TESTOWANIE TECHNOLOGII PRODUKCJI PSTRĄGA STOSOWANYCH W POLSCE W ŚWIETLE ROZPORZĄDZENIA KOMISJI (WE) NR 710/2009 – ŚRODOWISKOWA I PROZDROWOTNA OPTYMALIZACJA PRODUKCJI

01. 03. 2014 r. – Darłowo

TECHNOLOGIE CHOWU I HODOWLI PSTRĄGA TĘCZOWEGO A KSZTAŁTOWANIE SIĘ MECHANIZMÓW ODPORNOŚCI

Elżbieta Terech-Majewska Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

Czynniki biologiczne

Wirusy, bakterie, grzyby, pasożyty Zagrożenie jest skorelowane:

głównie ze zmianami w środowisku, brakiem kontroli, brakiem higieny

w warunkach hodowlanychułatwionym kontaktem ryb i możliwością bezpośredniego przenoszenia tych czynników

Zakres badańBadania kliniczne i anatomopatologicznebakteriologiczne i wirusologiczneimmunologiczne i biochemiczne

Każdorazowo zastosowano premedykację przed rozpoczęciem badań

zanurzenie w roztworze Propiscinu (IRS) w stężeniu 1 ml preparatu/litr wody

We wszystkich gospodarstwach o systemie OOH i RAS izolowano głównie saprofityczną, warunkowo chorobotwórczą florę bakteryjną,

Aeromonas sp. i Pseudomonas sp., występującą w wodach otwartych, na powłokach zewnętrznych ryb hodowlanych i wolnożyjących.

W gospodarstwie 3-OOH u ryb S i D oraz 2-RAS u ryb S i D stwierdzono na wiosnę 2012 r. obecność bakterii Aeromonas salmonicida, które są czynnikiem etiologicznym furunkulozy u ryb łososiowatych.

Ogółem izolowano 16 rodzajów czynników bakteryjnychczęstotliwość izolowania była zróżnicowana w zależności

od rodzajów gospodarstw. W próbkach z gospodarstw w systemach RAS

nie stwierdzono Vibrio fluvialis, natomiast w OOH nie stwierdzono Pasteurella pneumotropica.

WYNIKI

W Polsce największe znaczenie w patologii ryb hodowlanych mają mezolfilne, ruchliwe bakterie Aeromonas sp. (grupa fenotypowa Aer. hydrophila complex, Aer. sobria complex), psychrofilne Aer. salmonicida, różne gatunki Pseudomonas sp. i Flavobacterium sp., Shewanella putrefaciens, Yersinia ruckeri

W ostatnich latach notowane są przypadki zakażeń Acinetobacter sp., Citrobacter freundi, Hafnia alvei, Mycobacterium sp., Lactococcus sp., Pseudomonas chlororaphis, Streptococcus sp.

Badania wirusologiczneProwadzono w kierunku VHS, IHN, IPN i Herpes

SAlHV-2.

Materiał do badań stanowiły wycinki skrzeli, nerki, śledziony, wątroby oraz mózgu, które pobierano jałowo do pojemników transportowych i przetrzymywano w stanie zamrożenia (-20 C).

Izolację wirusów prowadzono metodami biologicznymi, a identyfikację (materiału genetycznego) wirusów wykonywano metodami molekularnymi PCR i Nested-PCR wg procedur stosowanych w ZPiIR IRS i zalecanych przez laboratoria referencyjne.

Dla oceny sprawności układu immunologicznego wybrano te wskaźniki, które umożliwiają ocenę naturalnych procesów, istotnych dla obrony przed szkodliwymi czynnikami środowiska

Ocena poziomu nieswoistej odporności humoralnejaktywność lizozymu w surowicy z użyciem bakterii

Micrococcus lysodeikticus poziom białka całkowitego w surowicy metodą

biuretową przy zastosowaniu zestawu Diagnostic Kits – Protein Total Reagents (Sigma)

poziom gamma-globulin z użyciem metody biuretowej (zestaw Diagnostic Kits – Protein Total Reagents - Sigma) oraz glikolu polietylenowego 10000 (Sigma)

poziom ceruloplazminy białek ostrej fazy kortyzolu laktoferyny

Oceny poziomu nieswoistej odporności komórkowej

RBA (Respiratory Burst Activity) – zdolność do wewnątrzkomórkowego wybuchu tlenowego, izolowanych z krwi oraz ze śledziony leukocytów, zawieszanych w gradiencie Gradisol G (Polfa), oznaczono za pomocą metody spektrofotometrycznej po stymulacji komórek PMA (Phorbol Myristate Acetate),

PKA (Potential Killing Activity) – aktywność bójcza fagocytów krwi oraz makrofagów izolowanych ze śledziony zawieszanych w gradiencie Gradisol G (Polfa), oznaczano przy użyciu metody spektrofotometrycznej, po stymulacji komórek bakteriami Aeromonas hydrophila,

LyP - odpowiedź proliferacyjna limfocytów T (LyTP) stymulowanych konkanawaliną A (ConA, Sigma) oraz limfocytów B (LyBP) stymulowanych lipopolisacharydem (LPS) przy użyciu metody MTT, limfocyty krwi oraz ze śledziony izolowano po wirowaniu komórek w gradiencie Gradisol L (Polfa).

Na odporność nieswoistą wpływa

temperatura- wzrastająca wpływa na wzrost poziomu lizozymu w surowicy, koncentrację IgM, a także ekspresję molekuł i cytokin;

długość dnia świetlnego i pora roku - wzrost poziomu lizozymu i IgM w surowicy (wiosna);

stres- czynniki stresogenne, t.j. zanieczyszczenie środowiska, stopień natlenienia wody, nadmierne zagęszczenie ryb, transport, a nawet obsługa.

Najwyższy potencjał odporności komórkowej i humoralnej stwierdzono w gospodarstwie 1-OOH we wszystkich okresach badawczych

zarówno w 2011 r. jak i 2012 r.

11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.20120

10

20

30

40

50

60

70

Aktywność lizozymu w różnych pobraniach u ryb z Gr S i Gr D w gosp. OOH 1

Gr S Gr D

Terminy pobrań

Liz

ozy

m m

g/l

11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.20120

20

40

60

80

100

Aktywnosć ceruloplazminy w różnych pobraniach próbek u ryb z Gr S i Gr D w gosp. OOH 1

Gr S Gr D

Terminy pobrań

Po

zio

m

ceru

lop

lazm

iny

(IU

)

3-OOH i 3-RAS

Statystycznie istotne obniżenie aktywności komórkowych mechanizmów obronnych

u ryb D i S w dwóch gospodarstwach 3-OOH i 3-RAS, gdzie stwierdzono w 2011 r.

w dwóch okresach badawczych obecność wirusa IPN

IPN

ma silne działanie obniżające aktywność fagocytów krwi i makrofagów oraz limfocytów T i B, czego wynikiem jest obserwowane obniżenie aktywności lizozymu.

11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.201205

1015202530354045

Aktywność lizozymu w różnych pobraniach od ryb w Gr S i Gr D z gosp. OOH 3

Gr S

Gr D

Terminy pobrań

Liz

ozy

m m

g/l

11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.20120

10

20

30

40

50

Aktywność lizozymu w róznych pobraniach od ryb z Gr S i Gr D w gosp. RAS 3

GR S

GR D

Terminy pobrańLiz

ozy

m m

g/l

11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.20120

102030405060708090

Aktywność ceruloplazminy w róznych pobraniach od ryb z Gr S i Gr D w gosp. OOH 3

Gr S Gr D

Terminy pobrań

PO

zio

m

ceru

lop

lazm

iny

(IU

)

11.2010 05-06.2011 10-11.2011 05-06.20120

102030405060708090

Aktywnośc ceruloplazminy w różnych pobraniach od ryb z Gr S i Gr D w gosp. RAS 3

Gr S Gr D

Terminy pobrań

Ceru

lop

lazm

ina (

IU)

W okresie wiosennym 2011 roku statystycznie istotny wzrost aktywności ceruloplazminy, białka ostrej fazy, co jednoznacznie wskazuje

na aktywację hepatocytów związaną z infekcją wirusową

Poziom białka całkowitego oraz Ig był zbliżony zarówno u ryb z gospodarstw OOH jak RAS

Jedynie obserwowano statystycznie istotny spadek białka całkowitego w okresie badań jesiennych u ryb z gospodarstw 3-OOH i 3-RAS, gdzie stwierdzono obecność wirusa IPN

Na podstawie uzyskanych wyników badań nie stwierdzono istotnych różnic w parametrach nieswoistej odporności komórkowej i humoralnej u pstrągów tęczowych pochodzących ze zróżnicowanych systemów chowu OOH i RAS,

Wysoki potencjał odporności przeciwzakaźnej nie pozwalał na pojawienie się objawów chorobowych u badanych ryb.

Stwierdzenie obecności wirusa IPN pozwoliło na obiektywną ocenę jego wpływu na komórkowe i humoralne mechanizmy obronne w gospodarstwach o odmiennych systemach chowu.

BirnaviridaeAquabirnavirus, wirus zakaźnej martwicy trzustki Infectious pancreatis necrosis - IPN

izolowany jest od 33 rodzin ryb, 11 gatunków mięczaków, 4 rodzin skorupiaków;

powszechne jest nosicielstwo; pierwsza izolacja w 1960 r. w USA (1941 r.);Chorobę stwierdza się w USA, Kanadzie, w krajach Płn.

i Płd. Europy (Norwegia, Szkocja, Hiszpania, Grecja, Turcja, także Polska), w krajach Płd. Ameryki (Meksyk, Chile), a także w Japonii.

Antychowicz 2008 - badania prowadzone w PIWet-PIB w Puławach

Gatunki ryb wrażliwe na IPNV: pstrąg tęczowy

(Oncorhynchus mykiss);

pstrąg źródlany (Salmo fontinalis);

pstrąg potokowy (Salmo trutta morpha fario L.);

łosoś bałtycki (Salmo salar);

troć wędrowna (Salmo trutta m. trutta).

Inne gatunki to: halibut, węgorz, danio * danio

pręgowane , a także małże i skorupiaki.

Birnaviridae

Budowa wirionu Birnavirusa:

kwas nukleinowy w formie dsRNA;

kapsyd białkowy;nie posiadają

otoczki.

Wirion ma kształt kulisty i wykazuje symetrię ikozaedralną, tzw. T13;

Średnica cząsteczki wirusa wynosi 60 nm.

Funkcje białek wirusowych

Część A genomu (większa 3092 pz) - koduje 4 białka VP2, VP3, VP4 (NS), VP5

Część B genomu (mniejsza 2784 pz) koduje cząstkę VP1

VP1 jest największym białkiem wirusa, polimeraza, nie jest związana z wirulencją.

VP-2 jest białkiem głównego kapsydu białkowego, to antygen grupowo swoisty. VP-2 i VP-3 są ze sobą związane. Nie posiadają one epitopów wiążących przeciwciała na IPNV.

VP4 czyli NS (non structure) funkcjonuje jako koenzym współgrający z enzymami komórki gospodarza, co służy namnożeniu wirusa.

VP 5 białko antyapoptotyczne.

Wirus jest bardzo trudny do sklasyfikowaniagenotyp nie równa się serotypowi,niepatogenne serotypy IPNV mogą być serologicznie

identyczne z formami patogennymi (w testach SN) Od 1988 r., uznaje się 3 serogrupy (A-C)

wraz ze swoimi serotypami, Grupa I (A) obejmuje wirusy patogenne dla ryb

(9 serotypów A1-A9) Sp, Ab, He, Te, Can1, Can2, Can3, Jasper, VR-299, są od siebie dość odległe serologicznie.

Grupa II (B) tzw. TV- od Tellina virus, od mięczaka Tellina tennis dotyczy mięczaków.

Grupa III (C) to wszystkie wirusy IPN - podobne

Udało się wydzielić 6 genogrup i przyporządkować je pochodzeniu geograficznemu oraz klasyfikacji serologicznej

Stwierdza się duże zróżnicowanie i zmienność w budowie antygenowej, zjadliwości oraz patogenności badanych szczepów wirusa IPN

Budowa molekularna zmienia się, genom ulega mutacjom, co także determinuje cechy patogenności

Źródła zakażenia wirusem IPN:Woda – główny wektor

Ptaki wodne: wykazano, że wirus IPN może być przenoszony na pazurach i dziobach ptaków oraz za pośrednictwem upuszczonych przez nie zakażonych ryb;

Ssaki wodne, a także inne, które współprzebywają w gospodarstwie;

Kał ptaków (IPNV jest oporny na działanie niskich pH);

Zaschnięty śluz ryb, którym pokryty jest sprzęt rybacki.

Źródła zakażenia wirusem IPNProdukty płciowe

IPNV może się znajdować na zewnątrz lub wewnątrz komórek płciowych ,u pstrąga tęczowego i źródlanego jest potwierdzony mechanizm (u pstrąga tęczowego także w nasieniu),

Wydzieliny wyrostków pylorycznych, trzustki oraz nerki (wydalany do środowiska),

Wirus IPN jest uwalniany do środowiska po rozkładzie zwłok śniętych ryb,

IPNV przeżywa w leukocytach krwi i w nerce (ochrona przed niszczeniem przez UI gospodarza.

IPNV jest stabilny i bardzo oporny na warunki środowiskowe:

W temp. 20 ºC może przetrwać w wodzie maksymalnie 3 miesiące

W temp. 10 ºC do 231 dni, (słonej także)

Oporny na wysuszenie: w temp. między 4 ºC a 20 ºC wysuszone i przetrzymywane w laboratorium próbki wirusa wykazywały właściwości zakaźne ponad 20 dni

Szczególnie długo przeżywa w rybach, np. w martwym pstrągu w temp. -20 ºC zachowuje właściwości infekcyjne ponad dwa lata

Objawy IPN:

korkociągowe ruchy w czasie pływaniawytrzeszcz gałek ocznychobrzęk jamy brzusznejbladość skrzeliwybroczyny w trzustceobrzęk okolicy odbytunitkowaty galaretowaty kalnieprawidłowe stężenie chlorków we krwizmiany martwicze trzustki i jelitamartwica wątroby (narybek słodkowodny)

PatogenezaWirus wnika do organizmu przez układ pokarmowy,

- „lubi” kwaśne pH (pierwotne miejsce namnażania wirusa,

stany zapalne, od nieżytu do krwotocznego zapalenia jelit i martwicy.

Wybroczyny lub rozległe przekrwienia w okolicy odźwiernika i wyrostków pylorycznych.

Wirus wędruje z krwią do nerki, trzustki oraz mięśni. Apoptoza, z wyjątkiem trzustki,hamując apoptozę w trzustce, wirus zyskuje czas na

namnożenie się, po namnożeniu wirusa rozwija się wywołana apoptozą martwica narządu.

Wirus może przebywać w komórkach leukocytarnych, a szczególnie w makrofagach różnych narządów (śledziony, nerki), które chronią go przed mechanizmami obronnymi gospodarza.

Często wirus IPN replikuje się w leukocytach krążących. Jest to wtedy infekcja przetrwała.

Taki wirus często też ma odmienne właściwości antygenowe niż typowy IPNV. Dzieje się tak, ponieważ tylko pewna subpopulacja leukocytów jest zakażona wirusem i tylko tam wirus się namnaża.

Daje to nietypowe objawy u ryb 3-4 letnich. Aktualnie obserwuje się tendencje do bezobjawowych

infekcji IPNV.

Aktualnie wirus IPN jest diagnozowany na zlecenie hodowcy lub lekarza prowadzącego, nie podlega obowiązkowi monitorowania, a zatem urzędowego diagnozowania realizowanych w ramach programów nadzoru.

Rezultat amplifikacji fragmentu genu VP2 (cDNA): RT PCR

M − marker GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus firmy Fermentas; składa się on z 14 oczyszczonych chromatograficznie fragmentów DNA o następujących długościach (w parach zasad): 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100;

P − kontrola pozytywna;N − kontrola negatywna;23-28 − numery kolejnych prób;(1×) − stężenie cDNA użyte w przypadku pierwszej amplifikacji;(2×) − stężenie cDNA dwukrotnie większe niż w przypadku pierwszej amplifikacji.

M P N (1×) (2×) M P N 23 24 25 26 27 28

Produkt długości 206 par zasad

U ryb wędrujących IPNV stanowi duże zagrożenie

IPN dodatnie smolty wykazują5x większą śmiertelność niż IPN- ujemne smolty, po zasiedleniu środowiska morskiego, sną krótko po zmianie

Istnieje możliwość szczepień!

US Patent 6274147 - Method for generating nonpathogenic infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) from synthetic RNA transcripts

US Patent Issued on August 14, 2001Estimated Patent Expiration Date:  March 31, 2019

ZwalczanieUsuwanie wirusa z powierzchni gamet

poprzez stosowanie środków biobójczych, daje możliwość stosowania profilaktyki i bioasekuracji

Przenoszenie wirusa wewnątrz gamet wymusza konieczność kontroli ryb w kierunku nosicielstwa (u tarlaków)

Aktualnie obserwuje się tendencje do bezobjawowych infekcji IPNV, wirusa należy diagnozować najefektywniejszymi metodami

Ryby mogą być nosicielami przez całe życie

Duże straty bezpośrednie, od kilku procent do około 100% (u narybku)

Wielkość śnięć jest uzależniona od gatunku i wieku ryby, warunków higienicznych, od stopnia zjadliwości patogennego szczepu wirusa.

Równie istotne dla efektów hodowli jest immunosupresyjne działanie wirusa na funkcje układu odpornościowego, co sprzyja wtórnym infekcjom bakteryjnym.

Dziękuję za uwagę!