,

4oC). Para a eluição, incubamos a resina com Tampão Laemli por 30 minutos, a 95oC.

O sobrenadante foi separado por centrifugação e aplicado em gel SDS-PAGE para

análise por WB.

2.6 Análise dos dados de IP-LC-MS/MS

As amostras obtidas na eluição das duas imunoprecipitações dos flag-TRs e

flag-GFP em 293T foram digeridas para posterior análise através de espectrometria

de massas (LC-MS/MS). As análises foram feitas no MAS – LNBio/CNPEM

(Laboratório de Espectrometria de Massas) de acordo com protocolos estabelecidos.

Foi feito um protocolo de digestão em solução, uma vez que a eluição se tratava de

uma mistura complexa. Para isso, as amostras foram reduzidas com 5 mM DTT e

57

alquiladas com 14 mM iodoacetamida. Foi feito o quenching da iodoacetamida livre

com a mesma solução de 5 mM DTT e foi adicionado 1 mM CaCl2. Depois, uma

solução de tripsina a 20 ng/μL foi adicionada para a digestão das amostras overnight.

A reação de digestão foi parada utilizando 0,4% ácido trifluoacético e o pH

das amostras foi verificado, devendo ser menor que 3. Para a preparação das

amostras, foi realizado ainda um protocolo para dessalinização das mesmas usando

colunas Stage Tips C18 (manufaturadas no Laboratório MAS).

Em seguida, as amostras foram secas em vácuo e reconstituídas em 20 μL de

0,1% ácido fórmico. Uma alíquota de 4,5 μL de cada amostra foi analisada no

espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos ETD (Thermo Scientific) conectado ao

sistema EASY-nLC (Proxeon Biosystem) por uma fonte de íon nanoelectrospray. Os

peptídeos foram separados em um gradiente de acetonitrila de 2 a 90% em 0,1%

ácido fórmico utilizando a coluna analitica PicoFrit Column (20cm x ID75μm, 5μm de

tamanho de partícula - New Objective) em um fluxo de 300 nL/min, por 85 minutos.

A voltagem do nanoelectrospray foi ajustada para 2,2 kV e a temperatura da fonte

para 275oC. Todos os métodos nos instrumentos foram ajustados no modo de

aquisição dependente de dados, sendo a fragmentação do tipo CID (dissociação

induzida por colisão). A resolução do equipamento foi de 60.000 e os picos mais

intensos foram fragmentados por CID com energia de colisão normalizada de 35%.

Para a obtenção do MS/MS, os íons deveriam ter pelo menos 1.000 contagens com

exclusão dinâmica de 60 segundos. As buscas foram realizadas utilizando o banco de

dados Human International Protein Database (IPI) v. 3.72 (86392 sequências;

35093930 resíduos).

A tabela de todos os peptídeos encontrados nas diferentes amostras corridas

em LC-MS/MS foi analisada de forma a subtrair todos aqueles peptídeos

encontrados no controle flag-GFP da condição flag-TR. Além disso, só escolhemos os

peptídeos que apareceram em 2 ou mais de 3 experimentos independentes para

aumentar a reprodutibilidade dos dados.

58

2.7 Análise dos dados de IP+y2h

Após a finalizacao da coleta de dados proveniente do espectrômetro de

massas e confirmacões de duplo-hibrido em levedura, passamos para a etapa de

análise. Para a análise de peptídeos encontrados na IP-LC/MS/MS, o primeiro passo

foi subtrair da lista total todos aqueles que co-imunoprecipitaram no controle (GFP),

ou seja, que são considerados ligações inespecíficas. Por exemplo, se uma proteína

aparece na amostra GFP, e ela também aparece na amostra TR, automaticamente

eliminamos este possível parceiro. Em seguida, verificamos as triplicatas de cada

amostra e eliminamos os peptídeos que apareceram apenas uma vez, mantendo,

então, aqueles que apareceram em 2 ou 3 experimentos independentes.

Devido ao grande número de peptídeos encontrados e diferentes condições

estudadas (2 isoformas de TR, com e sem T3) utilizamos softwares e plataformas de

análise de dados de proteoma com o objetivo de diminuir o tempo despendido

buscando e estudando os parceiros um a um.

2.7.1 Plataforma IIS (Integrated Interactome System) – anotação dos dados e

construção das redes

A plataforma Integrated Interactome System (IIS) é uma plataforma

integrativa capaz de agrupar os dados provenientes de y2h e IP-LC-MS/MS em

diferentes módulos: processamento, anotação, análise e visualização (CARAZZOLLE

et al., 2014). Foram submetidos em formato ‘.txt’ as listas com os UNIPROT IDs

encontrados nos dois experimentos (IP-LC-MS/MS e y2h). Mais detalhes sobre o

funcionamento da plataforma podem ser encontrados em CARAZOLLE et al. (2014).

A plataforma possui vários módulos de análise de dados. Começamos

primeiramente no módulo Submission, onde fizemos o upload das listas de

proteínas. Em seguida, no Annotation, ‘cadastramos’ todos os peptideos e presas

encontrados nos experimentos de acordo com várias bases de dados (CDD, Prosite,

Swiss-Prot, HPA, DisEMBL, PDB, Gene Ontology, entre outras). Por último, no

Interactome, todas as interações foram submetidas a um blast contra o banco de

59

dados Global Protein-Metabolite-Gene-Drug Interaction Databank (GPMGDID,

construído pelo grupamento dos bancos de dados BioGRID, Intact, DIP, MINT, HPRD,

HMDB, YMDB, ECMDB, DrugBank) e as novas interações foram adicionadas na rede

que foi construída. Esse módulo gera um arquivo XGMML que pode ser importado

no software Cytoscape.

2.7.2 Software Cytoscape – visualização e construção do interactoma

A partir dos dados provenientes da plataforma IIS, é gerada uma rede de

interação no formato XGMML contendo todas as anotações que podem ser

visualizadas no Cytoscape. Este Software é uma plataforma aberta que permite a

visualização de todas as interações encontradas entre as presas e isca (CARAZZOLLE

et al., 2014; SHANNON et al., 2003). Os plug-ins existentes permitem a organização

dos dados por diferentes métodos de visualização e nós optamos por organizar as

proteínas de acordo com o Top Enriched Biological Process - TEBP (retirado da

plataforma GeneOntology). Dessa forma, separamos em círculos àquelas proteínas

que estavam classificadas no mesmo processo biológico.

Além disso, com ajuda de ambos programas, pode-se visualizar quais

interações são inéditas (azul) e quais são provenientes do banco de dados (em

verde) ou seja, já estão descritas na literatura. Assim, reconhecemos quais as

interações são novas e, portanto, as escolhemos para trabalhar na etapa seguinte

(Co-Imunoprecipitação).

60

2.7.3 Software Metacore & Genecodis – principais vias e processos biológicos

encontrados

Os softwares MetaCore e a plataforma GeneCodis foram utilizados para

visualizar os processos biológicos e vias mais enriquecidas em cada rede de

interações produzida. O Metacore (Thomson Reuters), foi usado para analisar as vias

mais comuns encontradas entre as proteinas encontradas, no módulo “Pathway

Maps”. Já a plataforma Genecodis (CARMONA-SAEZ et al., 2007; TABAS-MADRID;

NOGALES-CADENAS; PASCUAL-MONTANO, 2012) foi usada para analisar em quais

processos biológicos as proteínas identificadas em nossos experimentos se

encontram. Nesta plataforma colocamos os peptídeos e presas contra um banco de

dados de genes humanos, em seguida anotamos e analisamos no modo GOSlim

Process. Esse modo representa uma versão resumida das ontologias da GO

(Plataforma GeneOntology) de forma a dar uma visão geral de processos biológicos

de ramos superiores sem detalhes tão específicos encontrados nos processos

biológicos inferiores (GOH et al., 2012) (FIGURA 11).

FIGURA 11. Árvore de Ontologias da plataforma Gene Ontology. Em negrito “regulation of gene expression” é considerado um ramo superior indicando um processo biológico. Abaixo deste, estão os ramos inferiores, ou seja, processos biológicos que estão contidos dentro do ramo superior.

61

2.8 Análise da Regulação da Transcrição

Se tratando de RNs, experimentos que mostrem diferenças na regulação da

transcrição de genes são imprescindíveis. Todos os experimentos foram conduzidos

em cultura de células (293T ou Hep-TRs) transfectadas com diferentes construções

de genes de interesse ou siRNA (no caso de knockdown). Estes ensaios foram usados

para analisar se determinada construção, como flag-TR, responde ao hormônio e é

capaz de ativar a transcrição; ou como a superexpressão de um parceiro de

interação juntamente com TR, interfere na transcrição; ou ainda, como o knockdown

de um parceiro de interação interfere na transcrição de genes regulados por TR+T3.

2.8.1 Ensaios de Transativacao – Gene Repórter Luciferase

Neste experimento buscou-se detectar se as construções flag-RN,

subclonadas em pLVIG, eram capazes de produzir proteínas que, na presença de T3,

seriam capazes de ativar uma determinada região promotora da transcrição de

Luciferase (gene repórter).

Para isso, sítios de ligação de TR (TREs: F2, DR-4 e AP-1) foram subclonados

na região promotora do plasmídeo pGL, que contém o gene da Luciferase de

vagalume (TRE-Luc). Quando co-transfectamos o flag-TR, pBlue (controle vazio), TRE-

Luc e gene da Luciferase de Renilla (pRL, como controle da transcrição basal e para

normalização de dados), obtemos uma certa quantia da enzima Luciferase expressa,

a qual foi avaliada como descrito a seguir neste mesmo tópico.

O experimento foi realizado em células 293T plaqueadas em placas de 24

poços. Quando as células atingem a confluência ideal transfectamos os plasmídeos

com Lipofectamina como descrito anteriormente, sendo que 1 M de T3 foi

adicionado 4h após a transfecção e foram aguardadas 36h para a coleta das células.

No controle experimental transfectamos 400 ng pBlue, 400 ng TRE-Luc e 400 ng pRL;

e, nas condições experimentais, 400 ng flag-TR ou flag-TR, 400 ng TRE-Luc, 400 ng

pRL, na presença e ausência de 1 M de T3.

62

Além disso, sabe-se que, quando TRs estão complexados com outras

proteínas celulares, ocorrem alterações na transcrição do gene repórter em células

de mamíferos. Neste caso, uma das proteínas que foi identificada nos experimentos

de IP+y2h (PDI), foi subclonada e transfectada, juntamente com os receptores de

estudo. Para realizar esse experimento, nos controles experimentais transfectamos

800 ng pBlue, 400 ng TRE-Luc e 400 ng pRL ou 400 ng PDI, 400 ng pBlue, 400 ng TRE-

Luc e 400 ng pRL; e nas condições experimentais, 400 ng flag-TR ou flag-TR, 400

ng TRE-Luc, 400 ng pRL, na presença e ausência de PDI e/ou de 1 M T3.

O sistema de ensaio empregado foi o Dual-Luciferase Reporter (Promega).

Neste sistema, as atividades das luciferases do vagalume e da Renilla foram

sequencialmente avaliadas um luminômetro de placas (GloMax®-Multi Detection

System). A primeira atividade medida é feita pela adição do Luciferase Assay Reagent

II, contendo o substrato luciferina de vagalume. A forma reduzida da luciferina

combina com ATP na presença de luciferase para formar um complexo luciferil-

adenilato. Esse complexo, então, se decompõe para produzir a luciferina oxidada,

gás carbônico e luz (comprimento de onda máximo de 560 nm). A quantidade de luz

produzida nessa reação foi captada e quantificada pelo luminômetro. Após a medida

deste sinal, a reação foi parada e a atividade da luciferase Renilla foi medida pela

adição do reagente Stop&Glow (com o substrato luciferina de Renilla). Desta

maneira, a atividade de luciferase de vagalume dirigida pelos elementos responsivos

foi normalizada pela luciferase de Renilla, que representa a transfecção e expressão

basal da célula. Foram feitos 3 experimentos independentes (n=3) para cada ensaio

e os dados obtidos foram analisados no programa Prism (GraphPad) de acordo com

o teste estatístico one-way ANOVA seguido de pós-teste Bonferroni.

2.8.2 Knockdown seguido de qPCR

Com o objetivo de estudar o efeito da interação entre TR e PDI (proteína

encontrada nos ensaios de IP e y2h) realizamos ensaios de knockdown de PDI em

linhagens Hep-TRs seguido de qPCR de genes regulados por TR+T3 de acordo com

Lin e colaboradores (2013).

63

O protocolo para knockdown foi adaptado de Dharmacon-DharmaFECT (GE

Healthcare Dharmacon), de quem adquirimos o kit para realização desse

experimento. Escolhemos uma solução contendo diversos siRNA (chamado de pool)

do gene P4HB que codifica a proteína PDI humana (ON-TARGETplus, Smart Pool, #L-

003690-00-0005). Além disso, recebemos um pool de siRNA para controle negativo

(ON-TARGETplus Non-targeting Pool, #D-001810-10-05) e a solução de transfecção

adequada para o tipo celular Hep-G2 (DharmaFECT 4 Transfection Reagent).

A linhagem HepG2-TR foi plaqueada a 1x105 células por poço em 2 placas de

12 poços, uma usada para o qPCR e outra para WB. As células foram mantidas em

DMEM completo.No dia seguinte, o meio foi trocado por DMEM sem antibióticos.

Em tubos separados diluimos em optiMEM o siRNA da PDI a 5 μM ou o siRNA do

controle negativo a 5 μM (tubo A). Em outros tubos, diluimos o reagente de

transfecção (tubo B). Após 5 minutos transferimos o conteúdo do tubo A para o B e

incubamos por 20 minutos, a temperatura ambiente, antes de adicionar o mix nas

células.

Após 48 horas de transfecção, as células foram coletadas para qPCR e após

72h, para WB.As placas usadas para qPCR foram lavadas com PBS, as células foram

lisadas e tiveram seu RNA coletado com o kit RNeasy Mini kit (QIAGEN), de acordo

com as instrucões do fabricante. Aproximadamente 1 μg de RNA foi usado para

sintetizar cDNA de acordo com o manual do kit iScript cDNA Synthesis (BIO-RAD).

Após diluir 10 vezes o cDNA obtido em água, as reações de qPCR foram montadas

usando SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems) e o aparelho usado foi ABI

7900HT RT-PCR system (Applied Biosystems) com o programa default de RT-PCR de 2

passos, de acordo com instruções do fabricante. As curvas de amplificação foram

avaliadas por analise de Ct comparativas. As sequências dos primers usados estão

listadas na Tabela 4.

Tabela 4. Lista de primers utilizados no qPCR

Primer Sequencia

PDI 1 F: CATCGTGAACTGGCTGAAGA

R: CTCCACGTCCTTGAAGAAGC

FURIN F: ACAACTATGGGACGCTGACC

R: TGGACACAGCTCTTCTGGTG

HIF2A F: CCACCAGCTTCACTCTCTCC

64

R: TCAGAAAAAGGCCACTGCTT

MYH6 F: CCACCCAAGTTCGACAAGAT

R: CACAGAAGAGGCCCGAGTAG

ALP1 F: GTATGTGTGGAACCGCACTG

R: CTGGTAAGCCACACCCTCAT

PCK1 F: GGGAGAAGGAGGTGGAAGAC

R: GAACACTTGCCCTCTCTTGC

GAPDH F: ACCTGCCGCCTGGAGAAACC

R: GACCATGAGGTCCACCACCCTG

2.9 Expressão e Purificação de Proteínas

Após identificar o complexo mais promissor encontrado via experimentos de

IP-LC-MS/MS e y2h, decidimos avaliar de forma biofísica e bioquímica o

comportamento do complexo em solução. Para isso, produzimos as proteínas de

forma heteróloga em E. coli BL21 e purificamos até obtermos uma amostra pura.

2.9.1 Expressão em E. coli BL21 (DE3)

Para expressão e purificação das proteínas foram utilizados protocolos pré-

estabelecidos em nosso grupo de pesquisa. Os vetores contendo os insertos das

proteínas a serem expressas e purificadas também estavam disponíveis no

laboratório, exceto pelo clone da PDI em pET28a, gentilmente cedido pelo Prof. Dr.

Francisco M. R. Laurindo (Incor, São Paulo).

Foram expressas as proteínas PDI, TRα e TRβ. Para a isoforma TR1

(aminoácidos 102-461), os dois principais domínios dessa proteína estavam

presentes: o Domínio de Ligação ao DNA (DBD) e também o Domínio de Ligação ao

Ligante (LBD). Para a isoforma do TR e para a PDI, usamos uma construção

contendo todos os domínios do receptor, chamada de full lenght.

Os vetores pET28a que contém as sequencias para expressão das proteínas

PDI, TRfull e TRDL, foram transformados por choque térmico em bactéria

Escherichia coli, linhagem BL21 (DE3), e as células foram plaqueadas em meio de

cultura sólido Luria-Bertani (LB-agar) com o antibiótico kanamicina.

65

A expressão se deu da seguinte forma: primeiramente uma colônia foi foi

inoculada e cresceu em pré-inóculo de 10 mL (LB com kanamicina) a 37oC, 200 rpm,

overnight; no dia seguinte, cada pré-inóculo foi adicionado a um inóculo de 1L (LB

com kanamicina) e as bactérias foram crescidas a 22oC, 200 rpm, até se obter uma

D.O. de 0,7 – 1,0. Em seguida, foram induzidas a expressar as proteínas utilizando-se

1 mM de IPTG e foram mantidas em crescimento nas mesmas condições overnight.

O IPTG é um indutor do operon lac e resulta na expressão da proteína subclonada no

plasmídeo pET28a. Além disso, foi utilizado 5 mM de solução de ZnCl2 durante a

expressão dos TRs (necessário para manter o DBD estruturado, devido existência dos

“dedos de zinco”).

2.9.2 Preparação do Extrato e Purificação por afinidade (IMAC)

O isolamento das bactérias BL21 expressando as proteínas de interesse foi

feito por meio centrifugação (12.000 g, a 4°C por 15 minutos) de forma a se obter

um pellet bacteriano. Esse pellet foi ressuspendido em tampão de lise (Hepes 20 mM

pH 8, NaCl 300 mM, 5% de glicerol) contendo 20 mM de β-mercaptoetanol e 100 μM

de PMSF. Para cada litro de expressão, usamos 20 mL do tampão de lise. Após a

ressuspensão do pellet no tampão de lise, adicionamos de 5 g/mL de lisozima e

incubamos por 30 minutos, para o rompimento da parede celular. Em seguida, foi

realizada sonicação em banho de gelo por 10 minutos (30s ON, 30s OFF), utilizando o

sonicador Vibra-Cell Amplitude (Sonics). Após a lise, a suspensão foi centrifugada a

30.000 g, 1 hora, 4oC, para separação das frações solúvel (sobrenadante) e insolúvel

(pellet).

As proteínas apresentam uma cauda de histidina proveniente do vetor

pET28a, por isso utilizamos o método de purificação por afinidade (Immobilized

Metal Ion Affinity Chromatography - IMAC). A cauda de Histidina tem afinidade pelo

cobalto da resina, e isso mantem as proteínas que apresentam essa cauda ligadas à

resina. Esse método é realizado por meio da incubação do sobrenadante obtido na

etapa anterior em resina de cobalto Talon (Clontech) por 90 minutos, sob rotação

leve, a 4oC. A resina de cobalto foi previamente ativada com um tampão de

66

equilíbrio (20 mM Hepes pH 8, 300 mM NaCl, 5% de glicerol, 5 mM imidazol, 2 mM

β-mercaptoetanol).

A suspensão foi então transferida para uma coluna plástica (BIO-RAD) e

lavada com 3 volumes de coluna (VC) de tampão de equilíbrio para eliminar as

interações inespecíficas entre outras proteínas da bactéria e a resina. Em seguida, as

proteínas foram eluídas com tampão de eluição (20 mM Hepes pH 8, 300 mM NaCl,

glicerol 5%, 300 mM imidazol, β-mercaptoetanol 2 mM). O imidazol em alta

concentração presente no tampão de eluição, compete com a histidina pelo cobalto

da resina, e tem afinidade maior por esse metal. Com isso, as proteínas com cauda

são liberadas da resina e são isoladas no tampão de eluição. Todo o processo de

purificação foi realizado a 4°C.

No caso da proteína TRFULL, o tampão utilizado foi 20mM de tampão fosfato

pH 7.4, 300 mM de NaCl e 5% de glicerol (β-mercaptoetanol e PMSF foram

adicionados conforme descrito para as construções acima). Para a purificação por

afinidade adicionamos 5 mM de Imidazol ao tampão fosfato durante as lavagens, e

300 mM de imidazol no tampão da eluição.

A concentração das proteínas foi verificada analisando-se a absorbância no

espectrofotômetro a 280 nm (Nanodrop 2000c, Thermo) de acordo com a massa e

coeficiente de extincao molar (ε) de cada proteina (Tabela 5).

Tabela 5. Proteínas utilizadas no projeto e seus respectivos coeficientes de extinção molar e massa em kDa.

PDIFULL TRFULL TR DL

Coeficiente de Extincao Molar (ε)

45.750 32.520 30.910

Massa (kDa) 57,12 47 42

Para se obter a concentração desejada, as proteínas foram concentradas por

centrifugação em concentrador AMICON com cut-off de 10.000 Daltons. A

centrifugação foi feita a uma velocidade de 1.200g, por 20 minutos, 4oC.

Após a purificação, quando necessário, as proteínas foram clivadas

utilizando-se 1 unidade (U) de trombina por 0,5 mg de proteína, incubando a 4oC,

por 4 horas. A expressão, purificação e clivagem das proteínas foram analisadas em

eletroforese de SDS-PAGE.

67

2.9.3 Purificação por Exclusão Molecular (Gel Filtração)

Este passo de purificação adicional foi utilizado para limpar as eluições

obtidas pela afinidade. Com este passo, conseguimos separar as proteínas baseadas

em seus tamanhos moleculares.

A gel filtração foi realizada utilizando-se uma coluna Superdex 200 (16/600),

previamente equilibrada com 1 volume de coluna (CV) de tampão contendo Hepes

20 mM pH 8, NaCl 200 mM, 5% de glicerol e DTT 2 mM, para a proteína TRDL. No

caso das proteínas TRfull e PDIfull, o tampão utilizado foi 20 mM tampão fosfato

pH 7,4, 300 mM NaCl, 5% de glicerol e 2 mM DTT. Foram injetados 2-5 mL de

proteína na coluna de gel filtração, em um fluxo de 0,3 mL/min seguido de eluição

isocrática com 1,2 Volumes de Coluna. Todo o processo foi realizado a 4°C. As

amostras foram armazenadas em gelo assim que coletadas, devido ao fato das

proteínas serem termos sensíveis. Ao fim desta etapa, as frações obtidas foram

analisadas por eletroforese de SDS-PAGE para se verificar a pureza das proteínas

purificadas.

2.10 Caracterização Biofísica das proteínas e complexos

Os ensaios de caracterização biofísica foram realizados para verificar a

qualidade da amostra, quanto ao tamanho e pureza das proteínas e complexos.

2.10.1 Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS)

O experimento de DLS foi realizado para monitorar o raio hidrodinâmico das

proteínas sozinhas e em complexo, homogeneidade da amostra (através da

polidispersão) e estado oligomérico. Para isso, foram utilizados 20 μl de proteina ou

complexo na concentração de 0,5-2 mg/mL. Esse experimento foi realizado no

68

aparelho Zetasizer NANO S90 (Malvern), seguindo o set up automático do

equipamento.

2.10.2 Gel Filtração Analítica

Os experimentos gel filtração analítica foram realizados em uma coluna com

resina SuperdexTM 200 10/300 (GE HealthCare) com 120 mL de volume. Os

experimentos foram feitos no FPLC UPC900, utilizando um fluxo de 0,5 mL/min, com

pressão máxima de 0,3 MPa na coluna e um detector de UV, monitorando a

absorbância em 280 nm. A coluna foi equilibrada com 1 Volume de Coluna de

tampão Hepes (TRDL) ou Fosfato (PDIFULL e TRFULL), injetou-se 500 μL a 2 mL de

amostra de proteína dependendo da coluna utilizada, e as corridas foram realizadas

com cerca de 2 Volumes de Coluna.

Para determinação do volume vazio da coluna (23,18 mL), utilizou-se uma

solução de Azul de Dextran (~2 MDa), 2 mg/mL em tampão fosfato de sódio (50

mmol/L, pH 7,2) e cloreto de sódio (150 mmol/L). Para a construção da curva de

calibração do coeficiente de partição em função da massa molecular das proteínas,

foram utilizadas proteínas dos kits de calibração para filtração em gel da GE

HealthCare (Gel filtration Calibration kit LMW e HMW). A partir dos dados das

corridas cromatográficas foi construída a curva de calibração do coeficiente de

partição (kav) em função da massa molecular das proteínas. Para a construção da

curva de calibração do coeficiente de partição em função do raio de Stokes (ou raio

hidrodinâmico) das proteínas, foram utilizados os mesmos dados das corridas com as

proteínas dos kits. A partir dos volumes de eluição obtidos e coeficientes de partição

calculados foi construída a curva de calibração do coeficiente de partição em função

do raio de Stokes das proteínas (ERICKSON, 2009). É importante mencionar que a

corrida cromatográfica para a calibração foi feita em triplicata.

69

2.11 Afinidade e termo-estabilidade do complexo

2.11.1 Anisotropia de Fluorescência

Foram realizados dois ensaios de anisotropia, sendo um para verificar a

afinidade entre as proteína do complexo TR:PDI; e um segundo experimento para

verificar a se o complexo TR:PDI permite o recrutamento de coativador, o SRC-1.

No primeiro ensaio, realizado pela Dra. Juliana Fattori, para verificar a

afinidade entre as proteínas do complexo, foi titulada PDIFULL em concentrações

variando entre 1 a 5000 nM em uma solução contendo TRDL com FITC (isotiocianato

de fluoresceína), na presença ou ausência de hormônio, em concentração de 50 nM.

Para este ensaio, TRDL foi marcada com excesso de sonda (FITC – Invitrogen)

equivalente a 3 vezes a concentração molar da proteína e foi incubada por 1 hora no

gelo. Posteriormente, a solução TRDL+sonda foi aplicada em uma coluna de

desalting (HiTrap desalting – GE Healthcare) para retirada do excesso de sonda. As

amostras obtidas de TRDL marcada foram monitoradas por absorbância em 280 e

495 nm para monitorar a presença de proteína e sonda, respectivamente. Essa

mesma marcação foi feita para a proteína PDI usada no ensaio de anisotropia com a

proteína TRFULL. Nesse ensaio, foi titulado TRFULL em concentrações variando entre

1 a 5000 nM em uma solução contendo PDI com FITC, na presença ou ausência de

hormônio, em concentração de 50 nM.

O segundo ensaio foi realizado para estudar a ação do complexo (TR:PDI) no

desligamento e recrutamento de peptídeo da proteína coativadora, SRC-1. Para isso,

incubamos as proteínas TR e PDI na proporção molar 1:1 para formar o complexo, e

em seguida, adicionamos T3 com 3 vezes de excesso molar. Incubamos por 1 hora, a

4oC. O complexo, em concentrações variando de 1 a 7000 nM, foi titulado em

soluções contendo SRC1 marcado com FITC na concentração de 50 nM. O peptídeo

70

corregulador utilizado neste segundo ensaio foi obtido pela Life-technologies : SRC1-

1 (peptídeo coativador) FITC-KYSQTSHKLVQLLTTTAEQQL

Para todos os ensaios foram feitos 3 experimentos independentes, e a curva

média de cada condição foi contruída no Origin. Foi medida a constante de

dissociação (Kd) de cada curva e dos valores foram calculados uma média e um

desvio padrão (erro). Para as medidas, os dados foram ajustados no programa Origin

por meio do algoritmo de Levenberg-Marquardt, e as curvas foram ajustadas de

acordo com a equação Hill para determinação dos valores de constante de

dissociação (Kd) e índice de cooperatividade (FIGUEIRA et al., 2010a).

A anisotropia foi medida a 15°C num fluorímetro (ISS-K2), utilizando 495 nm

como comprimento de onda de excitação, sendo a emissão monitorada a partir de

520 nm, utilizando-se filtro de 490 nm de Cuttoff (Kopp Glass #3384). Os valores de

anisotropia foram calculados pelo programa Vinci-ISS por meio da função

(LAKOWICZ, 2006):

No qual I se refere a intensidade de fluorescência medida, V e H correspondem

aos polarizadores orientados na vertical e horizontal, respectivamente, e G é um

fator de correção que considera diferenças da sensibilidade da fotomultiplicadora,

dependente das direções dos polarizadores.

Esse fator de correção pode ser calculado de acordo com (LAKOWICZ, 2006):

2.11.2 Dicroísmo Circular - CD

Foram realizados ensaios de dicroísmo circular (CD) para avaliar a estrutura

secundária do complexo e a termoestabilidade do mesmo. As medidas de CD foram

feitas em um espectropolarímetro J-810 (JASCO), equipado com um controlador de

temperatura (Peltier Type Control System PFD 4255, JASCO). Utilizando cubetas de

quartzo de 1 mm de caminho óptico, as medidas foram feitas com uma velocidade

71

de varredura de 20 nm/min de 197 a 260 nm, 25 acumulações, com intervalo de

dados de 0,5 nm a 10oC. Amostras das proteinas TRβDL e PDI, isoladas e em complexo

(TRβDL+PDI) na proporção 1:1, foram diluídas a concentração de 5 μmol/L.

Realizamos também a deconvolução dos espectros de CD das proteínas e do

complexo e obtivemos uma estimativa da estrutura secundária das mesmas. A

deconvolução dos espectros foi feita no servidor DichroWeb, utilizando o programa

K2D (ANDRADE et al., 1993; MERELO et al., 1994). Esta deconvolução foi feita

baseada em algorítmos e representa uma estimativa da estrutura secundária da

proteína.

2.11.3 Thermal-Shift

Este experimento foi realizado com o objetivo de avaliar a termo estabilidade

do complexo TR:PDI. O Thermal-shift consiste em um experimento no qual a

proteína é incubada com uma sonda fluorescente, SYPRO Orange (Life Technologies),

que somente emite fluorescência quando se liga em partes hidrofóbicas, as medidas

são realizadas em um equipamento de qPCR, pois este possui a capacidade de fazer

uma rampa de temperatura de forma controlada e também realizar a leitura de

fluorescência da amostra (LAYTON; HELLINGA, 2011).

No início do experimento, a proteína (ou complexo) está enovelada e a

fluorescência medida tem baixo valor, visto que as suas partes hidrofóbicas devem

estar escondidas do solvente. Esta proteína começa a ser aquecida em uma rampa

de temperatura de 10 a 100°C, variando-se a temperatura de 1 em 1 °C. Com isso, a

estrutura proteica começa a ser perdida, as partes hidrofóbicas são expostas e a

sonda se liga à proteína, emitindo fluorescência. A medida que a proteína perde sua

estrutura, a sonda se desliga, diminuindo a emissão da fluorescência, e curvas de

melting da proteína são obtidas. Com isso é possível calcular a temperatura média

do desenovelamento terciário da proteína (Tm) em diferentes condições, em

complexo ou sozinha, na presença ou ausência de hormônio. As condições que

estabilizam a estrutura da proteína apresentarão uma Tm maior. Os dados foram

analisados em Excel e no programa Origin, onde foi possível checar a temperatura de

melting dos complexos em cada uma das condições.

72

Para realizar o experimento, concentramos as três proteínas (TR, TR e

PDI), e juntamos na proporção molar 1:1 cada complexo (20 M de cada proteína),

no tampão Hepes 20 mM pH 8, NaCl 200 mM, 5% de glicerol e DTT 2 mM . Também

separamos alíquotas do complexo e incubamos com 3 vezes de excesso molar de T3.

Ambos, proteínas com T3 e complexos foram incubados por 1 hora, a 4oC, antes do

início do ensaio.

As quantidades de proteína e sonda foram escolhidas baseadas em um teste

feito previamente. Nesse teste variamos as condições de cada reagente. A partir

disso, escolhemos a condição onde obtivemos o melhor sinal de fluorescência para

ser usada no ensaio descrito (sonda de 10 a 20x, e proteína ou complexos de 10 a 15

M).

O ensaio de Thermal-shift foi realizado em placas de de 96 poços para qPCR,

em um volume final de 25 L. As condições utilizadas foram feitas em triplicata

experimental. Utilizamos condições com proteínas sozinhas (TRFULL ou TRDL ou

PDIFULL, na presença e ausência de T3) e em complexos (TRFULL:PDI ou TRDL:PDI, na

presença e ausência de T3).

2.12 Estudos estruturais do complexo in silico

Com o objetivo de se avaliar estruturalmente a interacao entre PDI e TRα ou

TRβ, foram realizados experimentos de docking molecular. Este experimento foi

realizado pelo aluno de Doutorado MsC. Helder Veras Ribeiro Filho em colaboração

com o Laboratório de Biologia Computacional – LBC (LNBio, CNPEM). Para tal, as

estruturas cristalográficas do LBD do TRβ e TRα humanos foram obtidas do Protein

Data Bank (PDB: 3GWS e 2H77, respectivamente). Especificamente na estrutura do

TRβ, o residuo CAS (s-(dimetilarsênico)cisteína) foi substituído por uma cisteína. Para

a PDI humana, não existe até o momento estrutura cristalográfica com todos seus

domínios e, portanto, a PDI completa (domínios a’,b’,b,a) foi construída por

homologia utilizando como modelo a PDI de levedura (PDB: 2B5E) por meio do

software YASARA (KRIEGER; KORAIMANN; VRIEND, 2002).

73

De posse das estruturas e modelos estruturais das proteínas, foi realizado um

experimento de docking de cada um dos TRs com a PDI, por meio do servidor de

predição de interação proteína-proteína ClusPro (COMEAU et al., 2004). Nessa fase

de docking, nenhuma restrição de distância entre resíduos foi adotada, permitindo

que seja avaliada toda a superfície de ambas as proteínas. Os melhores modelos

preditos no docking foram submetidos a um processo de neutralização e

minimização por meio do software YASARA.

74

Capítulo 3. Screening de novas interações entre TRs e outras proteínas

75

3.1 Introdução

Neste capítulo vamos discutir sobre os principais resultados obtidos através

dos screenings de novas interações entre os receptores nucleares TRs e outras

proteínas celulares.

O campo de pesquisa em Sistemas Biológicos tem se tornado um grande foco

de estudo nos últimos anos. E esse interesse se deve a: (1) grande quantidade de

dados gerados por genômica e proteômica disponíveis atualmente; (2) a necessidade

de entender sistemas celulares complexos ou doenças multifatoriais como câncer e

síndrome metabólica; (3) tecnologias emergentes que permitem o screening em

larga-escala (High-throughput Screening) de misturas complexas de biomoléculas. E

por último, todo esse avanço não seria possível sem o desenvolvimento de

ferramentas de bioinformática para analisar a grande quantidade de dados gerados

(BRÜCKNER et al., 2009).

Além disso, no caso de proteínas com funções desconhecidas, técnicas de

identificação das redes de interação proteína-proteína, trazem informações

importantes sobre quais seriam as funções dessas proteínas (CAUSIER, 2004). Essas

redes de interação biológicas podem ser definidas como um conjunto de proteínas

(ou genes) que foram ligados umas as outras de acordo com suas relações

funcionais. Portanto, entender essas conexões nesse sistema nos traz hipóteses de

como dada função pode ser coordenada pelas proteínas envolvidas nessa rede (GOH

et al., 2012). Ao contrário do que é visto em processos biológicos, que representam

sequencias de moléculas direcionadas a um resultado final, por exemplo, cascata de

sinais, as redes de interação são sistemas interligados entre si (BONETTA, 2010).

Screenings em larga-escala para a busca de interações físicas e genéticas

entre proteínas têm revelado novas perspectivas para o estudo dos Sistemas

Biológicos. Mais ainda, a análise detalhada dessas interações pode trazer novos

conhecimentos sobre funções de genes/proteínas e sobre a organização da rede de

interação celular. Com isso, a validação de alvos terapêuticos para o

desenvolvimento de fármacos se torna mais fácil (CARAZZOLLE et al., 2014).

Duas abordagens popularmente conhecidas e muito efetivas para revelar

essas redes de interação, são o duplo-híbrido em levedura (y2h) e proteômica

76

baseada em espectrometria de massas (MS) (CAUSIER, 2004). Entretanto, apesar de

y2h e proteômica baseada em MS resultarem no descobrimento e construção de

interactomas, cada método apresenta diferentes aspectos de interações proteína-

proteína. O y2h trata de interações binárias, ou diretas, entre proteínas; e a

proteômica baseada em MS, trata de formações de complexos de proteínas, ou

também, interações indiretas (GAVIN et al., 2002). Com isso, apenas combinando os

dados de ambas, um interactoma pode ser considerado como mais próximo possível

do real e completo (CAUSIER, 2004).

Como exemplos da aplicação dessas técnicas temos um estudo publicado que

relaciona a identificação e formação dos diversos complexos de transcrição, estáveis

ou transientes, utilizando a técnica de proteômica baseada em MS (MALOVANNAYA

et al., 2010). O estudo da transcrição na célula é muito relevante, uma vez que esse

processo é baseado em uma rede de interações ordenadas entre diferentes

complexos de proteínas. Além disso, muitas das proteínas envolvidas nesse processo

só apresentam atividade quando em complexo com outras proteínas (KADONAGA,

1998; MALOVANNAYA et al., 2010). Outro estudo na área de fatores de transcrição,

trata de duas isoformas de TRs (1 e 1), e revela as diferenças e semelhanças entre

o painel de proteínas que cada isoforma é capaz de interagir. Esse estudo foi feito

também utilizando a abordagem de proteômica baseada em MS (HAHM;

SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014).

3.2 Subclonagens

3.2.1 Subclonagens em pBTM116-KQ’

Os genes do TR α e β, que estavam em pCDNA3.1 foram subclonados para os

vetores pBTM116KQ’ com a colaboracao do bolsista de verao Vinicius Osterne e Dra.

Beatriz Santos Capela Alves.

Os produtos amplificados pelo PCR dos TRs foram ligados em pGEM-T. Após

a confirmação da sequência, o inserto foi digerido do pGEM-T e purificado

novamente do gel de agarose para a digestão com as enzimas específicas e ligação

77

no vetor final, pBTM116-KQ’ (FIGURA 12). As ligações foram confirmadas por PCR de

colônia e sequenciamento.

FIGURA 12. Subclonagens no vetor pBTM-116kQ’. O vetor ampliado mostra a localização dos genes TRs subclonados. Destacamos as regiões mais importantes do vetor: KanR, que fornece resistência à kanamicina quando expresso em E. coli; TRP1, gene que permite o crescimento da levedura em meio sem triptofano (SD-W); LexA-DBD, Domínio de ligação ao DNA da lexA, clonado em fusão ao gene da isca.

É possível observar no vetor resultante (FIGURA 12): o gene para a resistência

à kanamicina, usado para amplificar o vetor em E. coli (DH5); o gene TRP1, que

permite a levedura crescer em meio sem triptofano (SD-W); e o gene contendo o

Domínio de ligação ao DNA da lexA. Todas as construções foram checadas por

sequenciamento.

3.2.2 Subclonagens em pLVIG

Os genes do TR α, β, e PPAR α, β e γ, que estavam subclonados em pCDNA-

Flag, foram clonados para o vetor pLVIG com a colaboração da Dra. Beatriz Santos

Capela Alves (FIGURA 13).

O vetor LVIG é um vetor lentiviral, logo possui genes para a formação do vírus

(regiões LTR na FIGURA 13). Entretanto, decidimos utilizar este vetor para expressão

de NRs em 293T devido a expressão de GFP, utilizada como controle (na FIGURA 13

ilustrado pelo elemento IRES-GFP). É importante ressaltar que nessa subclonagem

78

adicionamos a cauda flag na posição N-Terminal dos genes, proveniente do vetor

pCDNA-Flag.

FIGURA 13. Subclonagens no vetor Lentiviral pLVIG. O vetor mostra a região em que o genes TRs foram subclonados. Destacamos as regiões mais importantes do vetor: LTR, regiões que codificam genes necessários à formação do lentivírus; Promotor Ubiquitina, que dirige a expressão dos genes, AMP, gene que confere resistência à ampicilina quando expresso em E. coli.; IRES-GFP, região de transcrição policistrônica do gene da proteína GFP.

3.3 Duplo-Híbrido em Levedura (y2h)

3.3.1 Transformação em L40 e Teste da Auto-ativação

O Teste da Auto-ativação, como sugerido em uma revisão recente (CAUSIER,

2004), deve ser feito com todas as iscas (após clonagem no vetor pBTM) a serem

utilizadas no screening, dado que pelo menos 10% das proteínas usadas como iscas,

principalmente fatores de transcrição, apresentaram auto-ativação do gene repórter

(FASHENA; SEREBRIISKII; GOLEMIS, 2000). A partir disso, resolvemos testar as

construções de TRs em pBTM.

Após a transformação da L40 com os plasmídeos específicos, as leveduras

foram plaqueadas em meios restritivos equivalentes. O Teste da Auto-ativação foi

feito na presença de 5mM 3-AT, quantidade mínima sugerida para evitar interações

inespecíficas (FIGURA 14).

79

FIGURA 14. Teste da auto-ativação (5mM 3-AT): As placas SD-W (sem triptofano) permitem o crescimento das colônias que possuem o vetor pBTM116-KQ’. E placas SD-WL (sem triptofano; sem leucina) permitem o crescimento de colônias com pBTM116-KQ’ e pACT2. Com isso, o teste da beta-galactosidade mostra a não-transcrição do gene repórter lacZ nos casos de controle negativo (vetores vazios) e a auto-ativação (azul) nas condições de controle positivo (FEZ; interação NDR:YA4). Felizmente ambas isoformas de TR não auto-ativaram (cor da colônia rosa claro), portanto seguimos o screening com esses RNs.

Fizemos os testes das construções em pBTM transformadas uma a uma em

levedura, e plaqueamos em meio restritivo SD-W. Além disso, testamos a Auto-

ativação das mesmas construções co-transformadas com pACT vazio, e plaqueamos

em SD-WL, para observar se haveria produção de halo azul.

Nos casos de controle negativo, nos quais temos vetores vazios (FIGURA 14:

pBTM vazio e pBTM vazio + pACT vazio), observamos a manutenção da cor da

colônia de L40 (branca a rosa claro). Já nos casos de controle positivo ou auto-

ativação, (FIGURA 14: FEZFULL; FEZFULL + pACT vazio; interação descrita NDR:YA4),

observamos halos azuis ou a colônia toda azul. Isso indica que o DBD da lexA e o AD

da GAL4 estavam próximos o suficiente para recrutar a maquinaria de transcrição e

transcrever lacZ. Porém para a construção FEZFULL apenas a presença de FEZ em

fusão com DBD da lexA, já é capaz de promover a transcrição, por isso, esta

construção é usada como controle positivo do teste da auto-ativação. Felizmente

ambas isoformas de TR (FIGURA 14) não auto-ativaram, e se mantiveram na cor

esperada (rosa claro), portanto seguimos com os experimentos de screening para

estes RNs.

80

3.3.2 Screening de Duplo-hibrido (y2h)

Após o screening, monitoramos o crescimento das colônias de interação.

Obtivemos um grande número de colônias co-transformadas em cada dia de

crescimento (Tabela 6).

Tabela 6. Número de colônias encontradas para cada isca em cada dia de crescimento.

Isca 3o Dia 4o Dia 5o Dia Total

TR 143 191 132 466 colônias

TR 180 261 186 627 colônias

A isca TR (Tabela 6) apresentou um maior número de colônias de interação,

se comparada à isca TR. Outro detalhe importante é o alto número inicial de

colônias para cada isca. Esse número inicial (~400 a 650 colônias) nos permite dizer

que obtivemos um screening de alta eficiência para busca de interações.

Após o crescimento das colônias de interação nas placas de repique SD-WL e

SD-WLH, foi feito o teste da -galactosidade (FIGURA 15).

FIGURA 15. Teste da beta-galactosidade nas colônias resultantes do screening. Aqui mostramos uma placa de cada isca, porém esse mesmo teste foi aplicado em todas as colônias encontradas. Após repique e crescimento das colônias, as mesmas foram retiradas com papel filtro e incubadas com buffer-Z (que possui o substrato da beta-gal, x-gal). A figura mostra a grande maioria de colônias azuis presentes, onde houve transcrição do gene repórter lacZ. Os destaques em rosa mostram colônias que não apresentaram interação e, portanto, o gene lacZ não foi transcrito, sendo consideradas ‘falso-positivas’.

81

Obtivemos cerca de 95% de colônias azuis por placa (FIGURA 15), mostrando

que houve interação isca-presa. Os outros 5% são falsos-positivos, nas quais houve

crescimento em SD-WLH, porém não houve produção de lacZ, ou seja apenas o gene

repórter HIS3 foi transcrito. Colônias de screening com esse comportamento (cor

rosa claro, falso-positivas) foram descartadas (circuladas em rosa na FIGURA 15).

Após o teste, seguimos com o protocolo e obtivemos aproximadamente 800 clones

em pACT2 para a próxima etapa.

3.3.3 Confirmação da presas encontradas – Co-transformação 1 a 1

Ao término das análises dos sequenciamentos, obtivemos um total de 55

possíveis parceiros de interação para o TR e 52 parceiros para o TR (Tabela 7).

Em negrito evidenciamos os parceiros de interação de TR já bem descritos pela

literatura: como o RXR, a proteína que forma heterodímeros com TR (BERRODIN et

al., 1992; BUGGE et al., 1992); e N-CoR, proteína correpressora da transcrição que

interage com TR (ARAKI et al., 2005; SAFER et al., 1998; WANG et al., 2009).

Tabela 7. Presas encontradas no screening para cada isoforma de TR. As siglas representam os GENE SYMBOLS (UniprotKB).

TR TR

ASB3 HMGB1 RPS6 ABCB8 LINC00269 RPL5

ATAD2 HSP90B1 RXRA ASCC2 LRPAP1 RPL8

C8orf44 L1TD1 RXRB ATP1B3 MRPL11 RPLP0

CASP4 LINC00596 SNRNP48 CCDC132 NAP1L1 RPS11

CCDC132 LTBR SRM CFL1 NCOR1 RPS16

CCT5 MESDC2 SRPK1 CLPX NCOR2 RPS4X

CIB1 MRPL28 STAC COG2 NPM1 RXRA

CNNM4 NCOR1 TAOK3 DGKZ P4HB SRSF3

CNTLN NCOR2 TBC1D9B DYNLT1 PCBP1 SYBU

COG2 NUDCD1 TIMM8A EEF1A1P5 PISD TIMM8A

COL4A2 PCYT2 TMPRSS3 ENO1 PLA2G16 TSC2

COPS5 PDHX UBA52 FTH1 PRDX1 UBA52

COPS7B PPM1G UBE2I FXC1 PRKAR1B UBE2I

CSNK1A1 RAB20 USP34 GOLGA7 PSMB1 ZNF195

DDX5 RFXANK USP7 HIGD1A PSME1

FAM134B RNASEH2B VIM HSP90AA1 PTP4A2

FIP1L1 RPL9 ZFAND1 IRF2BP1 RPL23A

FTH1 RPS2 KIF3A RPL28

FXC1 RPS4X L1TD1 RPL3

82

Com o objetivo de confirmar se as interações eram realmente verdadeiras,

realizamos a co-transformação da isca com uma das presas em levedura. Após a

análise dos resultados, obtivemos uma lista de interações confirmadas.

Para demonstrar os resultados dos testes de confirmação da interação,

selecionamos apenas algumas das presas que foram confirmadas (4 de 31 presas

para o TR, e 4 de 11 presas para o TR), embora o teste tenha sido feito com todas

(FIGURAS 16 E 17). As figuras estão separadas para cada presa, em dois quadrantes,

um preto e um azul. O primeiro (preto) representa fotos dos crescimentos das

colônias em placas SD-WLH, e o segundo (azul), representa fotos do teste da -

galactosidade.

FIGURA 16. Teste da co-transformação das presas encontradas no screening de TR. OS CONTROLES: (a) pBTM vazio + pACT vazio; (b) pBTM-FEZ full + pACT vazio; (c) pBTM-YA4 + pACT-NRD; (d) FEZ (truncada) + pACT vazio. PRESAS EM CO-TRASNFORMAÇÃO: Colônias 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + presa (controle negativo); Colônias 4 a 6, triplicata de pBTM-TR + presa. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina (SD-WLH); Quadrante azul: teste da -galactosidase (transcrição do lacZ – halos azuis). Os controles negativos (a e d) e controles positivos (b e c) estão de acordo com o esperado. Aqui ilustramos apenas algumas das interações que foram confirmadas via co-transformação e teste dos genes repórteres. Como esperado a triplicata 1-3, é o controle sem TR (espera-se um crescimento baixo ou nulo em SD-WLH, e no teste da -gal uma cor de colônia rosa claro, sem halos azuis) , e a triplicata 4-6, onde temos a confirmação da interação isca-presa (espera-se um crescimento alto ou maior em SD-WLH, e no tese da -gal uma colônia com halos azuis).

Para a isoforma TR ilustramos 4 das 31 interações (FIGURA 16), nas quais

observamos tanto o crescimento (triplicatas 4 a 6) em placas SD-WLH (quadrante

83

preto), quanto a cor azul no teste da -gal (quadrante azul). Detacamos as proteínas

NCor1; RXR ; TIMM8A, uma translocase mitocondrial; e CASP4, uma caspase.

FIGURA 17. Teste da co-transformação das presas encontradas no screening de TR. OS CONTROLES: (a) pBTM vazio + pACT vazio; (b) pBTM-FEZ full + pACT vazio; (c) pBTM-YA4 + pACT-NRD; (d) FEZ (truncada) + pACT vazio. PRESAS EM CO-TRANSFORMAÇÃO: Colônias 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + presa (controle negativo); Colônias 4 a 6, triplicata de pBTM-TR + presa. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina (SD-WLH); Quadrante azul: teste da -galactosidase (transcrição do lacZ – halos azuis). Os controles negativos (a e d) e controles positivos (b e c) estão de acordo com o esperado. Aqui ilustramos apenas algumas das interações que foram confirmadas via co-transformação e teste dos genes repórteres. Como esperado, a triplicata 1-3 é o controle sem TR (espera-se um crescimento baixo ou nulo em SD-WLH, e no teste da -gal, colônia rosa claro, sem halos azuis), a triplicata 4-6, confirma a interação isca-presa (espera-se um crescimento alto ou maior em SD-WLH, e no tese da -gal uma colônia com halos azuis).

Para a isoforma TR (FIGURA 17), ilustramos 4 das 11 interações

confirmadas, nas quais observamos tanto o crescimento (triplicatas 4 a 6) em placas

SD-WLH (quadrante preto), quanto a cor azul no teste da -gal (quadrante azul).

Destacamos as proteínas P4HB, uma Dissulfeto Isomerase; L1TD1, fator de

transcrição com Domínio Transposase Linha-1; NPM1, Nucleofosmina; NCor2.

O método de duplo-hibrido em levedura é considerado como uma ótima

técnica para a busca de novas interações, uma vez que, ao chegarmos ao final das

confirmacões, as interacões restantes sao consideradas interacões ‘diretas’, ou seja,

interações fortes proteína-proteína (BRÜCKNER et al., 2009; CAUSIER, 2004;

PARRISH; GULYAS; FINLEY, 2006). A partir do número inicial de aproximadamente

800 colônias (Tabela 6), encontramos 11 interações para o TR e 31 interações para

o TR. Nessa seleção dos candidatos a parceiros de interação, cada etapa funciona

como um filtro, eliminando as interações falso-positivas ou muito fracas (Tabela 8).

84

Por isso foi muito importante obter o maior número de colônias possível na primeira

etapa do screening.

Tabela 8. Duplo-híbrido em números

TR TR

Screening com biblioteca de HeLa (Clontech) Screening com biblioteca de HeLa (Clontech)

Dias de crescimento em meio sólido

Colônias Dias de crescimento em meio sólido

Colônias

3 143 3 180

4 191 4 261

5 132 5 186

total 466 total 627

Clones Clones

Colônias positivas na presença de x-gal

384 Colônias positivas na presença de x-gal

596

Crescimento em meio, extração de DNA em levedura, transformacao em DH5α, miniprep de bactéria e sequenciamento

128

Crescimento em meio, extração de DNA em levedura, transformacao em DH5α, miniprep de bactéria e sequenciamento

147

Número de proteínas encontradas

55 Número de proteínas encontradas

51

Confirmação da interação por co-transformação em levedura

31 Confirmação da interação por co-transformação em levedura

11

3.3.4 Interactoma, análise e discussão do y2h

Analisamos primeiramente as presas encontradas e confirmadas por y2h. Os

interactomas construídos no Cytoscape estão ilustrados a seguir (FIGURA 18). De

acordo com as configurações default do software Cytoscape, todas as interações

novas, ou não descritas pela literatura, aparecem em azul; e aquelas já descritas na

literatura, aparecem em verde.

85

FIGURA 18. Interactoma dos parceiros de TR encontrados no duplo-híbrido (y2h), analisados pela plataforma IIS e visualizados no Cytoscape. Em verde, os parceiros já descritos na literatura como interactores de TR, e em azul os parceiros inéditos.

Foram encontrados 31 parceiros de interação para a isoforma , sendo que

28 desses parceiros são considerados inéditos (mostrados em azul na FIGURA 18). Já

para o TR , foram encontradas 11 interações, sendo que 10 dessas interações,

nunca foram descritas (em azul, FIGURA 18). Também observamos que a validade do

método se concretiza pela presença de interações já descritas, como a proteína

86

NCOR, um correpressor bem estudado e bem conhecido do TR (ARAKI et al., 2005;

SAFER et al., 1998; WANG et al., 2009). Além disso, o RN envolvido na

heterodimerização do TR, o Receptor X-Retinóide (RXR), também foi encontrado

(BERRODIN et al., 1992; BUGGE et al., 1992). Dentre esses parceiros já descritos,

também encontramos o NCor 2 (ou SMRT) interagindo com o TR e o NCor 1

interagindo com a isoforma (FIGURA 18).

Nossa hipótese para as diferenças de parceiros de interação encontrados

para TR e é que caso houvesse um cruzamento da dados das confirmações, ou

seja, se os parceiros de TR fossem co-transformados com TR e vice versa, algumas

interações seriam confirmadas para ambas isoformas, como é o caso do NCor 1 e 2,

e dos RXRs. Além disso, no y2h é comum que algumas interações mais fracas possam

ser ‘’perdidas’’ ao longo do caminho (como mostrado na Tabela 8), em detrimento

das mais fortes e mais abundantes. Entretanto, não consideramos isso um problema,

uma vez que encontramos um grande número parceiros de interação direta

confirmados para ambas isoformas.

Descrição de alguns alvos encontrados para o TR

Além dessas proteínas, destacamos que, dentre os parceiros encontrados

para o TR, 5 proteínas estão relacionadas a sinalização de estrógeno e câncer de

mama (SGK3, PCYT2, CSNK1N1, CASP4, ATAD2). Os papéis de NRs na proliferação,

diferenciação e apoptose suportam a ideia de sua importante participação em

câncer e muitos estudos mostram a perda da expressão de NRs ou expressão

exacerbada em células neoplásicas (CHUNG et al., 2006; KRISHNAN; PEEHL;

FELDMAN, 2003; PENDÁS-FRANCO et al., 2008). Um desses estudos concentra-se no

Receptor de Hormônios Tireoidianos (TR) e sua expressão no câncer (ALYUSUF et al.,

2014; ARANDA et al., 2009; CHENG, 2003; CONDE et al., 2006). Embora as evidências

de uma relação entre hormônios tireoidianos e desenvolvimento de câncer de mama

são conhecidas desde 1896, alguns outros estudos in vivo e in vitro diferem

substancialmente (ALYUSUF et al., 2014; CESTARI et al., 2009; DINDA; SANCHEZ;

MOUDGIL, 2002; GLINSKII et al., 2009; GUIGON et al., 2011; PARK; ZHAO; CHENG,

2013; SAR et al., 2011; SARAIVA et al., 2005).

87

Dentre estes destaques, a SGK3 (ou C8orf44) é uma serina/treonina quinase

que faz parte da família de quinases do soro e de glicocorticóides, esta família

consiste de 3 isoformas, SGK-1, -2 e -3. Estas quinases são responsáveis por regular o

crescimento, a sobrevivência e a migração celular, processos celulares que se

apresentam desregulados no câncer. Além do mais, SGKs estão downstream da via

de sinalização da PI3K e interagem em vários níveis com as quinases RAS/RAF/ERK,

ambas sinalizações conhecidas por promover tumorigênese (BRUHN et al., 2010).

Um trabalho de 2012 mostra que a expressão da SGK3 está ligada ao Receptor de

Estrógeno (ER) tanto em linhagens de câncer de mama, quanto em amostra de

tumores, e demonstra que existe uma correlação positiva entre a presença desta

proteina e o prognóstico do tumor, principalmente, ER+ (XU et al., 2012).

O gene PCYT2, tem como produto a enzima CTP:fosfoetanolamina

citidililtransferase (ECT), essencial participante da via Kennedy, via primária de

síntese de fosfatidiletanolamina (PE) nas células de mamíferos. Alguns estudos

sugerem que ECT e a via PE-Kennedy poderiam ser inibidas em vários tumores e

células transformadas, inclusive em câncer de mama (BAKOVIC; FULLERTON;

MICHEL, 2007; ZHU; JOHNSON; BAKOVIC, 2008). Em outro trabalho foi demonstrado

que a grande síntese de DAG (Diacilglicerol) e alta atividade da taxa regulatória da

enzima Pcyt2 são moduladores críticos da via PE-Kennedy. Dessa forma, Pcyt2, além

de ser um gene ultrassensível ao microambiente nutricional, se mostra também um

bom alvo para novas estratégias no contexto do tratamento do câncer (ZHU;

BAKOVIC, 2012).

A CKI, produto do gene CSNK1a1, é chamada enzima caseína quinase 1.

Componente da família das caseínas quinases (CKs) que, assim como a SGK3,

também são serina/treonina quinases, divididas em em CK1 ou CK2, dependendo da

sua homologia e domínios catalíticos. A CKI faz parte da CK1 e em vertebrados

existem 7 isoformas (, , 1, 2, 3, e ). Muitos substratos são conhecidos como

específicos da CKI e estão envolvidos em vias de sinalização oncogênicas com Wnt/

-Catenina, p53 e PI3K/AKT (SCHITTEK; SINNBERG, 2014). Um grupo, investigando a

linhagem MCF-7 de câncer de mama e a resistência ao Tamoxifeno, também

observou que as células apresentavam a via Wnt/-catenina aumentada assim como

88

a trancrição dos genes associados, como o Csnk1a1, Axin2, Myc, entre outros

(ELYADA et al., 2011).

Caspases são cisteíno-proteases aspartato específicas, evolucionalmente

conservadas envolvidas em eventos de sinalização. São muito conhecidas por

executarem papéis na morte celular programada durante o desenvolvimento e a

vida adulta. As caspases -1, -4, -5 e -12, estão supostamente envolvidas com

inflamação. O gene CASP4, produz a proteína caspase-4, ainda pouco caracterizada

em humanos (SOLLBERGER et al., 2012). Foi identificada, através de hibridização por

Microarray, como um dos genes apoptóticos que são regulados pela curcumina

(pigmento amarelo presente em rizomas de cúrcuma, conhecida por efeitos anti-

tumorigênicos) na linhagem celular de câncer de mama, MCF-7, indicando que

CASP4 pode ser um possível alvo no tratamento deste tipo de cancer

(RAMACHANDRAN et al., 2005).

O ATAD2/ANCCA, AAA+ Corregulador Nuclear Associado ao Câncer, contém

dois domínios AAA (ATPases Associadas com diversas Atividades celulares),

identificado também como coativador de AR (Receptor de Andrógenos). Essa

proteína regula diretamente protooncogenes como ACTR, AIB1, SRC-3 e é altamente

expressa em câncer de próstata, além de regular genes como ciclina D1, c-Myc, e

E2F1, que contribuem para proliferação celular (WAN et al., 2014). Também foi

demonstrado que ATAD2 é comumente encontrado em muitos tumores e seus níveis

de expressão se correlacionam com o resultado do sucesso do tratamento dos

pacientes de câncer de mama. Autores sugerem que ATAD2 liga as vias de

sinalização E2F e MYC e contribui para o desenvolvimento do câncer agressivo,

através do aumento da transcrição dependente de MYC (CIRÓ et al., 2009). Ainda na

área de câncer de mama ER+, outro grupo descobriu que a estimulação da

proliferação por estrógeno de células de câncer envolve a regulação de proteínas

chamadas kinesinas, superfamília de proteínas motoras (Kifs). ANCCA, tem um papel

crucial na regulação da expressão das kinesinas pelo estrógeno (E2). O knockdown

da ANCCA impediu a proliferação celular e induziu a apoptose tanto nas células

resistentes quanto nas sensíveis ao tamoxifeno, demonstrando a importância deste

gene para um possível tratamento desse tipo de câncer (ZOU et al., 2014).

89

Descrição de alguns alvos encontrados para o TR

Dentre os parceiros do TR, encontramos NPM1, KIF3A, ASCC2, TIMM10B

(ou FXC1) e TIMM8A. Estas são proteínas que merecem destaque devido as suas

importantes funções em processos biológicos, como ciclo celular e translocação para

mitocôndria, ou como correguladoras de outros RNs.

NPM1 é uma proteína que reside no núcleo (região granular do nucléolo) e

está envolvida em duplicação de centrossomo, manutenção da integridade do

genoma, biogênese de ribossomos, atividade chaperona regulada por fosforilação e

no aumento da transcrição dependente de acetilação na cromatina (FREHLICK;

EIRÍN-LÓPEZ; AUSIÓ, 2007; SWAMINATHAN et al., 2005). Foi demonstrado que

NPM1 interage com o complexo APE1 (Ref-1/APE1), uma enzima de reparo de DNA e

coativador transcricional, sendo uma proteína vital nos mamíferos. Essa interação

resulta em uma regulação direta do crescimento celular através do controle da

qualidade de RNA. Esse controle, por fim, afeta a expressão gênica através de

mecanismos pós-transcricionais (VASCOTTO et al., 2009). Outro trabalho mostra

NPM1 envolvida na tumorigênese de câncer de mama, através da interação com um

complexo formado por BRCA2 e ROCK2. Esse complexo é responsável para manter a

integridade numérica de centrossomos e uma divisão celular acurada (WANG et al.,

2011).

Mais ainda, a proteína KIF3A, membro da família de proteínas motoras, que

está envolvida no complexo de sinalização Hedgehog e regula o desenvolvimento

precoce, ciliogênese e tumorigênese (HUANGFU et al., 2003). Foi demonstrado que

KIF3a é capaz de promover a proliferação e invasão em células de câncer de próstata

avançado, através da via de sinalização Wnt (LIU et al., 2014). Além disso, KIF3a se

liga a KIF3b com a ajuda de KAP3, formando o complexo Quinesina-2, e a presença

deste complexo foi demonstrada no aparato mitótico, principalmente nos

microtúbulos do fuso e centrossomos (HARAGUCHI et al., 2006).

A proteína ASCC2, também chamada de Proteína Cointegradora de Ativação

de Sinal (hASC-1), foi originalmente isolada como um coativador de RNs. ASC-1 tem

um papel essencial na transativação de AP-1, SRF e NF-kB para mediar a

transrepressão entre RNs e e essas proteínas in vivo (JUNG et al., 2002).

90

Foram encontradas também duas proteínas que fazem parte da mesma

família de proteínas mitocondriais, as translocases de membrana interna a TIMM8A

e TIMM10B (também chamada de FXC1). TIMM8a se liga à TIMM13 no espaço

intermembranas mitocondriais para formar um complexo de 70 kDa, isso facilita a

importação do substrato TIMM23, para essa localização. Além disso, a TIMM8A é

uma proteína que parece ser necessária para o desenvolvimento neurológico

(ROESCH et al., 2004; ROTHBAUER et al., 2001). Já a TIMM10B, é um componente do

complexo TIM22 que media a importação e inserção de proteínas transmembranas

na membrana interna da mitocôndria. Esse complexo é uma translocase de poros

duplos que se utiliza da força do potencial de membrana para realizar suas funções.

Em adição a isso, o complexo também funciona como ancora para o complexo de 70

kDa (TIMM8a e TIMM13) (MÜHLENBEIN et al., 2004). Como mencionado

anteriormente, os TRs estão presentes e conseguem atuar dentro da mitocôndria de

células cardíacas, se ligando à sequencias HRE no DNA mitocondrial (ARDAIL et al.,

1993; MORRISH et al., 2006), apesar desta função e sublocalização celular serem

pouco estudadas.

Importante mencionar que estas interacões encontradas para TRα e TRβ

sinalizam para funções adicionais destes receptores, além de desvendar novas vias

que podem ser reguladas por estes receptores. Dessas 11 interações encontradas

para isoforma , 3 se apresentam interagindo também com a isoforma , L1TD1,

TIMM8a e COG2. Isso mostra que apesar de serem isoformas diferentes, conseguem

interagir com as mesmas proteínas em alguns casos. Esse mesmo padrão de

interação se repetiu no número de peptídeos encontrados na imunoprecipitação,

como será discutido adiante.

91

3.4 Imunoprecipitação de flag-TR seguida de LC-MS/MS

3.4.1 Transfecção de TRs (pLVIG) e monitoramento da expressão de GFP

Com o objetivo de certificar se haviam TRs superexpressos nas células 293T

após a transfecção, utilizamos o veto lentiviral (pLVIG), contendo a sequência de

flag-TR e GFP sob o controle do mesmo promotor (transcrição bicistrônica). Como

nossos resultados demonstram, foi observada a presença da proteína GFP em todas

as amostras transfectadas com pLVIG, indicando também a presença dos TRs

(FIGURA 19).

FIGURA 19. Células 293T transfectadas (ou sem transfectar) com flag-TRs ou GFP-flag. Imagens obtidas com microscópio de fluorescência (FITC). Em verde, GFP expresso nas células 293T indicando que o plasmídeo que contém o gene do TR foi transcrito juntamente com GFP.

O controle experimental utilizado foi a célula 293T sem transfecção, que foi

observada nos modos de contraste de fase e FITC (FIGURA 19), conforme o

esperado, não foi observada nenhuma fluorescência nesta condição.

92

3.4.2 Transfecção de TRs (pLVIG) e monitoramento da expressão por WB

Em seguida, testamos também a expressão de flag-TRs LVIG em 293T, na

ausência ou presença do hormônio T3, antes de iniciar os ensaios de IP e

confirmamos a expressão das proteínas através de WB (FIGURA 20). Conseguimos

detectar a expressão de ambas isoformas de flag-TR superexpressas com o anticorpo

anti-flag. Curiosamente, em ambas isoformas (FIGURA 20), a adicao de 1 μM de T3

no meio de cultura por 36 horas parece diminuir a quantidade de TR presente nas

células.

FIGURA 20. Transfecção de flag-TR em 293T, com e sem T3. A presença de T3, após 36h de tratamento, diminui a expressão de TRs. A. Western Blot mostrando os TRs fusionados a flag (WB anti-flag) e a proteína controle de ‘loading’ (WB anti-beta actina). B. Quantificação da intensidade das bandas (ImageStudio, LI-COR) em relação ao controle ( -actina).

Esse mecanismo já foi reportado anteriormente (LIN et al., 2013) para o TR e

outros RNs. Nesse caso, essa degradação ocorre em função da via dependente de

ubiquitina que é ativada na presença de uma certa quantidade de receptores

nucleares na forma holo (complexados a seus ligantes) dentro da célula (LONARD;

O’MALLEY, 2009). Outro exemplo desse mecanismo foi descrito para o receptor de

glicocorticóides (GR) (DONG et al., 1988). A dexametasona (agonista de GR) causa

uma diminuição da produção de mRNA e proteína GR, tanto em cultura de tecido de

hepatoma, quanto em fígado de ratos. Essa diminuição nos níveis de mRNA de GR

ocorre porque também existe uma diminuição na taxa de transcrição do gene GR.

Além disso, a presença de dexametasona é capaz de modificar de forma pós-

traducional o receptor, ativando o ‘turnover’. Ou seja, na presença do ligante a

proteína tem sua meia-vida diminuída. Mais importante, a regulação de GR ocorre

tanto em nível transcricional, quanto pós-traducional (DONG et al., 1988) e

93

sugerimos que esse mesmo efeito pode acontecer para a condição TR+T3 em nossos

experimentos.

3.4.3 Ensaios de Transativacao para confirmar a funcionalidade da construção LVIG

Realizamos um ensaio de ativação para cada construção, flag-TR e flag-TR

em pLVIG, em dois elementos responsivos ao T3 (TREs), DR-4 e F2 (FIGURA 21). O

primeiro HRE (DR-4) consiste na repetição direta da sequência consenso, espaçada

por quatro nucleotídeos, e que favorece a ligação de TRs em heterodímeros com

RXR. O segundo TRE (F2), também chamado de IP6, possui o palíndromo da

sequência consenso, espaçada por 6 nucleotídeos, e que favorece a ligação de TRs

como homodímeros (IKEDA; RHEE; CHIN, 1994; RIBEIRO et al., 1998; VELASCO et al.,

2007; YEN, 2001; YEN et al., 1992).

No elemento responsivo F2 obtivemos 5x de ativação para o flag-TR e 8x

de ativação para o flag-TR, quando o hormônio T3 está presente (FIGURA 21). Já

em DR-4, na presença de T3, obtivemos quase 2x de ativação para o TR e 4x de

ativação para o TR (FIGURA 21). Em ambos os casos, a isoforma TR se mostra

mais ativa e responsiva ao hormônio do que a isoforma TR.

94

FIGURA 21. Ensaios de Gene Repórter em células 293T – Transativação de TRα (acima) e TRβ (abaixo). Os gráficos mostram a ativação de cada receptor após a adição do hormônio T3 (1 μM). Em todas as condições houve uma ativação significativa após a adição do hormônio, se comparada com a ativação basal (TR sem T3 = 1). A quantidade de luminescência se apresenta normalizada e representa apenas o sinal proveniente de flag-TRs transfectados (TRs endógenos foram subtraídos). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni (p ≤0.05; n=3).

Concluímos, então, que ambas isoformas clonadas no plasmídeo Lentiviral

pLVIG apresentam ativações satisfatórias quando o hormônio T3 é adicionado ao

meio de cultivo celular (FIGURA 21)(VELASCO et al., 2007). Esses resultados nos

mostram que ambas isoformas de TR estão expressas e funcionais em 293T.

3.4.4 Imunoprecipitação

Após confirmar a presença de TR via GFP por microscopia de fluorescência,

observar a resposta a T3 via gene repórter e confirmar por WB a superexpressão de

flag-TRs, realizamos a imunoprecipitação desses RNs, e de GFP como controle

experimental, na presença e e ausência de T3 (FIGURA 22).

95

FIGURA 22. Imunoprecipitação (IP) de flag-TRs e GFP-flag usando a resina anti-flag. A. Transfecção transiente de flag-TRs em 293T. O input mostra flag-TRs presentes antes da IP. As IPs são alíquotas da eluição onde também verificamos a presença de flag-TRs. O TR aparece com um tamanho menor que o TR, como esperado. B. Transfecção transiente de flag-GFP em 293T. O input mostra flag-GFP presente antes da IP. As IPs são alíquotas da eluição onde também verificamos a presença de flag-GFP.

O TR possui um tamanho de 49 kDa e o TR é um pouco maior, com 55kDa,

como mostrado no WB (FIGURA 22-A). O WB mostra um input de TR sem T3 e um

input de TR sem T3, que foram utilizados como controle da presença de flag-TRs

endógenos antes da IP. Observamos então, o sucesso da IP nas bandas presentes nas

canaletas seguintes, com os respectivos tamanhos corretos. O mesmo foi observado

para o GFP-flag, de 35 kDa, com e sem T3, na FIGURA 22-B. Após confirmar a

presença de TRs e GFP, as amostras seguiram para análise em espectrometria de

massas (LC-MS/MS).

A IP-LC-MS/MS, assim como o y2h, também apresentou números de

parceiros de interação muito interessantes (Tabela 9).

Tabela 9. Número de proteínas encontradas na IP-LC-MS/MS dos TRs.

TR TR

T3 - + T3 - + Número de proteínas encontradas

510 356 Número de

proteínas encontradas

231 33

Interações inéditas

459 311 Interações

inéditas 215 20

Observamos um número maior de peptídeos imunoprecipitados com TR se

comparado a isoforma (Tabela 9). Esse mesmo padrão que mostra TR

interagindo com mais proteínas que TR já foi descrito anteriormente (HAHM;

96

SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014). Uma comparação mais detalhada entre nossos

dados e dados obtidos por HAHM, SCHROEDER e PRIVALSKY (2014) será feita mais

adiante.

Curiosamente, o número de interações decresce em ambas isoformas

quando T3 está presente. Parte dessa diferença se deve ao fato que o T3 diminui a

expressão de TR, aumentando também sua degradação ao longo do tempo como

discutido anteriormente (FIGURA 20).

3.4.5 Interactoma e análise de IP+y2h

A lista de peptídeos obtida por LC-MS/MS foi carregada juntamente com a

lista do duplo-hibrido para a plataforma IIS, onde seguimos com as análises dos

interactomas através de diversos softwares e plataformas (IIS, Cytoscape, MetaCore

e GeneCodis). Os interactomas foram visualizados no Cytoscape, onde cada proteína

(identificada por um código swissprot) é classificada com um Top Enriched Biological

Process (TEBP), segundo o banco de dados do Gene Ontology (ASHBURNER et al.,

2000; CONSORTIUM, 2015), sendo o enriquecimento feito de acordo com o melhor

p-value dentre os processos biológicos que aquela proteína participa.

Em seguida, a árvore inferida para cada TEBP foi analisada e aqueles

processos que se juntavam em um ramo superior foram agrupados e renomeados

como mostrado nos interactomas a seguir (FIGURAS 23-26). .

97

FIGURA 23. Rede de interações (y2h+IP) de TR sem T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em roxo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR.

98

FIGURA 24. Rede de interações (y2h+IP) de TR com T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em roxo, nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR.

99

FIGURA 25. Rede de interações (y2h+IP) de TR sem T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em amarelo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR.

100

FIGURA 26. Rede de interações (y2h+IP) de TR com T3, gerada pelo IIS, visualizada no Cytoscape. Os peptídeos e presas foram agrupados pelos TEBP (Top Enriched Biological Processes – Gene Ontology). Em amarelo nossa isca, TR. Em verde, os parceiros já descritos pela literatura, juntamente com interações retiradas do banco de dados. Em azul, os parceiros inéditos encontrados pela IP. Em vermelho, todos os parceiros do y2h de TR.

101

A grosso modo, verificamos que TR sem ligante (TR-T3, FIGURA 23)

participa de 27 processos biológicos, além de interagir com outros 125 alvos não

agrupados em processos específicos. A presença do ligante (TR+T3, FIGURA 24)

parece direcionar o TR para os eventos relacionados à transcrição e metabolismo,

embora esta isoforma ainda continue participando de 22 processos celulares e

interaja com 78 proteinas não agrupadas em processos específicos (pontos

agrupados formando um quadrado ao centro da parte inferior das FIGURAS 23 e 24).

A ausência do ligante envolve o TR em um leque mais amplo de processos como:

apoptose, divisão celular, processos metabólicos de compostos nitrogenados,

biossíntese de acetil-CoA, tradução na mitocôndria, regulação positiva da atividade

de quinases e biossíntese de ATP (FIGURA 23), além dos encontrados independente

da presença do T3. Entretanto, a presença do ligante, parece direcionar o TR para

vias mais enriquecidas em número de parceiros, como: transcrição, tradução,

metabolismo de RNA, ciclo celular, processos virais, metabolismo de pequenas

moléculas, apoptose e direcionamento de axônio (FIGURA 24).

Por outro lado, a análise do interactoma de TR evidencia claramente que

esta isoforma do receptor é mais restrita quanto às interações celulares. O TR, na

ausência do ligante (TR-T3, FIGURA 25), participa de 22 processos celulares, sendo

que 15 deles são os mesmos encontrados em TR, e 7 são exclusivos. A presença do

ligante (TR+T3, FIGURA 26) parece direcionar o TR para interações que favoreçam

transcrição, tradução, metabolismo e reparo de DNA, além de metabolismo de

lipídeos. O número de processos celulares que o TR participa na ausência de

ligantes foi reduzido para 9 após a adição do T3, e o número de interações com

proteínas não listadas em processos também foi reduzido de 56 para 20 parceiros

(pontos agrupados formando um quadrado ao centro da parte inferior das FIGURAS

25 e 26). Os processos exclusivos da rede para este receptor na ausência de seu

ligante foram: tradução, processos metabólicos de RNA, apoptose, enovelamento de

proteínas, direcionamento proteico, organização de citoesqueleto, transporte

celular, proliferação celular, resposta a vírus, regeneração de órgãos e metabolismo

de compostos nitrogenados. Outros processos em que TR está envolvido e que

102

merecem destaque são aqueles que aparecem independente da presença do ligante:

desenvolvimento, metabolismo de lipídios, reparo de DNA, metabolismo de DNA,

metabolismo de pequenas moléculas, processos virais, ciclo celular e transcrição.

Se compararmos de maneira geral ambas as isoformas, independente da

presença de T3, observamos nas redes da isoforma TR (FIGURAS 23 e 24), esta

proteína interagindo com proteínas que regulam a divisão celular, expressão gênica,

via da ubiquitina, tradução na mitocôndria, biossíntese de acetil-CoA, regulação

positiva da atividade de quinases, biossíntese de ATP, resposta imune e

desenvolvimento de sistema nervoso. Enquanto que TR (FIGURAS 25 e 26) regula

vias diferentes daquelas observadas para TR, como metabolismo de DNA, reparo

de DNA, e regeneração de órgãos. Existem ainda outras vias que são reguladas por

ambas isoformas (ex. transcrição, tradução, metabolismo de RNA, processos virais,

ciclo celular, transducao de sinais, etc). Além disso, TRα interage com maior número

de proteinas, além de participar de mais processos celulares que TRβ, demonstrando

que o TRα deva ser menos especifico e mais promiscuo em relacao aos processos e

interacões que participa, enquanto TRβ parece ser mais direcionado para eventos

relacionados à regulação da transcrição. Entretanto, foram observados muitos

processos biológicos similares entre as duas isoformas, como regulação da

transcrição e metabolismo, principalmente na ausência de ligante. Comparando

todos os processos que TRβ e TRα participam, 15 sao comuns.

Nossos dados corroboram com os resultados observados em um artigo

publicado (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014), no qual TR interage com uma

variedade mais ampla de parceiros, sendo alguns deles co-expressos em tecidos nos

quais observamos alta expressão de TR. De fato, neste trabalho os autores

encontram uma gama variada de possíveis parceiros de TR, e os parceiros de TR

estão em menor número e incluídos na lista de parceiros da isoforma . Ou seja,

podemos dizer que a função de TR, nesse caso, é suprida pela isoforma , mas o

contrário não é verdadeiro.

103

3.5 MetaCore (Thomson Reuters®)

3.5.1 Análise de ‘Pathway Maps’ (junho de 2016)

Analisamos via Software MetaCore (Módulo Pathway Maps, junho de 2016)

os peptídeos e presas encontrados em relação as vias em que estão envolvidos, e os

agrupamos de acordo com as vias mais enriquecidas (visualização das 10 vias mais

enriquecidas - FIGURA 27).

Nas diferentes amostras analisadas, observamos a presença das presas

encontradas em vias relacionadas à transcrição de genes, o que confirma a função já

bem estudada de TR como regulador da transcrição. Outras vias como regulação

metabolismo de hormônios T3 e T4, também já são bem conhecidas (FIGURA 27).

Observamos também outros processos interessantes e menos estudados

como: quebra/reparo de DNA e apoptose (em destaque na FIGURA 27). Segundo

revisão recente, esses processos, quando desregulados, são considerados como

capacidades adquiridas pelas células (chamadas também de ‘hallmarks of cancer’)

que resultam no desenvolvimento de tumores (HANAHAN; WEINBERG, 2011). A

seguir evidenciaremos algumas dessas vias.

104

FIGURA 27. METACORE – ‘Pathway Maps’ – Análise das 10 vias mais enriquecidas (junho de 2016). As setas evidenciam tanto vias já bem estudadas como “transcrição”, como vias inéditas (ex. Dano ao DNA e apoptose).

Observando as vias em comum a todas as quatro amostras, encontramos a

via da transcrição e silenciamento de genes pelos correguladores NCor e SMRT. É

sabido que as proteínas TR, RXR, N-CoR e SMRT atuam na regulação da transcrição

dentro do núcleo da célula. Essa via contém a repressão e silenciamento de genes

feita pelo complexo correpressor, no qual existe a atuação de N-CoR ou SMRT, e

105

algumas deacetilases de histonas (HDACs). Sendo TR um RN regulado por proteínas

correguladoras (ex. NCor), essa via aparece como uma forma de confirmação da

confiabilidade dos métodos utilizados. Outra via enriquecida, a via de Regulação do

Metabolismo dos Hormônios T3 e T4, também traz confiabilidade aos nossos dados.

Nesta via está presente o TR com seus parceiros bem caracterizados: RXR, que forma

o heterodímero; NCor/SMRT, correpressores de TR; NCoA, coativador da transcrição

e TRIP, uma proteína caracterizada por interagir com TR na via de transcrição. Além

dessas, outra via bem estudada com a ação de TRs, é a via de transcrição de genes

regulados por retinóides. Nessa via observamos as mesmas proteínas encontradas

nas vias anteriores, exceto por FASN, que tem um papel importante na rota de

lipogênese e o biossíntese de ácidos graxos saturados.

A via de apoptose relacionada à fosforilação BAD (FIGURA 28) foi outra via

muito importante encontrada em nossos dados. BAD é um membro da família BCL-2,

que são reguladores das vias de morte celular programada, induzindo a apoptose.

Quando fosforilada, BAD é retida no citosol ligada à proteína 14-3-3 (encontrada na

amostra-1, interagindo com TR +T3). E em situações de estresse BAD é ativada por

defosforilação, executada principalmente pelas proteínas PP2A e PP2C (BERGMANN,

2002). Estudos demonstram que a expressão estável de TR em células de câncer de

mama (MCF-7) resulta em inibição do crescimento de tumor, através da ativação de

vias de apoptose (PARK; ZHAO; CHENG, 2013) e, talvez esta proteína seja um

importante elo de interação com o TR, que poderia explicar a diminuição da

proliferação deste tipo celular.

106

FIGURA 28. METACORE – Pathway Maps. Via da apoptose relacionada à fosforilação BAD. Encontrada em TR+T3. Apoptosis/Survival_BAD phosphorylation.. LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs.

Mais ainda, nossa análise destaca uma via que aparece em 3 das 4 amostras:

a via de dano ao DNA com DSBs (ou Double-strand breaks - DSBs) ligada à reparo

por NHEJ (junção de extremidades não-homólogas) (FIGURA 29). Quebra de dupla-

fita (DSBs) resultam da ruptura da estrutura dupla-hélice do DNA e a NHEJ parece ser

o mecanismo primário utilizado pelos mamíferos para reparar os DBSs (FIGURA 29).

No primeiro passo da via, o heterodímero Ku70/80 (encontrado nas amostra-1 e

amostra-3, interagindo com TR sem e com T3, respectivamente), que são

subunidades 70 e 80 kDa de DNA helicases dependentes de ATP, reconhecem as

extremidades do DNA, recrutam e ativam quinases, que vão ligar as fitas e

reconstituir o DNA (PASTWA; BLASIAK, 2003). Nessa via é importante mencionar a

ação pouco estudada de TR na quebra e reparo de DNA. De fato, existem muitas

evidências que mostram TR e THs (Hormônios Tireoidianos) envolvidos em

envelhecimento, câncer e doenças degenerativas. Em um trabalho publicado

recentemente (ZAMBRANO et al., 2014) foi demonstrado que a ligação do T3 ao TR

induz senescência e danos ao DNA em cultura de células e tecidos de camundongos

107

com hipertireoidismo. Isso ocorre através da ativação de proteínas de uma cascata

que resulta em aumento da respiração na mitocôndria, que por sua vez produz mais

espécies reativas de oxigênio causando DSBs.

FIGURA 29. METACORE – Pathway Maps. Via de dano ao DNA com DSBs ligada à reparo por NHEJ. Encontrada em TR+T3, TR+T3, TR-T3. DNA damage_NHEJ/DSB; LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs.

Por fim, também observamos a via de reparo de DNA ligada à proteínas

BRCA1/BRCA2 (FIGURA 30), que é uma via ativada na presença de quebra de DNA e

posterior fosforilação das proteínas BRCA1/BRCA2. A presença destas proteínas

indicam a susceptibilidade ao câncer de ovário e de mama. Existem proteínas dessa

via envolvidas em reparo do DNA, como a Rad50, que foi encontrada nas 4 amostras

analisadas em nossos experimentos, além da p53 (encontrada interagindo com TR

com e sem T3), tão importante nessa via e já descrita como parceira de interação de

TR (YAP; YU; CHENG, 1996).

108

FIGURA 30. METACORE – Pathway Maps. Via de reparo de DNA ligada à proteínas BRCA1/BRCA2. Encontrada nas 4 amostras analisadas. Brca1/Brca2 DNA Repair. LEGENDA das Amostras analisadas [IP+y2h]: 1.TR+T3; 2. TR+T3; 3. TR; 4. TR. Proteínas destacadas em colorido são as proteínas encontradas em nossos experimentos, interagindo com TRs.

3.5.2 Análise de ‘Disease Biomarkers Network’ – MetaCore (junho de 2016)

Em seguida, decidimos investigar se as proteínas encontradas como parceiras

de interação dos TRs estavam envolvidas no desenvolvimento e progressão de

doenças. Essa análise nos permite discutir se existe e qual seria a importância da

função dos TRs nesses processos. De acordo com análise do MetaCore, no módulo

de biomarcadores de doenças, encontramos as vias nas quais as proteínas parceiras

de TRs participam (FIGURA 31).

109

FIGURA 31. METACORE – ‘Disease Biomarker Networks’ – Análise das 10 vias mais enriquecidas (junho de 2016). Sem T3 – Laranja, Com T3 – Azul.

Em menor proporção observamos os parceiros de TR participando de

doenças como Esclerose Lateral Amiotrófica, Parkinson, Hepatite. Mas, de um modo

geral, entre as vias encontradas (FIGURA 31), observamos diversas vias de câncer,

muito enriquecidas em ambas amostras (TR e TR), como: neoplasmas de mama,

de tireoide, colorretal e de próstata.

De fato, a relação entre TRs e câncer não é nova, porém os mecanismos pelos

quais TRs podem suprimir ou ajudar na proliferação de tumores são pouco

estudados. Evidências dessa relação surgiram a partir do descobrimento de uma

forma mutante de TR1, v-erbA, que poderia estar envolvida em leucemia eritróide

aguda (THORMEYER; BANIAHMAD, 1999; WEINBERGER et al., 1986). A oncoproteína

v-erbA não liga T3 e perdeu sua habilidade de ativar a transcrição de genes, atua

aumentando a atividade oncogênica de outras proteínas. Além disso, v-erbA

compete com TR pelos TREs, interferindo na transcrição de genes (CHEN; PRIVALSKY,

1993; CHENG, 2003). Outras evidências vem de estudos com camundongos

transgênicos superexpressando v-erbA, que como resultado, desenvolvem

carcinoma hepatocelular (BARLOW et al., 1994).

Outra relação encontrada entre TR e câncer vem de estudos que

demonstram TR1 interagindo com ciclina D1, um produto oncogênico conhecido, e

110

p53, um supressor de tumor bem descrito na literatura. Nesses casos, os resultados

sugerem que TR1 estaria atuando como repressor da atividade transcricional

dessas nucleoproteínas (CHENG, 2003). De fato, a proteína p53 foi encontrada em

nossas amostras de imunoprecipitação de TR, com e sem T3. CHENG (2003)

também comenta o envolvimento de TRs em câncer de fígado, através da

confirmação da presença de formas truncadas de TR1 e TR1. (CHENG, 2003;

GONZÁLEZ-SANCHO et al., 2003).

3.6 Comparação com dados da Literatura

Em paralelo com as análises dos nossos dados de IP+y2h, também analisamos

os dados de outros dois estudos sobre TR e interações com outras proteínas

publicados anteriormente (GOVINDAN et al., 2009; HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY,

2014).

O primeiro trabalho de WALFISH (GOVINDAN et al., 2009), baseado em

identificar novos correguladores de TR que ajudem a entender melhor a ação dos

THs, realizou uma análise de arranjo genético sintético, cruzando uma colônia de

levedura que expressa TRβ1 e o coativador Grip1/SRC2 com 384 outras colônias de

levedura, com deleção de genes conhecidos. (GOVINDAN et al., 2009). O cruzamento

entre nossos dados e os encontrados pelo autor demonstraram nenhuma relação

entre os alvos encontrados. Esse resultado discrepante pode ser explicado porque

usamos diferentes métodos para a busca de parceiros. Ou seja, é evidente que os

TRs interagem com diversas proteínas, porém, cada método consegue abranger

apenas uma pequena amostra de toda a gama de parceiros de cada proteína.

111

Em outro cenário, porém mais próximo de nosso trabalho, está o trabalho de

PRIVALSKY (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014). Os autores buscaram responder

questões relacionadas à gama de correguladores recrutados por cada isoforma de

TR, que poderiam resultar em transcrição, propriedades e funções biológicas

diferenciadas. Após análise detalhada de cada candidato encontrado no trabalho de

PRIVALSKY (planilha de dados gentilmente enviada para nós pelo Dr. Martin

Privalsky), e comparação com nossos dados, construímos um diagrama Venn

(FIGURA 32), no qual foram analisados todos os peptídeos encontrados nas

condições com e sem T3.

FIGURA 32. Diagrama de Venn comparando peptídeos/presas encontrados en nossos screenings versus peptídeos encontrados em screening feito por PRIVALSKY (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014).

No trabalho de PRIVALSKY, todos dos parceiros encontrados para a isoforma

TRβ estao contidos na lista de interacões da isoforma α, o que difere do nosso

trabalho. Nossos dados mostram que temos 155 parceiros em comum entre as

isoformas (soma das intersecções: 122+11+22), sendo que encontramos 94

candidatos exclusivos para a isoforma (73+2+9). Além disso, como nossos dados

demonstram, o TRα possui uma lista de candidatos mais variada que o TRβ,

conforme também observado por PRIVALSKY (FIGURA 32). Em nossos dados de

112

IP+y2h de TR obtivemos 649 parceiros (elipse verde), enquanto que PRIVALSKY, na

IP de TR, obteve 723 parceiros (elipse azul); em comparação, nossos dados da

IP+y2h de TR, obtivemos 239 parceiros (elipse vermelha) e PRIVALSKY, que na IP de

TR, obteve 116 parceiros (elipse amarela) (FIGURA 32).

3.7 Genecodis

Além da análise dos interactomas através do software MetaCore, analisamos

também nossos dados na plataforma GeneCodis (CARMONA-SAEZ et al., 2007;

NOGALES-CADENAS et al., 2009; TABAS-MADRID; NOGALES-CADENAS; PASCUAL-

MONTANO, 2012), buscando os principais Processos Biológicos (BP) nos quais os

parceiros de interação estão envolvidos (módulo “GoSlim”- FIGURA 33).

Decidimos usar esse método de análise, juntamente com o MetaCore para

obter um maior número de evidências que suportem a hipótese que indica que TR

está envolvido intimamente com proteínas do ciclo celular. A importância disso,

como dito anteriormente, está no fato que a desregulação dessa via em células

normais é um dos “hallmarks” que podem levar à origem de diferentes tipos de

câncer (HANAHAN; WEINBERG, 2011).

113

FIGURA 33. GENECODIS – ‘GoSlim’ Processes – Dados de IP+y2h. Os números representam a quantidade de presas/peptídeos por anotação.

Nossos resultados mostram que uma grande porção de cada gráfico (FIGURA

33) é dedicada a parceiros de interação envolvidos em BP como processos

metabólicos e biossintéticos, resposta a estresse, desenvolvimento, enovelamento e

modificações pós-traducionais de proteínas. Esses processos biológicos menos

abundantes também foram encontrados nas análises feitas pelo Cytoscape e

MetaCore. Entretanto, em uma análise mais detalhada, vemos que ciclo celular,

mitose, divisão celular e proliferação celular são BPs evidenciados em todos os 4

114

gráficos (FIGURA 33: TRα+T3, TRα-T3, TRβ+T3, TRβ-T3), o que suporta nossa

hipótese de que TR pode estar envolvido na regulação do ciclo celular.

Mais ainda, quando analisamos os dados de PRIVALSKY (FIGURA 34) na

mesma plataforma, os BP ciclo celular, divisão celular e mitose também estavam

presentes. Com isso, obtivemos mais um dado que corrobora a importância de TR

nessas vias.

FIGURA 34. GENECODIS – ‘GoSlim’ Processes – Dados de Privalsky (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014). As proteínas encontradas em TR estão incluídas na lista do TR por isso realizamos apenas uma análise. Os números representam a quantidade de presas/peptídeos por anotação.

Em nossos experimentos de IP e y2h foram encontradas mais de 500

proteínas interagindo com TR, e para seguir para experimentos de confirmação

como Co-IP, foi necessário filtrar e escolher proteínas para serem usadas no Western

Blot.

Com esse objetivo, resolvemos iniciar a escolha pelos processos biológicos

em que estas proteínas estavam envolvidas. Juntamente com os dados gerados pelo

GeneCodis e MetaCore-‘Biomarkers’, buscamos na literatura diversos artigos

demonstrando que os TRs estão envolvidos com vias relacionadas ao

desenvolvimento e progressão do câncer (ARANDA et al., 2009; BRENT, 2012;

CHENG, 2003; GUIGON et al., 2011; PARK; ZHAO; CHENG, 2013). Entretanto, o

mecanismo detalhado pelo qual esses receptores agem continua incompleto, e por

isso selecionamos as proteínas mais importantes envolvidas em BP relacionados à

ciclo celular, para seguirem para a etapa de Co-imunoprecipitação.

115

3.7 Co-imunoprecipitação (Co-IP) de TR com proteínas de Ciclo Celular

Nesse item serão mostrados e discutidos os resultados de confirmações por

Co-imunoprecipitação entre ambas isoformas de TR e proteínas envolvidas em ciclo

celular. Estas proteínas foram selecionadas a partir do filtro aplicado à lista de

proteínas encontradas por IP e y2h. O filtro se deu da seguinte forma: (1) De todas as

proteínas encontradas, selecionamos àquelas enquadradas em processos biológicos

como: ciclo celular, mitose e proliferação celular; (2) Em seguida, filtramos as

proteínas de acordo com o peso molecular escolhendo àquelas que possuíam

tamanhos diferentes de 25 e 55 kDa, pesos das imunoglobulinas de cadeia leve e

pesada, respectivamente, para evitar possíveis problemas experimentais; (3) Por

último, escolhemos àquelas que apresentavam publicações que demonstravam ter

anticorpos específicos capazes de reconhecê-las por WB. Com isso chegamos aos

seguintes candidatos: EBP1; SRPK1; CKII; ERK3; PRMT5; e RXR, que foi utilizado

como controle positivo de interação.

3.7.1 RXR – controle positivo

Em experimentos iniciais de confirmação por Co-IP, escolhemos o RXRα, um

parceiro conhecido de TR, responsável pela formação de heterodímero TR-RXR,

como já publicado (FATTORI et al., 2015; IKEDA; RHEE; CHIN, 1994). RXR foi

encontrado nos experimentos de y2h, interagindo com as duas isoformas de TR, e

também nos experimentos de IP-LC-MS/MS de TRα sem T3.

Através da Co-IP do RXRα (FIGURA 35), confirmamos a eficiência do método

de IP-LC-MS/MS. Parte da membrana foi incubada com anti-RXR e nessa parte

observamos a presença de RXR no input (extrato proteico de 293T) nas 4 condições

de IP. Ou seja, concluímos que a interação entre TR e RXR, encontrada na

espectrometria de massas, ocorre de fato com as 2 isoformas de TR na presença e

ausência de T3.

116

FIGURA 35. Co-Imunoprecipitação flag-TR e RXR. O input é uma alíquota do extrato proteico (lisado) da célula 293T, e indica a presença de RXR. O controle negativo (-ctrl) é o extrato proteico de 293T sem superexpressão de flag-TRs, imunoprecipitado em resina anti-flag. Parte da membrana foi incubada com anti-RXR e parte com anti-flag. Na primeira parte vemos bandas de RXR nas 4 amostras, e não observamos quantidades significativas de RXR no controle negativo, mostrando que existe RXR interagindo com ambos TRs na presença ou ausência de T3. Na segunda parte da membrana observamos alíquotas das amostras de IP anti-flag. Escolhemos apenas 2 das 4 amostras pra análise em WB. A IP das 4 amostras juntas já foi apresentada na FIGURA 22.

Como mencionado anteriormente, a expressão de TR decai após 36h da

adição T3 no meio de cultura e suas bandas ficam menos intensas (condições com

ligante) (FIGURA 20). Além disso, TRα teve uma expressao relativamente maior

nesse experimento em particular, resultando em uma Co-IP de bandas mais intensas

para o RXR nas amostras de TRα-IP que a amostra TRβ-IP. A amostra do controle

negativo da IP (-ctrl, FIGURA 35), extrato proteico de 293T sem transfecção e

incubado com a resina anti-flag, apresentou nenhum sinal de quimiluminescência,

mostrando que o RXR imunoprecipitado nas outras canaletas, corresponde a

interação com TR, sem interações inespecíficas com a resina anti-flag.

A segunda parte da membrana foi incubada com anti-flag, e apresentamos

alíquotas da IP anti-flag sem T3, nas quais observamos a presença de TR e TR

imunoprecipitados (FIGURA 35, à direita). Com isso, concluímos que TR e RXR foram

co-imunoprecipitados na mesma amostra.

117

3.7.2 Proteinas do ‘Ciclo Celular’

EBP1 (ou PA2G4) – Proteína de ligação de ErbB3

Encontrado na IP de TRα com T3

Inicialmente identificado como proteína ligante de ErbB-3 através de um

duplo-hibrido, EBP1 é um membro da família PA2G4. Após o tratamento com o

ligante de ErbB-3, heregulina, EBP1 sai do citoplasma para o núcleo de células de

câncer de mama. A inibição da fosforilação de Ebp1 pelo inibidor da PKC, impede a

associação com ErbB-3. A expressão ectópica de Ebp1 em células de câncer de mama

ErbB-3 resulta em inibição da formação de colônia, diminuição da taxa de

proliferação, e supressão do crescimento em ágar. Ainda, a superexpressão de Ebp1

leva a um fenótipo diferenciado em células de câncer de mama AU565. Ebp1 tem

uma homologia significante a uma proteína murina p38-G4 que tem uma expressão

dependente de ciclo celular e liga ao DNA (LIU et al., 2006; YOO et al., 2000; ZHANG

et al., 2005).

Na Co-IP identificamos a proteína EBP1 co-imunoprecipitada com ambas

isoformas de TR e parece ser independente da presença de T3 (FIGURA 36). Durante

o WB observamos que anti-PA2G4 marcava uma banda de tamanho diferente da

apresentada no datasheet do anticorpo. Porém, dados da literatura demonstram

que o tamanho da banda encontrada pode ser modificado de acordo com a

linhagem celular utilizada no experimento (~48 kDa), conforme já demonstrado (LIU

et al., 2006).

FIGURA 36. Co-IP de EBP1. Extratos proteicos de células 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui EBP1 (ou PA2G4, Abcam #33613) interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, não houve imunoprecipitação inespecífica visto que não existem bandas no controle negativo.

118

SRPK1 – SR (Serina/arginine) quinase

Encontrado na IP de TRα sem T3

Membro das proteínas SR e participa primariamente no splicing de RNA,

regulando o desenvolvimento celular e crescimento. As proteínas SR são

reconhecidas pois fazem parte da família de fatores de splicing essenciais que tem

um papel importante no desenvolvimento do spliceossomo e outros eventos pos-

splicing. As SRPKs possuem uma fosforilação basal que permite a interação com

proteínas SR transportinas e localização nuclear das proteínas SR (PLOCINIK et al.,

2011). Estudos recentemente mostraram uma ligação entre sinalização Akt e

processamento de RNA. Uma ligação similar também foi estabelecida entre a ligação

de Akt e modulação da atividade de quinases específicas de proteínas SR (SRPK)

(TOKER; CHIN, 2014). Outro estudo mostra alta expressão de SRPK1 correlacionada

com tratamento pouco eficiente de câncer de mama, além de metástase

preferencial para o pulmão e cérebro. Em dois modelos murinos independentes de

metástase de câncer de mama, quando foi feito o knockdown estável de SRPK1

suprimiu a metástase para diversos órgãos, além de inibir a reorganização da adesão

focal das células. Assim, SRPK1 é sugerido como um potencial alvo de fármacos que

limitem a metástase de câncer de mama (VAN ROOSMALEN et al., 2015).

Na Co-IP da SRPK1 com TRs podemos observar a ausência de background do

controle negativo, mostrando que a interação acontece somente entre TR e SRPK1

(FIGURA 37). E ainda, essa interação acontece independentemente de T3 com

ambas as isoformas de TR.

FIGURA 37. Co-IP de SRPK1. Extratos proteicos de células 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui SRPK1 (BD #611072), interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, não houve imunoprecipitação inespecífica visto que não existem bandas no controle negativo.

119

CKII - Caseina Quinase II Subunidade

Encontrado na IP de TRα sem e com T3

Caseina quinase II alfa (CKIIα) é uma serino-treonina quinase que forma

complexos heterotetraméricos compostos de duas subunidades cataliticas (α e/ou

α’) e duas subunidades β nao-cataliticas. CKIIα é um fator vital para a sobrevivência e

estabilidade de células eucarióticas, sendo sua atividade catalítica aumentada em

muitos tumores, enquanto que sua regulação negativa leva à apoptose. É altamente

expressa em células de câncer colorretal (CRC) e sua inibição suprime a proliferação,

invasão e motilidade dessas células CRC. Além disso, a inibicao de CKIIα diminui a

população de células embrionárias de câncer em câncer de pulmão (WU et al.,

2014).

O primeiro teste de Co-IP para a CKIIα (FIGURA 38) foi feito usando de

controle negativo a proteína A/G agarose conjugada a IgG normal. O tamanho

esperado para a proteina CKIIα é de aproximadamente 42kDa, como mostrado na

fração de input. A interação de CKII acontece em maior intensidade nas condições

sem T3 para ambas isoformas de TR.

FIGURA 38. Co-IP de CKII. Extratos proteicos de células 293T com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. As bandas de CKII alpha (Cell signaling, #2656) observadas sugerem que esta proteína interage com as diferentes isoformas de TR, na ausência de T3. Observamos também que para essas proteínas, houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso, testamos um controle negativo diferente: Extrato de 293T superexpressando TRs, imuprecipitado por resina de proteína A/G agarose conjugadas a normal IgG.

Embora o controle negativo tenha falhado, os resultados indicam uma

interação fraca nas condições sem T3 para ambas isoformas de TR (FIGURA 38). Essa

interação é pouco visível nas condições com T3, sugerimos que isso ocorra devido ao

fato de TR diminuir sua expressão proteica quando as células foram tratadas com o

hormônio, como discutido anteriormente.

120

ERK3 (ou MAPK6) - Quinase 3 Regulada por sinais Extracelulares

Encontrado na IP de TRα sem T3

ERK3 (105 kDa), também conhecida como MAPK6, é um membro atípico da

família MAPK. Ao contrário de ERK1 e ERK2, que têm sido estudadas extensamente,

pouco se sabe sobre a ERK3 ou seus alvos a downstream. Muitas evidências sugerem

que ERK3 está envolvida na diferenciação celular e regulação do ciclo celular (LONG

et al., 2012). Altos níveis de ERK3 resultam em parada do ciclo celular na fase G1 e

inibição da proliferação (KOSTENKO; DUMITRIU; MOENS, 2012). Em pacientes com

leucemia mielóide crônica (CML) os níveis de PAK2 e ERK3 estão elevados,

juntamente com a alta expressão de PCNA. PCNA, assim como ERK3, é um regulador

chave no controle do ciclo celular, replicação do DNA e reparo. Estudos mostraram

que é a perturbação dos níveis dessas proteínas, PCNA e ERK3, que pode implicar no

desenvolvimento da CML (KOSTENKO; DUMITRIU; MOENS, 2012). Outro estudo

publicado sugere que ERK3 é crucial para a estabilidade do fuso mitótico, muito

necessário durante a transição metáfase-anáfase, na maturação de oocitos de ratos

(LI et al., 2010).

Em único teste inicial (FIGURA 39) realizado apenas com as amostras de TRα

com e sem T3, demonstramos a interação entre ERK3 e TR. Observamos também

que existem bandas no controle negativo, entretanto, podemos sugerir que exista

uma interação entre ERK3 e TR , na presença e ausência de T3 (FIGURA 39).

121

FIGURA 39. Co-IP de ERK3 com TR. Extratos proteicos de células 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui ERK3 (ou MAPK6, cell signaling #4067), interagindo com TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína, houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso a co-IP precisa ser otimizada.

PRMT5 – Proteina Arginina Metil Transferase 5

Encontrado na IP de TRα com T3

A proteína humana PRMT5 (Proteína Arginina Metiltransferase) foi

identificada inicialmente como Proteína ligante de Jak-1 (JBP1), e era conhecida por

metilar as histonas H2A e H4 na arginina 3, e H3 na arginina 8. Atualmente, foram

atribuídas mais funções à PRMT5, a qual é responsável por transferir os grupos metil

da S-adenosilmetionina (AdoMet) para o nitrogênio guanidino da arginina resultando

nos produtos metilarginina e S-adenosil homocisteína (AdoHcy). A maioria dos

vertebrados tem complexos de PRMT5 contendo MEP50. Esta proteína, também

conhecida por Wdr77, ou coativador do receptor de andrógenos p44, liga

diretamente à PRMT5 e aumenta sua atividade histona metiltransferase. PRMT5-

MEP50, junto com PRMT7, tem um papel muito importante no splicing de mRNA por

conta da metilação de proteínas do spliceossomo. Todas essas funções juntas,

relacionadas à modificação das caudas das histonas, fazem desta, uma proteína

muito importante na regulação epigenética (STOPA; KREBS; SHECHTER, 2015).

PRMT5 foi encontrada desde o nosso experimento piloto de IP (coletado e

analisado pelo Q-Tof Ultima (MicroMass/Waters), interagindo com ambas isoformas

do TR, sendo encontrada novamente nos experimentos finais desse trabalho através

da IP-LC-MS/MS de TR. Na Co-IP de PRMT5 e TRs, observamos que este parceiro de

122

interação tem afinidade por ambas isoformas de TRs independente da presença de

ligante (FIGURA 40). Por isso sugerimos que a interação entre PRMT5 e TRs ocorra,

embora o resultado do controle negativo não se apresentou satisfatório.

FIGURA 40. Co-IP de PRMT5. Extratos proteicos de células 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com e sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T, sem transfecção, antes da IP. Mostramos aqui PRMT5 (Millipore #07-405) interagindo com as diferentes isoformas de TR, na presença e ausência de T3. Mostramos também que para essa proteína houve imunoprecipitação inespecífica visto que existem bandas no controle negativo. Nesse caso a co-IP precisa ser otimizada.

3.8 Discussão e Conclusão dos Screenings

Os resultados encontrados nos permitiram construir vias e redes de interação

em que os TRs α e β estao envolvidos. De todos os processos mapeados, verificamos

que os TRs têm importante participação em processos biológicos relacionados ao

desenvolvimento e progressão do câncer. Com os experimentos de IP e Y2H foi

possivel identificar interacões inéditas entre TRα e β e EBP1, ERK3, CKII, SRPK1 e

PRMT5. Nos experimentos de duplo híbrido foram encontradas 28 interações

inéditas para TRα e 10, para TRβ. Nos experimentos de IP, foram encontradas mais

de 400 novas interacões para TRα (459 sem ligante e 311 com ligante) e mais de 200,

para TRβ (215 sem ligante e 20 com ligante T3). De acordo com o mapeamento

destas interações foi possível visualizarmos os processos em que os TR participam,

se existe preferência por isoforma na participação de determinados processos e,

como o ligante T3 interfere nas formações de complexos.

Verificamos que TRα se apresentou mais promiscuo em termos de parceiros

de interação, sendo que participa de diversos processos biológicos. A adição do

ligante T3 leva à redução tanto de parceiros de interação, quanto de processos em

123

que ambos os TRs participam. No caso, o T3 parece direcionar o TR para a

participação em eventos de regulação de transcrição e tradução. Mais ainda, após a

identificação dos processos celulares mais comuns em que os TRs atuam, e diversas

análises de bioinformática, buscamos a validação de nossos dados e a comparação

com outros trabalhos já publicados.

Nossos resultados corroboraram o trabalho de PRIVALSKY, conforme

demonstramos, e indicaram que a participação do TR em processos celulares

relacionados ao desenvolvimento e progressão do câncer.

Entretanto também encontramos algumas diferenças entre nossos dados e

os dados de PRIVALSKY. Uma hipótese para explicar essas diferenças está no método

usado por cada um dos trabalhos. Primeiramente, em nosso trabalho, a expressão

dos TRs foi feita dentro da mesma célula que a imunoprecipitação dos complexos,

criando um ambiente celular bem próximo do encontrado in vivo, sendo que os TRs

podem interagir com todas as proteínas presentes dentro de uma célula viva. Outra

hipótese se baseia nas diferenças encontradas no tipo de expressão das proteínas,

pois enquanto PRIVALSKY utilizou a construção inteira (full) de TRs fusionada em

GST, expressa em E. coli BL21 (DE3), nós utilizamos a expressão dos TRs em célula de

mamíferos e realizamos as IPs dos complexos dentro da própria célula. A expressão

em bactéria, usada por PRIVALSKY, resulta em ausência de modificações pós-

traducionais na proteína formada e, como consequência, têm-se interações e

recrutamento diferenciado de proteínas.

Além disso, em vez da realização de uma eletroforese para separação das

proteínas, nossos complexos foram eluídos da resina anti-flag por competição

química, antes de serem enviados para a análise de LC-MS/MS. Durante o

procedimento de correr um gel e recortar bandas para enviar para a análise, podem

existir escolhas enviesadas. Ao contrário, nós escolhemos eluir os complexos e

submeter a amostra líquida total para a análise, o que pode ter resultado em um

número maior de peptídeos encontrados exclusivamente para cada isoforma de TR.

Por fim, entendemos essas diferenças não como problemas do método, e sim como

um fator a ser usado a favor na busca das diversas interações que uma proteína

pode fazer.

124

Comparando os métodos IP-LC-MS/MS e y2h, suas vantagens e

desvantagens, uma das questões que podem ser levantadas em nossa análise, é o

fato de que não foram encontradas proteínas em comum em ambos. De fato, o

sistema y2h identifica interação proteína-proteína de forma binária, ou por interação

direta: presa interage com isca e temos a transcrição do gene repórter. Já no sistema

IP-LC-MS/MS, as proteínas identificadas podem fazer parte de um complexo muito

maior, e as interações encontradas não são necessariamente diretas. Ou seja, entre

flag-TR e a presa, podem haver outras proteínas que não necessariamente foram

identificadas pela espectrometria de massas (BRÜCKNER et al., 2009; CAUSIER,

2004).

Juntos, y2h e IP-LC-MS/MS, seja encontrando interações diretas ou

complexos, nos direcionaram a encontrar vias nas quais os TRs têm funções

relevantes. Essas vias foram cuidadosamente analisadas em diversos softwares e

plataformas. Através do método IP-LC/MS/MS foi possível confirmar vias em que os

TRs atuam dado que foram identificados complexos de proteínas nos quais as

interações binárias (y2h) estão inseridas. De fato, quando analisamos os

interactomas construídos no Cytoscape, é possivel verificar nas redes de interação

dos TRs as interações diretas com o receptor (presas do y2h), as quais compõem,

juntamente com os peptídeos identificados em LC-MS/MS, cada processo biológico

destacado. Ou seja, nosso trabalho se torna mais confiável e robusto, pelo uso de

duas técnicas complementares de screening.

Baseados nestas informações, buscamos alguns alvos para a confirmação

experimental através de Co-IP. Para todas as interações confirmadas por Co-IP –

RXRα, EBP1, SRPK1, CKIIα, ERK3 e PRMT5 – nós obtivemos a seguinte conclusão:

embora as proteínas foram encontradas inicialmente em espectrometria de massas

de uma condição em particular, a maioria dos candidatos escolhidos para Co-IP

interagiram com os TRs nas 4 condicões (TRα, TRα+3, TRβ, TRβ+3).

Atribuímos as diferenças encontradas entre IP e Co-IP aos ruídos de

background e cobertura de dados da MS. Conforme discutido em uma revisão

recente (GOH et al., 2012), essas são duas limitações muito comuns da técnica de

MS. Dessa forma, nós sugerimos que parte dos nossos dados podem não estar

totalmente cobertos na IP-LC-MS/MS dos TRs, o que explica porque algumas

125

proteínas que pareciam ser exclusivas de uma amostra (Ex. TRα sem T3), na Co-IP

acabaram sendo confirmadas para as outras amostras também (TR sem T3, TR

com T3 e TR com T3). Apesar disso, nossos dados de IP, y2h e Co-IP corroboraram a

hipótese de que TRs podem interagir com proteínas presentes em processos

essenciais das vias de regulação de câncer. O que revela uma nova e importante

função para esse receptor nuclear.

126

Capítulo 4. A interação inédita entre TR e PDI

127

4.1 Introdução

A Proteína Dissulfeto Isomerase, PDI (PDIA1 ou gene P4HB), é uma chaperona

redox que pertence ao grupo de ditiol-proteínas da superfamília da tiorredoxina,

cuja principal função é catalisar o enovelamento protéico pela inserção de pontes

dissulfeto em proteínas recém-sintetizadas no retículo endoplasmático que serão

secretadas ou irão para a membrana plasmática (GRUBER et al., 2006; WATANABE,

2014). Sua estrutura em forma de “U” (FIGURA 41)Error! Reference source not

found. possui cinco domínios denominados a, a’, b, b’ e c. Os módulos a e a’ contêm

os dois domínios catalíticos tiorredoxina com o motivo redox WCGHC, e estão

separados pelos domínios não catalíticos b e b’. Os domínios b e b’, que nao

possuem cisteinas ativas, parecem ser espacadores ou podem ser responsáveis pelo

reconhecimento do substrato. O domínio c na região C-terminal contém o motivo

KDEL responsável pela retenção da proteína do ER (HATAHET; RUDDOCK, 2007;

JANISZEWSKI et al., 2005; KOZLOV et al., 2010).

FIGURA 41. Esquema mostrando uma estrutura conhecida de PDI (baseada na PDI de levedura) composta pelos a-b-b′-x-a′-c, as quatro cisteínas redox (esferas cinzas) e o dominio C-terminal com a sequencia KDEL. Retirada de (LAURINDO; PESCATORE; DE CASTRO FERNANDES, 2012).

A PDI pode ter um papel importante na manutenção da homeostase por

mediar o enovelamento oxidativo de proteínas e também proporcionar a

sobrevivência e progresso de alguns tipos de câncer (XU; SANKAR; NEAMATI, 2014).

128

Processos redox sao relevantes a regulacao da sinalizacao celular e resposta

integrada a estresse (FERNANDES et al., 2009). Tais processos são hierarquizados em

niveis distintos e integrados, cujo evento central é a organizacao estrutural e

funcional da geração enzimática de espécies reativas e seu acoplamento a alvos

redox- sensíveis. Tal organização pressupõe integração destas enzimas e espécies

produzidas com plataformas físicas compartimentalizadas em células, formando

módulos de transdução de sinais (JONES, 2006). O desequilíbrio ou perda da

regulação destes processos leva ao estresse oxidativo (SIES, 2007), envolvido na

fisiopatologia de várias doenças, particularmente doenças cardiovasculares

(LAURINDO et al., 2008).

O Laboratório de nosso Pesquisador Colaborador Dr. Francisco R. M. Laurindo

(Incor, São Paulo), identificou um papel da Proteína Dissulfeto Isomerase (PDI), uma

chaperona redox do reticulo endoplasmático, na associação física com o complexo

NADPH oxidase e em sua regulação funcional. Este efeito foi identificado em células

musculares lisas vasculares, bem como em macrófagos, neutrófilos e células

endoteliais, indicando tratar- se de uma regulação mais geral e não específica a um

tipo celular (LAURINDO et al., 2008; SANTOS et al., 2009). Além disso, estudos

recentes têm apresentado convergência entre estresse oxidativo e estresse do

reticulo endoplasmático, uma circunstância na qual a PDI é superexpressa, participa

da produção de oxidantes (FERNANDES et al., 2009), e ativa certas NADPH oxidases

(AMANSO; DEBBAS; LAURINDO, 2011). Em conjunto, é possivel sugerir que a PDI

tenha funções de um adaptador redox de processos de sinalização celular

(FERNANDES et al., 2009).

Adicionalmente, devido a sua importante função no retículo endoplasmático,

a PDI é considerada um protetora no desenvolvimentos de doenças

neurodegenerativas como a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), Parkinson e

Alzheimer. Nessas doenças, a função redox da PDI está diminuída, o que resulta no

acúmulo de proteínas mal enoveladas e ativação das vias de estresse de Retículo

Endoplasmático (JEON et al., 2014; UEHARA et al., 2006; WATANABE, 2014).

Foi demonstrado que o silenciamento da PDI com siRNA inibe

significativamente a migração de células musculares lisas vasculares concomitante

com importante a redução na ativação de Rac1 e RhoA e a uma importante perda de

129

organização do citoesqueleto e de estruturas de adesão celular (PESCATORE et al.,

2012). Essas evidências demonstraram que existe associação física entre PDI e

RhoGTPases ou RhoGDI1 (PESCATORE et al., 2012).

Além dessas interações descritas, um grupo de pesquisa, ao estudar

proteínas ligadas ao receptor de estrógeno (ER), quando este está ligado a EREs

específicas (Elementos Responsivos a ER), encontrou a PDI (SCHULTZ-NORTON et al.,

2006). Em seguida, os autores comprovaram, usando ensaios biofísicos e

moleculares, que PDI colocaliza com ER no núcleo de células MCF7, altera a

conformação de ER, aumenta a interação ERE-ER na presença de agentes

oxidantes e redutores, além de influenciar a ação de ER na expressão gênica,

funcionando como uma chaperona deste receptor. Essa foi uma das primeiras

evidências de PDI interagindo com RNs (SCHULTZ-NORTON et al., 2006).

Adicionalmente, no campo de modificações pós-traducionais que alteram a

estrutura e função de proteínas, está a S-glutationilação de resíduos de cisteína. Essa

modificação foi encontrada em PDI, e faz com que o processo de enovelamento de

proteínas seja interrompido, e por consequência o sinal de resposta à proteínas mal-

enoveladas (UPR) é ativado. Foi demonstrado que a S-glutationilação de PDI,

principalmente em células de câncer de mama, impede a formação do complexo de

PDI-ER. Além disso, o aumento da transcrição de genes envolvidos com

proliferação celular promovido pela sinalização com estradiol é revertido com o

tratamento das células com drogas como PABA/NO. Dessa forma, essas drogas

regulam de forma redox a PDI causando S-glutationilação, com isso, promovem a

morte celular através da ativação de UPR, desestabilizando e interrompendo a

sinalização de ER (XIONG et al., 2012).

A terceira evidência da interação entre PDI e RNs foi estudada por

HASHIMOTO & IMAOKA (2013) quando perceberam que a superexpressão de PDI

em células GH3 era capaz de suprimir a resposta da célula ao hormônio T3. Nesse

trabalho, os autores investigaram e mostraram que esse mecanismo ocorria via TR.

Mais ainda, que PDI não atuava simplesmente como chapernona, mas como uma

dissulfeto isomerase que é capaz de mudar o estado redox de Ref-1, um fator de

transcrição. Ref-1, por sua vez, passa a atuar no estado redox de TR, resultando em

130

alteração da expressão do gene GH (gene do hormônio de crescimento)

(HASHIMOTO; IMAOKA, 2013).

Por fim, a PDI foi encontrada em nossos experimentos de IP e y2h (FIGURA

42), sendo um alvo importante, sobre o qual decidimos nos aprofundar nos estudos

de interação com TR. Resolvemos então, baseados na literatura e em nossos

resultados, investigar mais profundamente se PDI era capaz de se ligar diretamente

ao TR e modificar a expressão de outros genes.

FIGURA 42. Interação TR e PDI encontrada na IP-LC/MS/MS de TR sem T3, encontrada e confirmada em y2h de TR. A. Rede de interações de TR alpha sem T3, anotada e criada pela plataforma IIS, visualizada no Software Cytoscape (organic layout). Em azul, proteínas encontradas na IP consideradas inéditas; em verde, proteínas do banco de dados de interação do TR alpha, interações já descritas na literatura. Em destaque abaixo da rede, as interações já descritas encontradas pela LC-MS/MS, aumentam a confiabilidade do método. E em destaque na parte superior, a P4HB (ou PDI); B. Ensaio de confirmação de y2h. 1 a 3, triplicata de pBTM vazio + P4HB (controle negativo); 4 a 6, triplicata de pBTM-TR beta + P4HB. Quadrante preto: teste de crescimento em meio restritivo sem Histidina; Quadrante azul: teste da beta-galactosidase.

4.2 Co-IP de TR e PDI em 293T

Encontrada na IP de TRα sem T3 e confirmada em y2h de TR

Após encontrar a interação entre TR e PDI na IP-LC-MS/MS, e no y2h de TR,

decidimos usar o método da Co-IP para verificar esta interação (WB da Co-IP

ilustrado na FIGURA 43). Para isso, a PDI foi imunoprecipitada e buscamos a

presença de TRs por WB com anticorpos anti-flag (FIGURA 43-A). Em seguida, flag-

131

TRs foram imunoprecipitados, usando a resina anti-flag, e foi realizado o WB anti-PDI

(FIGURA 43-B).

FIGURA 43. Co-imunoprecipitação de TR e PDI. A. Extratos de 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3) foram imunoprecipitados com resina A/G agarose conjugada a anti-P4HB (anticorpo #MAB4236, R&D Systems). Input corresponde ao extrato de 293T com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3), antes da IP. WB anti-flag mostra TRs nas amostras nas quais PDI foi imunoprecipitada. Os gráficos ao lado da figura mostram a quantificação das bandas pelo software Li-Cor. Os números de intensidade são dados pelo software e calculamos usando o controle como intensidade basal (=1); B. Extratos de 293T sem (controle negativo, ‘-ctrl’) ou com superexpressão de flag-TRs (com ou sem T3) foram imunoprecipitados com resina anti-flag. Input corresponde ao extrato de 293T sem T3, antes da IP.

132

No WB anti-flag podemos observar uma banda pouco mais intensa para a

amostra TRα-T3 e todas as outras bandas mais fracas, ou seja. Este resultado nos

leva a sugerir que talvez ocorra uma interação mais forte entre PDI a isoforma sem

ligante (FIGURA 43-A). O mesmo padrão também é observado no WB anti-PDI, no

qual também verificamos maior quantidade de TR co-imunoprecipitado na

ausência de T3 (FIGURA 43-B).

Além disso, é importante ressaltar que encontramos PDI presente em todas

as amostras da IP de flag-TRs e encontramos TRs em todas as amostras de IP de PDI

(os gráficos da quantificação das bandas se encontram abaixo de cada ilustração do

WB da FIGURA 43). Apesar do controle negativo da Co-IP estar ligeiramente superior

à banda de Co-IP de TR e TR com T3 (FIGURA 43-A), podemos sugerir que a

interação também possa ocorrer entre ambas isoformas de TR. Essa diminuição das

bandas de PDI co-imunoprecipitada com TR+T3 se deve ao fato da diminuição da

expressão de TRs. Considerando o WB como um método qualitativo, a presença de

proteínas é suficiente para indicar uma possível confirmação que PDI co-

imunoprecipita com ambas isoformas de TR em condições de ausência e de presença

do hormônio, sendo o hormônio um fator não limitante para a possível interação.

4.3 Expressão e Purificação das proteínas

4.3.1 Purificação por afinidade (IMAC)

Os ensaios feitos em células de leveduras, demonstraram que as proteínas

TR e PDI estão próximas o suficiente para recrutar a maquinaria de transcrição, e

nossos resultados de Co-IP sugerem que PDI é capaz de co-imunoprecipitar em

complexo com o TR. Para estudo de possíveis interações diretas entre TR:PDI

expressamos e purificamos diferentes construcões das proteinas PDI, TRα e TRβ

(Tabela 10). Após a purificação por afinidade (IMAC), obtivemos o isolamento da

maior parte das proteínas de interesse nas frações da eluição (E1-E6) (FIGURA 44).

133

Todas as proteínas apresentam no gel bandas de tamanho de acordo com valores

teóricos de Massa Molecular (MM) (Tabela 10).

Tabela 10. Construções das proteínas utilizadas no projeto.

Construção Abreviação utilizada Vetor Cauda MM (kDa)

hTRβ-ΔAB TRβDL pET28a(+) Histidina 42

hTRα full length TRαFULL pET28a(+) Histidina 47

hPDI full length PDI pET28a(+) Histidina 57

FIGURA 44. Purificação por afinidade a His-tag das proteínas em resina de cobalto. SDS-PAGE 12%

acrilamida mostrando o TRFULL (A) de 47 kDa, a PDI (B) de 57 kDa e TRDL (C) de 42kDa. MW= marcador molecular; E1-E6 são as eluições da purificação. O destaque em vermelho mostra o tamanho das bandas da proteínas purificada.

A banda que ilustra a purificação da construção TRFULL está abaixo do

marcador de 50 kDa, próxima dos 47 kDa (FIGURA 44-A). Já a banda da construção

PDI (FIGURA 44-B) se mostra acima da banda do marcador de 50 kDa, bem próximo

do tamanho de 57 kDa. E por fim, observamos que a banda de TRDL, se encontra

abaixo dos 50 kDa, próximo dos 42 kDa (FIGURA 44-C). Com isso, concluímos que as

proteínas foram expressas conforme os tamanhos esperados.

134

É curioso ressaltar o rendimento da purificação de PDI, em torno de 40 mg de

proteína por litro de expressão (FIGURA 44-A), que é muito superior ao rendimento

das isoformas de TR (FIGURA 44-B e C), nas quais obtivemos 25 mg/L para o TRFULL

e 13 mg/L para o TRDL.

4.3.2 Purificação por Exclusão Molecular – Gel Filtração (GF)

Nas purificações por afinidade dos TRs, obtivemos uma relação

proteína:contaminantes relativamente maior que o esperado. Entretanto, com o

objetivo de obter amostras de TRs mais puras, as alíquotas E1 e E2 das eluições da

purificação por afinidade (mostradas nos géis da FIGURA 44) foram concentradas e

aplicadas na coluna de gel filtração para a purificação por exclusão de tamanho

molecular. Os experimentos de gel filtração (GF) foram realizados com a colaboração

da Dra. Juliana Fattori no Laboratório de Purificação de Proteínas – LPP (LNBio,

CNPEM).

Através da purificação por exclusão molecular, separamos as proteínas por

tamanho e coletamos apenas aquelas frações em que as proteínas estão puras. Além

disso, a GF nos forneceu informações sobre raio hidrodinâmico (Rh) e estado

oligomérico das amostras (FIGURA 45).

135

FIGURA 45. Purificação por gel filtração (GF, exclusão por tamanho molecular, em coluna Superdex 200 16/60) de TRs e PDI. MW= marcador molecular. A. Perfis da Gel filtração em coluna Superdex 200 16/60 de TRFULL, TRDL e PDI; B. TRFULL – SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de eluição retiradas da Gel filtração; C. TRDL – SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de eluição retiradas da Gel filtração; D. PDIFULL - SDS-PAGE 12% acrilamida – pool de frações do pico de eluição retiradas da Gel filtração.

Observamos na GF em coluna Superdex 200 16/60, picos de eluição das

proteínas TR e TR em volumes próximos a 46 mL, para ambas isoformas de

TR, enquanto que PDI foi eluida em 51 mL (FIGURA 45-A). Analisamos os géis

SDS-PAGE com as frações da Gel Filtração (GF) mais puras contendo os TRs, e,

de acordo com o esperado, ambos TRs aparecem próximos da banda do

marcador equivalente a 50 kDa (FIGURA 45-B e -C), sendo que PDI aparece em

uma banda superior a 50 kDa (FIGURA 45-D). Além disso, através dos géis

podemos afirmar que a purificação foi eficiente e aumentou a razão

proteína:contaminantes, ou seja, a quantidade de contaminantes que aparecem

nesses géis é irrelevante, comparada à quantidade de proteína de interesse.

4.4 Caracterização Biofísica

4.4.1 Gel Filtração Analítica

Realizamos também a GF analítica do complexto TR:PDI em coluna

Superdex 200 10/300 que também foi calibrada previamente. Nesse

experimento o complexo foi formado na proporção molar 1:1, e em seguida foi

eluido na fração próxima a 14 mL (cromatograma da FIGURA 46-A). As frações

136

próximas ao volume de eluição 14 mL foram analisadas em SDS-PAGE para

observar a presença das proteínas do complexo (bandas apontadas pelas setas

na FIGURA 46-B). Dessa forma, nosso resultados indicam que ambas proteínas

foram eluídas juntas em forma de complexo.

FIGURA 46. Gel Filtração analítica do complexo em Coluna Superdex 200 10/300. A. Perfil da gel filtração analítica na qual observamos o pico de eluição do complexo. B. SDS-PAGE 12% com frações da GF onde se encontra o complexo TR:PDI.

Através da calibração realizada nas colunas, e dos volumes de eluição

das proteínas (FIGURAS 45 e 46) conseguimos estimar os raios hidrodinâmicos

137

(Rh) (Error! Reference source not found.) de cada construção utilizada e inferir

seu estado oligomérico. Assim, o TRFULL e TRDL, obtiveram seus primeiros

picos de eluição em 46 mL, apresentando Rh de 5,2 nm, que correspondem a

tetrâmeros, de acordo com a literatura (FIGUEIRA et al., 2006).

Tabela 11. Raios hidrodinâmicos calculados através de Purificação por Exclusão Molecular e GF Analítica.

Volume de Eluição (GF)

Raio calculado (Rh) Estado oligomérico

TRFULL 46 mL 5.2 nm Tetrâmero

58 mL 3.0 nm Monômero

TRDL 46 mL 5.2 nm Tetrâmero

55 mL 3.2 nm Monômero

PDIFULL 51 mL 3.7 nm Monômero

TR:PDI 14 mL 3.9 nm Complexo 1:1

Logo após o primeiro pico, identificamos “ombros”, ou picos

secundários, que também correspondem aos TRs, mas em estados oligoméricos

menores. Para o TRFULL analisamos a fração do volume de eluição de 58 mL, e

para o TRDL analisamos a fração de 55 mL, correspondendo a Rh de 3,0 e 3,2

nm, respectivamente. Também de acordo com a literatura, foi visto que Rh=3.6

nm representa monômeros de TRDL, por isso inferimos que nossos valores de

raios observados sejam correspondentes a monômeros (FIGUEIRA et al., 2006)

(Error! Reference source not found.).

Analisando a proteína PDI humana, eluída em 51 mL, calculamos que o

Rh é em torno de 3,7 nm. De acordo com a literatura e, por experimentos de

espalhamento de luz à baixo ângulo (SAXS), a PDI humana se apresenta

monomérica com raio de giro de 3,3 nm (LI et al., 2006).

Por último, analisando o complexo TR:PDI, o raio encontrado foi de

aproximadamente 4 nm, ligeiramente maior que os raios dos monômeros de TR

e PDI. Esse valor pode indicar a formação de um complexo na proporção 1:1 e o

perfil da GF indica um pico único.

138

4.4.2 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)

Em seguida, foram feitos ensaios de espalhamento de luz dinâmico

(DLS), com as proteínas puras eluídas da Gel Filtração, para observação do

tamanho e forma oligomérica das proteínas sozinhas e em complexo (FIGURA

47). Além disso, com intuito de comparar os raios hidrodinâmicos calculados

pelas técnicas de GF e DLS, construímos um complexo TR:PDI na proporção 1:1

e analizamos em ensaio de DLS.

FIGURA 47. Medidas de DLS das proteínas sozinhas e em complexo (TR:PDI). A Tabela ao lado indica os valores dos Rh encontrados.

Através da análise dos picos de DLS obtivemos valores de raios

encontrados para as construções utilizadas (proteínas sozinhas) em comparação

com o complexo TR:PDI (FIGURA 47). Os valores de polidispersividade medidos

pelo DLS mostram que os picos estão monodispersos, o que indica uma mistura

homogênea de moléculas com aquele mesmo raio. Além disso, é possível

observar um pequeno deslocamento à direita para o pico do complexo em

relação aos picos das proteínas sozinhas o que pode sugerir a formação do

complexo entre as duas proteínas.

139

Comparação entre DLS e GF

Nossos resultados demonstram similaridades de valores de Rh encontrados

para a GF e DLS (Tabela 12). Novamente, ambas isoformas de TR, no DLS,

mostraram Rh de 3,2 nm, muito próximos dos valores de GF. E, como dito

anteriormente, consideramos que esses valores de raios são representados por

monômeros de TR, de acordo com a literatura (FIGUEIRA et al., 2006). No caso da

PDI, também observamos, segundo o DLS, um Rh de 3,3 nm (Tabela 12). Esse

mesmo raio foi calculado por experimentos de GF e está de acordo com o observado

em um trabalho publicado (LI et al., 2006). E por último, no caso do complexo

TR:PDI, observamos uma pequena diferença, porém pouco significativa, entre os Rh

encontrados por DLS e GF (Tabela 12). O DLS mostrou um Rh de 4,2 nm com erro de

0,8 nm, o que traz o valor para próximo do encontrado na GF (Rh=3,9 nm).

Tabela 12. Raios calculados à partir da GF e DLS.

Construção Peso Molecular

Rh (GF) Rh DLS Estado oligomérico

TRFULL 54,8 kDa 3.0 nm 3,2 nm ± 0.2 Monômero

TRDL 43,44 kDa 3.2 nm 3,2 nm ± 0.1 Monômero

PDIFULL 57,12 kDa 3.7 nm 3,3 ± 0.5 Monômero

PDI:TR 100,5 kDa 3.9 nm 4,2 nm ± 0.8 Complexo

4.4.3 Termoestabilidade

Em seguida, decidimos investigar se a formação do complexo alteraria a

estabilidade térmica das proteínas através de ensaios de desenovelamento térmico

e monitoramento de perda de estruturas secundárias (CD) e terciárias (Thermal-

Shift).

140

4.4.3.1 Dicroísmo Circular (CD)

Em colaboração com a Dra. Juliana Fattori, realizamos os experimentos de

Dicroísmo Circular (CD). Nesses experimentos, observamos pelos espectros de CD

que as duas proteínas (TRDL e PDI) se apresentaram corretamente enoveladas, com

estrutura secundária predominantemente helicoidal, comprovado pelos dois

mínimos caracteristicos de α-hélices, em 222 e 208 nm, assim como o complexo

TRβDL+PDI (FIGURA 48).

Além disso, as duas proteínas e o complexo se apresentam com maior porção

da estrutura em forma de α-hélice (FIGURA 48; Tabela 13). O complexo parece ser

mais estruturado que as proteínas isoladas, com maior porção helicoidal (56%), se

comparado à quantidade de alfa-hélices presentes nas proteínas sozinhas (31% para

a PDI e 40% para o TRDL).

FIGURA 48. Espectros de Dicroísmo Circular (CD) das proteínas: PDI em preto, TRβ-AB em vermelho e do complexo TRβ-AB:PDI em azul.

Tabela 13. Os resultados da deconvolução dos espectros no programa

DichroWeb (ANDRADE et al., 1993; MERELO et al., 1994).

Proteína % alfa-hélice

PDI 31

TR-ΔAB 40

TR-ΔAB:PDI 56

200 210 220 230 240 250 260

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

n

orm

aliz

ad

o

(nm)

PDI

TR-AB

TR-AB:PDI

141

Em seguida, as proteínas sozinhas e em complexo foram submetidas ao

desenovelamento térmico, monitorando o sinal de CD em 208 nm (FIGURA 49.

Error! Reference source not found.). Conforme se observa as proteinas PDI e TRβDL

apresentam estabilidade térmica semelhante, em relação à estrutura secundária das

proteínas, com Temperatura de melting (Tm) em torno de 45°C (FIGURA 52.-A e –B;

Tabela 14). Já o complexo, apresenta uma curva do tipo dois estados, que podemos

caracterizar como a presença de um intermediário no desenovelamento com Tm =

41,7 ± 0,3°C, e uma segunda Tm = 62,2 ± 0,6°C para a perda de estrutura secundária

(FIGURA 49. -C; Tabela 14).

FIGURA 49. Curvas de desnaturação térmica monitorando o sinal de CD em 208nm: A. TRβ-AB; B. PDI; C. TRβ-AB:PDI, na qual observamos 2 platôs indicados pelas setas.

142

Tabela 14. Temperaturas de melting (Tm) calculadas a partir das curvas de desnaturação térmica obtidas no CD (FIGURA 53).

Proteína Tm (oC)

TRDL 47,3 ± 0,7

PDI 43,3 ± 0,3

TRDL:PDI 41,7 ± 0,3 62,2 ± 0,6

Entretanto, analisando a curva de desnaturacao do complexo TRβDL:PDI

(Error! Reference source not found.-C), observa-se o platô final com elipcidade (Ɵ)

em torno de -14 miligraus, o que indica que ainda possam existir de formas

estruturadas em solução.

4.4.3.2 Thermal-Shift Assays (TSA)

Além dos estudos de estabilidade de estrutura secundária (CD), também

realizamos estudos de estabilidade de estrutura terciária do complexo e das

proteínas que o formam. Neste caso, através de experimentos de Thermal-shift

Assays (TSA) ( ).

A.

143

FIGURA 50. Thermal-Shift Assays das proteínas sozinhas e em complexo. A. Curvas médias da desnaturação de TR, TR, PDI, TR:PDI e TR:PDI, sem T3. B. Curvas médias da desnaturação de TR, TR, PDI , TR:PDI e TR:PDI, com T3. O perfil de desnaturação de PDI sozinha e em complexo com TRs possui 2 duas temperaturas de melting (Tm) diferentes.

Tabela 15. Temperaturas de melting (Tm) encontradas no Thermal-shift

Proteína Tm1 (oC) Tm2 (oC)

PDI 26,3 ± 0,2 40,6 ± 0,1

PDI T3 26,3 ± 0,2 40,6 ± 0.2

PDI:TR 27,0 ± 0,2 40,2 ± 0,1

PDI:TR+T3 26,3 ± 0,1 38,8 ± 0,03

PDI:TR 26,5 ± 0,03 41,0 ± 0,1

PDI:TR+T3 26,7 ± 0,1 41,0 ± 0,1

TRFULL 29,8 ± 0,4

TRFULL+T3 32,3 ± 0,1

TRDL 32,3 ± 0,1

TRDL+T3 31,5 ± 0,1

Para cada condição testada, as curvas de desnaturação resultaram em um

perfil de dois estados (enoveladodesenovelado) para ambas as isoformas de TR,

com Tm por volta de 30°C. Já a PDI e os complexos TR:PDI resultaram em curvas de

dois estados (enovelado intermediário desenovelado), com duas Tm, uma por

volta de 26°C, e a segunda, por volta de 32° C (FIGURA 54; Tabela 15).

B.

144

Infelizmente, em nossas medidas de termoestabilidade, a presença do

hormônio T3 não alterou significativamente a Tm de nenhuma das isoformas de TR.

Além disso, juntamente com o perfil característico de desenovelamento para a PDI,

no qual observamos duas Tm, decidimos observar apenas se a presença de TRs

alteraria o perfil dessa curva. Ou seja, consideramos PDI como nosso controle e

analisamos as alterações na curva a partir da adição de TR, na ausência (FIGURA

54Error! Reference source not found.-A; Tabela 15) e presença do T3 (FIGURA 54-

B; Tabela 15).

A única mudança mais visível de Tm está na comparação da condição PDI+T3

com PDI:TR+T3 (Tabela 15). Nesse caso, a Tm2 passou de 40 para 38oC quanto

TR+T3 foi adicionado. Ou seja, o complexo ficou relativamente menos estável. No

resto das curvas apresentadas, observamos que apesar de não haver grandes

mudanças nas Tm, temos um pequeno shift formando um platô (FIGURA 54-A e B)

entre as temperaturas 30 e 38oC, quando TRs estão presentes em complexo com

PDI. Esse platô pode representar o perfil característico da perda de estrutura

terciária das proteínas juntas em um complexo.

Comparação entre CD e TSA

A presença de PDI em complexo com TRs não aumentou ou diminuiu a

estabilidades dos mesmos. Dessa forma, verificamos que a formação do complexo

não muda a estabilidade das proteínas, em nossos experimentos de CD e Thermal-

shift.

4.5 Estudos da Interação TR:PDI

4.5.1 Afinidade entre TR e PDI – Anisotropia de fluorescência

Com o intuito de caracterizar a interação entre as duas proteínas estudadas,

TRβDL e PDI, ou TRFULL e PDI, buscamos calcular a afinidade (Kd, constante de

dissociação) entre elas, na presença e ausência do hormônio T3, através de ensaios

de anisotropia de fluorescência (FIGURA 51).

145

Analisando as curvas e os parâmetros calculados pela titulação da PDI no

TRβDL marcado (FIGURA 51-A), observa-se que a adição de T3 não altera

significativamente a afinidade entre as proteínas. Na ausência de T3, o Kd é de

aproximadamente 1 M e passa para 1,4 M, quando T3 é adicionado. Por isso,

consideramos que, para a interação TR:PDI, o hormônio T3 não altera a afinidade

entre as proteínas do complexo.

FIGURA 51. Curvas de Anisotropia de Fluorescência da formação do complexo TR-PDI com e sem T3. A. Curva de anisotropia de TR DL com e sem T3, titulado em PDI marcada com FITC. A tabela mostra o constante de dissociação (Kd) médio encontrado.; B. Curva de anisotropia de PDI titulada em TR marcado com FITC, na presença e ausência de T3. A tabela mostra o constante de dissociação (Kd) médio encontrado. As curvas são a representação média da triplicata experimental.

146

Foi realizada também a titulação inversa, mas nessa caso, com a isoforma

TRFULL. Marcamos a PDI e titulamos TR com e sem T3 (FIGURA 51-B), e

observamos que o Kd ficou em torno 2,4 M para ambas condições. Para o

complexo TR:PDI, o T3 também não alterou a afinidade entre as proteínas.

Ao observar as afinidades, vemos que PDI é capaz de interagir in vitro com

ambas isoformas, sendo que a afinidade da isoforma TR com PDI está em torno de

1 M e obtivemos o dobro para a isoforma com PDI, 2 M (FIGURA 51). Podemos

dizer que TR tem uma afinidade ligeiramente maior por PDI, se comparado ao TR,

embora sugerimos que essa diferença entre as isoformas ocorre devido à titulação

ora de TR, ora de PDI.

Por fim, esses experimentos nos mostram indícios de que o complexo é

formado em solução, e que existe uma afinidade alta entre as proteínas do

complexo, quando comparamos com outros estudos de interação proteína-proteína

(FIGUEIRA et al., 2010b).

4.5.2 Transativacao em elementos responsivos à TR (F2 e AP-1)

Com os estudos de caracterização do complexo, provamos que as proteínas

são capazes de formar um complexo e tem afinidade entre si. Em seguida,

pretendemos mostrar a importância e consequência da formação do complexo em

modelos de células de mamíferos. Sendo o TR um fator de transcrição, decidimos

investigar a importância da PDI na regulação da transcrição de genes. Utilizando o

gene repórter luciferase em um ensaio de transativação, podemos observar a

regulação da transcrição por TR, com e sem T3, em diferentes elementos

responsivos. Os elementos responsivos utilizados foram o F2 (ou IP6), no qual está a

sequência consenso posicionada em palíndromo invertido espaçada por 6

nucleotídeos, onde TRs se ligam em homodímeros (IKEDA; RHEE; CHIN, 1994; YEN,

2001; YEN et al., 1992); e AP-1, um elemento responsivo negativo de TR (LOPEZ et

al., 1993). Em seguida, quando PDI está superexpressa, mostramos as diferenças na

regulação da expressão de Luciferase (FIGURA 52).

147

FIGURA 52. Gene Reporter Luciferase – Ensaios de Transativaça o em células Hek 293T. Plasmídeos com o gene TRα ou TRβ, PDI e elementos responsivos (HREs) para TR, F2-Luc ou AP1-Luc, foram transfectados em células 293T (com ou sem 1μM T3). Após 36h a atividade da luciferase foi medida. Todos os valores de ativação foram normalizados pela condição controle (pBlue), portanto todo sinal de RNs endógenos foi descontado. A. TRα e PDI em F2-Luc. A condição TRα+T3:PDI mostra PDI aumentando a transcrição em 3 vezes (TRα+T3 vs.TRα+T3:PDI); B. TRα e PDI em AP1-Luc, elemento de resposta negativo. Aqui a presença de PDI parece não alterar a transcrição. Nenhuma diferença significativa foi observada; C. TRβ e PDI em F2-Luc. Como mostrado para a isoforma TRα, PDI aumenta em 2.5 vezes a transcrição, se compararmos TRβ+T3 vs.TRβ+T3:PDI; D. TRβ e PDI em AP1-Luc, elemento de resposta negativo. Aqui a presença de PDI promove desrepressão da transcrição, na condição sem T3, diferentemente do que acontece com a isoforma TRα. (*, P <0.05). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni.

No elemento responsivo F2, no qual se liga preferenciamente homodímeros

de TR (VELASCO et al., 2007), o T3 aumenta a a transativação em cerca de 10x para

isoforma e 50x para a isoforma (FIGURA 52-A e -C). Quando PDI é adicionada,

verificamos um aumento de 5x para a condição TR sem ligante e de 3x, para

TR+T3. Observamos um aumento de 2x para TR+T3; e, interessantemente,

nenhuma diferença foi observada para a condição TR sem ligante. Porém se

comparamos a condição TR sem T3 com PDI com a condição TR com T3 e PDI,

verificamos que houve um aumento de 100 vezes para o TR, enquanto que para o

148

TR aumentou apenas 7 vezes. Ou seja, a superexpressão de PDI na presença de T3,

aumenta a expressão de luciferase regulada pelo elemento responsivo F2 em maior

escala para o TR se comparado à isoforma (FIGURA 52-A e -C). Já a

superexpressão de PDI na ausência de T3 aumenta a transativação apenas para a

isoforma , indicando uma possível diferença na regulação de genes entre as

isoformas de TR.

Já em elementos de resposta a hormônio negativos, como AP-1, a luciferase

tem uma redução na expressão basal quando T3 está presente. O elemento

responsivo a AP-1 confere ativação transcricional aos fatores de transcrição Jun ou

Jun/Fos e ainda tem sua ativação aumentada em até 5 vezes na presença de TR sem

ligante (LOPEZ et al., 1993). Entretanto, quando se adiciona T3, a resposta de Jun se

torna repressiva com ajuda do TR. In vivo a sequência de AP-1 pode se localizar no

promotor da colagenase humana, e nesse mesmo trabalho de Lopez e colaboradores

(1993), foi demonstrado que resultados podem variar entre construções em

plasmídeos e promotores reais existentes in vivo.

Nossos resultados em AP-1, para ambas isoformas de TR (FIGURA 52-B e -D),

indicam uma redução de aproximadamente 50% na transcrição de luciferase quanto

T3 está presente. Entretanto, para a isoforma TR, não observamos uma alteração

na expressão do gene, durante a superexpressão de PDI. Portanto concluímos que

PDI não é importante para regular TR através deste elemento responsivo.

Contudo, para o TR (FIGURA 52-D) verificamos o aumento da ativação do

TR quando não há hormônio presente e PDI está superexpressa, ou seja, na ausência

de T3 a transcrição basal é 1, e passa para aproximadamente 1,5x quando PDI é

adicionada, e esse aumento foi considerado significativo de acordo com nossas

análises estatísticas. Esse efeito que ocorre com o TR e PDI em AP-1, onde existe

aumento da transcrição basal, é chamado de desrepressão do gene. Dessa forma,

observamos mais um indício de PDI regulando cada isoforma de TR de uma maneira

diferente.

149

4.5.3 Recrutamento de Coativador – Anisotropia de Fluorescência

Em nossos dados anteriores mostramos que PDI é capaz de agir aumentando

ou diminuindo a transcrição de genes regulados por TR, ou seja, alterando a

transcrição regulada por TR. Por isso decidimos investigar existe interferência no

recutamento de correguladores pelo TR quando PDI está presente.

O experimento de anisotropia de fluorescência com correguladores é bem

padronizado em nosso grupo e pode responder questões sobre interação RNs e

correguladores, como coativadores e correpressores da transcrição (FATTORI et al.,

2014). Para isso, temos disponível em nosso grupo peptídeos marcados, como o

SRC1, um coativador bem conhecido capaz de se ligar e regular a transcrição através

de TR (HAHM; SCHROEDER; PRIVALSKY, 2014; MOORE; GUY, 2005).

Realizamos anisotropia de fluorescência com o coregulador SRC1 (FIGURA

53). Obtivemos um Kd de 0,3 M para a condição TR+T3 em SRC1 (FIGURA 53;

curva preta). Segundo a literatura, a afinidade entre TR e SRC1 está em torno de 0,5

a 1 M (MOORE et al., 2004). E para a condição de PDI em complexo com TR+T3

(FIGURA 53, curva vermelha), o Kd ficou em 0,6 M.

FIGURA 53. Anisotropia de Fluorescência de TR alpha+T3 com e sem PDI titulado em peptídeo coativador SRC1 marcado. Representação média das triplicatas. A tabela mostra o coeficiente de dissociação (Kd) médio encontrado.

150

A presença de PDI parece ter diminuído ligeiramente a afinidade entre TR e

SRC1, aumentando a Kd de 0,3 para 0,6 M. Entretanto existem dois pontos a serem

discutidos. Primeiramente, nós consideramos que ambas as curvas, sem e com PDI,

apresentaram afinidades bem próximas, nas quais os erros encontrados podem ser

considerados relevantes. E em segundo lugar, de acordo com os valores obtidos,

vemos que a presença de PDI não afeta o recrutamento de um peptídeo coativador.

Ou seja, isso indica que SRC-1 consegue se ligar à interface clássica de ligação a

coativadores do TR, mesmo na presença de PDI.

Entretanto, é importante ressaltar que, como a construção usada foi a de um

peptídeo coativador, a interação entre TR e SRC1 ainda possa ser alterada pela

presença de PDI, caso estivéssemos usando a proteína inteira.

4.5.4 Knockdown de PDI seguido de qPCR

Com o objetivo de entender melhor o papel fisiológico do complexo PDI-TR,

decidimos investigar por meio de qPCR as diferenças de expressão em genes

regulados diretamente por TR+T3 na presença e ausência da PDI. Nosso grupo

colaborador do Houston Methodist Research Institute, dirigido pelo Dr. Paul Webb,

já havia pesquisado os diferentes genes regulados por TR na presença e ausência de

T3 em um trabalho recente (LIN et al., 2013). Nesse trabalho, os autores mostram as

diferenças na regulação de genes encontradas para as isoformas de TR. Ou seja,

apesar de semelhantes em estrutura, as isoformas têm funções completamente

distintas. Para isso, foram produzidas linhagens de Hep-G2 com expressão estável de

TRα ou TRβ, em seguida, a expressão de genes regulados por T3 com a linhagem

parental HepG2 foram comparadas.

A partir dos genes considerados como regulados por TR+T3, evidenciados no

trabalho de LIN et al. (2013), selecionamos 5 genes. Usamos esses dados de

regulação para observar se o knockdown da PDI afetaria a transcrição desses genes.

Após os knockdowns de PDI nas linhagens Hep-TR, analisamos a expressão dessa

proteína por WB (FIGURA 54) e por qPCR (Tabela 16).

151

FIGURA 54. Knockdown de PDI em linhagem celular Hep-TR com e sem T3. A. Western blot anti-P4HB e anti-beta actina. Linhagens Hep-TR e Hep-TR foram transfectadas com siRNA controle e P4HB siRNA. Após duas transfecções consecutivas seguidas de novos plaqueamentos, aguardamos 72h para coletar e lisar as células para avaliar a presença de PDI por WB. O knockdown se mostrou muito efetivo em nível proteico. Não observamos bandas de PDI nas amostras que sofreram o knockdown. Para as amostras tratadas com T3, adicionamos o hormônio 12h antes da coleta; B. Gráfico mostra a quantificação das bandas de WB de PDI em relação à beta-actina. Essa quantificação foi feita usando como base o WB das células Hep-TRs sem T3.

Tabela 16. Porcentagem de knockdown do gene P4HB em linhagens Hep-TR.

Linhagem Sem T3 Com T3

Hep-TR 99.76% 97.34%

Hep-TR 98.99% 99.41%

Após a análise por qPCR da PDI observamos um knockdown de mRNA de

aproximadamente 97% para a linhagem Hep-TR+T3, e de 99% para as linhagens

Hep-TR, Hep-TR+T3 e Hep-TR (Tabela 16). Já o knockdown de proteína foi

confirmado por WB e quantificado por análise de densitometria das bandas (FIGURA

54-A). De acordo com o WB e quantificações, podemos observar um resultado

próximo ao que poderia ser considerado knockout da proteína.

Seguimos então, para a análise por qPCR com primers para os seguintes

genes: PCK1, ALP1, MYH6, FURIN e HIF2A. Estes genes foram escolhidos devido a

alta regulação que sofrem pelo receptor TR com T3 (LIN et al., 2013). Primeiramente

vamos apresentar aqui as funções e detalhes sobre cada gene escolhido para o

experimento de qPCR (Tabela 17). Infelizmente para os genes PCK1 e ALP1 não

obtivemos resultados satisfatórios nos controles experimentais, nos quais a

presença de T3 deveria aumentar a expressão destes genes. Por isso, aqui

152

apresentamos os resultados apenas dos genes nos quais o hormônio T3 aumentou a

transcrição, juntamente com PDI em concentrações endógenas normais (condição

siRNA controle) (FIGURA 55).

Tabela 17. Genes regulados por TR+T3 utilizados no qPCR e sua respectivas funções segundo GeneCards (SAFRAN et al., 2010; SAFRAN; SOLOMON, 2002).

Gene Nome Função [GeneCards]

Myh6 Miosina cardíaca de cadeia pesada (Myosin Heavy Chain 6 Cardiac Muscle α)

A proteína miosina do músculo cardíaco é um hexâmetro composto de 2 subunidades de cadeia pesada, 2 subunidades de cadeia leve e 2 subunidades regulatórias. Doenças associadas com MYH6 incluem: cardiomiopatias dilatadas myh6-relacionadas, e cardiomiopatias familiais hipertróficas myh6-relacionadas. Entre as vias relacionadas ao MYH6 temos a via RhoGDI e a PAK. As anotações para esta proteína segundo o GeneOntology, incluem proteína ligante de quinase e atividade ATPase.

Furin Furin O gene Furin codifica a formação de uma proteína membro da família de proteases que processam precursores de proteínas e peptídeos que trafegam através da via secretória da célula. A proteína produzida pelo Furin é uma protease tipo 1 ligada à membrana que é expressa em muitos tecidos como neuroendócrino, fígado, intestino e cérebro. O produto desse gene é um dos 7 membros específicos de aminoácidos básicos e é responsável por clivar substratos em resíduos simples ou pareados. Alguns desses substratos são o paratormônio, precursor do TGF-β, proalbumina, pro-β-secretase, matriz metaloproteinase tipo 1 de membrana, β subunidade do Fator de crescimento pro-nervo e fator vo Willebrand. Doenças associadas a esse gene incluem a influenza aviária e demência familiar tipo-britânica. Entre as vias em que está envolvida, temos: sinalização por GPCR e Biologia do Desenvolvimento. Segundo o GeneOntology, as anotações específicas desse gene incluem atividade endopeptidase e atividade endopeptidase inibidora em serinas

Hif2a Epas1 – Proteína 1 endotelial com domínio PAS (Endothelial PAS Domain Protein 1)

Gene que codifica um fator de transcrição envolvido na indução de genes regulados pela queda dos níveis de oxigênio. A proteína contém um domínio básico hélice-loop-hélice responsável por heterodimerização, assim como um domínio encontrado em proteínas vias de transdução de sinais que respondem a níveis de oxigênio. Mutações nesse gene estão associadas à eritrocitose familiar tipo-4. Doenças relacionadas a EPAS1 incluem a policitemia secundária autossômica dominante e feocromocitoma esporádica. Entre as vias nas quais EPAS1 participa temos a Biologia do Desenvolvimento e Câncer. Esse gene está relacionado à estas anotações, segundo o Gene Ontology: fator de transcrição, ligação à sequencias de DNA específicas, e heterodimerização com outras proteínas

153

FIGURA 55. Knockdown de PDI seguido de qPCR em Células Hep-TR (Hep-G2 transduzidas com TR ou TR). A. Gene Hif2a. Em condições de knockdown de PDI (PDI siRNA), existe um aumento na transcrição do gene. PDI parece reprimir a transcrição do gene quando presente. Isso acontece em ambas isoformas de TR; B. Gene Myh6. Em condições de knockdown de PDI (PDI siRNA), existe um aumento na transcrição do gene. PDI atua de forma similar à Hif2a, reprimindo a transcrição do gene para ambas isoformas de TR; C. Gene Furin. O knockdown da PDI não afeta de forma significativa a expressão deste gene. (*, P <0.05), Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes ). Esses gráficos são uma média de 3 experimentos independentes analisados por one-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni.

Para o gene Hif2a (FIGURA 55-A), o knockdown de PDI afeta a regulação do

gene da mesma forma em ambas isoformas de TR, aumentando de 2 a 3x a

expressão do mRNA do Hif2a, na ausência de T3, em relação ao controle (ctrl si-

RNA). Já na presença de T3, o knockdown de PDI provoca um aumento de cerca de

154

6x em Hep-TR, e em torno de 10x em Hep-TR, em relação ao respectivo controle

(ctrl si-RNA) sem hormônio.

O knockdown de PDI, na ausência de T3, afetou a regulação do gene Myh6 de

forma a aumentar a transcrição em torno de 5x em Hep-TR, e em torno de 2 a 3x

em Hep-TR (FIGURA 55-B). No entanto, na presença de T3, o knockdown de PDI

afetou a regulação do gene Myh6 de forma a aumentar a transcrição em torno de

12x em Hep-TR, e em torno de 10x em Hep-TR, em relação ao respectivo controle

(ctrl si-RNA) sem hormônio. Apesar desse gene apresentar regulação diferenciada

entre as isoformas de TR, o que reflete em diferentes proporções de regulação da

PDI sobre o mesmo, podemos observar que o knockdown de PDI aumenta a

transcrição de Myh6, sendo que esse efeito é evidenciado na presença de T3.

De maneira geral, nossos resultados indicam que, para genes como Hif2A

(FIGURA 55-A) e Myh6 (FIGURA 55-B) que se comportam se forma similar, a

transcrição dos genes aumenta com T3, como era de se esperar. A partir do

momento que PDI não está mais presente (PDI siRNA; knockdown), a transcrição do

gene aumenta em ambas condições, com e sem T3. Verificamos aqui, nesses dois

genes, o primeiro indício de que PDI pode estar atuando na regulação da transcrição

como proteína repressora da transcrição, de forma que a sua ausência aumenta

tanto a transcrição basal, quanto a ativação por T3, em ambas isoformas de TR.

Embora esses dados estejam em desacordo aos dados obtidos na transativação com

gene repórter, vamos discutir posteriormente o que essas diferenças representam e

como podem ser explicadas.

Entretanto, para o gene Furin, o knockdown da PDI (PDI siRNA) não afeta a

transcrição, já o T3, como esperado, aumenta a transcrição do gene nas duas

isoformas de TR (FIGURA 55-C). Só foi possível observar um pequeno aumento da

transcricao na condicao TRβ+T3 sem PDI, porém pouco significativo.

Por fim, através do qPCR, obtivemos indicícios que talvez PDI regule de forma

diferente cada gene regulado por TR, e que existem diferenças para cada isoforma

de TR.

155

4.5.5 Estudos Estruturais in silico TR:PDI

Por fim decidimos investigar qual seria a interface de interação entre TR e

PDI, cujo modelo foi construído por homologia (FIGURA 56-A). De acordo com o

estudo feito por docking molecular e, após a avaliação dos complexos mais

energeticamente favoráveis, obtivemos alguns modelos de interação possíveis

(FIGURA 56-B, C e D).

O docking do TRαLBD em PDI apresentou dois modelos possíveis de interação

com a PDI (Modelo I e Modelo II). O Modelo I apresenta o TRα encaixado na

estrutura em “U” da PDI, no qual a alca do seu dominio hinge interage com o bolsão

hidrofóbico do dominio b’ da PDI e a hélice H12 do TRα não faz qualquer contato

com os domínios da PDI (FIGURA 56-B). No Modelo II, o TR apresenta

posicionamento semelhante ao que obtivemos para o TRβ (FIGURA 56-C).

Nesse modelo, ambos os TRs (FIGURA 56-C e D) se encaixam na estrutura em forma

de “U” formada pelos quatro dominios da PDI, e a hélice H12 de cada TR está em

contato com o domínio a da PDI (FIGURA 56-C). Diferentemente da posição

ilustrada no Modelo I descrito para o TRα (FIGURA 56-B), o domínio hinge dos TRs,

no Modelo II, não faz qualquer contato com a PDI.

Um aspecto interessante no Modelo II é a proximidade entre as cisteínas

catalíticas do domínio a da PDI (Cys53 e Cys56) e as cisteínas (Cys294 e Cys298),

localizadas entre as hélices H3 e H4 do TRβ (FIGURA 56-D). Pose semelhante foi

observada no Modelo II do TR, porém nesse modelo não existe proximidade entre

pares de cisteínas, uma vez que a isoforma possui apenas uma cisteína entre as

duas hélices (Cys244, mesma posicao que a Cys298 de TRβ).

156

FIGURA 56. Docking TR:PDI. A. Modelo de PDI humana com os quatro domínio a, b, b’, e a’, mostrando em vermelho as cisteínas catalíticas. B. Modelo I de docking entre PDI (cinza) e TRLBD (verde). Em azul esta indicado parte do hinge do TR, fazendo contato direto com o domínio b’ da PDI. C. Modelo II de docking entre PDI (cinza) e TRLBD (verde). Em vermelho, as cisteínas do domínio a da PDI fazendo contato com a cisteína das hélices H3 e H4 do TR. D. Modelo II de docking entre PDI (cinza) e TRLBD (amarelo). Em vermelho, as cisteínas do domínio a da PDI fazendo contato com as cisteínas das hélices H3 e H4 do TR. D. Aproximação do ponto de contato entre PDI (cinza) e TRLBD (amarelo). O modelo II de docking mostra as cisteínas 53 e 56 (vemelho) do domínio a de PDI próximas das cisteínas 294 e 298 (vemelho) de TR.

157

Verificando esse posicionamento possível para ambas isoformas (FIGURA 56-

C e D), juntamente com nossos dados de experimentos em células, poderíamos

explicar que PDI é capaz de regular especificamente alguns genes específicos através

de TR, sugerindo que essa regulação possa ocorrer através de mecanismos redox. De

fato, a literatura mostra que PDI é capaz de regular um fator de transcrição Ref-1,

através de mecanismos redox (HASHIMOTO; IMAOKA, 2013). Ou seja, os autores

demonstram através de ensaios in vitro e in vivo que PDI inibe a ativação de Ref-1,

oxidando os resíduos de cisteína presentes nesse fator de transcrição. Com isso,

sugerimos que o mesmo mecanismo pode ocorrer com TRβ.

Entretanto, verificamos também uma pequena diferença nos ensaios de

anisotropia com o peptídeo coativador SRC1, no qual PDI parece diminuir

ligeiramente a afinidade do complexo pelo SRC1. Uma hipótese que explicaria essa

diferença, baseada no posicionamento encontrado nos ensaios de docking, seria que

PDI poderia modificar ou se ligar aos TRs de forma a alterar ou atrapalhar o

recrutamento de correguladores, com isso, a transcrição de genes poderia ser

ativada ou reprimida. Outro ponto importante a se discutir é sobre as diferenças de

regulação encontradas entre as isoformas de TR nos ensaios de gene repórter e

qPCR. De acordo com as posicões possiveis encontradas para a isoforma α no

docking, principalmente com relação ao posicionamento no Modelo II (FIGURA 56-C

e D), podemos concluir que talvez PDI tenha uma função relevante apenas na

regulacao de genes para TRβ, através da modificacao das duas cisteinas livres, o que

nao ocorre para a única cisteina do TRα. Com isso concluímos que em ambos os

casos, PDI consegue se acoplar aos TRs e assim modificar esses receptores

resultando em regulações diferenciadas na transcrição de genes.

4.6 Discussão e Conclusões sobre a regulação de genes por TR e PDI

Após analise dos dados de qPCR e dados de transativação, observamos

algumas diferenças em relação à regulação de genes. Principalmente com relação à

ação da PDI nesses genes regulados por TR+T3.

158

Devido às diferenças encontradas entre o qPCR e os ensaios de transativação,

resolvemos investigar sob quais promotores estavam regulados os genes escolhidos

para o qPCR. No GeneCards, a partir do item ‘Genomics’, pesquisamos os sítios de

ligação de outros fatores de transcrição nos promotores de cada gene (Tabela 18).

Tabela 18. Genes e elementos responsivos regulados por TR e um resumo da ação do complexo PDI-TR nestes mesmos promotores

O gene Furin, pode ser regulado por AP-1, um dos fatores de transcrição que

sofrem regulação negativa pelo TR sem ligante (Tabela 18). Nossos dados de gene

repórter mostram que TR sem ligante junto com PDI, aumentam a transcrição de

Luciferase. Embora, por qPCR, não vemos o mesmo resultado para Furin, o qual não

parece ser regulado por PDI. Uma hipótese que levantamos se baseia na ideia de que

os promotores presentes na construção do plasmídeo de gene repórter e na

linhagem celular ou in vivo, sejam diferentes. De forma que existem muitos outros

elementos, além dos HREs, antes e depois da região promotora de um gene, que

obviamente não são clonados nos vetores dos genes repórteres.

Para os genes Myh6 e Hif2a observamos que o knockdown de PDI provocou

um aumento da transcrição do mRNA desses genes. Aumento que foi evidenciado

quando na presença de T3. Este aumento de transcrição na ausência de PDI não

corresponde aos resultados encontradas no experimento de transativação que

realizamos. No entanto, a análise do efeito da PDI na transativação foi observada nos

elementos responsivos AP-1 e F2, os quais não fazem parte dos elementos

regulatórios para os genes Myh6 e Hif2a. Como outros elementos estão envolvidos,

o comportamento da PDI na transcrição regulada por TR pode ser diferente da

observada nos experimentos de transativação. Observamos também que um outro

RN, o PPAR, pode regular o promotor de Myh6 e Hif2a (Tabela 18). Ou seja, pode

Furin Myh6 Hif2a A1 Luc F2 Luc

Principais Fatores de Transcrição Encontrados

AP-1; c-Jun; ATF-2; TBP;

YY1; GATA-1

YY1; aMEF-2;

HNF-42; HNF-

41; MEF-2A;

MEF-2; PPAR; c-Et-1.

PPAR2;

PPAR1; Sp1; HEN1;

HNF-1A; IRF-1; HNF-1

X X

Ação do complexo PDI

e TR

Não há diferença

PDI reprime o gene

PDI reprime o gene

TR sem T3 e PDI aumentam a transcrição

TR com T3 e PDI aumentam a

Transcrição

159

haver um cross-talk entre TR e PPAR nesse promotor como já mostrado na literatura

(ARAKI et al., 2005). Entretanto, não sabemos identificar e deduzir como PDI poderia

estar contribuindo para esse cross-talk. Uma possível explicação para esse resultado

é que Hif2a e Myh6 são regulados por promotores diferentes dos construídos nos

ensaios de gene repórter. Uma vez que a presença de PDI reprime a transcrição

(Myh6 e Hif2a) ao invés de aumentá-la (Luciferase em elemento F2), sugerimos

então, que existam outros reguladores da transcrição atuando com ou através dos

RNs nesse sítio.

Vale ressaltar que a PDI está envolvida com enovelamento oxidativo de

proteínas (função chaperona) e também proporciona a sobrevivência e progresso de

alguns tipos de câncer (XU; SANKAR; NEAMATI, 2014). Um artigo mostra que células

de carcinoma hepatocelular (HCC) expressam PDI em situação de hipóxia (YU et al.,

2012). Sabendo que a linhagem HepG2 é uma linhagem de carcinoma hepatocelular

de fígado, podemos pensar então em um possível papel da PDI como reguladora da

proliferação de células de câncer. E esta pode agir na regulação de genes como o

Hif2a, através de TR. Além disso, a atuação da PDI na regulação da transcrição do

gene Hif2a, que está envolvido na queda dos níveis de oxigênio celular, corrobora

dados já publicados do envolvimento da PDI com hipóxia celular (HASHIMOTO;

IMAOKA, 2013; LAURINDO; PESCATORE; DE CASTRO FERNANDES, 2012; XU; SANKAR;

NEAMATI, 2014; YU et al., 2012).

Outros trabalhos mostram que, a PDI, além de estar envolvida em estresse

oxidativo, pode estar relacionada à algumas patologias cardíacas (AMANSO; DEBBAS;

LAURINDO, 2011). Nossos dados demonstram que a ausência de PDI permite um

aumento na expressão do gene relacionado à miosina cardíaca de cadeia pesada

(Myh6). Sugerimos que deve existir uma relação importante entre o balanço da

presença de TR, PDI e a regulação do gene Myh6.

Além disso, foi demonstrado que a PDI possui dois sítios de ligação para o

hormônio T3, sendo que um deles é o mesmo sítio de ligação para o estradiol.

(PRIMM; GILBERT, 2001). Essa informação nos levou a sugerir a hipótese em que PDI

poderia estar atuando como um reservatório de hormônios, e sua função seria

então, transportar e entregar esses hormônios para os RNs como TR e ER.

Entretanto, refutamos essa hipótese em duas análises: (1) a presença do T3 não

160

afetou a afinidade entre TR:PDI nos ensaios de anisotropia de fluorescência; (2) a

regulação diferenciada de genes na presença e ausência de T3, identificada pelos

ensaios de qPCR e gene repórter.

E mais importante ainda, o trabalho de Hashimoto & Imaoka (2013)

(HASHIMOTO; IMAOKA, 2013) mostra que a superexpressão de PDI em células de

tumor pituitário (GH3), suprime a expressão do gene do hormônio de crescimento

que é estimulado por T3. Ou seja, assim como nossos dados apontam, a PDI

consegue atuar através de TR para reprimir a expressão de genes. E mais, esta

atuação está envolvida com a atividade dissulfeto oxidorredutase da PDI, na qual o

mutante de PDI não apresentou função na regulação do gene, o que comprova que a

atividade dissulfeto oxirredutase de PDI é essencial para a regulação de genes

através de TR (HASHIMOTO; IMAOKA, 2013). Então, como a PDI hora aumenta a

expressão, hora diminui a expressão de genes regulados por TR, o papel desta

proteína em cada elemento responsivo precisa ser melhor estudado. Mas nossos

experimentos indicam, e dados da literatura confirmam, que a presença ou ausência

de PDI pode provocar alterações na expressão de genes regulados por TR.

161

Capítulo 5. Conclusões e Perspectivas

162

5.1 Conclusões

Nossa busca por novas interações de TR com proteínas nos levou a um leque

de possibilidades de trabalho. A partir de ensaios feitos em y2h e IP-LC-MS/MS

chegamos a mais de 700 parceiros de interação, sendo que cerca de 80% dos

parceiros são considerados inéditos, de acordo com o banco de dados de Cytoscape.

Com o intuito de filtrar esses dados, utilizamos a literatura a nosso favor, de forma

que, em trabalhos publicados recentemente, TR parece exercer um função

importante e pouco conhecida em diversos tipos de câncer. Através de Softwares e

Plataformas de análise de dados, observamos que os parceiros de interação

encontrados estavam contidos, em grande parte e em diferentes amostras

analisadas, em processos biológicos relacionados ao Ciclo Celular. Além disso, dados

publicados em 2014, sobre parceiros de interação para as diferentes isoformas de TR

(dados de PRIVALSKY) também apontaram o envolvimento de TR com proteínas

presentes no mesmo processo biológico. Dessa forma, confirmamos por co-

imunoprecipitação, o envolvimento de TR com proteínas reguladoras do ciclo

celular, como: EBP1, SRPK1, CKIIα, ERK3 e PRMT5.

Em paralelo, identificamos um candidato de interação de TR envolvido em

mecanismos redox, uma dissulfeto isomerase, a PDI. A PDI além de mediar o

enovelamento oxidativo correto de proteínas, também proporciona a sobrevivência

e progresso de alguns tipos de câncer. Primeiramente comprovamos a co-

imunoprecipitação do complexo TR e PDI em células 293T. Em seguida, expressamos

e purificamos as proteínas PDI, TRα e TRβ, e caracterizamos o complexo por ensaios

biofísicos. Utilizamos gel filtração analítica e DLS para aferir os raios hidrodinâmicos

das proteínas sozinhas e em complexo, e observamos que o complexo TR:PDI possui

um raio razoavelmente maior o que indicaria a possível formação do complexo.

Medimos, em seguida, a afinidade entre as proteínas TR e PDI, através de ensaios de

anisotropia de fluorescência, o que indicou que TR é capaz de se ligar à PDI, e a

afinidade dessa ligação é ligeiramente maior entre a isoforma TR e PDI (Kd = 1 M),

do que, entre a isoforma e PDI (Kd = 2 M). Além disso, T3 nao apresentou efeitos

significativos na afinidade dos complexos. Investigamos, então, se a formação do

complexo alteraria a transcrição de genes regulada por TR. Observamos que a

163

superexpressão de PDI na presença de T3, aumenta a expressão de luciferase

regulada pelo elemento responsivo F2 em maior escala para o TR, se comparado à

isoforma . Já no elemento responsivo negativo AP-1, PDI superexpressa alterou

significativamente a regulação de TR, aumentando a transcrição basal da luciferase,

em um mecanismo de desrepressão do gene.

Além disso, investigamos se haviam diferenças na transcrição de genes, em

situação de knockdown da proteína PDI em linhagens de expressão estável de TR

(Hep-TR), através de análise por qPCR de genes regulados por TR+T3 (Myh6, Furin e

Hif2a). Para os genes Myh6 e Hif2a, a ausência de PDI permitiu que houvesse um

aumento na transcrição desses genes, na presença e ausência de T3. E para o gene

Furin, não observamos diferenças. O que mostra que PDI é uma reguladora

específica de alguns genes. Decidimos então, analisar se PDI alterava o recrutamento

de um coativador de TR, o SRC1, já que foram observados efeitos em regulações de

genes. Nossos dados de anisotropia de fluorescência mostraram que PDI altera

ligeiramente a afinidade entre TR+T3:CoA, aumentando o Kd de 0,3 para 0,6. Apesar

dos erros e da proximidade de valores, sugerimos que talvez maiores diferenças

seriam visíveis em estudos utilizando uma construção mais completa de SRC1.

Também observamos que as proteínas sozinhas ou em complexo, não apresentaram

grandes diferenças de termo-estabilidade na presença da PDI. Com isso, concluímos

que o complexo é estável tanto quanto as proteína sozinhas. De fato, um trabalho

publicado em 2013, mostra PDI regulando Ref-1, através de sua atividade dissulfeto

isomerase em cisteínas livres presentes nessa proteína. Por isso decidimos construir

modelos estruturais dessa interação utilizando docking molecular. Nesses modelos,

observamos TR interagindo com PDI, através de resíduos catalíticos presentes

nesta proteína. Esses resíduo fazem contato próximo com as císteinas de TR, o que

corrobora com os dados encontrados para Ref-1.

Por fim, concluímos que TRs podem interagir com uma gama de proteínas

celulares, o que resulta em muitas funções novas e pouco estudadas para esse

receptor. Funções essas que podem ir desde a regulação de ciclo celular através de

cascatas e complexos de sinalização, até formas inéditas de regulação de genes.

Nesse caso, sugerimos que talvez as cisteínas livres de TR poderiam ser

164

transformadas pela PDI em ligações dissulfeto, que por sua vez poderiam alterar a

estrutura e função desse receptor, resultando em regulação diferenciada de genes.

5.2 Perspectivas

Após a realização de ensaios para busca de novas interações para os TRs,

encontramos diversas proteínas inéditas. Essa gama de interações pode ser

estudada uma a uma, através de Co-imunoprecipitações, co-localização celular,

ensaios de pull-down, entre outros métodos, capazes de comprovar que o complexo

é formado em células. Em seguida, o complexo encontrado pode ser analisado

utilizando técnicas biofísicas, como as utilizadas neste projeto para o complexo

TR:PDI.

Outras perspectivas envolvem um estudo mais aprofundado do complexo

TR:PDI, como co-cristalização e análise por cristalografia da interface de interação;

novos ensaios de anisotropia de fluorescência; contrução de mutantes de TR (nas

cisteínas Cys294 e Cys298) e PDI (nas cisteínas catalíticas) e nova verificação da

regulação de genes (gene repórter luciferase). Além disso, estudos funcionais in vivo

mostrariam a relevância da formação desse complexo.

165

Capítulo 6. Elementos Pós-textuais

166

6.1 Referências ALYUSUF, R. H. et al. The pattern of expression and role of triiodothyronine (T3) receptors and type I 5’-deiodinase in breast carcinomas, benign breast diseases, lactational change, and normal breast epithelium. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry, v. 22, n. 7, p. 518–23, ago. 2014. AMANSO, A. M.; DEBBAS, V.; LAURINDO, F. R. M. Proteasome inhibition represses unfolded protein response and Nox4, sensitizing vascular cells to endoplasmic reticulum stress-induced death. PloS one, v. 6, n. 1, p. e14591, jan. 2011. ANDRADE, M. A. et al. Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using an unsupervised learning neural network. “Protein Engineering, Design and Selection”, v. 6, n. 4, p. 383–390, 1993. ARAKI, O. et al. Thyroid hormone receptor beta mutants: Dominant negative regulators of peroxisome proliferator-activated receptor gamma action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 102, n. 45, p. 16251–6, 2005. ARANDA, A. et al. Thyroid receptor: roles in cancer. Trends in endocrinology and metabolism: TEM, v. 20, n. 7, p. 318–24, set. 2009. ARANDA, A; PASCUAL, A. Nuclear hormone receptors and gene expression. Physiological reviews, v. 81, n. 3, p. 1269–304, jul. 2001. ARDAIL, D. et al. Evidence for the presence of alpha and beta-related T3 receptors in rat liver mitochondria. European journal of cell biology, v. 62, n. 1, p. 105–13, out. 1993. ASHBURNER, M. et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics, v. 25, n. 1, p. 25–29, 2000. BAKOVIC, M.; FULLERTON, M. D.; MICHEL, V. Metabolic and molecular aspects of ethanolamine phospholipid biosynthesis: the role of CTP:phosphoethanolamine cytidylyltransferase (Pcyt2). Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire, v. 85, n. 3, p. 283–300, 2007. BARLOW, C. et al. Thyroid abnormalities and hepatocellular carcinoma in mice transgenic for v-erbA. EMBO Journal, v. 13, n. 18, p. 4241–4250, 1994. BECK-PECCOZ, P.; CHATTERJEE, V. K. The variable clinical phenotype in thyroid hormone resistance syndrome. Thyroid : official journal of the American Thyroid Association, v. 4, n. 2, p. 225–32, 1994. BERGMANN, A. Survival Signaling Goes BAD. Developmental Cell, v. 3, n. 5, p. 607–608, 2002. BERMAN, H.; HENRICK, K.; NAKAMURA, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology, v. 10, n. 12, p. 980–980, dez. 2003. BERRODIN, T. J. et al. Heterodimerization among thyroid hormone receptor, retinoic acid receptor, retinoid X receptor, chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor, and an endogenous liver protein. Molecular endocrinology (Baltimore, Md.), v. 6, n. 9, p. 1468–78, 7 set. 1992. BONETTA, L. Protein–protein interactions: Interactome under construction. Nature, v. 468, n. 7325, p. 851–854, 9 dez. 2010. BOURGUET, W. et al. Crystal structure of the ligand-binding domain of the human nuclear receptor RXR-α. Nature, v. 375, n. 6530, p. 377–382, 1995. BOURGUET, W.; GERMAIN, P.; GRONEMEYER, H. Nuclear receptor ligand-binding domains: three-dimensional structures, molecular interactions and pharmacological implications. Trends in pharmacological sciences, v. 21, n. 10, p. 381–8, out. 2000. BRENT, G. A. Mechanisms of thyroid hormone action. Journal of Clinical Investigation, v. 122, n. 9, p. 3035–3043, 4 set. 2012. BRÜCKNER, A. et al. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biologyInternational Journal of Molecular Sciences, 2009. BRUHN, M. A. et al. Second AKT: the rise of SGK in cancer signalling. Growth factors (Chur, Switzerland), v. 28, n. 6, p. 394–408, 2010. BUGGE, T. H. et al. RXR alpha, a promiscuous partner of retinoic acid and thyroid hormone receptors. The EMBO journal, v. 11, n. 4, p. 1409–18, abr. 1992. BUNN, C. F. et al. Nucleocytoplasmic shuttling of the thyroid hormone receptor alpha. Molecular endocrinology (Baltimore, Md.), v. 15, n. 4, p. 512–33, 2 abr. 2001. CAELLES, C.; GONZÁLEZ-SANCHO, J. M.; MUÑOZ, A. Nuclear hormone receptor antagonism with AP-1 by inhibition of the JNK pathway. Genes & development, v. 11, n. 24, p. 3351–3364, 1997. CAO, H. J. et al. Cytoplasm-to-nucleus shuttling of thyroid hormone receptor-beta1 (Trbeta1) is

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6.2 Termo de aprovação da pesquisa pela Comissão de Bioética e/ou Biossegurança

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6.3 Declaração de que a dissertação ou tese não infringe os dispositivos da lei nº 9610/98, nem o direito autoral de qualquer editora