Struktura i funkcja białek

(I mgr)

dr Katarzyna Śmietanakasia@protein.pl

http://www.protein.pl/protein/downup/struk-funk/

Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer „Biochemia”Carl Branden, John Tooze “Introduction to Protein Structure”

Wykład 1

- cztery główne typy funkcjonalne białek

- aminokwasy: wzory, właściwości, szczególne cechy kodu genetycznego,

- struktury II, III, IV rzędowe białek, mapa Ramachandrana,

- preferencje do występowania w określonych strukturach II-rzędowych,

- wiązanie peptydowe: cechy charakterystyczne, kąty,

- typy oddziaływań, odległość, przykłady,

- elementy stabilizujące struktury białek,

- efekt hydrofobowy (zwijanie białek, oddziaływanie białko-białko)

Wykład 2

- motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta,

alfa/beta, alfa + beta

- oligomeryzacja białek (typy, przykłady)

- rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne, elastyczność białek,

białka szkieletowe,

- domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura,

specyficzność

Wykład 3

- poziomy kontroli funkcji białek

- mechanizmy kierowania i regulacji białek

- kontrola funkcji białek: degradacja, kowalencyjne modyfikacje, proteoliza,

lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja, fosforylacja

białek, przykłady, wpływ na strukturę/aktywność

- molekularne przełączniki

-- cykl aktywności białek G, minimalna domena G, zasada działania, białka

GAP, GEF, GDI – budowa i mechanizm działania, model działania

mięśniowej miozyny i kinezyny

- kontrola funkcji białek przez modyfikacje kowalencyjne (fosforylacja,

lipidacja, metylacja, N-acetylacja, sumoilacja, nitrozylacja)

- degradacja, proteoliza i składanie białek, czterostopniowy mechanizm

splicingu białek

Wykład 4

Od sekwencji do funkcji:

-- sekwencje homologiczne, dopasowanie sekwencyjne, motywy

strukturalne i funkcjonalne (przykład), zasada 40%

-- mikromacierze DNA, żele 2D, Y2H

-- modelowanie homologiczne, profile-based threading, metody Rosetta,

metoda GRID, THEMATICS

-- sekwencje kameleonowe

Biosynteza białka - etapy, funkcje poszczególnych IF, EF i RF, ogólny opis

struktury krystalicznej rybosomu, czym jest PTC, synteza wiązania

peptydowego, tunel wyjściowy, L22 i SecM

Wykład 5- kinazy białkowe, struktura przestrzenna, mechanizm aktywacji i działania

kinaz Src i układu Cdk2-cyklina A

- dwuskładnikowy mechanizm sygnalizacyjny bakterii

- przeciwciała, MHC I i II, receptor T: budowa, genetyczne i strukturalne

podłoże różnorodności

- p53, ogólne informacje, budowa domeny oligomeryzacyjnej i wiążącej DNA,

kluczowe reszty, białka natywnie niezwinięte

- struktura i funkcja bakteriorodopsyny, poryn, kanału potasowego,

- trzy typy białek fibrylarnych,

- kolagen, filamenty pośrednie, włókna amyloidowe: budowa i cechy

szczególne,

- foldy metastabilne – priony, amyloidy i serpiny

- białka opiekuńcze

- podstawowa jednostka symetrii wirusów sferycznych, budowa wybranych

wirusów

Wykład 6

?

Białka

• stanowią aż 75% suchej masy tkanek miękkich naszego ciała• z gr. proteios - pierwszorzędny, o największym znaczeniu• białka są polimerami zbudowanymi z zestawu 20 różnych

aminokwasów połączonych wiązaniami peptydowymi -> już dla stuaminokwasowego białka liczba możliwych sekwencji aminokwasowych (20100) przekracza 10130

• znaczne zróżnicowanie właściwości fizykochemicznych poszczególnych reszt aminokwasowych umożliwia tworzenie przez łańcuchy białkowe bardzo różnorodnych struktur trójwymiarowych odznaczających się często dużym stopniem komplikacji – pozwala to na pełnienie przez białka tak wielu różnych funkcji

• różnorodność białek jest widoczna już w ich rozmiarach – znane są białka o masach od tysiąca do ponad miliona Da

Wiązanie -różnorodność rozpoznawanych cząsteczek; komplementarność kształtu i oddziaływań polarnych

Kataliza -przyspieszanie reakcji do 17 rzędów wielkości, odpowiednie ułożenie grup reaktywnych, stabilizacja stanu przejściowego, kataliza kwasowo-zasadowa

Białka są najbardziej różnorodnymi i wielofunkcyjnymi cząsteczkami występującymi w komórce

Molekularny przełącznik -zmiana konformacyjna pod wpływem pH lub wiązania liganda przełącza funkcję

Białka strukturalne -specyficzna asocjacja podjednostek i białek pozwala na spontaniczne powstawanie nawet bardzo złożonych struktur

Wyróżniamy cztery poziomy organizacji struktury białek

w pH 7 końcowe grupy łańcucha polipeptydowego (aminowa i karboksylowa) są zjonizowane

-zaangażowane tylko w oddziaływania van der Waalsa

-unikanie wody i pakowanie się na siebie są podstawą efektu hydrofobowego

-Ala i Leu faworyzują powstawanie helisy w przeciwieństwie do proliny

-aromatyczny pierścień Phe czasami uczestniczy w słabych polarnych oddziaływaniach

Od właściwości łańcuchów bocznych zależy wkład różnych reszt aminokwasowych w zwijanie i funkcje białek

-mogą tworzyć wiązania wodorowe między sobą, z łańcuchem głównym i innymi cząsteczkami polarnymi (m.in. z wodą)

-niektóre dysponują ładunkiem (w zależności od pH i otoczenia)

- aa hydrofilowe tworzą wiązania wodorowe ze sobą,

z łańcuchem głównym, z polarnymi związkami

organicznymi i z wodą

- Glu i Asp pKa 5 (ujemnie naładowane w pH 7),

ale w otoczeniu hydrofobowym pKa może wzrosnąć

powyżej 7 i wtedy służą jako donory protonu

- Lys pKa 10 (w pH 7 dodatnio naładowana),

ale w otoczeniu hydrofobowym może spaść poniżej 6

i wtedy Lys staje się akceptorem protonu

- His ma dwie grupy –N-H, każda o pKa około 6

-- gdy jedna traci proton, pKa drugiej staje się większa niż 10

-- gdy obie są uprotonowane His jest ujemnie naładowana

(bardzo rzadko)

-- gdy jedna jest uprotonowana His jest neutralna i zdolna

do przyjęcia bądź oddania protonu

- Arg jest prawie zawsze uprotonowana

- Grupa –SH cysteiny jest najsilniejszym nukleofilem

- Ser, Thr, Gln i Asn są akceptorami i donorami protonu

-- aa amfipatyczne najczęściej uczestniczą w tworzeniu

interfejsów między elementami hydrofobowymi a polarnymi

- Tyr zwykle nie jonizuje w pH 7 (pKa=9). Grupa –OH jest

donorem i akceptorem wiązania wodorowego,

a aromatyczny pierścień Tyr uczestniczy w słabych

oddziaływaniach polarnych

- Met jest najmniej polarna z grupy aa amfipatycznych,

ale jej siarka jest często uczestniczy w oddziaływaniach

z jonami metali

Sposób organizacji kodu genetycznego odzwierciedla wzajemne podobieństwa aminokwasów

Więcej białek niż genów u Eukariontów:

-alternatywny splicing

-editing RNA

Częstość podstawień aminokwasowych w tym samym białku pochodzącym z różnych organizmów

„conservative substitutions”

Tworzenie i hydroliza wiązania peptydowego

Wiązanie kowalencyjne tworzone pomiędzy kwasem

karboksylowym i grupą aminową dwóch α-aminokwasów

z uwolnieniem jednej cząsteczki wody. Wiązania amidowe są bardzo stabilne w środowisku

wodnym w pH bliskim 7. W komórce tworzenie i hydroliza

wiązań peptydowych kontrolowane są enzymatycznie.

Rozciągnięty łańcuch polipeptydowy

Rezonans – delokalizacja elektronów w obrębie wiązania peptydowego powoduje:

-częściowy charakter wiązania podwójnego (CNO w jednej płaszczyźnie - dwa kąty torsyjne - ograniczona możliwość rotacji i konformacji; podwyższona stabilność)

-polarność wiązania peptydowego, moment dipolowy (możliwe oddziaływania)

Oddziaływania stabilizujące białko

oddziaływania z wodą lub za jej pośrednictwem

C=O i N-H we wnętrzu białka nie mogą tworzyć wiązań wodorowych z cząsteczkami wody, więc tworzą je między sobą prowadząc do powstania

struktur II rzędowych i stabilizacji struktury

Wykres RamachandranaPrawie we wszystkich białkach łańcuch główny przyjmuje taką

konformację, w której kąty torsyjne phi i psi powtarzają

się, tworząc regularne wzory – elementy struktury

drugorzędowej

Ograniczenia steryczne określają możliwe typy

struktury drugorzędowej

Zgięcie beta (beta/hairpin/reverse turn)najprostszy element struktury II-rzędowej

-NH

-O n+3(n+2)

Część grup C=O i N-H nie tworzy wiązań wodorowych w obrębie łańcucha, dlatego zgięcia występują najczęściej na powierzchni cząsteczki białka

Obecność zgięć beta pozwala ograniczyć rozmiary białka i nadać mu bardziej zwartą strukturę

Helisa alfa – najpopularniejsza struktura II-rzędowa

wiązania wodorowe pomiędzy C=O i N-H znajdującymi się blisko siebie w sekwencji

n+43.6 reszty na skręt

Parametry elementów helikalnych

n+4n+3n+5

Amfipatyczność helis alfa

-łańcuchy boczne „wystają” co 100o

-reszty oddalone od siebie o 3-4 aminokwasy grupują się po tej samej stronie helisy

-helisy amfipatyczne stabilizują pakowanie helisa-helisa i często występują na powierzchni białka

Helisy zawierające reszty proliny

Struktura kolagenu

helisa lewoskrętna

(Gly-X-Y)n gdzie X, Y to Pro, Pro-OH lub (rzadziej) Lys

Helisy poliprolinowe

wszystkie proliny w formie trans tworzą lewoskrętną helisę (3 reszty na skręt);

motyw w białkach sygnalnych rozpoznawany przez domeny SH3

Struktury beta

Silnie rozciągnięty, zwykle lekko skręcony łańcuch polipeptydowy

bardziej stabilna

nie są eksponowane do rozpuszczalnika, najczęściej „przeplatane” helisami

odległość między resztami 3,3 Å

Możliwość utworzenia struktury amfipatycznej

Kompleks Rap–Rafpakowanie helisy na równoległe włókno beta

międzycząsteczkowa struktura beta jako interfejs oddziaływania białko-białko

Baryłka beta (-barrel)

białko wiążące retinol z niepolarnym ligandem związanym we wnętrzu baryłki

-włókna beta, ze względu

na konfiguracje L aminokwasów,

mają tendencję do prawoskrętu

-aminokwasy rozgałęzione

na węglu beta (Val, Ile) łatwo

akomodują się w strukturze

beta (w porównaniu z gęsto

upakowaną helisą)

- trafność przewidywań zaledwie ok. 70%

- najłatwiej określić położenie helis (tworzone dzięki oddziaływaniom reszt sąsiadujących ze sobą w sekwencji)

- najtrudniej przewidzieć granice pętli i miejsca zgięć

Przewidywanie struktury drugorzędowej

Tworzenie struktury trzeciorzędowej

Intermediaty zwijania (barnaza)

-minimalizacja powierzchni

hydrofobowej dostępnej

dla rozpuszczalnika

-zbliżenie polaryzowalnych

grup hydrofobowych

umożliwia powstanie między

nimi oddziaływań van der

Waalsa

-tym samym „wciągniecie”

polarnych grup C=O i N-H

łańcucha głównego staje się

siłą sprawczą powstania

struktur drugorzędowych

Efekt hydrofobowy

Porównanie struktur TIM (izomerazy triozofosforanowej) i DHFR (reduktazy kw. dihydrofoliowego)

-podobne elementy struktury drugorzędowej mogą tworzyć białka o całkiem różnych strukturach III°

-wynika to ze sposobu łączenia elementów - występowania pętli lub zgięć

Pętle

-pętle w białkach zwykle ulokowane są na powierzchni, eksponowane do rozpuszczalnika

-ponieważ ich wkład w stabilizację struktury białka jest niewielki, w obrębie pętli łatwiej tolerowane są mutacje

-dzięki temu pętle łatwo dostosowują się do powierzchni ligandów i często tworzą interfejsy oddziaływań białko-białko

Pierwsza powłoka hydratacyjna elastazy

-cząsteczki wody ściśle związane z białkiem stanowią część jego struktury

Wnętrze zwiniętego białka

- atomy we wnętrzu są upakowane

prawie jak w ciele stałym

-kanały i szczeliny pozwalają

jednak na ruch atomów

i zapewniają elastyczność

-jeśli w rdzeniu znajdują się

większe przestrzenie,

to wypełnione są cząsteczkami

wody, które mogą oddziaływać

z okolicznymi grupami polarnymi

Motywy pakowania struktur helikalnych

cytochrom b562 ludzki hormon wzrostu

„ridges and grooves”

Symulowana struktura fragmentu dwuwarstwy lipidowej

20 x 1,5 Å - helisa

8-9 x 3.5 Å - włókno beta

-otoczenie hydrofobowe powoduje, że wszystkie polarne grupy (w tym C=O i N-H łańcucha głównego) muszą zostać „zagrzebane” we wnętrzu białka – odwrotnie niż w środowisku wodnym

Fragment kompleksu cytochromu bc1

elementy przezbłonowe najczęściej są helikalne, ze względu na możliwość lokalnego utworzenia wiązań wodorowych w obrębie łańcucha głównego

Profil hydrofobowości białka DctB z Rhizobium meliloti

Błonowe białka beta

Struktura transportera FhuA

-włókno przezbłonowe = 8-9 reszt

-zwykle pod kątem => trudniejsze do przewidzenia

-zamknięte baryłki aby zaspokoić HB

-często tworzą kanały

Struktura bakteryjnego kanału potasowego

homotetramer

Zorganizowane cząsteczki wody na eksponowanej powierzchni hydrofobowej rybonukleazy A

Zwinięte natywnie białko jest termodynamicznym kompromisem.

Stabilność można zdefiniować jako utratę energii swobodnej, będącą sumą efektów entalpowych i entropowych.

Dla większości białek różnica energii między stanem rozwiniętym a zwiniętym jest marginalna, około 21-42 kJ/mol.

Pojedyncze słabe oddziaływanie uwalnia około 4-13 kJ/mol energii swobodnej

Stabilność, denaturacja, termofilność

-marginalna stabilność dopuszcza duży stopień swobody (niezbędny do wzajemnego dopasowania podczas oddziaływań z ligandami czy katalizy)

-stan zdenaturowany rozpoznajemy po utracie aktywności biologicznej/biochemicznej lub zmianie sygnału np. dichroizmu kołowego

-denaturację można wymusić wysoką temperaturą oraz chemicznymi denaturantami (chlorowodorek guanidyny, mocznik, SDS), które współzawodniczą z polarnymi grupami białka o wiązania wodorowe

-stabilizację białek można uzyskać poprzez skracanie pętli, dodawanie mostków solnych itp.

Struktura BPTI

stabilizacja przez mostki S-S

-zwykle struktura białka jest stabilizowana przede wszystkim przez oddziaływania niekowalencyjne

-w niektórych przypadkach istotną rolę mogą też pełnić oddziaływania kowalencyjne, np. tworzenie mostków disulfidowych

-dotyczy to głównie białek zewnątrzkomórkowych, ponieważ warunki panujące w komórce są silnie redukujące

Fragment struktury subtylizyny

stabilizacja przez koordynację metalu (Ca2+)

-Kd wiązania metalu w zakresie od mM (bardzo słabe) do nM (bardzo mocne)

-w koordynacji mogą uczestniczyć cząsteczki wody

-w niektórych przypadkach białka strukturyzują się wyłącznie w obecności jonów metalu, a ich usunięcie prowadzi do denaturacji

Stabilizacja przez wiązanie kofaktoradotyczy miejsc aktywnych

DaAT/pirydoksal mioglobina/hem+żelazo

cytochrom c/hem+żelazo oksydaza poliaminowa

/PQQ

Modyfikacje potranslacyjne wpływające na stabilność białka

SUMOylationS-nitrosylation

Diagram tetrameru Lac represora wiążącego się do DNA

Domeny strukturalne

-białka fibrylarne/globularne

-domena – zwarty obszar w strukturze białka, zwykle (ale nie zawsze) tworzony przez ciągłą sekwencję aa, często posiadający zdolność zwijania się i funkcjonowania w sposób niezależny od reszty białka

-domeny mają nie więcej niż 250 aa (49% w granicach 51-150aa)

domeny tetrameryzacyjne

domeny wiążące DNA

struktura racemazy alaniny

- nie wszystkie domeny budowane są przez ciągły odcinek sekwencji

- rdzenie hydrofobowe domen białkowych

Domeny strukturalne

Domeny strukturalne

homodimer

(dehydraza tioestrowa)

monomer

(tioesteraza)

-białka wielodomenowe ewoluowały przez fuzję genów kodujących pojedyncze białka-im dawniej nastąpiła duplikacja, tym trudniej dostrzec podobieństwo (coraz więcej nagromadzonych mutacji)

Struktura gamma-krystaliny z soczewki oka

podwójna duplikacja w obrębie tej samej domeny

Struktury syntazy Trp i dehydratazy galaktonianiu

Podobna alfa/beta baryłka (żółta) mimo całkowitego braku

pokrewieństwa oraz podobieństwa sekwencji czy funkcji obu białek

-ograniczona liczba sposobów zwijania

-domain fold – topograficzny układ elementów struktury drugorzędowej, charakterystyczny dla danej domeny

Diagram aranżacji domen w białkach zaangażowanych w sygnalizację

komórkową

-funkcjonowanie poszczególnych modułów może (ale nie musi) zależeć od ich kolejności w łańcuchu polipeptydowym => możliwe zamienianie i dokładanie domen

-wyodrębniamy rodziny białek w zależności od architektury domenowej

Struktura reduktazy aldozy (redukcja, NADPH) i fosfotriesterazy (hydroliza, jon metalu)

ten sam sposób zwinięcia – zupełnie inna funkcja i mechanizm katalizy

Struktura aminotransferaz

-katalizują tą samą reakcję

-brak podobieństwa sekwencji

i struktury przestrzennej,

z wyjątkiem bardzo podobnych

miejsc aktywnych

Na następnym wykładzie:

-motywy strukturalne i funkcjonalne (przykłady), domeny alfa, beta,

alfa/beta, alfa + beta

- oligomeryzacja białek (typy, przykłady)

- rozpoznanie, komplementarność i centra aktywne,

- elastyczność białek, białka szkieletowe,

- domena PDZ, cechy charakterystyczne wiązania ligandów, struktura,

specyficzność