RODZICIELSKIE PIĘTNOWANIE GENOMOWE. EPIGENETYKA W CHOROBACH NEUROLOGICZNYCH.

Monika Gos

Instytut Matki i Dziecka, Warszawa

Kurs: „Neurogenetyka i genetycznie uwarunkowane choroby narządów zmysłów”

21 – 25.11.12.2016

MECHANIZMY REGULACJI EPIGENETYCZNEJ

metylacja: (wyspy CpG, zahamowanie

ekspresji)

modyfikacje białek histonowych:

acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitynacja (efekt zależny od miejsca i

charakteru modyfikacji)

struktura chromatyny:

gęstość upakowania chromatyny (eu- i

heterochromathna – nieaktywna transkrypcyjnie)

struktury przestrzenne tworzone przez chromatynę

(pętle) oddziaływanie z kompleksami

białkowymi

niekodujące cząsteczki RNA: małe (<200pz, mikroRNA, snRNA i snoRNA)

i duże (>200pz, lncRNA)

Aktywacja ekspresji genu otwarta struktura chromatyny niemetylowane cytozyny acetylowane histony (HAT)

Zahamowanie ekspresji genu „zamknięta” struktura chromatyny metylowane cytozyny (DNMT) deacetylacja histonów (HDAC)

Modyfikacje a ekspresja genów

Regulacja epigenetyczna

mechanizm nie jest związany ze zmianą sekwencji DNA wzór piętna genomowego musi być utrzymany w tracie podziałów komórkowych i

różnicowania się komórek wzór piętna musi zostać rozpoznany przez aparat transkrypcyjny, tak aby doszło do

ekspresji genu z odpowiedniego allelu jest potencjalnie odwracalne (odwracalność jest warunkiem koniecznym do

ustalenia wzoru piętna genomowego specyficznego dla płci) może mieć charakter losowy (inaktywacja chromosomu X), jak również zależeć od

pochodzenia rodzicielskiego

Zaburzenia lub zmiana regulacji epigenetycznej efekt fenotypowy

Niekodujące RNA (non-coding RNA, ncRNA)

ncRNA

małe ncRNA (<200nt)

microRNA

snRNA

tRNA

snoRNA

piRNA

długie ncRNA (>200nt)

rRNA

inne ncRNA

Niekodujące cząsteczki RNA (ncRNA)

ekspresja 60% genów

kodujących białka

jest regulowana przy

udziale miRNA

www.sigmaaldrich.com

70% miRNA

ekspresja w mózgu

(specyficzna dla neuronów)

Przykłady: ↓ miR-206 – ALS

↓ miR-9 – SMA

↓ miR-19, miR-101, miR-130 – SCA typ I

Funkcje ncRNA

Hipoteza 1: odgrywają rolę regulatorową względem kompleksów białkowych odpowiedzialnych za modyfikację struktury chromatyny (brak zdolności do wiązania się z DNA)

1. Imprinting i regulacja dawki ekspresji genu – lokalizacja w piętnowanych loci

2. Pluripotencja komórek macierzystych – RoR lncRNA reg. przez Oct4, Sox2 i Nanog

3. Rozwój embrionalny (segmentacja ciała) – regulacja ekspresji genów Hox

4. Hematopoeza 5. Inaktywacja chromosomu X (Xist) 6. Różnicowanie komórek układu nerwowego

– TUG1 – lncRNA – siatkówka; brak fotoreceptorów

wpływ na ekspresję genów (cis i trans)

Epigenetyka – mechanizm adaptacyjny?

1944 – klęska głodu

Holandia

kobiety

I trymestr ciąży

kobiety

III trymestr ciąży

prawidłowa masa urodzeniowa;

otyłość i choroby układu krążenia

obniżona masa urodzeniowa;

nadciśnienie i insulinooporność

ekspresja genów odpowiedzialnych za

metabolizm glukozy i kwasów tłuszczowych

adaptacja do warunków środowiska

warunki stresowe wzrost ryzyka rozwoju depresji i nerwicy

ZMIANY EPIGENETYCZNE SĄ SZYBSZE NIŻ MUTACJE DNA

Defekty epigenetyczne w ciągu życia a choroby cywilizacyjne

Wraz z wiekiem poza kumulacją mutacji punktowych w organizmie zachodzą także zmiany epigenetyczne

NOWOTWORY

INNE CHOROBY CYWILIZACYJNE

Genetyczno-epigenetyczny model powstawania chorób kompleksowych

1. rozwój choroby zależy od podłoża genetycznego oraz działania czynników epigenetycznych

2. czynnik epigenetyczny (DNA, chromatyna) może być modyfikowany przez czynniki środowiskowe

3. również warianty sekwencji genów odpowiedzialnych za regulację ekpresji genów mogą wpływać na powyższe zmiany

4. Starzenie się proces utraty plastyczności fenotypowej w czasie

cukrzyca, choroby serca, nabyta NI

Uszkodzenia epigenotypu

CHOROBY EPIGENETYCZNE

nieprawidłowy wzór epigenetyczny mutacje w genach kodujących modyfikatory epigenetyczne

Zespół łamliwego chromosomu X (FXS)

Częstość występowania: 1/4000 mężczyzn, 1/8000 kobiet

Częstość nosicielstwa: 1/800 mężczyzn, 1/250 kobiet

Cechy kliniczne (chłopcy z pełną mutacją):

1. opóźniony rozwój mowy i psychoruchowy

2. NI (IQ 30-50)

3. specyficzne cechy dysmorfii

4. zaburzenia psychologiczne (autyzm, ADHD, nadreaktywność)

5. makroorchidyzm

http://medgen.genetics.utah.edu/photographs/pages/fragile_x.htm

FMRP (FMR1) – RNA interacting protein transport mRNA do dendrytów i regulator syntezy białek w synapsach istotne dla

procesów uczenia się i pamięci

regulacja internalizacji receptora AMPA po pobudzeniu mGluR brak FMRP nadmiar internalizacji AMPAR

Status CGG Liczba powtórzeń

CGG Metylacja FMR1

Objawy kliniczne

mężczyzna kobieta

Premutacja ~55-200 niemetylowany FXTAS FX-POI i FXTAS

Mutacja >200 całkowita metylacja 100% ID ~50% - ID,

~50% - prawidłowy

Mozaika w liczbie powtórzeń

p+m; n+p+m zmienna, w zależności od liczby powtórzeń

Do 100% ID

fenotyp zmienny; od prawidłowego do ID

Mozaika metylacyjna >200 zmienna

Niemetylowana pełna mutacja

>200 niemetylowany prawie wszyscy ID (nawet w dolnym zakresie normy)

XLMR a inaktywacja chromosomu X

Inaktywacja chromosomu X – stadium ok. 200 komórkowe (mozaicyzm)

Regulacja przy udziale ncRNA – XIST – akumulacja wzdłuż chr. X

wymazanie zmian epigenetycznych aktywnej chromatyny (H3K4me3, H3ac) naniesienie zmian chromatyny nieaktywnej (ubH2A, H3K27me3)

przyłączenie białek z rodziny

Polycomb, trithorax (Ash2L), białka SAF-A, histonu macroH2A

XLID - 150 jednostek chorobowych, głównie chłopcy zmiany dziedziczone od matek, u których obserwuje się

nielosową inaktywację chromosomu X (zaburzenia proliferacji lub przeżycia komórek z mutacją)

NI lekka – 55-69, umiark. 35-54, znaczna – 20-34, głęboka - <20

Inaktywacja chromosomu X - analiza

DNA

amplifikacja AR

HhaI

elektroforeza

M - NT

M - HhaI

P - NT

P - HhaI

m

_ m/-

Piętnowanie genomowe (GI)

Piętnowanie genomowe, rodzicielskie piętno genomowe

monoalleliczna ekspresja genu zależna od jego rodzicielskiego pochodzenia

46,XX 46,XY

R! ORGANIZM DIPLOIDALNY

każdy gen w dwóch kopiach (zazwyczaj eksprymowany z obu)

HAPLOINSUFICJENCJA (monosomie, 45,X, zespół Marfana)

Geny piętnowane (ok. 150) są odpowiedzialne za:

-rozwój mowy - kształtowanie kontaktów

międzyludzkich - inne fenotypy związane z

zachowaniem

1. organizacja klastrowa 2. eskpresja z allela mat. lub ojc. 3. w obrębie klastra – również geny

dla ncRNA 4. centra regulatorowe 5. piętno może być nałożone na

chromosomie mat. lub ojc.

Piętno genomowe (GI)

46,XX

46,XY

R!

R!

DEFEKTY PIĘTNA GENOMOWEGO – bardzo rzadkie, niemożliwe do naprawienia po zapłodnieniu

(epimutacja pierwotna lub epimutacja wtórna – cis, trans)

R!

46,XX

problemy z usunięciem piętna

R!

46,XX

problemy z nałożeniem piętna

gen eksprymowany z allela pochodzenia matczynego

gen eksprymowany z allela pochodzenia ojcowskiego

46,XX - matka

46,XY - ojciec

CHOROBA EPIGENETYCZNA

CHOROBA EPIGENETYCZNA

brak efektu fenotypowego mężczyzna może przekazać

defekt potomstwu

brak efektu fenotypowego kobieta może przekazać

defekt potomstwu

EFEKT: aktywacja allelu, który powinien być wyciszony wyciszenie allelu, który powinien być aktywny

NIEPRAWIDŁOWA DAWKA EKSPRESJI GENU

ekspresja obu kopii albo brak ekspresji zaburzenia wzrostu i rozwoju organizmu

Defekty GI – mechanizmy powstawania

R! R!

Rodzicielskie piętno genomowe

PWS/AS UPD14

SRS BWS/SRS

GNAS

TNDM

Choroba Częstość

występowania ID (%)

Region

chromosomowy

Zespół Pradera-Williego 1/10000 - 1/25000 ≈1 15q11-q13

Zespół Angelmana 1/12000 - 1/20000 ≈4 15q11-q13

Zespół Beckwitha-Wiedemanna 1/15000 ≈60 11p15.5

Zespół Russell-Silver 1/3000 - 1/100000 ≈50 11p15.5,

7p11.2-p13

Przemijająca cukrzyca

noworodkowa typu I 1/400000 ≈30 6q24

Pseudohypoparatyroidyzm Ib ? >90 20q13.11

UPD(14)mat

(zespół Temple) ? ? 14q32

UPD(14)pat

(zespół Kagami-Ogata) ? ? 14q32

Typowe choroby epigenetyczne

Zespół Pradera-Williego

objawy kliniczne: - hipotonia - trudności w karmieniu - nadmierne łaknienie - otyłość - zaburzenia funkcji poznawczych (NI) - specyficzny fenotyp behawioralny - hypogonadyzm - niskorosłość, małe dłonie i stopy - subtelna dysmorfia twarzoczaszki - zez - skolioza

Zespół Angelmana

Kryteria główne (4/4) - znaczne opóźnienie rozwoju - zaburzenia chodu / równowagi - opóźnienie rozwoju mowy - specyficzny fenotyp behawioralny Kryteria dodatkowe (3/6) - małogłowie pourodzeniowe - napady padaczkowe - nieprawidłowy wzór EEG - zaburzenia snu - zainteresowanie wodą / błyskaniem - ślinotok

Choroby epigenetyczne

„La Monstrua „ Juan Carreño de Miranda (1616-1685); Milan, Prada Museum

Eugenia Martinez Vallejo from Carol 2nd royal court

A boy with a puppet Giovanni Francesco Caroto

AS PWS

delecja mat 15q11-q13 delecja pat 15q11-q13

patUPD matUPD

epimutacja IC (brak piętna) epimutacja IC (piętno ++)

mutacja UBE3A delecja SNORD116

Disomia jednorodzicielska chr.14

matUPD14 – zespół Temple

przed- i pourodzeniowe zahamowanie wzrostu

wrodzona hypotonia

wiotkość stawów

opóźnienie rozwoju ruchowego

NI w stopniu umiarkowanym

patUPD14 – zespół Kagami-Ogata

(KOS, zespół Wang)

wielowodzie

wady w obrębie brzucha i klatki piersiowej

podwyższona waga urodzeniowa

(hypertrofia mięśniowa)

NI w stopniu głębokim

MLMD (multilocus DNA methylation defects)

Hypometylacja w obrębie kilku piętnowanych loci (ICR2+GNAS+IGF2R+PEG1 lub TNDM+ICR2+GRB10+PEG1)

białka odpowiedzialne za nałożenie wzoru piętna genomowego???

ZFP57 – białko jądrowe odpowiedzialne za utrzymanie wzoru piętna

w trakcie rozwoju zarodkowego; TNDM i BWS; AR

NLRP2 i NLRP7 – białka cytoplazmatyczne o nieznanej funkcji

NLRP2 – BWS – mutacja typu frameshift (ex.6)

NLRP7 i C6orf221 – AR – dziedziczna forma zaśniadu groniastego

(brak nałożonego piętna matczynego)

Analiza metylacji DNA

Izolacja DNA

PCR po trawieniu DNA enzymami restrykcyjnymi wrażliwymi na metylację

MS-MLPA

modyfikacja DNA kwaśnym dwusiarczynem sodowym

sekwencjonowanie MS-PCR pyrosekwencjonowanie

analiza metylacji w

SNRPN

nieprawidłowy wzór metylacji

analiza delecji (FISH, MLPA)

delecja w locus 15q11-13

PWS/AS brak delecji

analiza RFLP, mikrosatelity

dziedziczenie oburodzicielskie

defekt piętna genomowego PWS/AS

patUPD AS

matUPD PWS

prawidłowy wzór metylacji

ponowna weryfikacja

kliniczna

wykluczenie PWS/ AS

potwierdzenie AS

analiza UBE3A

potwierdzenie obecności

mutacji AS

analiza UBE3A u rodziców

brak mutacji

???

Mechanizm genetyczny Ryzyko

Delecja <1%

UPD <1%

Defekt imprintingu i mutacja ≤50%

Defekt imprintingu bez mutacji <1%

Translokacja zrównoważona powstała de novo <1%

Odziedziczona translokacja zrównoważona. 25%

Ryzyko genetyczne

Przykładowe wyniki

Przykładowe wyniki

MAT PAT

Analiza metylacji (MS-PCR lub MS-MLPA)

Analiza delecji (FISH lub MS-MLPA)

Analiza UPD markery mikrosatelitarne dla 15q

Analiza AS-SRO (sekw.) Tylko AS

P1 P3

Uszkodzenia epigenotypu

CHOROBY EPIGENETYCZNE

nieprawidłowy wzór epigenetyczny mutacje w genach kodujących modyfikatory epigenetyczne

Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych

1. choroby dziedziczące się w sposób mendlowski – najczęściej autosomalny (80%) dominujący (wyjątek: 71% chorób związanych z usuwaniem znaczników epigenetycznych – chromosom X); AR – 14% vs. 80% dla IEM

2. białka – składniki kompleksów wielobiałkowych zmiana poziomu/aktywności zaburzenie działania całego kompleksu

3. choroby wieloukładowe, o szerszym spektrum objawów klinicznych niż inne jednostki chorobowe; różna ekspresja fenotypowa trudny do identyfikacji defekt molekularny przed erą sekwencjonowania następnej generacji (NGS)

4. efekt fenotypowy – zmienny, nie dotyczy wszystkich komórek organizmu, a jedynie określonej frakcji komórek, dla których prawidłowego funkcjonowania konieczna jest właściwa aktywność regulatora epigenetycznego konieczność identyfikacji „target genes”

5. efekt fenotypowy – może zależeć także od poza epigenetycznych funkcji białka (np. HDAC8 – zespół Cornelia de Lange – koezynopatia – NIPBL)

Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych

44 jednostki chorobowe objawy kliniczne: 1. niepełnosprawność intelektualna (prawidłowa regulacja epigentyczna niezbędna dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania układu nerwowego) 2. zaburzenia wzrastania – niskorosłość lub gigantyzm 3. wady kończyn (nieprawidłowa budowa paznokcia ↔ brachydaktylia) 4. zaburzenia immunologiczne

Choroby związane z defektem modyfikatorów epigenetycznych

PRZYCZYNA CHOROBY

zaburzenia równowagi stanów transkrypcyjnych chromatyny (aktywny ↔ nieaktywny)

zaburzenia regulacji genów docelowych

Zespół Kabuki (NGS) 1. niskorosłość 2. małogłowie 3. dysmorfia (uszy, ptoza, brwi) 4. wrodzona wada serca (ASD, VSD, koarktacja aorty) 5. niepełnosprawność intelektualna / opóźnienie rozwoju psychoruchowego 6. drgawki padaczkowe / hypotonia 7. problemy z karmieniem 8. skolioza, nieprawidłowości w budowie kręgów, nadruchliwość stawów 9. wnętrostwo / wady budowy nerek 10. opuszki płodowe palców 11. CAL, hirsutyzm

KMT2D (MLL2) H3K4me3 aktywny

KDM6A H3K27me3 nieaktywny

↓ ekspresji genów docelowych (1/3 – homologi genów Polycomb i Trithorax – odpowiedź na działanie

czynników zewnętrznych, rytm dobowy, szlak mTOR)

DNMT1 – demencja, głuchota, neuropatia czuciowa; ataksja móżdżkowa, głuchota, narkolepsja

DNMT3b (de novo) – zespół ICF (OMIM #242860) niedobór odporności, niestabilności centromerów, anomalie twarzy, ID

DNMT3a – nadmierny wzrost + ID, dysmorfia twarzy (Nat Genet. 2014 Apr;46(4):385-8)

MECP2 – zespół Retta; zespół dup. MECP2 MBD1-4 – autyzm

Choroby MECP2-zależne

X-linked, Xq28

MECP2 – białko wiążące się do metylowanych sekwencji CpG

poza domeną wiążącą metylowane DNA (MBD), białko posiada domenę TRD, odpowiedzialną za oddziaływanie z pozostałymi białkami kompleksu hamującego transkrypcję (białka HDAC, metylotransferazy histonowe, inne białka odpowiedzialne za tworzenie heterochromatyny)

mutacje: delecje i m. nonsens w MBD i TRD związane są z objawami neurologicznymi

gen regulowany przez MECP2 – BDNF – czynnik odpowiedzialny za rozwój układu nerwowego (zapobiega apoptozie), różnicowanie komórek progenitorowych oraz procesy pamięci i uczenia się

MECP2

↓ miR-30a/d, miR-381, miR-495 - ↓ BDNF Mecp2 brain knockout – miR-29 i miR-146 (komórki nerwowe i glejowe)

BDNF miR-212, miR-132 ↓ MECP2

Choroby związane z MECP2

Zespół Retta

• głównie dziewczynki (1/10-15 tys.)

• regres rozwoju po okresie

prawidłowego rozwoju

• utrata nabytych umiejętności

posługiwania się rękoma

• regres mowy

• zaburzenia chodu

• stereotypie

• pourodzeniowa mikrocefalia

• zaburzenia oddychania

• chłopcy: encefalopatia

niemowlęca

Zespół duplikacji MECP2

• głównie chłopcy

• NI – ciężka - głęboka

• wczesnodziecięca hypotonia

• opóźniony rozwój motoryczny

• narastająca spastyczność

• predyspozycja do infekcji (75%)

• Napady padaczkowe (50%)

• cechy dysmorfii - dyskretne

• kobiety: nielosowa inaktywacja

chromosomu X

(całkowita lub znaczna)

Zespół ATR-X Zespół Rubinstein-

Taybiego Zespół Coffina-Lowry’ego

ATRX (Xq13.3) CREBBP (16p13.3) RSK2 (Xq22.3)

członek rodziny SWI/SNF;

represja transkrypcji; zmiany

w konformacji chromatyny

CREB binding protein, HAT,

acetylacja H3, oddziaływuje z

regulatorami cyklu

komórkowego c-FOS,

c-JUN

aktywacja białek CREB na

drodze fosforylacji;

fosforylacja histonów (H3S10)

NI głęboka, opóźnienie rozwoju

mowy, drgawki, hypotonia,

dysmorfia; zaburzenia rozwoju

kory mózgowej

NI (umiarkowana do głębokiej),

zaburzenia rozwoju mowy i

poznawczego, impulsywność,

zaburzenia koncentracji, otyłość,

dysmorfia twarzy, spowolnienie

wzrostu, niskorosłość, wady

szkieletu

NI (głęboka u chłopców),

opóźnienie rozwoju mowy,

małogłowie, wady serca,

dysmorfia twarzy, zaburzenia

budowy szkieletu

Zespół płciowo-rzepkowy

Zespół Say-Barber-Biesecker-Young-

Simpson

10q22.2 MYST4

(KAT6B)

acetylotransferaza

histonowa

Zespół Rubinstein-Taybi 16p13

22q13

CREBBP

(KAT3A),

EP300

(KAT3B)

acetylotransferaza

histonowa

Zespół brachydaktylia

niepełnosprawność intelektualna

(zespół microdelecyjny)

2q37.3 HDAC4 deacetylaza

histonowa

Zespół podobny do z. Wilsona-Turnera,

sprzężony z chromosomem X

(XLID, hypogonadyzm, ginekomastia,

otyłość, niskorosłość, dysmorfia)

Zespół podobny do z. Cornelia de Lange

(dysmorfia, zaburzenia wzrastania,

niepełnosprawność intelektualna,

zaburzenia budowy kończyn górnych,

zaburzenia neurologiczne i pokarmowe )

Xq13.1 HDAC8 deacetylaza

histonowa

Zespół Kleefstra 9q34 EHMT1

MLL3

metylotransferaza

histonowa

Zespół Weavera

(wysoki wzrost, specyficzny

wygląd twarzy, NI)

7q36.1 EZH2

Zespół Wiedemann-Steiner

(niskorosłość, NI, dysmorfia) 11q23.3 MLL

Zespół Kabuki

(NI, wada serca, wady układu

moczowego, niedosłuch, hypotonia,

pourodzeniowy niedobór wzrostu)

12q13.12 MLL2

Zespół Sotosa

Zespół Weavera 5q35 NSD1

Autyzm 1q21.3 SETDB1

XLID (NI sprzężona z chr. X) Xp11.22 PHF8

demetylaza

histonowa

NI (NGS-trio analysis) 1q32.1 KDM5B

XLID (NI sprzężona z chr. X +

niskorosłość, ataksja, wzmożone

napięcie mięśniowe, hyperrefleksja)

Xp11 KDM5C

(JARID1C)

XLID

(NI sprzężona z chr. X, brak

rozwoju mowy, drgawki,

wady układu moczowo-

płciowego, problemy ze

skórą, niska linia włosów na

karku, szeroko rozstawione

sutki, nadmiar włosów na

tułowiu, dysmorfia)

Xq24 UBE2A

transferaza

ubikwitynowa

XLID

(NI sprzężona z chr. X;

zespół podobny

do zespołu Turnera)

Xp11.22 HUWE1

Zespół Coffina-Lowry’ego

(NI sprzężona z chr. X) Xp22 RPS6KA3

kinaza białek

histonowych i czynników

transkrypcyjnych

Zespół Nicolaidesa-Baraitsera 9p24.3 SMARCA2 podjednostki

kompleksów

remodelujących

chromatynę

Zespół Coffina-Sirisa

11p13.2 SMARCA4

1p36.11 ARID1A

Zespół CHARGE 8q12 CHD7

helikaza DNA autyzm i zaburzenia ASD 14q11.2 CHD8

zespół α-thalasemia-NI (ATR-X) Xq13 ATRX

* niskorosłość * opóźnienie rozwoju

psychoruchowego * NI

* dysmorfia * zaburzenia kostno-szkieletowe

* wrodzona wada serca * brak płytki paznokciowej

piątego palca