Post on 18-Jan-2016
description
PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA
Nukleotydy i kwasy nukleinowe
OH
OH
H
O
HH
H
OH
HOCH2
H
OH
H
O
HH
H
OH
HOCH2
ryboza2-deoksyryboza
N
1 23
45
6N
PIRYMIDYNAcytozynatyminauracyl
N
N1
234
56
N
N7
89
PURYNAadenina guaninaO
N
zasada
cukier1’
2’3’
4’
5’CH2P
O
O-
O-
reszta kwasu ortofosforowego
Nukleotydy
O
N
1’
2’3’
4’
5’CH2P
O
O-
O-
nukleotyd
O
N
1’
2’3’
4’
5’CH2OH
nukleozyd
CH2P
O
O-
O-
monofoforan nukleozydu
CH2P
O
O
O-
P
O
O-
O-
difoforan nukleozydu
CH2P
O
O
O-
P
O
O-
OP
O
O-
O-
trifoforan nukleozydu
Nukleotydy
wiązanie N-glikozydowe
wiązanie estrowe
koniec 5’ łańcucha
koniec 3’ łańcucha
O
cukier1’
2’3’
4’
5’fosforan N
zasada
N
O
zasada
cukier1’
2’3’
4’
5’
O
cukier1’
2’3’
4’
5’
fosforan
fosforan N
zasada
Fragment łańcucha kwasu nukleinowego
wiązanie fosfodiestrowe
wiązanie fosfodiestrowe
OH
Kwasy nukleinowe
DNA
kwas rybonukleinowy
bierze udział w rozkodowywaniu
informacji zawartej w DNA
koduje informację o budowie i działaniu całego organizmu
kwas deoksyrybonukleinowy
RNA
CH2P
O
O-
O-
monofoforan nukleozydu
CH2P
O
O
O-
P
O
O-
OP
O
O-
O-
trifoforan nukleozydu
DNA dATP, dGTP, dCTP, dTTP
RNA ATP, GTP, CTP, UTP
Podwójna helisa DNA
G C
A T
komplementarne parowanie zasad
5’ GGTACCAATTCAAAGCTTATG 3’3’ CCATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’
Enzymy restrykcyjne
Kpn IGGTACCCCATGG
5’ GGTAC 3’3’ C 5’
5’CAATTCAAAGCTTATG 3’3’ CATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’
Hind IIIAAGCTTTTCGAA
5’ GGTACCAATTCAA 3’3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’
5’AGCTTATG 3’ 3’ATAC 5’
Alu IAGCTTCGA
5’ CTTATG 3’3’ GAATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAAAG 3’3’ CCATGGTTAAGTTTC 5’
5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA
AGCTTATG 3’ | ATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA
AGCTTATG 3’ | ATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA
AGCTTATG 3’ | ATAC 5’
Hind III AAGCTTTTCGAA
Hind III
5’ GGTACCAATTCAA 3’ |||||||||||||3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’
5’AGCTTATG 3’ ||| 3’ATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAA 3’ |||||||||||||3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’
5’AGCTTATG 3’ ||| 3’ATAC 5’
ligaza
wektor
trawienie enzymem restrykcyjnym
Klonowanie DNA
DNA zawierający wstawkę, którą chcemy przeklonować
trawienie enzymem
restrykcyjnym
wstawka
ligacja wektora ze wstawką
plazmid ze wstawką gotowy do wprowadzenia do bakterii
mieszanina jednoniciowych
cząsteczek DNA
jednoniciowa wyznakowanasonda komplementarna
do cząsteczki A
hybrydyzacja w warunkach ostrych
hybrydyzacja w warunkach łagodnych
tylko cząsteczka A tworzy stabilną dwuniciową cząsteczkę
cząsteczki A, C i E tworzą stabilne dwuniciowe cząsteczki
Hybrydyzacja
Hybrydyzacja
denaturacja DNA w celu uzyskania jednoniciowych cząsteczek
inkubacja błony z jednoniciową wyznakowaną radioaktywnie sondą DNA
Sekwencjonowanie DNA
denaturacja
dwuniciowy DNAGCATATGTCAGTCCAG
CGTATACAGTCAGGTC5’3’
3’5’
GCAT
CGTATACAGTCAGGTC
5’3’ 5’
3’
jednoniciowy DNA(matryca do sekwencjonowania)
GCATATGTCAGTCCAG
CGTATACAGTCAGGTC
5’
3’
3’
5’
GCAT5’ 3’przyłączenie znakowanego startera
Sekwencjonowanie DNAGCAT
CGTATACAGTCAGGTC
5’3’ 5’
3’dATP, dTTP, dCTP, dGTP +
ddATP ddGTPddCTPddTTPpolimeraza DNA polimeraza DNApolimeraza DNApolimeraza DNA
GCAT
GCAT
GCAT
A
ATGTCA
ATGTCAGTCCA
GCAT
GCAT
GCAT
AT
ATGT
ATGTCAGT
GCAT
GCAT
GCAT
ATGTC
ATGTCAGTC
ATGTCAGTCC
GCAT
GCAT
GCAT
ATG
ATGTCAG
ATGTCAGTCCG
elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Sekwencjonowanie DNAddATP ddTTP ddCTP ddGTP
A T C G
GACCTGACTGTA 5’
3’
bufor
Reakcja PCRmieszanina reakcyjna
dNTPstarter1 starter2 polimeraza Taq
dwuniciowa matryca DNA
sekwencja docelowa
Cykl syntezy DNA w reakcji PCR
etap 1 - denaturacja matrycy
etap 2 - przyłączenie starterów
etap 3 - wydłużanie starterów
CYKL 1 denaturacja 94C
jednoniciowa matryca DNA
CYKL 1 przyłączenie startera do matrycy 40-65C
starter 1 starter 2
CYKL 1 wydłużanie startera 72C
starter 1 starter 2
powstają cząsteczkidłuższe od sekwencji docelowej
CYKL 2 denaturacja matrycy 94C
matryca
DNA, który powstał w cyklu 1
CYKL 2 przyłączenie startera do matrycy 40-65C
CYKL 2 wydłużanie starterów 72C
powstają cząsteczkidłuższe od sekwencji
docelowej
powstają cząsteczkio długości sekwencji
docelowej
94°C15s
94°C3 min
65°C15s
72°C30s
tem
pera
tura
czas
15x
72°C30s
4°C
1x 1x
94°C15s
94°C3 min
65°C15s
72°C30s
tem
pera
tura
czas
15x
72°C30s
4°C
1x 1x
Profil termiczny reakcji PCR
cykl podstawowy
cykle dodatkowe
plazmid pUC18/cDNAPPRas2ze wstawką 0,8 kp
mieszanina A: startery A1 i A2
A1 A2
B2B1
0,6 kb
0,35 kb
Część praktyczna
mieszanina B: startery B1 i B2
1 - wzorce wielkości2, 3, 4 - produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii)5 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu6 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji A, do której nie dodano żadnej matrycy 7 - produkty reakcji B, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii)8 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji B, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu9 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji B, do której nie dodano żadnej matrycy 10 - wzorce wielkości
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1,35 kb1,08 kb0,87 kb
0,6 kb
0,28 kb0,23 kb0,31kb
0,6 kb
0,35 kb
0,19 kb
A B